Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Русанов, Александр Леонидович

• Русанов, Александр Леонидович
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Русанов, Александр Леонидович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура GFP-подобных белков

2.2. Применение цветных флуоресцирующих белков

2.3. Фотоактивируемые флуоресцирующие белки

2.4. Фотохимическая конверсия

2.5. Процессы протонирования-депротонирования хромофора в GFP

2.6. Роль планарности и цис-транс изомеризации в фотофизических свойствах флуоресцирующих белков

2.7. Влияние белкового окружения хромофора на свойства флуоресцирующих белков

2.8. Квантово-химическое моделирование процесса разгорания KFP

2.9. Индуктивно-резонансный перенос энергии между флуоресцирующими белками

2.10. Выбор флуоресцирующих белков для метода FRET

2.11. Способы измерения FRET

2.11.1. Спектральный метод

2.11.2. Измерение времён жизни флуоресценции

2.12. Генно-инженерные конструкции для FRET

2.13. Межмолекулярный FRET

2.14. Внутримолекулярный FRET

2.15. Структура линкеров

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Используемые реагенты и оборудование

3.2. Выделение, очистка и трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК

3.3. Экспрессия и выделение белков с 6-гистидиновым тагом

3.4. Электрофорез белков

3.5. Титрование белков *

3.6. Спектральные измерения

3.7. Кинетические измерения

3.7.1. Кинетики разгорания и тушения флуоресценции KFP

3.7.2. Необратимая фотоконверсия KFP

3.8. Метод получения генетической конструкции для оценки эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии

3.8.1. Амплификация генов красных флуоресцирующих белков с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3.8.2. Клонирование генов красных флуоресцирующих белков в экспрессирующихся в про- и эукариотических клетках векторах

3.8.3. Встраивание литерных последовательностей, содержащих сайт узнавания каспазы-З между парой красных флуоресцирующих белков

3.8.4. Конструирование плазмиды pET22b/TagRFP-23-KFP для изучения эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии между парой красных флуоресцирующих белков in vitro

3.9. Изучение синтеза рекомбинантного белка TagRFP-23-KFP в клетках Е. Coli

3.10. Очистка рекомбинантного белка TagRFP-23-KFP

3.10.1. Осаждение сульфатом аммония

3.10.2. Ионообменная хроматография

3.10.3. Гель-фильтрация

3.11. Динамическое светорассеяние

3.12. Иммуноблоттинг

3.13. Трансфекция эукариотических клеток

3.14. Измерение времён жизни

3.15. Планарный имиджинг 68 3.15. Определение активности каспазы-3 in vitro

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Спектрально-флуоресцентные свойства KFP

4.1.1. Анализ рН-зависимостей asCP и его мутантов

4.1.2. Кинетики разгорания и тушения KFP

4.1.3. Квантово-механическое - молекулярно-механическое моделирование процесса разгорания

4.1.4. Необратимая фотоактивация KFP

4.2. Обоснование выбора FRET-пары

4.3. Получение и характеристика FRET-пары

4.3.1. Конструирование плазмиды

4.3.2. Свойства полученного белка

4.3.2.1. Характеристика размеров TagRFP-23-KFP

4.3.2.2. Спектральные свойства выделенной конструкции

4.4. Определение эффективности переноса энергии

TagRFP в конструкции TagRFP-23-KFP

4.4.1. Разложение спектров флуоресценции с помощью распределения Гаусса

4.4.2. Измерение времён жизни флуоресценции TagRFP-23-KFP

4.5. Определение эффективности расщепления TagRFP-23-KFP под действием каспазы

4.5.1. Стационарная флуоресцентная спектроскопия

4.5.2. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением

4.5.3. Электрофорез и иммуноблоттинг

4.6. Верификация полученной молекулярной модели на эукариотических клеточных линиях и животных

4.6.1. Трансфекция эукариотических клеток

4.6.2. Изучение активации каспазы-3 в клетках

MelKor под действием индукторов апоптоза

4.6.3. Верификация полученной молекулярной модели на животных

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии»

Флуоресценция используется для визуализации процессов клеточной биологии на различных уровнях, от отдельных молекул до целых организмов [1]. Традиционные методы, основанные на флуоресцентных красителях, требуют инвазивного введения внутрь клетки. Эти ограничения можно преодолеть благодаря использованию зеленого флуоресцирующего белка GFP и его гомологов. При этом присоединение их к интересующим белкам, благодаря их относительно небольшой и компактной структуре, слабо или совершенно не влияет на исходные свойства изучаемых белков [2]. Использование флуоресцирующих белков позволяет вести неинвазивное наблюдение экспрессии репортёрных генов, внутриклеточного перемещения белков и динамики биохимических сигналов в живых клетках и организмах [1].

Зелёный флуоресцирующий белок был впервые выделен в 1962 году из медузы Aequorea Victoria, за 30 лет до того, как была расшифрована последовательность кодирующей этот белок кДНК. Хотя были получены мутанты с голубой, синей и желто-зеленой флуоресценцией, ни для одного из них максимум эмиссии не превышал 529 нм [3]. Открытие новых «GFP-подобных» протеинов из кораллов рода Anthozoa значительно расширило набор цветов доступных для использования в биологических приложениях [4, 5].

Знание и понимание функций ключевых ферментов в метаболических процессах в режиме реального времени - это те задачи, которые решаются с помощью современных достижений в области физики, химии и биологии. Одно событие или процесс могут описываться целым каскадом биохимических реакций и молекулярных событий. В этом случае традиционные методы in vitro не применимы или частично применимы для оценки взаимосвязи индивидуальных молекулярных процессов в клеточных метаболических путях. Таким образом, определение ферментативной активности in vivo в реальном времени остается сложной комплексной задачей. На сегодняшний момент решение таких задач стало возможно при использовании методов исследования, позволяющих вести мониторинг молекулярных событий на уровне одной функционирующей клетки.

Использование методов, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии (FRET) между двумя флуоресцирующими белками позволило существенно увеличить возможности применения этих белков в качестве маркеров в живых клетках для наблюдения за биологическими механизмами и физиологическими функциями клетки [6].

FRET-биосенсоры на основе флуоресцирующих белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами, в которых используется конъюгация с синтетическими красителями. Во-первых, они могут быть сконструированы путем простых генетических манипуляций и доставлены в клетки с помощью трансфекции и последующей экспрессии; во-вторых, им можно придать сигналы внутриклеточной или тканевой локализации, что позволяет вести наблюдение как за органеллами и отдельными клетками, так и за целыми организмами. Это открывает новые возможности для изучения действия лекарственных препаратов непосредственно на живых организмах, а использование методов с высокой разрешающей способностью позволяет вести наблюдение за динамикой молекулярных процессов внутри живых систем. Визуализация процессов в реальном времени, а также количественная оценка эффективности действия лекарственных средств делают такие биосенсоры перспективным инструментом для проведения доклинического скрининга новых препаратов на лабораторных животных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура СРР-подобных белков

Экспрессия генов флуоресцирующих белков возможна в любых живых клетках, при этом посттрансляционная модификация белка не требует введения дополнительных ферментов, кофакторов или каких-либо других вспомогательных веществ, кроме кислорода, поскольку хромофор образуется путем автокаталитической циклизации и окисления трех аминокислот (в случае вРР это 8ег65-Туг66-01у67) [7]. Этому предшествует образование структуры полого цилиндра ((3-бочонка), внешняя сторона которого образована одиннадцатью антипараллельными р-листами. Диаметр такого цилиндра составляет приблизительно 24 А, а высота 42 А. Хромофор находится внутри этой структуры и связан а-спиральными участками, проходящими вдоль оси бочонка. Короткие фрагменты а-спиралей и петли образуют «крышки», закрывающие цилиндр сверху и снизу. Такой плотно сконструированный бочонок служит, по-видимому, для защиты хромофора, обеспечивая стабильность и устойчивость при нагревании и действии денатурирующих агентов. Структура данного типа характерна для всех флуоресцирующих белков [8]. Хромофор всегда образуется из трех аминокислот, при этом первая из них может быть практически любой, а две другие (Туг и в1у) в природе инвариантны. Методами направленного мутагенеза было показано, что Туг может быть заменен на любую другую ароматическую аминокислоту. И только в1у67 сохраняется во всех флуоресцирующих белках [9], так как он является лучшим нуклеофилом в подобных циклизациях, поскольку создает минимальные стерические затруднения [8].

Белки с синей и зеленой флуоресценцией имеют хромофоры химически идентичные хромофору ОБР, в то время как желтые и красные флуоресцирующие варианты подвергаются дополнительной реакции окисления, в результате которой образуется ацилимин. Возможны также дальнейшие химические превращения, приводящие к образованию хромофоров с уникальными свойствами (рис. 1) [9]. флуоресцирующих белков. Хромофоры вРР и ОзЯес! являются промежуточными соединениями для образования других структур. Рисунок взят из работы [9].

Так, в гРР538 остаток лизина хромофора подвергается циклизации, взаимодействуя с собственной а-карбонильной группой, образуя при этом тетрагидропиридиновое кольцо. В т-Огаг^е треонин взаимодействует с карбонильным атомом углерода, образуя дигидроксиоксазольный цикл. В фотоконвертируемом белке Каес1е путем светоиндуцируемой реакции зеленый хромофор Нлэ-Туг-Иу необратимо переходит в красный, что сопряжено с разрывом цепи. Наконец, в фотоактивируемом «разгорающемся флуоресцирующем белке» (КРТ) хромофор подвергается автокаталитическому гидролизу ацилимина, в результате чего образуется кето-форма. Определяющим в цвете флуоресценции является размер системы сопряжения, при этом локальные эффекты среды, такие как положение заряженных групп внутри белка, могут приводить к сдвигу максимума в спектре поглощения и эмиссии до 20 нм любом направлении [3, 9].

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Русанов, Александр Леонидович

6. выводы

1) Показано, что флуоресцентные свойства KFP обусловлены набором конформеров, равновесие между которыми зависит от значения рН. Движение в щелочную область рН приводит к увеличению концентрации флуоресцирующего конформера.

2) При щелочных рН установлено существование двух флуоресцирующих конформеров, по-разному реагирующих на действие синего света. Один из них при облучении светом с длиной волны 470 нм возвращается в нефлуоресцирующее состояние, другой не чувствителен к облучению.

3) Получены плазмиды для экспрессии белка слияния TagRFP-23-KFP в прокариотических и эукариотических клетках.

4) Определена эффективность переноса энергии в созданном сенсоре TagRFP-23-KFP, равная 51.1%, что соответствует расстоянию между белками в 4565 Á.

5) Под воздействием каспазы-3 на полученный сенсор TagRFP-23-KFP, представляющим собой конструкцию на основе двух красных белков TagRFP и KFP, соединённых линкером с сайтом расщепления каспазой-3, уровень переноса энергии снижается с 51.1% до 0%.

6) Инкубация клеток линии MelKor, эскпрессирующих белок TagRFP-23-KFP, с индуктором апоптоза камптотецином приводит к исчезновению компоненты со временем жизни флуоресценции равным 1.2 не, что характерно для расщепленной конструкции.

7) Показана возможность дискриминации расщеплённой и нерасщеплённой конструкции на животных ш vivo флуоресцентными методами с временным разрешением.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биосенсоры на основе индуктивно-резонансного переноса энергии между цветными флуоресцирующими белками позволяют наблюдать за широким диапазоном молекулярных событий, такими как белок-белковые взаимодействия, конформационные изменения молекул, каталитические функции ферментов и изменение концентрации биомолекул в живых клетках. Они являются важным инструментом современной клеточной и молекулярной биологии, поскольку обладают уникальными преимуществами, среди которых генетически кодируемая флуоресценция, простота генетических манипуляций и доставки внутрь клетки, возможность легко пометить изучаемые органеллы и ткани.

Однако на данный момент все известные FRJET-пары обладают некоторыми недостатками, что снижает динамический диапазон измерений. Одно из направлений по улучшению FRET-биосенсоров заключается в измерении FRET по временам жизни и в получении новых FRET-nap с модифицированными свойствами за счет изменения ориентационного и дистанционного факторов.

Сенсоры на основе FRET могут быть использованы для наблюдения за сложными и комплексными молекулярными процессами, такими как передача сигналов или изучение метаболических путей внутри трансгенных животных. Возможность in vivo имиджинга в реальном времени позволяет заглянуть вглубь биологических механизмов и физиологических функций клетки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Русанов, Александр Леонидович, 2010 год

1. В. Giepmans, S. Adams, М. Ellisman, R. Tsien, Science 312, 217 (2006).

2. W. Du, Y. Wang, Q. Luo, B.-F. Liu, Anal. Bioanal. Chem. 386, 444 (2006).

3. R. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 67, 509 (1998).

4. M. Matz, A. Fradkov, Y. Labas, A. Savitsky, A. Zaraisky, M. Markelov, and S. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 17, 969 (1999).

5. A. Miyawaki, Neuron 48, 189 (2005).

6. K. Truong and M. Ikura,Cur. Opin. in Struct. Biol. 11, 573 (2001).

7. R. Heim, D. Prasher and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 12501 (1994).

8. H. Зубова, А. Булавина, А.Савицкий, Успехи биологической химии 43, 163 (2003).

9. J. Remington, Curr. Opinion in Struct. Biol. 16, 714 (2006).

10. N. Shaner, P. Steinbach, and R. Tsien, Nat. Meth. 2, 905 (2005).

11. N. Zubova, V. Korolenko, A. Astafyev, A. Petrukhin, L. Vinokurov, O. Sarkisov and A. Savitsky, Biochem. 44, 3982 (2005).

12. Y. Yanushevich, D. Staroverov, A. Savitsky, A. Fradkov, N. Gurskaya, M. Bulina, K. Lukyanov, and S. Lukyanov, FEBS Lett. 511, 11 (2002).

13. R. Campbell, O. Tour, A. Palmer, P. Steinbach, G. Baird, D. Zacharias, and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99, 7877 (2002).

14. J. Wiedenmann, В. Vallone, F. Renzi, К. Nienhaus, S. Ivanchenko, С. Röcker, and G. Nienhaus, J. Biomed. Opt. 10, 14003 (2003).

15. J. Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. Röcker, A. Salih, K.-D. Spindler, and G. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101, 15905 (2004).

16. T. Kogure, S. Karasawa, T. Araki, K. Saito, M. Kinjo, and A. Miyawaki, Nat. Biotechnol. 24, 577 (2006).

17. E. Galperin, V. Verkhusha, and A. Sorkin, Nat. Meth. 1, 209 (2004).

18. M. Bulina, K. Lukyanov, O. Britanova, D. Onichtchoulc, S. Lukyanov, and D. Chudakov, Nat. Protocols 1, 947 (2006).

19. M. Zimmer, Chem. Rev. 102, 759 (2002).112

20. Н. Зубова, А.Савицкий, Успехи биологической химии 45, 391 (2005).

21. R. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 67, 509 (1998).

22. C.-W. Lin, C. Jao, and A. Ting, J. Am. Chem. Soc. 126, 5982 (2004).

23. T. Evers, M. Appelhof, P. de Graaf-Heuvelmans, E. Meijer, and M. Merkx, J. Mol. Biol. 374,411 (2007).

24. A. Terskikh, A. Fradkov, G. Ermakova, A. Zaraisky, P. Tan, A. Kajava, X. Zhao, S. Lukyanov, M. Matz, S. Kim, I. Weissman, and P. Siebert, Science 290, 1585 (2000).

25. V. Belousov, A. Fradkov, K. Lukyanov, D. Staroverov, K. Shakhbazov, A. Terskikh, and S. Lukyanov, Nat. Methods 3, 281 (2006).

26. K. Piatkevich, E. Efremenko, V. Verkhusha, and S. Varfolomeev, Russ. Chem. Rev. 79, 243 (2010).

27. K. Lukyanov, D. Chudakov, S. Lukyanov, and V. Verkhusha, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 885 (2005).

28. S. J. Remington, Curr. Opin. in Struct. Biol. 16, 714 (2006).

29. А.А. Красновский мл., Биохимия, 72, 1311 (2007).

30. A. Jiménez-Banzo, S. Nonell, J. Hofkens, and C. Flors, Biophys. J. 94, 168-172 (2008).

31. J. van Thor, T. Gensch, K. Hellingwerf, and L. Johnson, Nat. Struct. Biol. 9, 37 (2002).

32. D. Chudakov, V. Verkhusha, D. Staroverov, E. Suslova, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 22, 1435 (2004).

33. R. Ando, H. Hama, M. Yamamoto-Hino, H. Mizuno, and A. Miyawaki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12651 (2002).

34. H. Mizuno, T. Mal, K. Tong, R. Ando, Т. Furuta, M. Ikura, and A. Miyawaki, Mol. Cell 12, 1051 (2003).

35. S. Ivanchenko, C. Rocker, F. Oswald, J. Wiedenmann and G. Nienhaus, J. Biol. Phys. 31, 249 (2005).

36. S. Mckinney, C. Murphy, K. Hazelwood, M. Davidson, and L. Looger, Nat. Methods 6, 131 (2009).

37. H. Tsutsui, S. Karasawa, H. Shimizu, N. Nukina, and A. Miyawaki, EMBO reports 6, 233 (2005).

38. S. Habuchi, H. Tsutsui, A. Kochaniak, A. Miyawaki, and A. van Oijen, PLoS ONE 3: e3944 (2008).

39. N. Gurskaya, V. Verkhusha, A. Shcheglov, D. Staroverov, T. Chepurnykh, A. Fradkov, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 24, 461 (2006).

40. K. Lukyanov, A. Fradkov, N. Gurskaya, M. Matz, Y. Labas, A. Savitsky, M. Markelov, A. Zaraisky, X. Zhao, Y. Fang, W. Tan, and S. Lukyanov, J. Biol. Chem. 275, 25879 (2000).

41. D. Chudakov, A. Feofanov, N. Mudrik, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, J. Biol. Chem. 278, 7215 (2003).

42. D. Chudakov, V. Belousov, A. Zaraisky, V. Novoselov, D. Staroverov, D. Zorov, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 21, 191 (2003).

43. J. Lippincott-Schwartz and G. Patterson, Science 300, 87 (2003).

44. S. Habuchi, R. Ando, P. Dedecker, W. Verheijen, H. Mizuno, A. Miyawaki, and J. Hofkens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 9511 (2005).

45. M. Quillin, D. Anstrom, X. Shu, S. O'Leary, K. Kallio, D. Chudakov, and J. Remington, Biochemistry 44, 5774 (2005).

46. P. Wilmann, J. Petersen, R. Devenish, M. Prescott, and J. Rossjohn, J. Biol. Chem. 280, 2401 (2005).

47. P. Schwille, S. Kummer, A. Heikal, W. Moerner, and W. Webb, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 151 (2000).

48. M. Chen, C. Lambert, J. Urgitis, and M. Zimmer, Chem. Phys. 270, 157 (2001).

49. M. Cotlet, J. Hofkens, M. Maus, T. Gensch, M. Van der Auweraer, J. Michiels, G. Dirix, M. Van Guyse, J. Vanderleyden, A. Visser, and F. De Schryver, J. Phys. Chem. B 105, 4999 (2001).

50. J. Wiedenmann, C. Elke, K.-D. Spindler, and W. Funke, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14091 (2000).

51. V. Martynov, A. Savitsky, N. Martynova, P. Savitsky, K. Lukyanov, and S. Lukyanov, J. Biol. Chem. 276, 21012 (2001).114

52. V. Zagranichny, N. Rudenko, A. Gorokhovatsky, M. Zakharov, T. Balashova, and A. Arseniev. Biochemistry 43, 13598 (2004).

53. J. Kennis, D. Larsen, I. van Stokkum, M. Vengris, J. van Thor and R. van Grondelle, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101, 17988 (2004).

54. A. Bell, D. Stoner-Ma, R. Wächter, and P. Tonge, J. Am. Chem. Soc. 125, 6919 (2003).

55. S. Habuchi, M. Cotlet, T. Gensch, T. Bednarz, S. Haber-Pohlmeier, J. Rozenski, G. Dirix, J. Michiels, J. Vanderleyden, J. Heberle, F. De Schryver, and J. Hofkens, J. Am. Chem. Soc. 127, 8977 (2005).

56. M. Chattoraj, B. King, G. Bublitz, and S. Boxer, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 8362 (1996).

57. H. Lossau, A.Kummer, R.Heinecke, F. Pollinger-Dammer, C. Kompa, G. Bieser, T. Jonsson, C. Silva, M. Yang, D. Youvan, M. Michel-Beyerle, Chem. Phys. 213, 1 (1996).

58. J. Petersen, P. Wilmann, T. Beddoe, A. Oakley, R. Devenish, M. Prescott, and J. Rossjohn, J. Biol. Chem. 278, 44626 (2003) .

59. K. Nienhaus, B. Vallone, F. Renzi, J. Wiedenmann, and G. Nienhaus, Acta Crystallogr. D59, 1253 (2003).

60. M. Prescott, M. Ling, T. Beddoe, A. Oakley, S. Dove, O. Hoegh-Guldberg, R. Devenish, and J. Rossjohn, Structure 11, 275 (2003).

61. P. Wilmann, J. Petersen, A. Pettikiriarachchi, A. Buckle, S. Smith, S. Olsen, M. Perugini, R. Devenish, M. Prescott, and J. Rossjohn, J. Mol. Biol. 349, 223 (2005).

62. S. Olsen and S. Smith, J. Am. Chem. Soc. 129, 2054 (2007).

63. X. He, A. Bell, P. Tonge, FEBS Letters 549, 35 (2003).

64. T. Schüttrigkeit, T. von Feilitzsch, C. Kompa, K. Lukyanov, A. Savitsky, A.Voityuk, and M.E. Michel-Beyerle, Chem. Phys. 323, 149 (2006).

65. I. Yampolsky, J. Remington, V. Martynov, V. Potapov, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Biochemistry 44, 5788 (2005).

66. X. He, A. Bell, and P. Tonge, Org. Lett. 4, 1525 (2002).

67. D. Yarbrough, R. Wächter, K. Kallio, M. Matz, and J. Remington, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 462 (2001),.

68. M. Seifert, J. Georgescu, D. Ksiazek, P. Smialowski, T. Rehm, B. Steipe, and T. Hola, Biochemistry 42, 2500 (2003).

69. A. Terskikh, A. Fradkov, A. Zaraisky, A. Kajava, and B. Angres, J. Biol. Chem. 277, 7633 (2002).

70. M. Andresen, M. Wahl, A. Stiel, F. Gräter, L. Schäfer, S. Trowitzsch, G.Weber, C. Eggeling, H. Grubmüller, S. Hell, and S. Jakobs, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102, 13070 (2005).

71. N. Henderson and J. Remington, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102, 12712 (2005).

72. K. Bravaya, A. Bochenkova, A. Granovsky, A. Savitsky, A. Nemukhin, J. Phys. Chem. A, 112, 8804 (2008).

73. J. Battad, P. Wilmann, S. Olsen, E. Byres, S. Smith, S. Dove, K. Turcic, R. Devenish, J. Rossjohn, M. Prescott, J. Mol. Biol. 368, 998 (2007).

74. A. Nemukhin, I. Topol, B. Grigorenko, A. Savitsky, J. Collins, J. Mol. Struct. (THEOCHEM), 863, 39 (2008).

75. R. Bizzarri, R. Nifosi, S.Abbruzzetti, W. Rocchia, S. Guidi, D. Arosio, G. Garau, B. Campanini, E. Grandi, F. Ricci, C. Viappiani, F.Beltram, Biochemistry, 46, 5494 (2007).

76. B. Grigorenko, A. Savitsky, I. Topol, S. Burt, A.Nemukhin. J. Phys. Chem. B, 110, 18635 (2006).

77. L. Schäfer, G. Groenhof, A. Klingen, G. Ullmann, M. Boggio-Pasqua, M. Robb, andH. Grabmüller, Angew. Chemie Int. Ed. 2007,119, 530-536.

78. L. Schäfer, G. Groenhof, M. Boggio-Pasqua, M. Robb, and H. Grubmüller, PLoS Comput. Biol. 2008, 4, el000034.

79. M. Martin, F. Negri, and M. Olivucci, J. Am. Chem. Soc. 126, 5452 (2004).

80. B. Grigorenko and A. Nemukhin, Proceedings of SPIE 6449, 6449001 (2007).

81. B. Grigorenko, A. Savitsky, I. Topol, S. Burt, A. Nemukhin. Chem. Phys. Lett. 424, 184 (2006).

82. Li, E. Pham, and K. Truong, J. Biotechnol. Lett. 28, 1971 (2006).116

83. Joseph R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Second Edition, 1999, Kluwer Academic/ Plenum Publishers, New York, 367-373.

84. G. Patterson, D. Piston, and B. Barisas, Anal. Biochem. 284, 438 (2000).

85. K. Jensen, L. Martini, and T. Schwartz, Biochem. 40, 938 (2001).

86. J. Vinkenborg, T. Evers, S. Reulen, E. Meijer, and M. Merkx, ChemBioChem 8, 119(2007).

87. S. Shimozono, H. Hosoi, H. Mizuno, T. Fukano, T. Tahara, and A. Miyawaki, Biochem. 45, 6267 (2006).

88. T. Evers, E. van Dongen, A. Faesen, E. Meijer, and M. Merkx, Biochem. 45, 13183 (2006).

89. A. Livesey and J.-C.Brochon, Biophys. J. 52, 693 (1987).

90. J.-C. Brochon, Methods Enzymol. 240, 262 (1994).

91. A. Visser , S. Laptenok, N. Visser, A. van Hoek, D. Birch, J.-C. Brochon5 and J. Borst, Europ. Biophys. J. 39, 241 (2010).

92. M. Matz, A. Fradkov, Y. Labas, A. Savitsky, A. Zaraisky, M. Markelov, and S. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 17, 969 (1999).

93. A. Sinicropi, T. Andruniow, N. Ferre, R. Basosi, M. Olivucci, J. Am. Chem. Soc. 127, 11534(2005).

94. A. Nemukhin, B. Grigorenko, A. Savitsky, Acta Naturae, 2, 33 (2009).

95. B. Pollok and R. Heim, Trends in Cell Biol. 9, 57 (1999).

96. Fluorescent Proteins, Methods in Cell Biology, Second Edition, edited by Kevin F. Sullivan, 2008, Academic Press, 382-393.

97. M.Rizzo, G. Springer, B. Granada, and D. Piston , Nat. Biotechnol. 22, 445 (2004).

98. G.-J. Kremers, J. Goedhart, E. van Munster, and T. Gadella, Biochem. 45, 6570 (2006).

99. M. Lelimousin, M. Noirclerc-Savoye, C. Lazareno-Saez, B. Paetzold, S. Le Vot, R. Chazal, P. Macheboeuf, M. Field, D. Bourgeois, A. Royant, Biochem. 48, 10038 (2009).

100. A. Müller-Taubenberger and K. Anderson. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77, 1 (2007).

101. H. Mizuno, A. Sawano, P. Eli, H. Hama, and A. Miyawaki, Biochem. 40, 2502 (2001).

102. N. Gurskaya, A. Fradkov, A. Terskikh, M. Matz, Y. Labas, V. Martynov, Y. Yanushevich, K. Lukyanov, S. Lukyanov, FEBS Lett. 507, 16 (2001).

103. R. Steinmeyer, A. Noskov, C. Krasel, I. Weber, C. Dees, and G. Harms, J. Fluor. 15, 707 (2005).

104. R. Strack, B. Hein, D. Bhattacharyya, S. Hell, R. Keenan, and B. Glick, Biochem. 48, 8279 (2009).

105. A. Doerr, Nature Methods, 6, 482 (2009).

106. J. Goedhart, J. Vermeer, M. Adjobo-Hermans, L. van Weeren, T. Gadella Jr., PLoS ONE, 2, elOl 1 (2007).

107. O. Zapata-Hommer, O. Griesbeck, BMC Biotechnol. 3, 5 (2003).

108. T. Nagai, A. Sawano, E. Park, and A. Miyawaki, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 3197(2001).

109. M. Mank, D. Reiff, N. Heim, M. Friedrich, A. Borst, and O. Griesbeck, Biophys. J. 90, 1790 (2006).

110. Y. Huang, and C. Bystroff, Biochem. 48, 929 (2009).

111. J. Lippincott-Schwartz and G. Patterson, Science 300, 87 (2003). 112.1. Majoul, Int. J. Med. Microbiol. 293, 1 (2004).

112. Y. Yan and G. Marriott, J. Cur. Opinion in Chem. Biol. 7, 635 (2003).

113. A. Harpur, F. Wouters, and P. Bastiaens, Nat. Biotechnol. 19, 167 (2001).

114. M. Pedersen, M. Carmosino, and B. Forbush, J. Biol. Chem. 283, 2663 (2007).

115. E. Zelazny, J. Borst, M. Muylaert, H. Batoko, M. Hemminga, and F. Chaumont, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 104, 12359 (2007).

116. S. Scolari, S. Engel, N. Krebs, A. Pia Plazzo, R. De Almeida, M. Prieto, M. Veit, and A. Herrmann, J. Biol. Chem. 284, 15708 (2009).

117. S. Ganesan, S. Ameer-beg, T. Ng, B. Vojnovic, and F. Wouters, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 103, 4089 (2006).

118. R. Cummings, H. McGovern, S. Zheng, Y. Park, and J. Hermes, Anal. Biochem. 269, 79 (1999).

119. E. Heyduk and I. Heyduk, Anal. Biochem. 248, 216 (1997).

120. P.R. Selvin, Annu. Rev. Biophys. Biomembr. 31, 275 (2002).

121. P.R. Selvin, Nature Struct. Biol. 7, 730 (2000).

122. K. Lundin, K. Blomberg, T. Nordstrom, and C. Lindqvist, Anal. Biochem. 299, 92 (2001).

123. K. Stenroos, P. Hurskainen, S. Eriksson, I. Hemmila, K. Blomberg, and C. Lindqvist, Cytokine 10, 495 (1998).

124. K. Blomberg, P. Hurskainen, and I. Hemmila, Clin. Chem. 45, 855 (1999).

125. S. Kane, C. Fleener, Y. Zhang, L. Davis, A. Musselman, and P. Huang, Anal. Biochem. 278, 29 (2000).

126. E. Lopez-Crapez, H. Bazin, E. Andre, J. Noletti, J. Greinier, and G. Mathis, Nucleic Acid Res. 29, 1 (2001).

127. L. Arslanbaeva, V. Zherdeva, T. Ivashina, L. Vinokurov, A. Rusanov, and A. Savitsky, App. Biochem. and Microbiol. 46, 154 (2010).

128. L. Martin, B. Sculimbrene, M. Nitz, and B. Imperiali, QSAR Comb. Sci. 24, 1149(2005).

129. I. Clark, I. Hill, M. Sikorska-Walker, J. MacManus, and A. Szabo, FEBS Lett. 333,96 (1993). •

130. Maliwal, B.P., Gryczynski, Z., and Lakowicz, J.R., Anal. Chem. 73, 4277 (2001).

131. H. Rajapakse, N. Gahlaut, S. Mohandessi, D. Yu, J. Turner, and L. Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 107, 13582 (2010).

132. J. Kramer, L. Yi, F. Shen, A. Maitra, X. Jiao, T. Jin, and S. Gaffen, J. Immunol. 176,711 (2006).1341. Azpiazu and N. Gautam, J. Biol. Chem. 279, 27709 (2004).

133. T. Weiss, C. Chamberlain, T. Takeda, P. Lin, K. Hahn, and M. Farquhar, Proc.

134. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14961 (2001).

135. B. Camuzeaux, C. Spriet, L. Heliot, J. Coll, and M. Duterque-Coquillaud, Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 1107 (2005).

136. R. Latif, P. Graves, and T. Davies, J. Biol. Chem. 276, 45217 (2001).1381. Majoul, M. Straub, R. Duden, S. Hell, and H.-D. Soling, Dev. Cell 1, 1 (2001).

137. T. Wurch, A. Matsumoto, and P.J. Pauwels, FEBS Lett. 507, 109 (2001).

138. V. Lissandron, A. Terrin, M. Collini, L D'alfonso, G. Chirico, S. Pantano, and M. Zaccolo, J. Mol. Biol. 354, 546 (2005).

139. M. Zaccolo, T. Cesetti, G. Di Benedetto, M. Mongillo, V. Lissandron, A. Terrin, and I. Zamparo, Biochem. Soc. Trans. 33, 1323 (2005).

140. E. Yeow and A. Clayton, Biophys. J. 92, 3098 (2007).

141. I. Gautier, M. Tramier, C. Durieux, J. Coppey, R. B. Pansu, J-C. Nicolas, K. Kemnitz, and M. Coppey-Moisan, Biophys. J. 80, 3000 (2001).

142. K. Yoshitake, S. Waki, and H. Ueda, Biosens. Bioelectr. 23, 1266 (2008).

143. T. Endoh, M. Mie, and E. Kobatake, J. Biotechnol. 133, 413 (2008).

144. A. Rodriguez, J. Condeelis, R. Singer, J. Dictenberg, Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 202 (2007).

145. M. Rehm, H. Dussmann, R. Janicke, J. Tavare, D. Kogel, and J. Prehn, J. Biol. Chem. 277, 24506 (2002).

146. K. Luo, V. Yu, Y. Pu, and D. Chang, Biochem.Biophys. Res. Commun. 304, 217 (2003).

147. J. Chiang and K. Truong, Biotechnol. Lett. 27, 1219 (2005).

148. T. Awaji, A. Hirasawa, H. Shirakawa, G. Tsujimoto, and S. Miyazaki, Biochem. Biophys. Res. Comm. 289, 457 (2001).

149. T. Remus, A. Zima, J. Bossuyt, D. Bare, J. Martin, L. Blatter, D. Bers, and G. Mignery, J. Biol. Chem. 281, 608 (2006).

150. A. Tanimura, A. Nezu, T. Morita, R.Turner, and Y. Tojyo, J. Biol. Chem. 279, 38095 (2004).

151. S. De, I. Macara, D. Lannigan, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 96, 235 (2005).

152. T. Endoh, H. Funabashi, M. Mie, and E. Kobatake, Anal. Chem. 77, 4308 (2005).

153. M. Fehr, S. Lalonde, I. Lager, M. Wolff, and W. Frommer, J. Biol. Chem. 278, 19127 (2003).

154. M. Fehr, S. Lalonde, D. Ehrhardt, and W. Frommer, J. Fluor. 14, 603 (2004).

155. M. Fehr, W. Frommer, and S. Lalonde, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99, 9846 (2002).

156. S. Okumoto, L. Looger, K. Micheva, R. Reimer, S. Smith, and W. Frommer, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 102, 8740 (2005).

157. H. Takanaga, B. Chaudhuri, and W. Frommer, Biochim. Biophys. Acta 1778, 1091 (2007)

158. P. Dittmer, J. Miranda, J. Gorski, and A. Palmer, J Biol Chem. 284, 16289 (2009).

159. A. Tanimura, T. Morita, A. Nezu, A. Shitara, N. Hashimoto, and Y. Tojyo, J. Biol. Chem. 284, 8910 (2009).

160. H. Imamura, K. Nhat, H. Togawa, K. Saito, R. lino, Y. Kato-Yamada,T. Nagai, and H. Noji, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 106, 15651 (2009).

161. A. Yamada, K. Hirose, A. Hashimoto, and M. lino, Biochem. J. 385, 589 (2005).

162. D. Braun, S. Garfield, and P. Blumberg, J. Biol. Chem. 280, 8164 (2005).

163. M. Sato, T. Ozawa, K. Inukai, T. Asano, and Y. Umezawa, Nat. Biotechnol. 20, 287 (2002).

164. A. Ting, K. Kain, R. IClemke, and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 15003 (2001).

165. Y. Wang, E. Botvinick, Y. Zhao, M. Berns, S. Usami, R. Tsien, and S. Chien, Nature 434, 1040 (2005).

166. B. Hall, M. McLean, K. Davis, J. Casanova, S. Sligar, and M. Schwartz, Anal. Biochem. 374, 243 (2007).

167. R. Itoh, K. Kurokawa, Y. Ohba, H. Yoshizaki, N. Mochizuki, and M. Matsuda, Mol. and Cell. Biol. 22, 6582 (2002).

168. A. Collinson, S.Bligh, D. Graham, H. Mott, P. Chalk, N. Korniotis, and P. Lowe, ASSAY and Drug Dev.Technol. 2, 659 (2004).

169. A. Seth, T. Otomo, H. Yin, and M. Rosen, Biochem. 42, 3997 (2003).121

170. C.-W. Lin, C. Jao, and A. Ting, J. Am. Chem. Soc. 126, 5982 (2004).

171. K. Osibow, R. Malli, G. Kostner, and W. Graier, J. Biol. Chem. 281, 5017 (2006).

172. A. Miyawaki, J. Llopis, R. Heim, J. McCaffery, J. Adams, M. Ikura, and R. Tsien, Nature 388, 882 (1997).

173. A.Miyawaki, O. Griesbeck, R. Heim, and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,2135 (1999).

174. R. Rudolf, M. Mongillo, P. Magalhaes, and T. Pozzan, J. Cell Biol. 166, 527 (2004).

175. R. Cornea, F. Nitu, S. Graber, K. ICohler, M. Satzer, D. Thomas, B. Fruen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 6128 (2009).

176. S. Diegelmann, A. Fiala, C. Leibold, T. Spall, and E. Buchner, Genesis 34, 95 (2002).

177. M. Hara, V. Bindokas, J. Lopez, K. Kaihara, L. Landa Jr., M. Harbeck, and M. Roe, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 932 (2004).

178. N. Tsujino, A. Yamanaka, K. Ichiki, Y. Muraki, T. Kilduff, K. Yagami, S. Takahashi, K. Goto, and T. Sakurai, J. Neurosci. 25, 7459 (2005).

179. R. Kerr, V. Lev-Ram, G. Baird, P. Vincent, R. Tsien, and W. Schafer, Neuron 26, 583 (2000).

180. K. Gromova, M. Friedrich, A. Noskov, G. Harms, Biochim. Biophys. Acta 1773, 1759 (2007).

181. M. Bogner and U. Ludewig, J. Fluoresc. 17, 350 (2007).

182. R. Sakai, V. Repunte-Canonigo, C. Raj, and T. Knopfel, Europ. J. of Neurosci. 13, 2314(2001).

183. R. Mitra, C. Silva, D. Youvan, Gene 173, 13 (1996).

184. B. Zhang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 323, 674 (2004).

185. A. Gorokhovatsky, V. Marchenkov, N. Rudenko, T. Ivashina, V. Ksenzenko, N. Burkhardt, G. Semisotnov, L. Vinokurov, and Y. Alakhov, Biochem. Biophys. Res. Comm. 320, 703 (2004).

186. B. Schüler, E. Lipman, P. Steinbach, M. Kumke, and W. Eaton, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 102, 2754 (2005).

187. R. Best, K. Merchant, I. Gopich, B. Schüler, A. Bax, and W. Eaton, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 104, 18964 (2007).

188. D. Graham, P. Lowe, and P. Chalk, Anal. Biochem. 296, 208 (2001).

189. F. Chan, R. Siegel, D. Zacharias, R. Swofford, K. Holmes, R. Tsien, and M. Lenardo, Cytometry 44, 361 (2001).

190. T. Ohashi, S. Galiacy, G. Briscoe, and H. Erickson, Prot. Sei. 16, 1429 (2007).

191. M. Schwentker, H. Bock, M. Hofmann, S. Jakobs, J. Bewersdorf, C. Eggeling, S. Hell, Microsc. Res. Tech., 70,269 (2007).

192. E. Merzlyak, J. Goedhart, D. Shcherbo, M. Bulina, A. Shcheglov, A. Fradkov, A. Gaintzeva, K. Lukyanov, S. Lukyanov, T. Gadella, and D. Chudakov, Nature Methods 4, 555 (2007).

193. G. Jekely, Neural Notes 4, 2 (1998).

194. C.-Z. Ni, C. Li, J. Wu, A. Spada, and K. Ely, J. Mol. Recognit. 16, 121 (2003).

195. J. Rotonda, D. Nicholson, K. Fazil, M. Gallant, Y. Gareau, M. Labelle, E. Peterson, D. Rasper, R. Ruel, J. Vaillancourt, N. Thornberry, and J. Becker, Nat. Struct. Mol. Biol. 3, 619 (1996).

196. A. Porter and R. JaEnicke, Cell Death Diff. 6, 99 (1999).

197. N. Thornberry, T. Rano, E. Peterson, D. Rasper, T. Timkey, M. Garcia-Calvo, V. Houtzager, P. Nordstrom, S. Roy, J. Vaillancourt, K. Chapman, and D. Nicholson, J Biol Chem. 272, 17907 (1997).

198. G. Cohen, Biochem. J. 326, 1 (1997).

199. N. Thornberry, Chem. Biol. 5, 97 (1998).