Молекулярные механизмы холодоадаптации и реверсий к TS+фенотипу вирусов гриппа A и B тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Цфасман, Татьяна Михайловна

• Цфасман, Татьяна Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Цфасман, Татьяна Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Живые противовирусные вакцины — проблемы и преимущества.

1.1.1. Общая характеристика живых противовирусных вакцин.

1.1.2. Проблемы, связанные с применением живых противовирусных вакцин.

1.1.3. Способы улучшения живых противовирусных вакцин.

1.2. Вирус гриппа: строение вириона и геном.

1.3. Генетика вируса гриппа.

1.3.1. Мутационная изменчивость.

1.3.2. Рекомбинационная изменчивость.

1.3.3. Экстрагенные и интрагенные супрессии.

1.4. Живые холодоадаптированные гриппозные вакцины.

1.4.1. Получение живых гриппозных вакцин.

1.4.2. Механизмы аттенуации ХА штаммов-доноров для производства ЖГВ.

1.4.3. Генетическая стабильность аттенуированных штаммов и вакцин, полученных на их основе.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Лабораторные штаммы вирусов.

2.1.3. Клеточные линии и куриные эмбрионы.

2.2. Методы.

2.2.1. Работа с культурами клеток.

2.2.2. Определение инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопление вирусов для последующих опытов.

2.2.3. Получение ХА вариантов штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87.

2.2.4. Получение ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А (А/Краснодар/101/35/59 и А/Ленинград/134/47/57) и ХА штамма вируса гриппа В (В/Виктория/2/41/87).

2.2.5. Клонирование ХА штаммов и ts+ ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 методом бляшек.!.

2.2.6. Оценка патогенности вирусов для мышей.

2.2.7. Комплементационно-рекомбинационный тест.

2.2.8. Очистка вируса и выделение вирионной РНК.

2.2.9. Получение ПЦР-продуктов для последующего секвенирования или ПЦР-рестрикционного анализа.

2.2.10. ПЦР-рестрикционный метод.

2.2.11. Очистка ПЦР-продуктов.

2.2.12. Секвестрование.

2.2.13. Статистическая обработка результатов опытов по оценке патогенности вирусов для мышей.

2.2.14. Компьютерное обеспечение.

Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ ВИРУСОВ ГРИППА А И В НА МОДЕЛИ ХА МУТАНТОВ ШТАММОВ А/КРАСНОДАР/101/59 И В/ВИКТОРИЯ/2/87.

3.1. Биологические свойства и мутации в геноме ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) - потомка эпидемического штамма А/Краснодар/101/59.

3.2. Биологические свойства и мутации в геноме ХА вариантов штамма В/Виктория/2/87.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕВЕРСИЙ ХА ШТАММОВ К ts+ ФЕНОТИПУ.

4.1. Получение и биологические свойства ts+ ревертанта ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

4.2. Получение и биологические свойства ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59.

4.3. Получение и биологические свойства ¿5+ ревертанта ХА штамма В/Виктория/2/41/87.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные механизмы холодоадаптации и реверсий к TS+фенотипу вирусов гриппа A и B»

Актуальность проблемы.

Вакцинопрофилактика является важнейшим способом борьбы с эпидемиями гриппа. Наряду с инактивированными вакцинами, широко используются живые вакцины против гриппа (ЖГВ) [Гендон, 2004].

Применение живых противовирусных вакцин связано с риском возникновения вакциноассоциированного заболевания в результате реверсии фенотипа или селекции более патогенных вариантов из гетерогенной популяции вакцинного штамма [Murphy B.R. and Chanock, 2001]. Таким образом, чрезвычайно важными являются исследования стабильности фенотипа вакцинных штаммов в разных условиях и контроль генетической однородности популяции вакцинного штамма, а также изучение механизмов, приводящих к аттенуации вакцинных штаммов.

Для получения живых гриппозных вакцин используют холодоадаптированные (ХА) штаммы. Основными фенотипическими маркёрами, которые определяют аттенуацию ХА штаммов, являются са и ts фенотип, т.е. способность к эффективной репродукции при пониженной (26°С) и неспособность к репродукции при повышенной (39-40 С) температуре [Александрова и Климов, 1994; Ambrose et al., 2008]. Считается, что са, ts и аттенуированный фенотип ХА штаммов стабилен благодаря мутациям в генах, кодирующих внутренние белки вириона (РВ2, РВ1, РА, NP, М1/М2 и NS1/NS2), приобретённым этими штаммами в процессе адаптации к пониженной температуре [Jin et al., 2003; Jin et al., 2004a; Hoffmann et al., 2005; Kiseleva et al., 2004a; Kiseleva et al., 2010; Klimov et al., 1992].

Несмотря на то, что живые гриппозные вакцины на основе ХА штаммов в течение многих лет используются в России и в США, механизмы адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре до сих пор изучены недостаточно. Роль различных генов в аттенуации ХА штаммов исследована лишь для четырёх штаммов, которые используются для производства вакцины: А/Энн Арбор/6/60, В/Энн Арбор/1/66, А/Ленинград/134/17/57, В/СССР/60/69 [Jin et al., 2003; Jin et al., 2004a; Hoffmann et al., 2005; Kiseleva et al., 2004a; Kiseleva et al., 2010]. Среди этих четырёх штаммов наиболее подробно изучены штаммы А/Энн Арбор/6/60 и В/Энн Арбор/1/66: известно, какой минимальный набор мутаций требуется для проявления са, ts и аттенуированного фенотипа этих штаммов и какие этапы жизненного цикла вируса нарушены в связи с этими мутациями [Jin et al., 2003; Jin et al., 2004a; Hoffmann et al., 2005; Chan et al., 2008; Chen et al., 2006; Chen et al., 2008]. Для двух других штаммов — А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, полученных на основе одного и того же предкового штамма — известно, какие именно мутации произошли в процессе адаптации этих штаммов к пониженной температуре (для остальных штаммов неизвестны соответствующие предковые дикие штаммы, с которыми можно было бы провести сравнение) [Медведева и др., 1991; Ghendon et al., 1984; Herlocher et al., 1993; KlimovetaL, 1992].

Неясно, есть ли определённые локусы, в которых возникают мутации при адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре или подобная адаптация и, соответственно, сходный фенотип ХА штаммов, может быть обусловлен различным сочетанием мутаций в разных генах? Всегда ли важные для поддержания ts, са и аттенуированного фенотипа мутации возникают в консервативных участках белков? В таком случае, большая часть подобных мутаций должны быть уникальными для ХА штаммов по сравнению с эпидемическими штаммами вируса гриппа.

Известно, что темпы накопления мутаций для вирусов гриппа В ниже, чем для вирусов гриппа А. Проблема различия темпов накопления мутаций вирусами гриппа А и В в процессе адаптации к пониженной температуре и обратной адаптации ХА штаммов к повышенной температуре требует дальнейшего изучения.

Как было сказано выше, аттенуированный фенотип ХА штаммов стабилен благодаря мутациям во всех внутренних генах этих штаммов. Существует ряд методов, контролирующих сохранность этих мутаций, однако все эти методы имеют свои ограничения. Так, ПЦР-рестрикционный метод, применявшийся в том числе для контроля стабильности генома изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей, не позволяет судить о возможном накоплении в геноме ХА штамма дополнительных супрессорных мутаций.

В связи с этим возникает вопрос, действительно ли са и аттенуированный фенотип ХА штаммов связан только с сохранностью вышеупомянутых мутаций и возможна ли реверсия фенотипа ХА штаммов без реверсии этих мутаций, за счёт экстра- или интрагенной суппрессии?

Несмотря на подтверждённую стабильность фенотипа ХА штаммов вируса гриппа т у1уо, неясно, при каких условиях возможна реверсия фенотипа подобных штаммов и достижимы ли эти условия во время репликации вируса в организме человека. Неизвестно, какие мутации могут обусловить подобную реверсию и какую роль в реверсии фенотипа ХА штаммов будут играть истинные реверсии мутаций, присутствовавших в геноме ХА штаммов.

Получить ответ на эти вопросы чрезвычайно важно прежде всего с точки зрения безопасности применения живой гриппозной вакцины.

Цели и задачи исследования.

Основной целью работы было изучение молекулярных механизмов холодоадаптации и реверсий вирусов гриппа А и В.

В первой части работы планировалось получить и охарактеризовать новые ХА штаммы вируса гриппа А и В — кандидаты в штаммы-доноры аттенуации для получения ЖГВ.

Вторая часть работы заключалась в изучении молекулярных механизмов реверсий к ts+ фенотипу ХА штаммов-доноров аттенуации для живых гриппозных реассортантных вакцин на модели полученных в лаборатории ts+ ревертантов ХА штаммов А/Ленинград/134/47/57, А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить ХА варианты штаммов вируса гриппа на основе эпидемических штаммов А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87 путём пассажей при пониженной температуре и изучить их ts, са и аттенуированный фенотип, а также мутации, приобретённые за время пассажей при пониженной температуре.

2. Получить ts+ ревертанты ХА штаммов А/Ленинград/134/47/57, А/Краснодар/101/3 5/59 и В/Виктория/2/41/87 путём пассажей данных штаммов при постепенно повышающихся температурах и изучить их са и аттенуированный фенотип.

3. Оценить эффективность методов комплементационно-рекомбинационного и ПЦР-рестрикционного анализа для контроля стабильности ts мутаций в геноме ХА штаммов и для обнаружения истинных реверсий и супрессорных мутаций на модели ревертанта ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

4. Методом секвенирования выявить истинные реверсии ts и са мутаций и супрессорные мутации, возникшие в геноме £у+ ревертанта штамма А/Ленинград/134/47/57 и одного из ts+ ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 в процессе пассажей при повышенной температуре.

Научная новизна работы.

Изучение фенотипа новых ХА штаммов и мутаций в их геноме вносит существенный вклад в понимание механизмов аттенуации вируса гриппа.

Впервые показана возможность получения ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа в лабораторных условиях и показана роль как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций в реверсии к фенотипу ХА штаммов вируса гриппа.

Практическая значимость.

1. Полученные и охарактеризованные в работе ХА штаммы А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 могут быть предложены как штаммы-кандидаты для получения живой гриппозной вакцины.

2. Показано, что для эффективного контроля генетической стабильности и безопасности ХА штаммов-доноров аттенуации вируса гриппа целесообразно комбинированное применение нескольких методов исследования, например, ПЦР-рестрикционного метода и комплементационно-рекомбинационного метода.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ХА штаммы А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87 могут быть исследованы в качестве новых доноров для получения живой вакцины против гриппа, производимой на куриных эмбрионах или в культуре клеток МОСК.

2. Са, ¿у и аттенуированный фенотип ХА штаммов может быть обусловлен различным сочетанием мутаций в разных генах. Мутации в ХА штаммах А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 были уникальными для этих штаммов по сравнению с другими известными ХА штаммами. Большая часть накопленных за время адаптации к пониженной температуре мутаций специфична для данного ХА штамма и не встречается у эпидемических штаммов вируса гриппа.

3. ХА штаммы вируса гриппа обладают большой степенью фенотипической стабильности. Реверсия ts фенотипа этих штаммов происходит только при условиях, которые не достижимы во время репликации в организме человека (большое количество пассажей при постепенно повышающихся температурах). Данные условия позволяют получить ts+ ревертант ХА штамма, который, тем не менее, может при этом обладать частичным са и аттенуированным фенотипом, что дополнительно подтверждает стабильность фенотипа ХА штаммов.

4. Для реверсии фенотипа ХА штаммов важны как истинные реверсии, так и суппрессорные мутации. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и суппрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

5. Для адаптации вирусов гриппа В к пониженной температуре требуется большее количество пассажей, по сравнению с вирусами гриппа А, что подтверждается результатами этой работы и исследованиями других учёных. Тем не менее, наши данные по получению ревертантов ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87 позволяют предположить, что вирусы гриппа А и В имеют сравнимые темпы обратной адаптации к повышенной температуре.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Цфасман, Татьяна Михайловна

ВЫВОДЫ:

1. ХА штаммы вируса гриппа А/Краснодар/101/3 5/59 и В/Виктория/2/63/87 обладают са, ts и att фенотипом и могут быть предложены в качестве кандидатов штаммов-доноров для производства живых гриппозных вакцин.

2. Большая часть мутаций, ответственных за ts и са фенотип, в ХА штаммах вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 расположены в консервативных участках белков.

3. Не наблюдается корреляции в расположении уникальных замен в геноме ХА штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 и в геноме ХА штаммов, полученных другими исследователями.

4. Для адаптации штамма вируса гриппа В/Виктория/2/87 к пониженной температуре потребовалось в два раза больше пассажей по сравнению со штаммом А/Краснодар/101/59, однако темпы реверсии вирусов гриппа А и В к ts+ фенотипу оказались сравнимыми.

5. ХА штаммы вируса гриппа А и В обладают высокой стабильностью са и ts фенотипа.

6. Реверсия ts фенотипа ХА штаммов вируса гриппа А и В не всегда сопровождается реверсией са фенотипа и утерей аттенуированного фенотипа.

7. Реверсии ts фенотипа ХА штаммов вируса гриппа обусловлены появлением как истинных реверсий, так и интра- или экстрагенных супрессорных мутаций в отдельных генах.

8. Реверсия ts мутации в N8 гене ts+ ревертанта штамма А/Ленинград/134/47/57 обусловлена явлением экстрагенной супрессии, а реверсия ts мутации в гене — экстра- или интрагенной супрессией.

9. Реверсия ts фенотипа ХА штаммов обусловлена как истинными реверсиями, так и супрессорными мутациями. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, д.м.н. Маркушину Станиславу Георгиевичу за постановку темы, обучение в процессе работы, ценные советы на всём протяжении работы и моральную поддержку.

Автор выражает благодарность д.м.н. Гендону Юрию Захаровичу за помощь в интерпретации результатов работы и ценные замечания по поводу полученных результатов на всём протяжении работы.

Автор выражает благодарность к.б.н. Акоповой Ирине Ивановне за помощь в получении ХА штаммов вируса гриппа А и В и в изучении их фенотипа.

Автор выражает благодарность к.б.н. Файзулоеву Евгению Борисовичу за помощь в подборе праймеров, подготовке ПЦР-продуктов и анализе результатов секвенирования ХА штаммов, а также за ценные советы.

Автор выражает благодарность к.б.н. Коптяевой Ирине Борисовне за помощь в культивировании клеток МЕ)СК.

Автор выражает благодарность всем остальным сотрудникам лаборатории РНК-содержащих вирусов за поддержку.

Автор выражает отдельную благодарность Илье Иткину за помощь в литературной правке текста работы.

Автор выражает благодарность рецензентам работы к.б.н. Файзулоеву Евгению Борисовичу и к.м.н. Ганковской Оксане Анатольевне за внимательное чтение работы и за ценные замечания по сути работы и по поводу её текста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе путём пассажей при пониженной температуре были получены ХА штаммы А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87. Было показано, что эти штаммы обладают са и ¿у фенотипом и не уступают по своему фенотипу ХА штаммам, используемым в настоящее время для поизводства живой гриппозной вакцины. Как показали опыты на мышах, вирулентность полученных штаммов была снижена по сравнению с исходными дикими штаммами. Таким образом, можно утверждать, что целесообразно дальнейшее изучение возможности применения ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 в качестве штаммов-доноров аттенуации для производства живой гриппозной вакцины.

Изучение мутационных изменений в геноме ХА штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 показало, что адаптация к пониженной температуре может быть обусловлена различными мутациями. Не было замечено никакой корреляции между набором мутаций в ХА штаммах А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 по сравнению с ранее изученными ХА штаммами. При этом подавляющее число мутаций в геноме ХА штаммов уникальны для ХА штамма (то есть не встречаются у эпидемических штаммов вируса гриппа), что говорит о том, что мутации, отвечающие за са, Лу и аП фенотип возникают в консервативных (и, соответственно, функционально важных) участках белков.

Изучение молекулярных механизмов реверсий ХА штаммов к £у+ фенотипу указывает на высокую стабильность фенотипа ХА штаммов, в том числе аттенуированного фенотипа. Реверсия фенотипа ХА штаммов возможна в условиях, которые не достижимы во время репликации вируса в организме человека (более 10 пассажей при повышении температуры на 1-2°С через каждые 2-3 пассажа). При этом реверсия ¿у фенотипа не всегда приводит к реверсии са и аМ фенотипа, что подтверждает данные литературы о том, что за са, и аи фенотип отвечают мутации в различных участках генома ХА штаммов вирусов гриппа А и В.

Наши данные говорят о том, что реверсии ¿у фенотипа ХА штаммов обусловлены появлением как истинных реверсий, так и интра- или экстрагенных супрессорных мутаций. Было показано, что ¿у мутации в генах n8 и 1чпр ревертанта АУЛенинград/134/47/57/Яеу были супрессированы другими мутациями, возникшими в геноме ревертанта, причём в случае N8 гена произошла экстрагенная супрессия мутации, а в случае гена полученные данные не позволяют сделать вывод о природе супрессии.

Поскольку в реверсии ts фенотипа вакцинных штаммов могут играть роль как истинные реверсии, так и супрессорные мутации, для контроля стабильности фенотипа ХА вакцинных реассортантных штаммов вируса гриппа более целесообразно секвенирование всех внутренних генов изолятов ХА штаммов или комплексное применение ПЦР-рестрикционного метода и комплементационно-рекомбинационного метода. Сочетание этих методов позволит делать выводы как о прямых реверсиях мутации, так и о возможных супрессорных мутациях, не давая при этом информации о экстра- или интрагенной природе супрессий.

Интересно отметить, что для адаптации вирусов гриппа В к пониженной температуре требуется приблизительно в два раза больше пассажей по сравнению с вирусами гриппа А, что подтверждается данными литературы и результатами данной работы. Однако, наши данные по изучению ревертантов ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 говорят в пользу того, что вируса гриппа А и В имеют сравнимые темпы реверсии к фенотипу, то есть сравнимые темпы обратной адаптации к повышенной температуре.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Цфасман, Татьяна Михайловна, 2010 год

1. Александрова Г.И., Климов А.И. (1994) Живая вакцина против гриппа. //СПб.: Наука, 151с.

2. Белов Г.А. (2002) Практикум по общей вирусологии: Учеб. пособие п/ред. И.Г. Атабекова, 2-е изд.//М.: Издательство МГУ, 184 с.

3. Гендон Ю.З. (2004) Преимущества и недостатки инактивированной и живой вакцины против гриппа. //Вопросы вирусологии, 49(4): 4-12.

4. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Климов А.И. (2007) Определение состава генома реассортантных холодоадаптированных штаммов вируса гриппа В методом рестриктазного анализа //Вопросы вирусологии, 52(3): 16-19.

5. Киселёва И.В, Григорьева Е.П., Найхин А.Н., Иванова В.В., Ларионова Н.В. и др. (2003) Температурочувствительность эпидемических вирусов гриппа А как возможный маркёр иммуногенности реассортантных вакцинных штаммов. //Вопросы вирусологии, 48(4): 2629.

6. Киселёва И.В., Климов А.И. (2002) Анализ мутаций в геноме холодадаптированных штаммов вируса гриппа А с использованием расширенной модификации ПЦР-рестриктного метода. //Вопросы вирусологии, 47(6): 24-27.

7. Медведева Т.Е., Романова Ю.Р., Гущина М.И., Руденко Л.Г., Гендон Ю.З. и др. (1990) Ts фенотип реизолятов от детей, привитых живой холодоадаптированной гриппозной вакциной типа А. //Вопросы вирусологии, 35(2): 105-108.

8. Неведомская Г.Н., Медведева Т.Е., Жихарёва И.В., Климов А.И., Александрова Г.И. (1992) Оценка степени аттенуации холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А на моделях мышей линии СВА и сирийских хомячков. //Вопросы вирусологии, 37(1): 37-40.

9. Сейбиль В.Б., Малышкина Л.П. (2005) Всемирная организация здравоохранения и проблема ликвидации инфекционных заболеваний в мире. //Вопросы вирусологии, 50(3): 60-63.

10. Шубладзе А.К. и Гайдамович С.Я. (1954) Краткий курс практической вирусологии. Изд 2-е, переработанное и дополненное. // М.: Гос. изд-во мед. лит-ры. Медгиз, 380 с.

11. Яковенко М. Л., Короткова Е. А. (2008) Эволюция вакцинных штаммов полиовируса. //Вопросы вирусологии, 53(3): 45-48.

12. Afzal М.А., Pickford A.R., Forsey Т., Heath А.В., Minor P.D. (1993)The Jeryl Lynn vaccine strain of mumps virus is a mixture of two distinct isolates. Journal of General Virology, 74( Pt 5): 917-920.

13. Albo C., Valencia A., Portela A. (1995) Identification of an RNA binding region within the N-terminal third of the influenza A virus nucleoprotein. //Virology, 69(6): 3799-3806.

14. Ambrose C.S., Luke C., Coelingh K. (2008) Current status of live attenuated influenza vaccine in the United States for seasonal and pandemic influenza. //Influenza and other respiratory viruses, 2(6): 193-202.

15. Biswas S.K., Boutz P.L., Nayak D.P. (1998) Influenza virus nucleoprotein interacts with influenza virus polymerase proteins. //Virology, 72(7): 5493-5501.

16. Blinov V.M., Kiselev O.G. (2006) Molecular mechanism of recombination and evolution of H5N1 influenza viruses. //The 10th ISTC/Korea workshop, March 14-15, Jeonam Provincial Office, Mokpo Shinan Beach Hotel.

17. Buonagurio D.A., O'neill R.E., Shutyak L., D'Arco G.A., Bechert T.M. et al. (2006b) Genetic and phenotypic stability of cold-adapted influenza viruses in a trivalent vaccine administered to children in a day care setting. //Virology, 347(2): 296-306.

18. Chen Z., Aspelund A., Kemble G., Jin H. (2006) Genetic mapping of the cold-adapted phenotype of B/Ann Arbor/1/66, the master donor virus for live attenuated influenza vaccines (FluMist). //Virology, 345(2): 416423.

19. Chen Z., Aspelund A., Kemble G., Jin H. (2008) Molecular studies of temperature-sensitive replication of the cold-adapted B/Ann Arbor/1/66, the master donor virus for live attenuated influenza FluMist vaccines. //Virology, 380(2): 354-362.

20. Elton D., Medcalf L., Bishop K., Harrison D., Digard P. (1999) Identification of amino acid residues of influenza virus nucleoprotein essential for RNA binding. //Virology, 73(9): 7357-7367.

21. Falcon A.M., Fortes P., Marion R.M., Beloso A., Ortin J. (1999) Interaction of influenza virus NS1 protein and the human homologue of Staufen in vivo and in vitro. //Nucleic Acids Research, 27(11): 2241-2247.

22. Fouchier R.A., Munster V., Wallensten A., Bestebroer T.M., Herfst S. et al. (2005) Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (HI 6) obtained from black-headed gulls. //Virology, 79(5): 2814-2822.

23. Galler R., Pugachev K.V., Santos C.L., Ocran S.W., Jabor A.V. et al. (2001) Phenotypic and molecular analyses of yellow fever 17 DD vaccine viruses associated with serious adverse events in Brazil. //Virology, 290(2): 309-319.

24. Ghedin E., Sengamalay N.A., Shumway M., Zaborsky J., Feldblyum T. et al. (2005) Large-scale sequencing of human influenza reveals the dynamic nature of viral genome evolution. //Nature, 437(7062): 1162-1166.

25. Ghendon Y.Z. (1998) Cold-adapted, live influenza vaccines developed in Russia. //Textbook of influenza. Ed. Nicholson K., Webster R., Hay A.; Blackwell science, 391-399.

26. Ghendon Y.Z., Markushin S.G. (1980) Studies on mutation lesions and physiology of fowl plague virus ts mutants. //Philosophic Transactions of the Royal Society of London, B, 288(1029): 383-392.

27. Haaheim L.R., Pattison J.R., Whitley R.J. (2002) A practical guide to clinical virology. //John Wiley and Sons Ltd.

28. Hale B.G., Randall R.E., Ortin J., Jackson D. (2008) The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. //Journal of General Virology, 89, 2359-2376.

29. Hambleton S., Gershon A.A. (2005) Preventing varicella-zoster disease. //Clinical Microbiology Reviews, 18(1): 70-80.

30. Hay A.J., Lomniczi B., Bellamy A.R., Skehel J.J. (1977) Transcription of the influenza virus genome. //Virology, 83(2): 337-355.

31. Herlocher M.L., Clavo A.C., Maassab H.F. (1996) Sequence comparisons of A/AA/6/60 influenza viruses: mutations which may contribute to attenuation. //Virus Research, 42: 11-25.

32. Herlocher M.L., Maassab H.F., Webster R.G. (1993) Molecular and biological changes in the cold-adapted "master strain" A/AA/6/60 (H2N2) influenza virus. //Proceedings of National Academy of Sciences USA, 90: 6032-6036.

33. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z., Yang C-F., Spaete J. et al. (2005) Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann Arbor/1/66 //Virology, 79(17): 1101411021.

34. Holmes E.C., Ghedin E., Miller N., Taylor J., Bao Y. et al. (2005) Whole-genome analysis of human influenza A virus reveals multiple persistent lineages and reassortment among recent H3N2 viruses. //PLoS Biology, 3(9): e300.

35. Honda A., Mizumoto K., Ishihama A. (1999) Two separate sequences of PB2 subunit constitute the RNA cap-binding site of influenza virus RNA polymerase. //Genes to cells, 4(8): 471-478.

36. Imai M., Kawasaki K., Odagiri T. (2008) Cytoplasmic domain of influenza B virus BM2 protein plays critical roles in production of infectious virus. //Journal of Virology, 82(2): 728-739.

37. Jennings A.D., Gibson C.A., Miller B.R., Mathews J.H., Mitchell C.J. et al. (1994) Analysis of a yellow fever virus isolated from a fatal case of vaccine-associated human encephalitis. //Journal of Infectious Diseases, 169: 512-518.

38. Jin H., Lu B., Zhou H., Kemble G. (2004a) Genetic studies of FluMist influenza vaccines derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. //International congress series 1263: 153-156.

39. Jin H., Lu B., Zhou H., Ma Ch., Zhao J. et al. (2003) Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. //Virology, 306(1): 18-24.

40. Keawcharoen J., Oraveerakul K., Kuiken T., Fouchier R.A., Amonsin A. et al. (2004) Avian influenza H5N1 in tigers and leopards. //Emerging Infectious Diseases, 10(12): 2189-2191.

41. Kendal A.P., Maassab H.F., Alexandrova G.I., Ghendon Y.Z. (1981) Development of cold-adapted recombinant live, attenuated influenza A vaccines in the U.S.A. and U.S.S.R. //Antiviral Research, 1: 339-365.

42. Kiseleva I., Su Q., Toner T.J., Szymkowiak C., Kwan W.S. et al. (2004b) Cell-based assay for the determination of temperature sensitive andcold adapted phenotypes of influenza viruses. //Journal of Virological Methods, 116(1): 71-78.

43. Klimov A.I., Cox N.J. (1995) PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines //Virological Methods, 52: 41-49.

44. Klimov A.I., Cox N.J., Yotov W., Rocha E., Alexandrova G.I. et al. (1992) Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A /Leningrad/134/57 (H2N2) virus. //Virology, 186(2): 795-797.

45. Kosutic-Gulija T., Forcic D., Santak M., Ramljak A., Mateljak-Lukacevic S. et al. (2008) Genetic heterogeneity of L-Zagreb mumps virus vaccine strain //Virology Journal, 5: 79.

46. Lamb R.A., Krug R.M. (2001) Orthomyxoviridae. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al.; Fields Virology, 4-th edition. //Lippincott Williams & Wilkins.

47. Lee K.-H., Seo S.-U., Song J.-M., Lee C.-M., Kim H.-A. et al. (2006) Characterization of live influenza vaccine donor strain derived from cold-adaptation of X-31 virus. //Vaccine, 24(11): 1966-1974.

48. Li C., Hatta M., Watanabe S., Neumann G., Kawaoka Y. (2008) Compatibility among polymerase subunit proteins is a restricting factor in reassortment between equine H7N7 and human H3N2 influenza viruses. //Journal of Virology, 82(23): 11880-11888.

49. Lin Y.P., Gregory V., Bennett M., Hay A. (2004) Recent changes among human influenza viruses. //Virus Research, 103(1-2): 47-52.

50. Lindsey N.P., Schroeder B.A., Miller E.R., Braun M.M., Hinckley A.F. et al. (2008) Adverse event reports following yellow fever vaccination. //Vaccine, 26(48): 6077-6082.

51. Liu T., Ye Z. (2004) Introduction of a temperature-sensitive phenotype into influenza A/WSN/33 virus by altering the basic amino acid domain of influenza virus matrix protein. //Journal of Virology, 78(18): 95859591.

52. Liu T., Ye Z. (2005) Attenuating mutations of the matrix gene of influenza A/WSN/33 virus. //Journal of Virology, 79(3): 1918-1923.

53. Maier H.J., Kashiwagi Т., Нага К., Brownlee G.G. (2008) Differential role of the influenza A virus polymerase PA subunit for vRNA and cRNA promoter binding //Virology, 370: 194-204.

54. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular cloning. (A laboratory manual). //Cold spring harbor laboratory, 545 pp.

55. Marion R.M., Aragon Т., Beloso A., Nieto A., Ortin J. (1997) The N-terminal half of the influenza virus NS1 protein is sufficient for nuclear retention of mRNA and enhancement of viral mRNA translation. //Nucleic Acids Research, 25(21): 4271-4277.

56. Mazur I., Anhlan D., Mitzner D., Wixler L., Schubert U. et al. (2008) The proapoptotic influenza A virus protein PB1-F2 regulates viral polymerase activity by interaction with the PB1 protein //Cell Microbiology, 10(5): 1140-52.

57. Mostow S.R., Hopkins J.A., Wright P.F. (1979) Behavior of vaccine revertants of temperature-sensitive mutants of influenza virus in ferret tracheal organ culture //infection and Immunity, 26(1): 193-196.

58. Mould J. A., Paterson R.G., Takeda M., Ohigashi Y., Venkataraman P. et al. (2003) Influenza В virus BM2 protein has ion channel activity that conducts protons across membranes //Developmental Cell, 5(1): 175-184.

59. Murphy B.R., Chanock R.M. (2001) Immunization against viral diseases. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al.; Fields Virology, 4th edition. //Lippincott Williams & Wilkins.

60. Murphy T.V., Gargiullo P.M., Massoudi M.S., Nelson D.B., Jumaan A.O. et al. (2001) Intussusception among Infants Given an Oral Rotavirus Vaccine //The New England Journal of Medicine, 344: 564-572.

61. Murphy T.V., Smith P.J., Gargiullo P.M., Schwarz B. (2003) The first rotavirus vaccine and intussusception: epidemiological studies and policy decisions //The Journal of Infectious Diseases, 187: 1309-1313.

62. NayakD.P., Baloguna R.A., Yamada H., Zhou Z.H., Barman S. (2009) Influenza virus morphogenesis and budding //Virus Research, 143(2): 147-161.

63. Nayak D.P., Hui E.K., Barman S. (2004) Assembly and budding of influenza virus.//Virus Research, 106(2): 147-165.

64. Nobusawa E., Sato K. (2006) Comparison of mutation rates of human influenza A and B viruses. //Journal of Virology, 80(7): 3675-3678.

65. Obayashi E., Yoshida H., Kawai F., Shibayama N., Kawaguchi A. et al. (2008) The structural basis for an essential subunit interaction in influenza virus RNA polymerase. //Nature, 454(7208): 1127-1131.

66. Odoom J.K., Yunus Z., Dunn G., Minor P.D., Martin J. (2008) Changes in population dynamics during long-term evolution of sabin type 1 poliovirus in an immunodeficient patient //Journal of Virology, 82(18): 91799190.

67. Paterson R.G., Takeda M., Ohigashi Y., Pinto L.H., Lamb R.A. (2003) Influenza B virus BM2 protein is an oligomeric integral membrane protein expressed at the cell surface. //Virology, 306(1): 7-17.

68. Poole E., Elton D., Medcalf L., Digard P. (2004) Functional domains of the influenza A virus PB2 protein: identification of NP- and PB1-binding sites //Virology, 321(1): 120-133.

69. Portela A., Digard P. (2002) The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication. //General Virology, 83(4): 723-734.

70. Qian X.Y., Alonso-Caplen F., Krug R.M. (1994) Two functional domains of the influenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA. //Virology, 68(4): 2433-2441.

71. Quinlivan M., Zamarin D., Garcia-Sastre A., Cullinane A., Chambers T. et al. (2005) Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein. //Virology, 79(13): 8431-8439.

72. Racaniello V.R. (2006) One hundred years of poliovirus pathogenesis. //Virology, 344(1): 9-16.

73. Rodriguez A., Pérez-González A., Nieto A. (2007) Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. //Journal of Virology, 81(10): 5315-5324.

74. Rudenko L.G., Kiseleva I.V., Larionova N.V., Grigorieva E.P., Naikhin A.N. et al. (2004) Analysis of some factors influencing immunogenicity of live cold-adapted reassortant influenza vaccines. //International congress series 1263: 542-546.

75. Sauder C.J., Vandenburgh K.M., Iskow R.C., Malik T., Carbone K.M. et al. (2006) Changes in mumps virus neurovirulence phenotype associated with quasispecies heterogeneity. //Virology, 350(1): 48-57.

76. Scholtissek Chr., Spring S.B. (1981) Extragenic suppression of temperature-sensitive mutations in RNA segment 8 by replacement of different RNA segments with those of other influenza A virus prototype strains. //Virology, 118(1): 28-34.

77. Seo S.U., Byun Y.H., Lee E.Y., Jung E.J., Jang Y.H. et al. (2008) Development and characterization of a live attenuated influenza B virus vaccine candidate. //Vaccine, 26(7): 874-881.

78. Smith D.B., Inglis S.C. (1987) The mutation rate and variability of eukaryotic viruses: an analytical review. //Journal of General Virology, 68(Pt 11): 2729-40.

79. Snyder M.H., Betts R.F., DeBorde D., Tierney E.L., Clements M.L. et al. (1988) Four viral genes independantly contribute to attenuation of live influenza A/AA/6/60 cold-adapted reassortant virus vaccines. //Virology, 62(2): 488-495.

80. Sweet T.M., Maassab H.F., Herlocher M.L. (2004) Reverse genetics studies of attenuation of the ca A/AA/6/60 influenza virus: the role of the matrix gene. //Biomedicine and pharmacotherapy, 58(9): 509-515.

81. Treanor J.J., Buja R., Murphy B.R. (1991) Intragenic suppression of a deletion mutation of the nonstructural gene of an influenza A virus. //Virology, 65(8): 4204-4210.

82. Treanor J.J., Perkins M., Battaglia R., Murphy B.R. (1994) Evaluation of the genetic stability of the temperature-sensitive PB2 gene mutation of the influenza A/Ann Arbor/6/60 cold-adapted vaccine virus. //Virology, 68(12): 7684-7688.

83. Watson J.M. (1998) Surveillance of influenza. In Karl G. Nicholson et al.; Textbook of influenza. //Blackwell science: 207-216.

84. Wilschut J., McElhaney J.E. (2005) Rapid reference: Influenza. //Printed by Grafos, Spain: Mosby, 216 pp.

85. Wong S.S., Yuen K.Y. (2006) Avian influenza virus infections in humans.//Chest, 129(1): 156-168.

86. Wright K.E., Dimock K., Brown E.G. (2000) Biological characteristics of genetic variants of Urabe AM9 mumps vaccine virus. //Virus research, 67(1): 49-57

87. Wright P.F., Webster R.G. (2001) Orthomyxoviruses. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al. Fields Virology, 4-th edition. //Lippincott Williams & Wilkins.

88. Yin-Murphy M., Almond J.W. (1996) Picornaviruses In: Peake R.C., James D. A., Susman M. et al.; Medical microbiology, 4-th edition, ed. by Baron S.

89. Youil R., Kiseleva I., Kwan W.S., Szymkowiak C., Toner T.J. et al. (2004) Phenotypic and genetic analyses of the heterogeneous population present in the cold-adapted master donor strain: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).//Virus Research, 102(2): 165-176.

90. Yuan P., Bartlam M., Lou Z., Chen S., Zhou J. et al. (2009) Crystal structure of an avian influenza polymerase PA(N) reveals an endonuclease active site. //Nature, 458(7240): 909-913.

91. Zamarin D., Ortigoza M.B., Palese P. (2006) Influenza A virus PB1-F2 protein contributes to viral pathogenesis in mice. //Journal of Virology, 80(16): 7976-7983.

92. Zhang Y.M., Tian S.F., Zhu J.M. (1982) Identification of naturally occurring temperature-sensitive strains of influenza A virus and location of their genetic lesions. //Scientia Sinica, B., 25(4): 411-419.