Фенотипические и генетические маркеры холодовой адаптации вируса краснухи тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Дмитриев, Григорий Владимирович

• Дмитриев, Григорий Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дмитриев, Григорий Владимирович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Структурная и молекулярно-биологическая характеристика вируса краснухи.

1.1.1. Структура вириона вируса краснухи.

1.1.2. Геном вируса краснухи.

1.1.3. Репликация генома вируса краснухи и трансляция неструктурных белков.

1.1.4. Генетическая изменчивость вируса краснухи.

1.2. Механизмы аттенуации вируса краснухи.

1.2.1. Вакцинные штаммы вируса краснухи.

1.2.2. Детерминанты аттенуации вируса краснухи.

2. Материалы и методы.

2.1. Вирусный материал.

2.2. Клеточные линии.

2.3. Реактивы.

2.4. Тест на иммуногенность.

2.5. Культуральные методы.

2.5.1. Накопление вируса в культуре клеток.

2.5.2. Титрование вируса краснухи по ЦПД в культуре клеток 11К-13.

2.5.3. Реакция нейтрализации.

2.6. Молекулярно-биологические методы.

2.6.1. Выделение вирусной РНК.

2.6.2. Реакция обратной транскрипции.

2.6.3. Полимеразная цепная реакция.

2.6.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.6.5. Пробоподготовка ампликонов и секвенирование генома вируса краснухи.

2.6.6. Филогенетический анализ и компьютерный анализ нуклеотидиых последовательностей.

2.6.7. Количественное определение вируса.

2.7. Определение антител к вирусу краснухи методом иммуноферментного анализа (ИФА).

2.8. Статистическая обработка результатов исследования.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Биологическая характеристика дикого и атгенуированного вариантов штамма С-77 ВК (у^ и са).

3.1.1. Получение вирусного материала.

3.1.2. Анализ температурной чувствительности штаммов вируса краснухи.

3.1.3. Изучение и са вариантов штамма С-77 в иммунологическом маркерном тесте.

3.2. Выявление генетических маркеров аттенуации штамма С-77 вируса краснухи.

3.2.1. Подбор праймеров для секвенирования генома вируса краснухи и оптимизация условий проведения реакции ПЦР.

3.2.2. Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности генома дикого и атгенуированного вариантов ВК (штамм С-77).

3.2.3. Выявление и анализ мутаций, потенциально ответственных за холодовую адаптацию штамма С-77 вируса краснухи.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фенотипические и генетические маркеры холодовой адаптации вируса краснухи»

Актуальность проблемы

Краснуха - острое вирусное заболевание, характеризующееся пятнисто-папулезными высыпаниями на коже, слабовыраженными катаральными явлениями со стороны дыхательных путей и увеличенными периферическими лимфатическими узлами. Заболевание широко распространено как у детей, так и у взрослых. Актуальность и социальная значимость этой проблемы обусловлена способностью вируса краснухи вызывать у женщин во время беременности серьезную фетопатию (синдром врожденной краснухи - СВК), нередко заканчивающуюся выкидышем или рождением ребенка с различными тяжелыми пороками развития, такими как слепота, глухота, врожденные пороки сердца. По данным различных авторов, риск развития врожденных пороков органов зрения, слуха, сердечно-сосудистой системы и др. составляет 10% от общего числа врожденных аномалий [3, 102].

Заболевание у взрослых людей характеризуется более тяжелым течением, чем у детей, и нередко протекает с длительной лихорадкой, суставным синдромом, а также развитием органной патологии. Среди возможных осложнений встречаются краснушные энцефалиты, серозный менингит, полиневриты, тромбоцитопении и др.

Вакцинация является наиболее эффективным, экономичным и доступным средством борьбы с краснухой. В России вакцинация против краснухи введена в календарь прививок с 1998 г. Несмотря на все более широкое применение вакцины против краснухи, среди женщин детородного возраста сохраняется значительная неиммунная прослойка, что сохраняет угрозу появления случаев СВК. В связи с этим проблема профилактики СВК в настоящее время является весьма актуальной. Борьба с такими вирусными инфекциями, как краснуха, требует особого внимания по обеспечению полноты охвата соответствующими прививками, особенно в связи с поставленной ВОЗ задачей снижения частоты СВК (до 0.01 случаев и менее на 1000 родов).

В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации населения против краснухи используется вакцина зарубежного производства, созданная на основе штамма Wistar RA27/3 и впервые зарегистрированная в Европе в 1971 г. [94]. Для проведения широкомасштабной вакцинации в России и снижения издержек на закупку зарубежной вакцины требуется создание вакцины, основанной на отечественном вакцинном штамме.

В процессе создания вакцинных препаратов возникает необходимость решить ряд важнейших задач, среди них выбор клеточного субстрата для атте-нуации вируса и получения высокоактивного препарата, контроль специфической активности, безопасности препарата на всех стадиях производства.

С учетом массовости и повторности прививок против этой инфекции важны надлежащее качество применяемых вакцин и их низкая реактогенность. Особое значение имеет контроль генетической стабильности вакцинных штаммов. Такой контроль необходим, так как в процессе производства вакцин возможно накопление в геноме вакцинного вируса мутаций, способных привести к снижению или потере иммуногенных свойств вследствие гиператтенуации, а также к реверсии аттенуированного вируса к дикому штамму. Согласно рекомендациям ВОЗ, в особенности, для живых аттенуированных вакцин, следует проводить контроль генетической стабильности, поиск генетических маркеров аттенуации и подтверждение их наличия в вакцинных штаммах [125, 126]. С этой целью могут использоваться молекулярно-генетические методы. Так, например, для контроля нейровирулентности и генетической стабильности полиовирусной вакцины показано применение MAPREC-теста (mutant analysis by polymerase chain reaction and restriction enzyme cleavage), заключающегося в оценке содержания в вирусной популяции нейровирулентных мутантов, имеющих нуклео-тидную замену U на С в позиции 472 в 5'-нетранслируемом регионе РНК [12]. Контроль генетической стабильности предусмотрен производственным регламентом для вакцинного штамма холерного вибриона и вируса Денге [1, 127].

Механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью, поэтому актуальным является изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось выявление фенотипических и генетических детерминант аттенуации вируса краснухи на примере штамма С-77.

Для реализации поставленной цели требовалось решение следующих задач: биологическая характеристика дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи и выявление его фенотипических детерминант аттенуации; подбор праймеров для секвенирования генома вируса краснухи и оптимизация условий проведения ПНР; определение генотипа штамма С-77 вируса краснухи; полноразмерное секвенирование генома уЛ и са вариантов штамма С-77 вируса краснухи; сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей ^ и са вариантов штамма С-77 вируса краснухи и поиск его вероятных генетических маркеров аттенуации.

Научная новизна работы

Впервые в России осуществлен анализ геномов дикого и холодоадаптиро-ванного вариантов (са и \\1; варианты) вируса краснухи. Было проведено сравнение последовательностей геномов са и ^ вариантов штамма С-77, а также других известных последовательностей геномов вируса краснухи. На основании этого сравнения были установлены вероятные генетические маркеры атте-нуации, согласующиеся с современными представлениями о механизмах атте-нуации вируса краснухи. В частности, была обнаружена аминокислотная замена в позиции 1042 домена, кодирующего протеазу, которая играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа са варианта штамма С-77. С использованием современных вирусологических, иммунохимических и молекулярно-биологических методов установлены фенотипические маркеры аттенуации холодоадаптированного варианта штамма С-77 вируса краснухи.

Практическая значимость

Отработанные методические приемы выявления генетических и фенотипи-ческих маркеров аттенуации вируса краснухи, выявленные генетические и фенотипические маркеры аттенуации штамма С-77 могут быть использованы в научных исследованиях, а также для контроля вакцинных штаммов на производстве, разработки и характеристики новых вакцинных штаммов вируса краснухи.

Полученные в работе данные о механизмах аттенуации вируса краснухи могут быть использованы при разработке вакцинных препаратов. Вариант штамма С-77 на 39 пассаже обладает биологическими маркерами аттенуации: пониженной иммуногенностью на кроликах по сравнению с диким вариантом и холодоадаптированным фенотипом, что позволяет рассматривать его в качестве кандидата для разработки на его основе отечественной вакцины.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Варианты штамма С-77 на 39 и 46 пассаже обладают холодоадаптирован-ным фенотипом, то есть способны к эффективной репродукции при пониженной температуре.

2. Са и ^ варианты штамма С-77 обладают фенотипическими различиями, выражающимися в сниженной иммуногенности на кроликах и более интенсивной репродукцией при пониженной температуре холодоадаптиро-ванного варианта штамма С-77 по сравнению с диким вариантом.

3. В процессе холодовой адаптации штамма С-77 в геноме вируса произошло 13 нуклеотидных замен, 6 из которых вели к замене аминокислот. Часть из них уникальна и, возможно, определяет фенотипические отличия дикого и холодоадаптированного штамма.

4. Большая часть аминокислотных замен локализована в области, кодирующей неструктурные белки, в частности, протеазу и представляют особый интерес, так как мутации в этом регионе, по данным литературы, приводят к возникновению холодоадаптированного фенотипа и связаны с аттенуаци-ей вируса краснухи. Замена Туг на Суэ в позиции 1042 ОРС НСБ области, кодирующей протеазу, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа са варианта штамма С-77.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Дмитриев, Григорий Владимирович

Выводы

1. Показано, что варианты штамма С-77 (39 и 46 пассаж) обладают холодоа-даптированным фенотипом.

2. Установлены фенотипические различия дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи, выражающиеся в сниженной иммуногенно-сти на кроликах и различной интенсивности репродукции при пониженной температуре.

3. При сравнении геномов са и wt вариантов штамма С-77 обнаружено 13 нуклеотидных замен, 6 из которых приводили к замене аминокислот. 4 аминокислотные замены локализуются в области, кодирующей неструктурные белки, а 2 - в домене протеазы.

4. Четыре аминокислотные замены являются уникальными, что позволяет судить об их важной роли в приобретении холодоадаптированного фенотипа са варианта штамма С-77 или адаптации к новому хозяину (культуре клеток Vero).

5. Замена аминокислоты Туг на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ области, кодирующей протеазу, соответствующая нуклеотидной замене в позиции 3165, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа са варианта штамма С-77.

6. Вариант штамма С-77 на 39 пассаже по своим фенотипическим и генетическим характеристикам может рассматриваться в качестве кандидата для производства отечественной вакцины.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы: доктору биологических наук Борисовой Татьяне Константиновне и кандидату биологических наук Файзулоеву Евгению Бахтиеровичу за построение логики работы и помощь в интерпретации результатов.

Особуя благодарность автор выражает доктору медицинских наук Десятско-вой Р.Г. за предоставленный штамм вируса краснухи.

Автор выражает также большую благодарность сотрудникам лаборатории экспериментальной иммунологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова, в особенности, к.б.н Шухминой Н.Р., Аммур Ю.И., Тяблиной В.Т. и Клочковой О.П. за помощь и сотрудничество при проведении исследования.

Кроме того, за помощь в выполнении работы автор выражает благодарность к.б.н. Оксаничу A.C.

Заключенно

Вакцинация против краснухи применяется уже более сорока лет, за это время были разработаны и внедрены несколько вакцин, благодаря чему заболеваемость краснухой и СВК многократно снизилась [104]. В России в 2011 году заболеваемость краснухой достигла уровня 0.25 на 100 тыс. населения, в то время как в 2001 году данный показатель составлял 393,7 на 100 тыс. населения [9]. Тем не менее, получение отечественного вакцинного штамма вируса краснухи до сих пор остается актуальным. До сих пор мало изучены механизмы аттенуа-ции вируса краснухи. В работах отечественных и зарубежных авторов был установлен ряд фенотипических маркеров, характерных для аттенуированных штаммов вируса краснухи, в частности, морфология бляшек, особенности роста на разных культурах клеток, иммуногенетический маркер и са-фенотип [53, 70, 87, 108, 109]. Но о генетических механизмах аттенуации вируса краснухи до сих пор известно крайне мало, и нет единого мнения относительно роли в аттенуации тех или иных мутаций. Дальнейшее изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов, является по-прежнему актуальным.

В процессе аттенуации вакцинные штаммы вируса краснухи приобретают ряд фенотипических отличий от диких штаммов. Одним из важнейших фенотипических маркеров аттенуации является наличие са-фенотипа, т.е. способность эффективно репродуцироваться при пониженной температуре. Аттенуацию всех вакцинных штаммов вируса краснухи проводили при пониженной температуре, в результате чего все они приобрели са-фенотип [90]. В нашем исследовании была установлена достоверная разница интенсивности репродукции са39 и са46 вариантов штамма 0,-11 при температурах культивирования 33°С и 39°С, при отсутствии достоверной разницы для варианта, что подтверждает наличие у са варианта вируса биологического маркера аттенуации - холодоадаптированного фенотипа. Данный маркер аттенуации может быть использован для дифференцирования ослабленных и диких штаммов вируса краснухи, а также для контроля стабильности вакцинных штаммов на производстве вакцин против краснухи.

У ослабленного и холодоадаптированного варианта штамма С-77 выявлен иммунологический маркер аттенуации: уровень протективных антител к са39, также как и для вакцинного штамма ЯА 27/3, был достоверно ниже, чем таковой к дикому варианту штамма С-77. Наряду с холодоадаптированным фенотипом данный маркер аттенуации может быть использован на производстве для контроля вакцинных штаммов. Следует отметить, что са39 вариант обладал большей антигенностыо по сравнению с вакцинным штаммом ИА 27/3 - титр вируснейтрализующих антител при иммунизации животных вариантом са39 в 2-4 раза превышал титр вируснейтрализующих антител при иммунизации ре-ференс-препаратом. Учитывая полученные данные по биологической характеристике штамма вируса краснухи С-77, можно рассматривать са вариант штамма С-77 в качестве отечественного кандидата вакцинного штамма.

С целыо выявления вероятных генетических детерминант холодовой адаптации было проведено сравнение геномов и са39 вариантов штамма С-77 вируса краснухи. При сравнении геномов са и ^ вариантов штамма С-77 обнаружено 13 нуклеотидных замен, 6 из которых приводили к замене аминокислоты. Во фрагменте, кодирующем ОРС НСБ, было обнаружено 8 нуклеотидных замен, 4 из которых ведут к замене аминокислоты. Во фрагменте, кодирующем ОРС СБ, было обнаружено 5 нуклеотидных замен, 2 из которых ведут к замене аминокислоты (таблица 9).

Было проведено множественное выравнивание последовательностей са39 и вариантов штамма С-77 с известными последовательностями диких штаммов вируса краснухи, полученных из базы данных ИСВ1 ОепВапк. В результате было обнаружено, что четыре замены являются уникальными, т.е. в данных позициях ни у одного из диких штаммов вируса краснухи не обнаруживалось такой же аминокислоты за исключением 1 штамма (таблица 10). Две из них локализуются в позициях 3165 и 3357 в ОРС НСБ и приводят к заменам аминокислот, Tyrl042Cys и SerllOóThr в протеазе. Две других локализуются в позициях 6588 и 8199 ОРС СБ и приводят к заменам аминокислот Leu27Phe в белке С и Ala567Thr в белке Е2.

Таким образом, в результате сравнительного анализа полноразмерных геномов wt и са39 вариантов штамма С-77 были выявлены вероятные генетические детерминанты аттенуации вируса краснухи. 5 из 13, выявленных нами нуклео-тидных замен в позициях 2320, 6223, 7392, 7490 и 8957, приобретенных в процессе холодовой адаптации штамма С-77, по всей вероятности, являются случайными, так как не ведут к замене аминокислоты и не являются уникальными. Хотя полностью исключать их роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа штаммом С-77 нельзя. Две нуклеотидные замены в позициях 328 и 6064 также не ведут к замене аминокислот, но являются уникальными и поэтому представляют больший интерес. Нуклеотидная замена в позиции 164, сопровождается заменой аминокислоты Thr21Ser. Данная нуклеотидная замена не является уникальной, но аминокислота Ser в этой позиции находится у вакцинного штамма Wistar RA27/3 и не встречается ни у одного штамма-предка других вакцинных штаммов. Одна нуклеотидная замена в позиции 5360 ведет к замене аминокислоты, но не является уникальной. Наибольший интерес представляют нуклеотидные замены в позициях 3165, 3357, 6588, 8199, так как они ведут к замене на аминокислоты, нехарактерные для диких штаммов вируса краснухи, что рассматривается нами как свидетельство их вероятной роли в приобретении холодоадаптированного фенотипа са варианта штамма С-77 или адаптации к новому хозяину (клеткам Vero). Замена аминокислоты Туг на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ, соответствующая нуклеотидной замене в позиции 3165, по всей вероятности, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа са варианта штамма С-77, что согласуется с последними данными литературы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дмитриев, Григорий Владимирович, 2012 год

1. Вакцинопрофилактика. Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона методические указания. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. 3.3.1- МУ 3.3.1.2075-06.- 2006.-35с.

2. Вирусология. Методы: Пер. с англ./Под ред. Б. Мэйхи. М.: Мир, 1988. -344 с.

3. Десятскова, Р.Г., Мальцева H.H., Ведунова С.Д., Рахимова М.С. Лабораторная диагностика краснухи // Краснуха. Синдром врожденной краснухи: информационный сборник 1997-С. 17-24.

4. Забияка Ю.И., Файзулоев Е.Б., Борисова Т.К., и др. Экспресс-метод оценки титра вируса краснухи в вируссодержащей жидкости с помощью пцр-рв // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии — 2010,-№5.-С. 57-62.

5. Зверев В.В., Десятскова Р.Г., Юминова Н.В., Лоте В.Д., Степанов A.B. Лабораторная характеристика ослабленных вариантов отечественных штаммов вируса краснухи, адаптированных к культуре клеток Vero // Вакцинопрофилактика 2008 - 4(41) - С. 46-53

6. Зверев В.В. Du-Ping Zheng Ильясов Ю.Ю. Ярулин В.Р. Особенности генотипов вируса краснухи, циркулирующего в России // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2005- №6 С. 19-23.

7. Нетесов C.B., Тюнников Г.И., Петров B.C. и др. Анализ геномов двух изолятов вируса краснухи из вспышек 2004—2005 гг. в Западной Сибири // Вопросы вирусологии 2007 - № 2- С. 16-19.

8. Нетесов C.B., Тюнников Г.И., Петров B.C. и др. Генотипирование вируса краснухи, циркулирующего на территории Западной Сибири России в эпидемический период 2004 2006 годов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2007 - №6.- С. 26-29.

9. Основные направления профилактики инфекционных и паразитарных заболеваний. Краснуха. Материалы 10 съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -2012.-С. 24-25.

10. Петрова И.Д., Казаева Е.В., Малкова Е.М. и др. Клиническое, серологическое и молекулярно-биологическое исследование краснухи в Новосибирске в 2006 году// Инфекционные болезни 2007 - №3- С. 16-20.

11. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д. ПНР в реальном времени. -Бином, 2009. 223с.

12. Andino R., Rieckhof G. Е., Baltimore, D. A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5'-end of poliovirus RNA // Cell 1990 - № 63-P. 369-380.

13. Balistreri G., Caldentey J., Kaariainen L., Ahola T. Enzymatic defects of the nsP2 proteins of Semliki Forest virus temperature-sensitive mutants // Journal of Virology.- 2007.- №81 (6).- C. 2849-2860.

14. Bardeletti G., Kessler N., Aymard-Henry M. Morphology, biochemical analysis and neuraminidase activity of rubella virus // Archives of Virology 1975-№49(2-3).-P. 175-186.

15. Beatch M.D., Everitt J.C., Law L.J., Hobman T.C. Interactions between rubella virus capsid and host protein p32 are important for virus replication // Journal of Virology 2005 - №79 - P. 10807-20.

16. Best J. M., Rubella vaccines: past, present and future // Epidemiology and Infection.-^.-№107.-P. 17-30.

17. Best J. M., Cooray S., Banatvala J. E. Rubella. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections 10th edition, 2010- 3500 p.

18. Best J. M., Banatvala J. B., Bowen J. M. New Japanese rubella vaccine: comparative trials // British medical journal 1974- №3- P. 221-224.

19. Bowden D. S., Westaway E. G. Rubella virus: structural and non-structural proteins //Journal of General Virology.- 1984.- №65- P. 933-943.

20. Chantler J. K., Lund K. D., Miki N. P. et.al. Characterisation of rubella virus strain differences associated with attenuation // Intervirology.-1993.-№36.-P. 225-236.

21. Chen J.P., Strauss J.H., Strauss E.G., Frey T.K. Characterization of the rubella virus nonstructural protease domain and its cleavage site // Journal of Virology.- 1996.-№70(7).-P. 4707-13.

22. Chen M.H., Frey T.K. Mutagenic analysis of the 3' cis-acting elements of the rubella virus genome // Journal of Virology.- 1999.-73(4).- P. 3386-403.

23. Chen M.H., Frolov I., Icenogle J.P., Frey T.K. Analysis of the 3' cis-acting elements of rubella virus by using replicons expressing a puromycin resistance gene // Journal of Virology.-2004.-№78(5).-P. 2553-61.

24. Chen M.H., Icenogle J.P. Rubella virus capsid protein modulates viral genome replication and virus infectivity // Journal of Virology 2004- 78(8).- P. 4314-22.

25. Chen M.H., Icenogle J.P. Molecular virology of rubella virus. Rubella Viruses // Perspectives in medical virology 2006.-15 P. 1-18.

26. Clarke D. M., Loo T. W., Hui I., Chong P., Gillam S. Nucleotide sequence and in vitro expression of rubella virus 24S subgenomic messenger RNA encoding the structural proteins El, E2 and C // Nucleic Acids Research- 1987-№15(7).-P. 3041-3057.

27. Cordoba P., Lanoel A., Grutadauria S., Zapata M. Evaluation of antibodies against a rubella virus neutralizing domain for determination of immune status // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2000 - №7(6).- P. 964-6.

28. Dorsett P. H., Miller D. C., Green K. Y., Byrd, F. I. Structure and function of the rubella virus proteins // The Journal of Infectious Diseases 1985 - №7-P. 150- 156.

29. Dominguez G., Wang C.Y., Frey T.K. Sequence of the genome RNA of rubella virus P. evidence for genetic rearrangement during togavirus evolution // Virology.- 1990.-№177(1).-P. 225-38.

30. Doms R.W., Lamb R.A., Rose J.K., Helenius A. Folding and assembly of viral membrane proteins // Virology.- 1993,- №193(2).- P. 545-62.

31. Ehrengruber M.U., Renggli M., Raineteau O., et. al. Semliki Forest virus A7(74) transduces hippocampal neurons and glial cells in a temperature-dependent dual manner // Journal of neurovirology- 2003 №9(1).- P. 16-28.

32. Frey T.K. Molecular biology of rubella virus // Advances in Virus Research-1994.-№44.-P. 69-160.

33. Frey T. K., Straws J. H. Replication of Sindbis virus. VI. Poly(A) and poly(U) in virus-specific RNA species // Virology.- 1978- №86- P. 494-506.

34. Frey T.K, Wolinsky J.S. Rubella virus (Togaviridae). Encyclopedia of Virology (Granoff A, Webster RG, editors). San Diego: Academic Press 1999- P. 1592.

35. Frolov I., Schlesinger S. Translation of Sindbis virus mRNA: analysis of sequences downstream of the initiating AUG codon that enhance translation // Journal of Virology 1996.-№70.-P. 1182-90.

36. Forng R.Y., Atreya C.D. Mutations in the retinoblastoma protein-binding LXCXE motif of rubella virus putative replicase affect virus replication // Journal of General Virology.- 1999,-№80.-P. 327-32.

37. Forng R.Y., Frey T.K. Identification of the rubella virus nonstructural proteins //Virology.- 1995.-№206.-P. 843-53.

38. Hemphill, M. L., Forng, R.-Y., Abernathy, E. S., Frey, T. K. Time course of virus-specific macromolecular synthesis during rubella virus infection in Vero cells // Virology.-1988.-№162(l).-P. 65-75.

39. Hertz J. M., Huang H. V. Utilization of heterologous alphavirus junction sequences as promoters by Sindbis virus // Journal of Virology 1992- 66(2).-P. 857-864.

40. Hira L. Nakhasi I., Dexian Z. I., et. al. Rubella virus P. mechanism of attenuation in the vaccine strain (HPV77) // Virus Research.- 1989- №13(3).- P. 231-244.

41. Hobman T.C., Lemon H.F., Jewell K. Characterization of an endoplasmic reticulum retention signal in the rubella virus El glycoprotein // Virology .1997.-, №71(10).-P. 7670-80.

42. Hobman T.C., Lundstrom M.L., Mauracher C.A., et al. Assembly of rubella virus structural proteins into virus-like particles in transfected cells // Virology.- 1994.-№202(2).-P. 574-85.

43. Ho-Terry L., Cohen A. Rubella virus haemagglutinin: association with a single virion glycoprotein // Archives of Virology 1985 - №84(3-4).- P. 207215.

44. Hovi T. Release of rubella virus ribonucleic acid from ribonucleoprotein by polyanions //Journal of Virology.- 1972.-№9(5).-P. 879-882.

45. Howson C.P., Katz M., Johnston R.B., et al. Chronic arthritis after rubella vaccination//Clinical Infectious Diseases 1992-№15(2)-P. 307-12.

46. Ikemura T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms // Molecular Biology and Evolution 1985 - №2(1).- P. 13-34.

47. Kakizawa J., Nitta Y., Yamashita T., et. al. Mutations of rubella virus vaccine TO-336 strain occurred in the attenuation process of wild progenitor virus // Vaccine.-2001.-№19(4 (20-22).-P. 2793-802.

48. Kalkkinen N., Oker-Blom C., Pettersson R. F. Three genes code for rubella virus structural proteins El, E2a, E2b and C // Journal of General Virology.— 1984.-№65.-P. 1549-1557.

49. Kamer G., Argos P. Primary structural comparison of RNA-dependent polymerases from plant, animal and bacterial viruses // Nucleic Acids Research-1984.-№12.-P. 7269-82.

50. Karen D. L., Chantler J. K., Mapping of Genetic Determinants of Rubella Virus Associated with Growth in Joint Tissue // Journal of virology 2000-№74(2).-P. 796-804.

51. Katow S., Minahara H., Ota T. et al. Identification of strain-specific nucleotide sequences in El and NS4 genes of rubella virus vaccine strains in Japan // Vaccine.- 1997.-№15(14).-P. 1579-85.

52. Katow S., Sugiura A. Low pH-induced conformational change of rubella virus envelope proteins // Journal of General Virology-1988.- №69.- P. 2797-2807.

53. Kee S.H., Cho E.J., Song J.W., et al. Effects of endocytosis inhibitory drugs on rubella virus entry into Vero E6 cells // Microbiology and Immunology-2004.-№48(11).-P. 823-9.

54. Kozak M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs //Nucleic Acids Research.- 1987.-№15.-P. 8125-8148.

55. Kozak M. The scanning model for translation: an update // Journal of Cell Biology.- 1989.-№108.-P. 229-241.

56. Kuhn R.J., Zhang W., Rossmann M.G., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion // Cell 2002-№108.-P. 717-25.

57. Law L.M., Duncan R., Esmaili A., et. al. Rubella virus E2 signal peptide is required for perinuclear localization of capsid protein and virus assembly // Journal of Virology .-2001.-№75(4).-P. 1978-83.

58. Law L.M., Everitt J.C., Beatch M.D., et al. Phosphorylation of rubella virus capsid regulates its RNA binding activity and virus replication // Journal of Virology .-2003 .-№77.-P. 1764-71.

59. Lee J.Y., Bowden D.S. Rubella virus replication and links to teratogenicity // Clinical Microbiology Reviews.-2000.-№13.-P. 571-87.

60. Lee J-Y, Marshall J.A., Bowden D.S. Localization of rubella virus core particles in Vero cells // Virology.- 1999.- №265.- P. 110-9.

61. Levis R., Schlesinger S., Huang H. V. Promoter for Sindbis virus RNA-dependent subgenomic RNA transcription // Journal of Virology- 1990.-№64.-P. 1726-1733.

62. Liang Y., Gillam S. Mutational analysis of the rubella virus nonstructural polyprotein and its cleavage products in virus replication and RNA synthesis // Journal of Virology.-2000.-№74.-P. 5133-41.

63. Liang Y., Yao J., Gillam S. Rubella virus nonstructural protein protease domains involved in trans- and cis-cleavage activities // Journal of Virology — 2000,- №74.- P. 5412-23

64. Liang Y., Gillam S. Rubella virus RNA replication is cis-preferential and synthesis of negative- and positive-strand RNAs is regulated by the processing of nonstructural protein // Virology 2001.- №282 - P. 307-19.

65. Linnemann C.C., Jr., Hutchinson L., Rotte C.T., et.al. Stability of the Rabbit Immunogenic marker of RA27/3 Rubella vaccine virus after human passage // Infection and immunity.- 1974.-№9(3).-P. 547-549.

66. Liu Z., Yang D., Qui Z., et al. Identification of domains in rubella virus genomic RNA and capsid protein necessary for specific interaction // Journal of Virology.- 1996.-№70.-P. 2184-90.

67. Liu X., Ropp S.L., Jackson R.L., Frey T.K. The rubella virus nonstructural protease requires divalent cations for activity and functions in trans // Journal of Virology.- 1998.-№72 P. 4463-66.

68. Liu X., Yang J., Ghazi A.M., Frey T.K. Characterization of the zink binding activity of the rubella virus nonstructural protease // Journal of Virology.-2000.- №74.- P. 5949-56.

69. Lulla V., Merits A., Sarin P., et. al. Identification of mutations causing temperature-sensitive defects in Semliki Forest virus RNA synthesis // Journal of Virology.- 2006.- №80(6).- P. 3108-11.

70. Lundstrom M. L., Mauracher C. A., Tingle A. J. Characterization of carbohydrates linked to rubella virus glycoprotein E2 // Journal of General Virology-1991.-№72.-P. 843-850.

71. Magliano D., Marshall J.A., Bowden D.S., et al. Rubella virus replication complexes are virusmodified lysosomes // Virology 1998 - №240 - P. 57-63.

72. Marr L. D., Sanchez A., Frey T. K. Efficient in vitro translation and processing of the rubella virus structural proteins in the presence of microsomes // Virology.- 1991.-№180.-P. 400-405.

73. McAleer W. J., Markus H. Z., McLean A. A., et.al. Stability on storage at various temperatures of live measles, mumps and rubella virus vaccines in new stabilizer//Journal of biological standardization 1980-№8-P. 281-287.

74. Meyer IT.M., Jr., Parkman P.D., Panos T.C. Attenuated rubella virus. II. Production of an experimental live-virus vaccine and clinical trial // The New England Journal of Medicine.- 1966.-№275(11).-P. 575-80.

75. Miki N. P., Chantler J. K. Differential ability of wild-type and vaccine strains of rubella virus to replicate and persist in human joint tissue // Clinical and Experimental Rheumatology.- 1992-№10-P. 3-12.

76. Moss B., Elroy-Stein O., Mizukami T., et.al. Product review. New mammalian expression vectors //Nature 1990-№348,-P. 91-92.

77. Myles K.M., Pierro D.J., Olson K.E. Deletions in the putative cell receptor-binding domain of Sindbis virus strain MRE16 E2 glycoprotein reduce midgut infectivity in Aedes aegypti // Journal of Virology.- 2003.- №77.- P. 8872-81.

78. Nakhasi H. L., Cao X-Q., Rouault T. A., Liu T.-Y. Specific binding of host cell proteins to the 3'-terminal stem-loop structure of rubella virus negativestrand RNA // Journal of Virology.- 1991.- №65.- P. 5961-5967.

79. Nakhasi H.L., Ramanujam M., Atreya C.D., et al. Rubella virus glycoprotein interaction with the endoplasmic reticulum calreticulin and calnexin // Archives of Virology.- 2001.- № 146.- P. 1-14.

80. Niesters H. G. M., Strauss J. H. Mutagenesis of the conserved 51-nucleotide region of Sindbis virus //Journal of Virology- 1990-№64-P. 1639-1647.

81. Noriyuki O., Hitoshi A., Torn K., et.al. Elucidation of the full genetic information of Japanese rubella vaccines and the genetic changes associated with in vitro and in vivo vaccine virus phenotypes 11 Vaccine 2011- №29 - P. 18631873.

82. Oker-Blom C., Kalkkinen N., Kaariainen L., Pettersson R. F. Rubella virus contains one capsid protein and three envelope glycoproteins, El, E2a, and E2b // Journal of Virology.- 1983.-№46 P.-. 964-973.

83. Oker-Blom C., Ulmanen I., Kaariainen L., Pettersson, L. Rubella virus 40S genome RNA specifies a 24S subgenomic mRNA that codes for a precursor to structural proteins // Journal of Virology 1984.- №49.- P. 403-408.

84. Ohtawara M., Kobune F., Umino Y., Sugiura A. Inability of Japanese rubella vaccines to induce antibody response in rabbits is due to growth restriction at 39 degrees C // Archives of Virology.- 1985.- №83(3^1).- P. 217-27.

85. Pappas C.L., Tzeng W.P., Frey T.K. Evaluation of cis-acting elements in the rubella virus subgenomic RNA that play a role in its translation // Archives of Virology.- 2005.- № 151 (2).- P. 327-46.

86. Payment P., Ajdukovic D., Pavilanis V. Rubella virus. I. Morphology and structural proteins // Canadian Journal of Microbiology- 1975 №21- P. 703-709.

87. Perrenoud G., Messerli F., Thierry A-C, et al. A recombinant rubella virus El glycoprotein as a rubella vaccine candidate // Vaccine.- 2004 №23 - P. 4808.

88. Plotkin S.A., Beale A.J. Production of RA27/3 rubella vaccine and clinical results with the vaccine // Journal of Developmental Biology 1976 - №37 - P. 291-6

89. Plotkin S.A., Farquhar J.D., Ogra P.L. Immunologic properties of RA27-3 rubella virus vaccine. A comparison with strains presently licensed in the United States // The Journal of the American Medical Association 1973 - №225(6).-P. 585-90.

90. Polo J. M., R. E. Johnston. Attenuating mutations in glycoproteins El and E2 of Sindbis virus produce a highly attenuated strain when combined in vitro // Journal of Virology.- 1990.-№64.-P. 4438^1444.

91. Pugachev K.V., Abernathy E.S., Frey T.K. Genomic sequence of the RA27/3 vaccine strain of rubella virus // Archives of Virology 1997 - №142(6).- P. 1165-80.

92. Pugachev K.V., Frey T.K. Effects of defined mutations in the 5 nontranslated region of rubella virus genomic RNA on virus viability and macromolecule synthesis //Journal of Virology.- 1998.-№72.-P. 641-50.

93. Pugachev K.V., Tzeng W-P, Frey T.K. Development of a rubella virus vaccine expression vector: use of a picornavirus internal ribosome entry site increases stability of expression // Journal of Virology 2000 - №74 - P. 10811-5.

94. Qui Z., Yao J., Cao H., Gillam S. Mutations in the El hydrophobic domain of rubella virus impair virus infectivity but not virus assembly // Journal of Virology.- 2000.- №74.- P. 6637-42.

95. Ramanujam M., Hofmann J., Nakhasi H.L., Atreya C.D. Effect of site-directed asparagine to isoleucine substitutions at the N-linked El glycosylation sites on rubella virus viability // Virus Research 2001№81- P. 151-6.

96. Robertson S.E., Featherstone D.A., Gacic-Dodo M., Hersh B.S. Rubella and congenital rubella syndrome: global update // Revista Panamericana de Salud Publica — 2003-№14.- P. 306-15.

97. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints // American journal of hygiene .- 1938.- 21.- P. 493^197.

98. Reef S.E., Frey T.K., Theall K., et al. The changing epidemiology of rubella in the 1990s: on the verge of elimination and new challenges for control and prevention // The Journal of the American Medical Association 2002 - №287-P. 464-72.

99. Risco C., Carrascosa J.L., Frey T.K. Structural maturation of rubella virus in the Golgi complex // Virology.- 2003.- №312.- P. 261-9.

100. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing Guide Trees // Molecular Biology and Evolution 1987 - №4 - P. 406-425.

101. Sakata M., Komase K., Nakayama T., Histidine at position 1042 of the pl50 region of a Takahashi vaccine live attenuated rubella vaccine strain is responsible for the temperature sensitivity // Vaccine 2009 - №27 - P. 234-242.

102. Sakata M., Nakayama T., Protease and helicase domains are related to the temperature sensitivity of wild-type rubella viruses // Vaccine- 2011-№29(5).-P. 1107-1113.

103. Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proceedings of the national academy of sciences 1977 - №74-P. 5463-5467.

104. Schluter B., Bellomy B., Brown A. Pathogenesis of temperature-sensitive mutants of sindbis virus in the embryonated egg. I. Characterization and kinetics of viral multiplication // Infection and Immunity 1974 - №9(1).- P. 68-75.

105. Sedman S. A., Gelembiuk G. W., Mertz J . E. Translation initiation at a downstream AUG occurs with increased efficiency when the upstream AUG is located very close to the 5' cap // Journal of Virology 1990 - №64- P. 453457.

106. Sedwick W. D., Sokol F. Nucleic acid of rubella virus and its replication in hamster kidney cells // Journal of Virology 1970.- №5.- P. 478-489.

107. Shishido A., Ohtawara M. Development of attenuated rubella virus vaccines in Japan // Japanese Journal of Medical Science & Biology 1976.-№29(5).- P. 227-53.

108. Strauss, J. H., and E. G. Strauss. The alphaviruses: gene expression, replication and evolution // Microbiology Reviews 1994 - №58 - P. 491-562.

109. Tzeng W-P, Chen M-H, Derdeyn C.A., Frey T.K. Rubella virus DI RNAs and replicons: requirement for nonstructural proteins acting in cis for amplification by helper virus // Virology.- 2001.- №289.- P. 63-73.

110. Tzeng W-P, Frey T.K. Mapping the rubella virus subgenomic promoter // Journal of Virology.- 2002.- №76.- P. 3189-201.

111. Tzeng W-P, Frey T.K. Complementation of a deletion in the rubella virus PI50 nonstructural protein by the viral capsid protein // Journal of Virology.-2003.-№77.-P. 9502-10.

112. Voiland A., Bardeletti G. Fatty acid composition of rubella virus and BHK21/13S infected cells // Archives ofVirology.- 1980.- №64,- P. 319-328.

113. Wang X., Gillam S. Mutations in the GDD motif of rubella virus putative RNA-dependent RNA polymerase affect virus replication // Virology 2001 -№285.-P. 322-31.

114. WHO. Weekly epidemiological record. Update of standard nomenclature for wild-type rubella viruses.- 2007. №82(24).- P. 216-222.

115. WHO. Weekly epidemiological record. Standardization of the nomenclature for genetic characteristics of wildtype rubella viruses. 2005. №80(14).- P. 126-132.

116. WHO Expert Committee on Biological Standardization Technical Report Series No 941. Annex 5 WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza pandemic vaccines. 2007-P.-265-301.

117. WHO Expert Committee on Biological Standardization Technical Report Series No 941. Annex 5 WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza pandemic vaccines. 2007-P.- 265-301.

118. WHO Expert Committee on Biological Standardization. // Technical Report, Series №. 924. Annex 1 Guidelines on clinical evaluation of vaccines: regulatory expectations. 2004 P.- 35-101.

119. WHO Meeting Report Working Group on Technical Specifications for Manufacture and Evaluation of Dengue Vaccines Geneva, Switzerland. Quality Control Aspects of Manufacturing Live Recombinant Dengue Vaccines. 11-12 May 2009.- P.l-36.

120. Will C., Muhlberger E., Linder D., et. al. Marburg virus gene 4 encodes the virion membrane protein, a type I transmembrane glycoprotein // Journal of Virology.- 1993.-№67/-P. 1203-1210.

121. Wiley D. C. Fundamental Virology (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.), 1986.- 768 p.

122. Yao J., Gillam S.A. single-amino-acid substitution of a tyrosine residue in the rubella virus El cytoplasmic domain blocks virus release // Journal of Virology.- 2000.- №74.- P. 3029-36.

123. Yao J., Yang D., Chang P., et. al. Proteolytic prosessing of rubella virus nonstructural proteins // Virology 1998 - №246 - P. 74-82.

124. Zheng D. P., Frey T. K., Icenogle J., et. al. Global distribution of rubella virus genotypes //Emerg Infect.-2003.-№9.-P. 1523-1530

125. Zheng D-P, Zhou Y.M., Zhao K., et al. Characterization of genotype II Rubella virus strains // Archives of Virology.- 2003 №148.- P. 1835-50.

126. Zhou Y., Tzeng W.P., Ye Y., Huang Y, Li S, Chen Y, et al. A cysteine-rich metalbinding domain from rubella virus non-structural protein is essential for viral protease activity and virus replication // Biochemical Journal 2009-№417(2).-P. 477-83.

127. Zhou Y., Tzeng W.P., Wong H.C., et. al. Calcium-dependent association of calmodulin with the rubella virus nonstructural protease domain // The Journal of Biological Chemistry.-2010.-№285(12) P. 8855-68.

128. Zhou Y., Ushijima H., Frey T.K. Genomic analysis of diverse rubella virus genotypes //Journal of General Virology.- 2007 №88(3) - P. 932^11.6vr)