Изучение структуры и свойств желтого флуоресцирующего белка zFP538 из кораллов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Зубова, Надежда Николаевна

• Зубова, Надежда Николаевна
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Зубова, Надежда Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЦВЕТНЫХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ БЕЛКОВ.

1.1. Стабильность GFP -подобных белков.

1.1.1. Влияние температуры.

1.1.2. Влияние рН.

1.1.3. Действие протеаз.

1.2. Третичная структура GFP и его гомологов.

1.3. Спектральное разнообразие GFP-подобных белков.

1.4. Основные типы хромофоров GFP-подобных белков.

1.4.1. Зеленый хромофор GFP-типа.

1.4.2. Структура красного хромофора DsRed типа.

1.4.3. Структура хромофора asFP595.

1.4.4. Структура хромофора Kaede.

1.4.5. Структура хромофора zFP538.

1.5. Формирование хромофора GFP, DsRed и zFP538.

1.5.1. Формирование структуры «зеленого» хромофора.

1.5.2. Формирование ацилимина в хромофоре DsRed-типа.

1.5.3. Формирование желтого хромофора zFP538.

ГЛАВА 2. ОЛИГОМЕРИЗАЦИЯ И АГРЕГАЦИЯ ЦВЕТНЫХ

ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ БЕЛКОВ.

2.1. Олнгомсрпзацпя цветных флуоресцирующих белков.

2.1.1. GFP из кишечнополостных Hydrozoa.

2.1.2. Цветные белки из кораллов.

2.1.3. Структура тетрамеров DsRed и zFP538.

2.2. Агрегация цветных белков из кораллов.

2.3. Биологическая функция GFP-подобных белков.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ рН НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ И ПОГЛОЩЕНИЕ ЦВЕТНЫХ БЕЛКОВ.

3.1. Взаимодействие меяаду хромофором и белковым окружением.

3.2. Влияние рН на спектральные свойства GFP.

3.3. Влияние рН на спектральные свойства хромонептндов GFP.

3.4. Протоппрованпые состояния хромофора GFP.

3.4.1. Теоретические расчеты.

3.4.2. Экспериментальные данные.

ГЛАВА 4. ФОТОФИЗИКА И ФОТОХИМИЯ GFP-ПОДОБНЫХ БЕЛКОВ.

4.1. Перенос протопа в возбужденном состоянии.

4.2. Поворот хромофора в возбужденном состоянии. Цпс-транс изомеризация.

4.2.1. Изучение модельных хромофоров.

4.2.2. Модель фотоизомеризации.

4.2.3. Изучение белков.

4.3. Копформацноппая подвижность /7-бочонка GFP.

ГЛАВА 5. АППАРАТУРА, РЕАГЕНТЫ, МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

5.1. Использусмые реагенты н оборудование.

5.2. Экспрессия и выделение zFP538.

5.3. Выделение хромонентндов из zFP538.

5.4. Спектроскоппя н рН-метрня.

5.4.1. Титрование хромопептидов.

5.4.2. Титрование белка zFP

5.5. Динамическое рассеяние света.

5.6. Гель-фильтрация.

5.7. Подготовка образца для сканирующей зондовон микроскопии.

5.7.1. На поверхности стекла.

5.7.2. Сорбция на поверхности графита.

5.8. Кинетические измерения.

5.9. Расчет значении рКа из рН-профилси.

5.9.1. Одностадийная схема 1.

5.9.2. Двустадийная схема 2.

5.9.3. Трехстадийная схема 3.

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ рН-ЗАВИСИМОСТЕЙ ХРОМОПЕПТИДОВ.

6.1. Имнно-форма хромопептнда zFP538. Поглощение.

6.2. Имнно-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция.

6.3. Кето-форма хромопептнда zFP538. Поглощение.

6.4. Кето-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция.

ГЛАВА 7. АНАЛИЗ рН-ЗАВИСИМОСТЕЙ ЖЕЛТОГО БЕЛКА zFP538.

7.1. рН-завнснмостн поглощения желтого белка zFP538.

7.1.1. Поглощение концентрированного раствора.

7.1.2. рН-зависимость поглощения разбавленного раствора zFP538.

7.2. рН-зависимости флуоресценции zFP538.

7.2.1. Флуоресценция растворов с высокой концентрацией белка.

7.2.2. Флуоресценция разбавленных растворов zFP538.

7.2.3. Эффект начального значения рН.

7.2.4. Анализ полных рН-профилей флуоресценции разбавленных растворов zFP538.

7.2.5. Нелинейность зависимости интенсивности флуоресценции zFP538 от концентрации белка.

ГЛАВА 8. ОЦЕНКА РАЗМЕРОВ АГРЕГАТОВ zFP538.

8.1. Светорассеяние.

8.2. Гель-фильтрация.

8.3. Исследование агрегации zFP538 с помощью микроскопии.

8.3.1. На поверхности стекла.

8.3.2. На поверхности графита.

ГЛАВА 9. КИНЕТИКА КИСЛОТНОЙ ДЕНАТУРАЦИИ zFP538.

9.1. Кинетические кривые.

9.2. Спектральные изменения, наблюдаемые при кислотной денатурации zFP

9.3. Предполагаемая схема кислотной инактивации zFP538.

ГЛАВА 10. МЕХАНИЗМЫ СТАБИЛИЗАЦИИ СТРУКТУРЫ zFP538 ЗА СЧЕТ

АГРЕГАЦИИ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение структуры и свойств желтого флуоресцирующего белка zFP538 из кораллов»

Многие годы GFP изучался очень небольшой группой исследователей как белок, являющийся частью биолюмииесцентной системы стрекающих кишечнополостных Hydrozoa. Лишь в 1992 году была установлена его аминокислотная последовательность [1]. Решающий прорыв в практическом применении GFP произошел после того, как зеленый белок был клонирован [1], и было показано, что экспрессия гена GFP в других организмах также приводит к появлению флуоресцирующего белка [2, 3]. Следовательно, ген содержит всю информацию, необходимую для посттрансляционного синтеза хромофора.

После этого открытия интерес к GFP чрезвычайно возрос, и этот белок стали активно использовать для фундаментальных исследований в клеточной биологии, онтогепетике (биологии развития), пейробиологии и экологии. Начиная с 1999 года, разнообразные разноцветные гомологи GFP были выделены из многочисленных организмов Anthozoa (кораллы, морские актинии и др.), и даже из ракообразных. В настоящее время зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его гомологи широко используются в качестве генетически кодируемых флуоресцентных маркеров, позволяющих исследовать многообразные процессы, происходящие в живых клетках, тканях и организмах. Использование таких индикаторов позволяет изучать локализацию и транспорт различных белков внутри клетки, уровень экспрессии генов, взаимодействия между белками в клетке, определять концентрацию низкомолекулярных метаболитов, у, некоторых физиологически важных ионов (Са , СГ), рН и редоксипотенциал внутренней среды, изучать сигнальные пути и взаимодействия рецептор-лиганд, определять ферментативную активность в живых клетках [4, 5, 6, 7]. Флуоресцирующие белки могут быть гетерологически экспрессированы в любых клетках, и для наблюдения их флуоресценции не требуется каких-либо дополнительных ферментов или кофакторов, за исключением кислорода. Особые преимущества молекулярных сенсоров проявляются при исследовании Ферстеровского переноса энергии (FRET) - широкий выбор донорно-акцепторных пар обеспечивается хорошим перекрыванием спектров флуоресценции и поглощения в постоянно пополняющемся ряду цветных белков.

Цветные белки из Anthozoa (кораллы, актинии, зоантиды и др.) превосходят GFP по спектральному разнообразию и стабильности, однако проигрывают в том, что являются облигатными олигомерами, более медленно созревают и обладают ярко выраженной склонностью к агрегации. Агрегация является общим свойством этих белков, что можно объяснить высокой степенью гомологии между ними. Образование олигомеров не мешает применению этих белков для наблюдения за уровнем экспрессии генов, но может быть помехой использованию белков в качестве репортерпых генов для изучения белок-белковых взаимодействий (методы на основе FRET) и внутриклеточной локализации белков. Агрегация ФБ внутри клеток вообще может привести к токсическому эффекту. Если олигомеризация и агрегация цветных белков из кораллов являются нежелательными с точки зрения их применения, то нельзя исключить возможную важность этих процессов для формирования спектральных свойств и функциональности этих белков в природе. Так, например, димеризация GFP из Aequorea victoria влияет на форму спектра поглощения. Красный флуоресцирующий белок из кораллов Discosoma drFP583 (также известный как DsRed) существует в виде облигатного тетрамера, стабильного даже в растворах с очень низкой концентрацией белка. Полученный методами генной инженерии мономер этого белка характеризуется не только сдвигом спектров поглощения и флуоресценции, но и уменьшением квантового выхода флуоресценции. Однако в литературе нет прямых данных о влиянии олигомеризации DsRed на его спектральные свойства, а наблюдаемые различия могут быть следствием интенсивного мутагенеза (33 мутации), необходимого для получения мономерного флуоресцирующего белка, а не следствием олигомерного состояния.

Поглощение и флуоресценция желтого флуоресцирующего белка zFP538, выделенного из ротового диска пуговичного полипа Zoanthus (рифовые кораллы) [8], лежат в диапазоне длин волн между флуоресценцией зеленых и поглощением красных белков. Это дает возможность использовать zFP538 для индуктивно-резонансного переноса энергии, лежащего в основе многих методов анализа с использованием цветных белков. Желтый белок zFP538, как и многие другие цветные белки из кораллов, образует тетрамеры и более высокомолекулярные агрегаты, однако влияние агрегации на спектральные свойства не исследовано, и нельзя исключить важность этих процессов для функциональности цветных белков в природе. Цветные флуоресцирующие белки обычно используются для исследования живых биологических систем, рН внутри которых может сильно изменяться даже в пределах одной клетки, поэтому представляет интерес оценить влияние рН па яркость и стабильность zFP538.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зубова, Надежда Николаевна

выводы

1. Методами гель-фильтрации, светорассеяния и сканирующей зондовой микроскопии показано, что желтый флуоресцирующий белок zFP538 образует агрегаты в водных растворах и в пленках. Размеры агрегатов для концентрированных растворов (1 мг/мл) белка при рН 8-9 составляют порядка 94-97 нм, а в пленке 50x150 нм. Размеры агрегатов уменьшаются при понижении рН и концентрации белка.

2. Спектральная чувствительность zFP538 к рН зависит от концентрации белка, при этом растворы с максимальной концентрацией менее всего чувствительны к рН. Чем выше концентрация белка (больше размер агрегата), тем выше удельная яркость флуоресценции zFP538, что проявляется в нелинейности зависимости флуоресценции zFP538 от концентрации белка в диапазоне рН 5-9.

3. Изменение удельной яркости агрегатов белка может быть обусловлено изменением жесткости белка и, как следствие, изменением вероятности цис-транс изомеризации хромофора, ведущей к безызлучательной дезактивации. Кроме того, при уменьшении размеров агрегатов может увеличиваться степень доступности хромофора для молекул воды, как следствие, приводящая к локальному изменению рН и протонированию хромофора.

4. Кислотная инактивация zFP538 полностью обратима при подкислении растворов с высокой концентрацией белка (s3xl0"5 М) до рН 3, как по спектрам поглощения, так и по флуоресценции. Степень обратимости кислотной инактивации уменьшается при понижении концентрации белка. В диапазоне рН 3,75-5,5 кинетика инактивации описывается двумя экспонентами, а при рН 3,5 тремя экспонентами. Предложен механизм кислотной денатурации zFP538, основанный на последовательной диссоциации агрегатов. Агрегаты более крупного размера делают желтый белок более устойчивым к тушению флуоресценции при подкислении раствора.

5. Структура хромофора в zFP538 химически лабильна и может изменяться при экстремальных значениях рН. При кислых значениях рН происходит гидролиз основания Шиффа в структуре хромофора с образованием кетона. Такое производное флуоресцирует при 580 нм.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу свою благодарность д.ф.-м.н., профессору О.М. Саркисову, к.ф.-м.н. А.Н. Петрухину и А.А. Астафьеву (Институт химической физики РАН им. Н.Н. Семенова), а также д.х.н. И.Н. Курочкину и Е. Евтушенко (химический факультет МГУ) за помощь в проведении экспериментов по сканирующей зондовой и ближнепольной оптической микроскопии; к.х.н. JT.M. Винокурову (Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН) за предоставленный штамм-продуцент zFP538 и образцы хромопептидов; д.х.н., профессору А.В. Немухину (химический факультет МГУ) за проведение квантово-химических расчетов значений рКа хромофоров ZFP538 и GFP.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Зубова, Надежда Николаевна, 2006 год

1. Prasher, D.C., Eckenrode, V.K., Ward, W.W., Prendergast, F.G., and Cormier, M.J. (1992) Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein, Gene, 111, 229-233.

2. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., and Prasher, D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science, 263, 802-805.

3. Inouye, S., and Tsuji, F.I. (1994) Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein, FEBS Lett., 341,277-280.

4. Tsien, R.Y. (1998) The green fluorescent protein, Annu. Rev. Biochem., 67, 509-544.

5. Zimmer, M. (2002) Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior, Chem. Rev., 102(3), 759-781.

6. Miyawaki, A. (2003) Fluorescence imaging of physiological activity in complex systems using GFP-based probes, Curr. Opin. Neurobiol., 13(5), 591-596.

7. Verkhusha, V.V., and Lukyanov, K.A. (2004) The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins, Nat. Biotechnol., 22,289-296.

8. Shaner, N.C., Steinbach, P.A., and Tsien, R.Y. (2005) A guide to choosing fluorescent proteins, Nat. Methods, 2(12), 905-909.11. http://www.evrogen.com/pl .shtml

9. Shaner, N.C., Campbell, R.E., Steinbach, P.A., Giepmans, B.N., Palmer, A.E., and Tsien, R.Y. (2004) Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein, Nat. Biotechnol., 22(12), 1567-1572.

10. Ward, W.W., and Bokman, S.H. (1982) Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: Physical separation and characterization of the renatured protein Biochemistry, 21,4535-4540.

11. Makino, Y., Amada, K., Taguchi, H., and Yoshiba, M. (1997) Chaperonin-mediated folding of green fluorescent protein, J. Biol. Chem., 272, 12468-12474.

12. Topell, S., Hennecke, J., and Glockshuber, R. (1999) Circularly permuted variants of the green fluorescent protein, FEBSLett., 457, 283-289.

13. Bokman, S.H., and Ward, W.W. (1981) Renaturation of Aequorea green-fluorescent protein, Biochem. Biophys. Res. Commun., 101, 1372-1380.

14. Penna, T.C.V., Ishii, M., Pessoa, A. Jr., and Cholewa, O. (2004) Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values, Appl. Biochem. Biotech., 113-116, 469-483.

15. Ward, W.W. (1981) Properties of the coelenterate green fluorescent proteins. In: Bioluminescence and Chemiluminescence (DeLuca, M., and McElroy, D.W., eds.) Academic Press, New York, pp. 235-242.

16. Youvan, D.C., and Michel-Beyerle, M.-E. (1996) Structure and fluorescence mechanism of GFP, Nat. BiotechnoL, 14,1219-1220.

17. Verkhusha, V.V., Akovbian, N.A., Efremenko, E.N., Varfolomeyev, S.D. and Vrzheshch, P.V. (2001) Kinetic analysis of maturation and denaturation of DsRed, a coral derived red fluorescent protein, Biochemistry (Moscow), 66(12), 1342-1351.

18. Cody, C.W., Prasher, D.C., Westler, W.M., Prendergast, F.G., and Ward, W.W. (1993) Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein, Biochemistry, 32,1212-1218.

19. Ward, W.W., and Cormier, M.J. (1979) An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein, J. Biol. Chem., 254(3), 781-788.

20. Yang, F., Moss, L.G., and Phillips, G.N. Jr. (1996) The molecular structure of green fluorescent protein, Nat. Biotechnol., 14, 1246-1251.

21. Dopf, J., and Horiagon, T.M. (1996) Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Gene, 173, 39-44.

22. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S.R., and Huang, C.C. (1997) Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescence, J. Biol. Chem., Ill, 28545-28549.

23. Remington, S.J., Wachter, R.M., Yarbrough, D.K., Branchaud, B.D., Anderson, C., Kallio, K., and Lukyanov, K.A. (2005) zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore, Biochemistry, 44, 202-212.

24. Bulina, M.E., Chudakov, D.M., Mudrik, N.N., and Lukyanov, K.A. (2002) Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and nonfluorescent proteins by mutagenesis, BMC Biochem., 3:7.

25. Gurskaya, N.G., Fradkov, A.F., Terskikh, A., Matz, M.V., Labas, Y.A., Martynov, V.I., Yanushevich, Y.G., Lukyanov, K.A., and Lukyanov, S.A. (2001) GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins, FEBS Lett., 507(1), 16-20.

26. Gurskaya, N.G., Savitsky, A.P., Yanushevich, Y.G., Lukyanov, S.A., and Lukyanov, K.A. (2001) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis, BMC Biochem., 2:6.

27. Remington, S.J. (2000) Structural basis for understanding spectral variations in green fluorescent protein, Methods Enzymol., 305, 196-211.

28. Heim, R., Cubitt, A.B., and Tsien, R.Y. (1995) Improved green fluorescence, Nature, 373, 663-664.

29. Heim, R., Prasher, D.C., and Tsien, R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 12501-12504.

30. Ehrig, Т., O'Kane, D.J., and Prendergast, F.G. (1995) Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra, FEBS Lett., 367, 163-166.

31. Patterson, G.H., and Lippincott-Schwartz, J.A. (2002) A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells, Science, 297, 1873-1877.

32. Ormo, M., Cubitt, A.B., Kallio, K., Gross, L.A., Tsien, R.Y., and Remington, S.J. (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Science, 273, 1392-1395.

33. Chudakov, D.M., Feofanov, A.V., Mudrik, N.N., Lukyanov, S., and Lukyanov, K.A. (2003) Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle, J. Biol. Chem., 278, 7215-7219.

34. Terskikh, A., Fradkov, A., Ermakova, G., Zaraisky, A., Tan, P., Kajava, A.V., Zhao, X., Lukyanov, S., Matz, M., Kim, S., Weissman, I., and Siebert, P. (2000) "Fluorescent timer": protein that changes color with time, Science, 290, 1585-1588.

35. Gross, L.A., Baird, G.S., Hoffman, R.C., Baldridge, K.K., and Tsien, R.Y. (2000) The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97,11990-11995.

36. Wall, M.A., Socolich, M., and Ranganathan, R. (2000) The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed, Nat. Struct. Biol., 7, 1133-1138.

37. Yarbrough, D., Wachter, R.M., Kallio, K., Matz, M.V. and Remington, S.J. (2001) Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98,462-467.

38. Baird, G.S., Zacharias, D.A., and Tsien, R.Y. (2000) Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 11984-11989.

39. Prescott, M., Ling, M., Beddoe, Т., Oakley, A.J., Dove, S., Hoegh-Guldberg, O., Devenish, R. J., and Rossjohn, J. (2003) The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation, Structure, 11, 275-284.

40. Quillin, M.L., Anstrom, D.M., Shu, X., O'Leary, S., Kallio, K., Chudakov, D.M., and Remington, S.J. (2005) Kindling fluorescent protein from Ammonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution, Biochemistry, 44, 5774-5787.

41. Wilmann, P.G., Petersen, J., Devenish, R.J., Prescott, M., and Rossjohn, J. (2005) Variations on the GFP Chromophore, J. Biol. Chem., 280, 2401-2404.

42. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., and Miyawaki, A. (2002) An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 12651-12656.

43. Mizuno, H., Mai, Т.К., Tong, K.I., Ando, R., Furuta, Т., Ikura, M., and Miyawaki A. (2003) Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein, Mol. Cell, 12, 1051-1058.

44. Cubitt, A.B., Heim, R., Adams, S.R., Boyd, A.E., Gross, L.A., and Tsien, R.Y. (1995) Understanding, improving and using green fluorescent proteins, Trends Biochem. Sci., 20, 448455.

45. Reid, B.G., and Flynn, G.C. (1997) Chromophore formation in green fluorescent protein, Biochemistry, 36, 6786-6791.

46. Kojima, S., Hirano, Т., Niwa, H., Ohashi, M., Inouye, S., and Tsuji, F.I. (1997) Mechanism of the redox reaction of the Aequorea green fluorescent protein (GFP), Tetrahedron Lett., 38(16), 2875-2878.

47. Branchini, B.R., Nemser, A.R., and Zimmer, M. (1998) A computational analysis of the unique protein-induced tight turn that results in posttranslational chromophore formation in green fluorescent protein, J. Am. Chem. Soc., 120(1), 1-6.

48. Kane, J.F., and Hartley, D.L. (1988) Formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli, Trends Biotechnol., 6(5), 95-101.

49. Palm, G.J., Zdanov, A., Gaitanaris, G.A., Stauber, R., Pavlakis, G.N., and Wlodawer, A. (1997) The structural basis for spectral variations in green fluorescent protein, Nat. Struct. Biol., 4,361-365.

50. Siegbahn, P.E.M., Wirstam, M., and Zimmer, M. (2001) Theoretical study of the mechanism of peptide ring formation in green fluorescent protein, Int. J. Quantum Chem., 81(2), 169-186.

51. Zhang, L., Patel, H.N., Lappe, J.W., and Wachter, R.M. (2006) Reaction progress of chromophore biogenesis in green fluorescent protein, J Am. Chem. Soc., 128(14), 4766-4772.

52. Wiehler, J., von Hummel, J., and Steipe, B. (2001) Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore, FEBS Lett., 487, 384-389.

53. Verkhusha, V.V., Chudakov, D.M., Gurskaya, N.G., Lukyanov, S., and Lukyanov, K.A. (2004) Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins, Chem. Biol., 11, 845-854.

54. Ward, W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In: Green Fluorescent protein: properties, applications, and protocols (Chalfie, M., and Kain, S. eds.), Wiley-Liss, New York, pp. 45-75.

55. Zacharias, D.A., Violin, J.D., Newton, A.C., and Tsien, R.Y. (2002) Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells, Science, 296, 913-916.

56. Vrzheshch, P.V., Akovbian. N.A., Varfolomeyev, S.D., and Verkhusha, V.V. (2000) Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions, FEBS lett., 487,203-208.

57. Jakobs, S., Subramaniam, V., Schonle, A., Jovin, T.M., and Hell, S.W. (2000) EFGP and DsRed expressing cultures of Escherichia coli imaged by confocal, two-photon and fluorescence lifetime microscopy, FEBS Lett., 479(3), 131-135.

58. Wiedenmann, J., Vallone, В., Renzi, F., Nienhaus, K., Ivanchenko, S., Rocker, C., and Nienhaus, G.U. (2005) Red fluorescent protein eqFP611 and its genetically engineered dimeric variants, J. Biomed. Opt., 10(1), 14003/1-7.

59. Lounis, В., Deich, J., Rosell, F.I., Boxer, S.G., and Moerner, W.E. (2001) Photophysics of DsRed, a red fluorescent protein, from the ensemble to the single-molecule level, J. Phys. Chem. В., 105, 5048-5054.

60. Beddoe, Т., Ling, M., Dove, S., Hoegh-Guldberg, O., Devenish, R.J., Prescott, M., and Rossjohn, J. (2003) The production, purification and crystallization of a pocilloporin pigment from a reef-forming coral, Acta Crystallogr. D, 59(3), 597-599.

61. Karasawa, S., Araki, Т., Yamamoto-Hino, M., and Miyawaki A. (2003) A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labeling, J. Biol. Chem., 278(36), 34167-34171.

62. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., and Nienhaus, G.U. (2004) Identification of GFP-like proteins in nonbioluminescent, azooxanthellate Anthozoa opens new perspectives for bioprospecting, Mar. Biotechnol., 6(3), 270-277.

63. Sacchetti, A., Subramaniam, V., Jovin, T.M., and Alberti, S. (2002) Oligomerization of DsRed is required for the generation of a functional red fluorescent chromophore, FEBS Lett., 525(1-3), 13-19.

64. Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., Steinbach, P.A., Baird, G.S., Zacharias, D.A., and Tsien, R.Y. (2002) A monomeric red fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 12, 78777882.

65. Ando, R., Yonezawa, A., Watanabe, C., and Kawamura, S. (2004) Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting, Science, 306, 13701373.

66. Полторак, O.M., Чухрай, E.C., Торшин, И.Ю. (1998) Диссоциативная термоинактивация, стабильность и активность олигомерных ферментов, Биохимия, 63, 360-369.

67. Verkhusha, V.V., Kuznetsova, I.M., Stepanenko, O.V., Zaraisky, A.G., Shavlovsky, M.M., Turoverov, K.K., and Uversky, V.N. (2003) High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP, Biochemistry, 42(26), 7879-7884.

68. Lauf, U., Lopez, .P, and Falk, M.M. (2001) Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins, FEBS Lett., 498(1), 1115.

69. Mizuno, H., Sawano, A., Eli, P., Наша, H., and Miyawaki, A. (2001) Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer, Biochemistry, 40,2502-2510.

70. Bevis, B.J., and Glick, B.S. (2002) Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed), Nat. Biotechnol., 20, 83-87.

71. Wiedenmann, J., Elke, C., Spindler, K.D., and Funke, W. (2000) Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria), Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA., 97(26), 14091-14096.

72. Wiedenmann, J., and Lorenz, U. (2000) Fluoreszenz- und elektronenmicroskopische Untersuchungen an der seeanemone Anemonia sulcata Pennant (Cnidaria, Anthozoa), Mikrokosmos, 89, 1-6.

73. Matz, M.V., Labas, Y.A., and Ugalde, J. (2005) Evolution of function and color in GFP-like proteins. In: Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols (Chalfie, M., and Kain, S.R., eds), Wiley, New-Jersea, pp. 139-161.

74. Morin, J.G., and Hastings, J.W. (1971) Energy transfer in a bioluminescent system, J. Cell. Physiol., 77,313-318.

75. Partridge, J.C., and Hilder, P.E. (1990) The colour sensitivity and vision of fishes. In: Llight and life in the sea (Herring, P.J., Campbell, A.K., Whitfield, M., and Maddock, L., eds.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 167-184.

76. Labas, Y.A., Gurskaya, N.G., Yanushevich, Y.G., Fradkov, A.F., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A., and Matz, M.V. (2002) Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99(7), 4256-4261.

77. Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kiihl, M., and Hoegh-Guldberg, O. (2000) Fluorescent pigments in corals are photoprotective, Nature, 408, 850-853.

78. Kawaguti, S. (1969) Effect of the green fluorescent pigment on the productivity of the reef corals, Micronesica, 5,313.

79. Schlichter, D., Fricke, H.W., and Weber, W. (1986) Light harvesting by wavelength transformation in a symbiotic coral of the Red Sea twilight zone, Mar. Biol., 91, 403-407.

80. Hohenester, E., and Engel, J. (2002) Domain structure and organisation in extracellular matrix proteins, Matrix Biol., 21(2), 115-128.

81. Wachter, R.M., Elsliger, M.A., Kallio, K., Hanson, G.T., and Remington, S.J. (1998) Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. Structure, 6, 1267-1277.

82. Elsliger, M.A., Wachter, R.M., Hanson, G.T., Kallio, K., and Remington, S.J. (1999) Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH, Biochemistry, 38(17), 5296-5301.

83. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., and Verkman, A.S. (1998) Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator, Biophys. J., 74, 1591-1599.

84. Llopis, J., McCaffery, J.M., Miyawaki, A., Farquhar, M.G., and Tsien, R.Y. (1998) Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 6803-6808.

85. Griesbeck, O., Baird, G.S., Campbell, R.E., Zacharias, D.A., and Tsien, R.Y. (2001) Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications, J. Biol. Chem., 276(31), 29188-29194

86. Ward, W.W., Cody, C.W., Hart, R.C., and Cormier, M.J. (1980) Spectrophotometric identity of the energy transfer chromophores in Renilla and Aequorea green-fluorescent proteins, Photochem. Photobiol., 31, 611-615.

87. Niwa, H., Inouye, S., Hirano, Т., Matsuno, Т., Kojima, S., Kubota, M., Ohashi, M., and Tsuji, F.I. (1996) Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 13617-13622.

88. Nielsen, S.B., Lapierre, A., Andersen, J.U., Pedersen, U.V., Tomita, S., and Andersen, L.H. (2001) Absorption spectrum of the green fluorescent protein chromophore anion in vacuo, Phys. Rev. Lett., 87(22), 228102(1-4).

89. Laino, Т., Nifosi, R., and Tozzini, V. (2004) Relationship between structure and optical properties in green fluorescent proteins: a quantum mechanical study of the chromophore environment, Chem. Phys., 298, 17-28.

90. Voityuk, A.A., Kummer, A.D., Michel-Beyerle, M.-E., and Rosch, N. (2001) Absorption spectra of the GFP chromophore in solution: comparison of theoretical and experimental results, Chem. Phys., 269, 83-91.

91. Yazal, J.E., Prendergast, F.G., Shaw, D.E., and Pang, Y.-P. (2000) Protonation states of the chromophore of denatured green fluorescent proteins predicted by ab initio calculations, J. Am. Chem. Soc., 122, 11411-11415.

92. Bell, A.F., He, X., Wachter, R.M., and Tonge, P.J. (2000) Probing the ground state structure of the green fluorescent protein chromophore using Raman spectroscopy, Biochemistry, 39(15), 4423-4431.

93. Voityuk, A.A., Michel-Beyerle, M.-E., Rosch, N. (1997) Protonation effects on the chromophore of green fluorescent protein. Quantum chemical study of the absorption spectrum, Chem. Phys. Lett., 272,162-167.

94. Xie, D., and Zeng, J. (2005) Electronic excitations of green fluorescent proteins: protonation states of chromophore model compound in solutions, J. Comput. Chem., 26, 14871496.

95. Chattoraj, M., King, B.A., Bublitz, G.U., and Boxer, S.G., (1996) Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93(16), 8362-8367.

96. Chen, M.C., Lambert, C.R., Urgitis, J.D., and Zimmer, M. (2001) Photoisomerization of green fluorescent protein and the dimensions of the chromophore cavity, Chem. Phys., 270, 157— 164.

97. Nifosi, R., and Tozzini, V. (2006) Cis-trans photoisomerization of the chromophore in the green fluorescent protein variant E2GFP: A molecular dynamics study, Chem. Phys., 323, 358368.

98. Webber, N.M., Litvinenko, K.L., and Meech, S.R. (2001) Radiationless relaxation in a synthetic analogue of the green fluorescent protein chromophore, J. Phys. Chem. B, 105, 80368039.

99. Mandal, D., Tahara, Т., Webber, N.M., and Meech, S.R. (2002) Ultrafast fluorescence of the chromophore of the green fluorescent protein in alcohol solutions, Chem. Phys. Lett., 358, 495-501.

100. Martinez, T.J. (2006) Insights for light-driven molecular devices from ab initio multiple spawning excited-state dynamics of organic and biological chromophores, Acc. Chem. Res. 39(2), 119-126.

101. Martin, M.E., Negri, F., and Olivucci, M. (2004) Origin, nature, and fate of the fluorescent state of the green fluorescent protein chromophore at the CASPT2//CASSCF resolution, J. Am. Chem. Soc., 126, 5452-5464.

102. Waldeck, D.H. (2000) The role of solute-solvent friction in large-amplitude motions. In: Conformational Analysis of Molecules in Excited States (Waluk, J„ ed.), Wiley-VCH, pp. 113176.

103. Bublitz, G., King, B.A., and Boxer, S.G. (1998) Electronic structure of the chromophore in green fluorescent protein (GFP), J. Am. Chem. Soc., 120, 9370-9371.

104. Toniolo, A., Olsen, S., Manohar, L., and Martinez, T.J. (2004) Conical intersection dynamics in solution: the chromophore of green fluorescent protein, Faraday Discuss., 127, 149163.

105. Weber, W., Helms, V., McCammon, J.A., and Langhoff, P.W. (1999) Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96,6177-6182.

106. Voityuk, A.A., Michel-Beyerle, M.-E., and Rosch, N. (1998) Structure and rotation barriers for ground and excited states of the isolated chromophore of the green fluorescent protein. Chem. Phys. Lett., 296, 269-276.

107. He, X., Bell, A.F., and Tonge, P.J. (2003) Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore, FEBS Lett., 549, 35-38.

108. Maddalo, S.L., and Zimmer, M. (2006) The role of the protein matrix in GFP fluorescence, Photochem. Photobiol., 82(2), 367-372.

109. Seifert, M.H.J., Ksiazek, D., Azim, M.K., Smialowski, P., Budisa, N., and Holak, T.A. (2002) Slow exchange in the chromophore of a green fluorescent protein variant, J. Am. Chem. Soc., 124(27), 7932-7942.

110. Abrash, S., Repinec, S. and Hochstrasser, R.M. (1990) The viscosity dependence and reaction coordinate for isomerization of cis-stilbene, J. Chem. Phys., 93, 1041-1053.

111. Seifert, M.H.J., Georgescu, J., Ksiazek, D., Smialowski, P., Rehm, Т., Steipe, В., and Holak, T.A. (2003) Backbone dynamics of green fluorescent protein and the effect of histidine 148 substitution, Biochemistry, 42, 2500-2512.

112. Miesenbock, G., De Angelis, D.A., and Rothman, J.E. (1998) Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins, Nature, 394, 192-195.

113. Ugarova, N.N., Savitsky, A.P., and Berezin I.V. (1981) The protoporphyrin apoperoxidase complex as a horseradish peroxidase analog. A fluorimetric study of the heme pocket, Biochim. Biophys. Acta, 662, 210-219.

114. Щукин, Е.Д., Перцов, A.B., Амелина, E.A. (2004) Коллоидная химия (3-е изд.) М: Высшая школа, 445 с.

115. Andreu, J.M., and Timasheff, S.N. (1986) The measurement of cooperative protein self-assembly by turbidity and other techniques, Method. Enzymol., 130, 47-59.

116. Yu, M.-H., Glazer, A.N., and Williams, R.C. (1981) Cyanobacterial phycobilisomes. Phycocyanin assembly in the rod substructures of Anabaena variabilis phycobilisomes, J. Biol. Chem., 256, 13130-13136.

117. Lundell, D.J., Williams, R.C., and Glazer, A.N. (1981) Molecular architecture of a light-harvesting antenna. In vitro assembly of the rod substructures of Synechococcus 6301 phycobilisomes, J. Biol. Chem., 256, 3580-3592.

118. Stec, В., Troxler, R.F., and Teeter, M.M. (1999) Crystal structure of C-phycocyanin from Cyanidium caldarium provides a new perspective on phycobilisome assembly, Biophys. J., 76, 2912-2921.

119. Стадничук, И.Н. (1990) Фикобилипротеины, Итоги науки и техники, Серия Биологическая химия, 40, 1-196.

120. Glazer, A.N., Fang, S., and Brown, D.M. (1973) Spectroscopic properties of C-phycocyanin and of its a and subunits, J. Biol Chem., 248, 5679-5685.

121. MacColl, R., Csatorday, K., Berns, D.S., and Traeger, E. (1980) Chromophore interaction in allophycocyanin, Biochemistry, 19, 2817-2820.

122. Foguel, D., and Weber, G. (1995) Pressure-induced dissociation and denaturation of allophycocyanin at subzero temperatures, J. Biol. Chem., 270, 28759-28766.

123. MacColl, R„ Malak, H., Cipollo, J., Label, В., Ricci, G., MacColl, D., and Eisele, L.E. (1995) Studies on the dissociation of cryptomonad biliproteins, J. Biol. Chem., 270, 2755527561.

124. Liu, J.-Y., Jiang, Т., Zhang, J.-P., and Liang, D.-C. (1999) Crystal structure of allophycocyanin from red algae Porphyra yezoensis at 2.2-A resolution, J. Biol. Chem., 274, 16945-16952.

125. Sugimoto, Т., Kikushima, M., Saito, M., and Suzuki, H. (1984) Models for the change in chromophore structure of allophycocyanin corresponding to its observed reversible change in absorbance, J. Phys. Soc. Jpn, 53, 873-881.

126. Berns, D.S., and MacColl, R. (1989) Phycocyanin in physical-chemical studies, Chem. Rev., 89, 807-825.

127. Blauer, G., and Wagnier, G. (1975) Conformation of bilirubin and biliverdin in their complexes with serum albumin, J. Am. Chem. Soc., 97, 1949-1954.

128. Schirmer, Т., Bode, W., and Huber, R. (1987) Refined three-dimentional structures of two cyanobacterial C-phycocyanins at 2.1 and 2.5 A resolution. A common principle of phycobilin-protein interaction, J. Mol. Biol., 196, 677-695.

129. Greene, B.I., Lamola, A.A., and Shank, C.V. (1981) Picosecond primary photoprocesses of bilirubin bound to human serum albumin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 2008-2012.

130. Оптическая плотность при 445 нмел о оо Ъзо Ъзо00