Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, доктор биологических наук Верхуша, Владислав Витальевич

• Верхуша, Владислав Витальевич
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Верхуша, Владислав Витальевич

Список часто используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 1.1. Физико-химические свойства ОБР-подобных белков.

1.1.1. Источники флуоресцентных белков и хромопротеинов.

1.1.2. Агрегация.

1.1.3. Олигомеризация.

1.1.4. Созревание: фолдинг белка и образование хромофора.

1.1.5. Фотостабильность.

1.1.6. рН устойчивость флуоресценции.

1.2. Улучшенные мономерные красные флуоресцентные белки.

1.2.1. Оранжевые и красные флуоресцентные белки. 1.2.2. Дальне-красные флуоресцентные белки.

1.2.3. Тетрамерный флуоресцентный таймер.

1.3. Фотоактивируемые красные флуоресцентные белки.

1.3.1. Необратимо фотоактивируемые ультрафиолетовым светом.

1.3.2. Необратимо фотоактивируемые видимым светом.

1.3.3. Обратимо переключаемые флуоресцентные белки.

1.4. Структура флуоресцентных белков.

1.4.1. Кристаллическая структура флуоресцентных белков.

1.4.2. Структура и образование хромофора.

1.4.3. Окружение хромофора.

1.4.4. Образования ацилиминой связи в хромофоре.

1.4.5. Планарность хромофора.

1.5. Фотоконверсия в красных флуоресцентных белках.

1.5.1. Необратимое фотопереключение.

1.5.2. Цис-транс изомеризация хромофора.

1.5.3. Фотоконверсии перманентных красных флуоресцентных белков

1.6. Перенос протона в возбужденном состоянии хромофора.

1.6.1. Заряд хромофора и сеть водородных связей.

1.6.2. Фотоцикл в GFP белке дикого типа.

1.6.3. Зависимость переноса протона от окружения хромофора.

1.7. Основные направления применения красных флуоресцентных

1 белков.

1.7.1. Преимущества применения в клеточной биологии.

1.7.2. Флуоресцентные белки как репортерные гены. 1.7.3. Флуоресцентные белки как маркеры.

1.7.4. Методы, основанные на FRET.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы молекулярной биологии.

2.3. Выделение и характеризация рекомбинантных белков.

2.4. Структурный анализ белков.

2.5. Методы клеточной биологии.

2.6. Флуоресцентная микроскопия клеток в культуре.

2.7. Двухфотонная микроскопия и визуализация в мышах.

2.8. Общая схема создания новых флуоресцентных белов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP.

3.1.1. Физико-химические характеристики очищенного mTagBFP.

3.1.2. Использование mTagBFP в качестве донора FRET.

3.1.3. Структуры хромофоров mTagBFP и его предшественника TagRFP

3.1.4. Трансформация тирозин содержащих хромофоров.

3.2. Серия мономерных флуоресцентных белков-таймеров.

3.2.1. Основные свойства очищенных рекомбинантных быстрого

FastFT), среднего (MediumFT) и медленного (SlowFT) таймеров

3.2.2. Использование флуоресцентных таймеров для изучения внутриклеточных процессов.

3.2.3. Структуры хромофоров FastFT и его синего мутанта В1ие102.

3.3. Серия фотоактивируемых флуоресцентных белков PAmCherry.

3.3.1. Свойства очищенных белков PAmCherry.

3.3.2. Использование PAmCherryl в микроскопии сверхвысокого разрешения PALM.

1 3.3.3. Хромофор PAmCherryl в тёмном и флуоресцентном состояниях.

3.4. Фотоактивируемый красный флуоресцентный белок PATagRFP.

3.4.1. Физико-химические характеристики PATagRFP.

3.4.2. Использование PATagRFP в микроскопии траекторий единичных частиц sptPALM.

3.5. Обратимо фотопереключаемый красный флуоресцентный белок rsTagRFP.

3.5.1. Физико-химические свойства очищенного rsTagRFP.

3.5.2. Свойства rsTagRFP в фотохромном FRET.

3.5.3. Применение rsTagRFP в pcFRET в живых клетках.

3.6. Мономерный дальне-красный флуоресцентный белок TagRFP

3.6.1. Физико-химические характеристики очищенного TagRFP657.

3.6.2. TagRFP657 в многоцветовых цитофлуорометрии и микроскопии.

3.6.3. TagRFP657 в микроскопии сверхвысокого разрешения STED.

3.6.4. Неинвазивная визуализация раковой опухоли с помощью

TagRFP

3.7. Белки с большим стоксовым сдвигом LSSmKatel и LSSmKate2.

3.7.1. Физико-химические характеристики LSSmKatel и LSSmKate2.

3.7.2. Механизм большого стоксового сдвига в белках LSSmKate.

3.7.3. Рациональный дизайн белков с большим стоксовым сдвигом.

3.7.4. Использование белков LSSmKatel и LSSmKate2 для визуализации процессов, происходящих в живых клетках.

3.7.5. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки»

Актуальность проблемы. Прижизненная визуализация процессов, происходящих в клетках и организмах, с высоким пространственным разрешением в реальном масштабе времени с использованием в качестве флуоресцентных маркеров зеленого флуоресцентного белка (ОБР), его вариантов и гомологов, составляющих семейство СБР-подобных белков, стала в последнее десятилетие одним из наиболее востребованных методов исследования в биологии и медицине. В отличие от других природных пигментов, ОБР-подобные белки формируют хромофор без участия внешних ферментных систем или кофакторов, кроме молекулярного кислорода. Таким образом, образование хромофора и возникновение свечения происходит непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Концевые фрагменты флуоресцентных белков доступны для связывания с другими белками, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентных белков (ТР) с белками-мишенями. Это свойство делает БР уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами -незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков, их локализации, внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров на различные внутриклеточные метаболиты.

В настоящее время БР широко используются для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и целых организмов как прокариот, так и эукариот. Возможность одновременного использования нескольких БР с разными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточном организме. Последующие исследования посттрансляционных изменений, структуры и свойств СРР-подобных белков позволили разработать подходы для целенаправленного создания новых БР с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биологии и биотехнологии.

Все красные БР дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное образование хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение РР. Получение улучшенных вариантов БР остается важной задачей, решение которой значительно расширяет возможности применения РР в молекулярной и клеточной биологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных РР является сочетание случайного и сайт-направленного мутагенеза с высоко эффективной техникой сортировки и отбора клеток.

Практическая значимость красных РР особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, поскольку свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Более того, использование красных БР повышает чувствительность детекции флуоресценции, так как автофлуоресценция клеток и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны света.

Ввиду уникальных биохимических свойств белков семейства ОРР, большой практической значимости РР для молекулярной и клеточной биологии, а также биомедицинских исследований, изучение механизмов, лежащих в основе спектральных, фотохимических и биохимических свойств FP, и создание новых FP является актуальной задачей.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось создание новых постоянно флуоресцирующих FP, фотоактивируемых флуоресцентных белков (PAFP) и белков, флуоресценция которых изменяется со временем (т.н. флуоресцентных белков-таймеров (FT)), позволяющих производить флуоресцентное мечение в живых клетках и тканях. В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Создание мономерных вариантов FP, PAFP и FT с различными спектральными характеристиками и паспортизация их фотохимических и биохимических свойств.

2. Определение пространственной структуры вновь созданных FP, PAFP и FT белков, изучение структуры их хромофоров, а также аутокаталитических и фотоиндуцированных механизмов их формирования.

3. Изучение свойств новых FP, PAFP и FT в связи с перспективами их использования в качестве маркеров в различных современных методах микроскопии и цитофлуорометрии.

4. Применение улучшенных вариантов FP, PAFP и FT, созданных в ходе выполнения работы, в конструкциях слияния с клеточными белками для решения ряда конкретных задач клеточной биологии.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Формирование Tyr-содержащих хромофоров красных FP, PAFP и FT происходит через стадию образования синего интермедиата, хромофор которого состоит из имидазольиого кольца и N-ацилиминовой группы, не объединенных в систему сопряженных л-связей с фенольным кольцом тирозина 64.

2. Автокаталитическая трансформация синего интермедиата в красный хромофор может быть замедлена, полностью остановлена или преобразована в фотоиндуцированный процесс методом сайт-направленного мутагенеза. Тем самым был показан путь целенаправленного превращения мономерных FP в PAFP и FT.

3. Предложен рациональный молекулярный подход, направленный на получение вариантов FP с большим* стоксовым сдвигом флуоресценции посредством формирования в них цепей водородных связей для переноса протона в возбуждённом состоянии хромофора.

4. Созданные в работе FP, PAFP и FT являются оптимизированными маркерами для стандартных методов флуоресцентной микроскопии, микроскопии сверхвысокого разрешения и для флуоресцентной визуализации процессов в тканях животных.

5. Полученные в работе FP, PAFP и FT с улучшенными спектральными, биохимическими и фотохимическими свойствами позволяют решать ряд новых биологических задач на живых клетках и тканях млекопитающих.

Научная новизна работы. Созданы двенадцать новых мономерных FP, PAFP и FT, обладающих либо совершенно новыми, либо существенно улучшеными, по сравнению с существующими аналогами, физико-химическими свойствами при экспрессии в качестве белков слияния в клетках. Часть созданных белков не имеет аналогов. Получены кристаллы и определена методом рентгеноструктурного анализа простраственная структура семи белков. На основании этих данных и результатов масс-спектрометрического анализа определены химические структуры хромофоров этих белков, предложены молекулярные механизмы их спектрального, фотохимического и биохимического поведения. Предложена общая схема формирования тирозин-содержащих хромофоров в FP. Показано, что новые FP, PAFP и FT расширяют возможности многоцветового внутриклеточного мечения при использовании методов стандартной флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуорометрии. Вновь созданные варианты FP были применены в качестве маркеров при апробации новых методов оптической микроскопии, таких как регистрация резонансного безызлучательного переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET), двухфотонное (two-photon, 2Р) возбуждение флуоресценции, регистрация изображений сверхвысокого разрешения единичных молекул PALM (photoactivated localization microscopy) и микроскопия сверхвысокого разрешения ансамбля молекул STED (stimulated emission depletion). Созданные FP, PAFP и FT были использованы для решения задач молекулярной клеточной биологии, включая мечение структур в живых клетках, детекцию внутриклеточных взаимодействий и детекцию ^локализации белков-мишеней, определение внутриклеточного возраста белков.

Практическое значение полученных результатов. Практическая ценность работы заключается в получении новых мономерных FP, которые можно применять для многоцветового мечения белков, органелл, клеток и организмов различных видов прокариот и эукариот. Разработана стратегия рационального дизайна красных фотоактивируемых FP и FP с большим стоксовым сдвигом, которая может быть использована для получения других подобных маркеров с заданными спектральными характеристиками. Разработано несколько фотоактивируемых красных FP, что открывает новые возможности для прицельного введения и последующего слежения за перемещением одновременно I двух флуоресцентно-меченых белков в живых тканях, клетках и органеллах. Становится доступным двухцветовая PALM микроскопия, основанная на использовании двух спектрально различающихся фотоактивируемых FP. Получен мономерный FP, флуоресцирующий в дальне-красной области спектра.

Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены в качестве приглашённых докладов на следующих международных симпозиумах и конференциях: "Novel Approaches to Bioimaging II" (Эшберн, США, 2010), 50th Annual Meeting of American Society for Cell Biology (Филаделфия, США, 2010), "Light in Life Sciences" (Мельбурн, Австралия, 2009), "Fluorescent Proteins and Biological Sensors IF (Эшберн, США, 2009), 238th American Chemical Society National Meeting (Вашингтон, США, 2009), Annual USA-Russian Flow Cytometry Workshop (Москва, 2009), 48th Annual Meeting of American Society for Cell Biology (Сан-Франциско, США, 2008), "Fluorescent Proteins and Biological Sensors" (Эшберн, США, 2007), The MetroFlow Fall Meeting (Нью-Йорк, США, 2007), 4th Symposium on Biological Imaging "Innovations in Fluorescence Probes for Live-Cell Imaging" (Медисон, США, 2007), NIH Chesapeake Cytometry Consortium meeting (Бетезда, США, 2007), "Frontiers in Microscopy" (Бар Харбор, США, 2006), 57th Pittsburg Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy (Орландо, США, 2006), а также на приглашенных семинарах и лекциях в Колумбийском университете (США, 2011), Гарвардском университете (США, 2001, 2007, 2011), Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010),

Йельском университете (США, 2009), Институте молекулярной биологии и генетики (Киев, Украина, 2006, 2009), Институте медицинских исследований Бурке (США, 2007), Университете Флориды (США, 2005), Университете Центральной Флориды (США, 2005), Питтсбургском университете (США, 2004), Центре фотомедицины Велмана Массачусетского госпиталя (США, 2004), Институте биоорганической химии РАН (2000, 2003), университете Колорадо (США, 2003), факультете биоинженерии и биоинформатики и факультете химии Московского государственного университета (1999, 2002), Вюрцбургском университете (Германия, 2001), Киотском университете (Япония, 2001), университете Томаса Джефферсона (США, 2001), университете Орегона (США, 2001).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Национальных Институтов Здоровья США (гранты DA019980, GM070358 и GM073913), NATO Collaborative Linkage Grant CBP.NR.NRCLG 981752 (Россия-США), федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (контракт 02.740.11.5141) и программы РАН "Молекулярная и клеточная биология".

Публикации по теме работы. По материалам диссертации опубликованы 52 рецензированные печатные работы (44 оригинальные статьи, 6 обзоров и 2 главы в книгах) за период с 1999 по 2010 год.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследований, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все результаты, обсуждаемые в работе, были получены либо лично автором, либо руководимыми им сотрудниками и аспирантами. В Работах, выполненных в соавторстве, личный ВИад автора заключался в непосредственном участии в планировании „ проведении экспериментов, в обсуждении и литературном оформлении результатов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обычно предполагается, что все цветовое разнообразие живых организмов обусловленно хромопротеинами или низкомолекулярными пигментами. Как правило, хромопротенины содержат небольшую молекулу небелковой природы или ион металла, которые отвечают за хромогенные свойства белка. Однако, флуоресценция зеленого флуоресцентного белка (GFP), открытого в 1961 году группой исследователей во главе с Осаму Шимомурой [1] при изучении ими биолюминесценции медузы Aequorea victoria из класса Hydrozoa, обусловлена взаимодействим внутренних аминокилотных остатков белка и не требует участия вспомогательных кофакторов, ферментов или каких-либо субстратов. Многие годы GFP изучался очень небольшой группой исследователей как белок, являющийся частью биолюминесцентной системы [2]. После клонирования гена GFP интерес к нему чрезвычайно возрос, и в настоящее время GFP и его улучшенные мутанты являются наиболее широко используемыми генетическими маркерами [3-5]. В 2008 году Нобелевской премии по химии, самой престижной научной награды, удостоились Осаму Шимомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсиен за разработку и получение различных форм зеленого флуоресцентного белка [6]. Очередным толчком к развитию этого направления в биотехнологии послужило клонирование генов GFP-подобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальне-красной областях спектра [7]. На момент начала работы над диссертацией были известны флуоресцентные белки всей цветовой гаммы от голубого до дальне-красного, которые покрывают спектр от 424 нм до 655 нм.

Красные флуоресцентные белки (RFPs) имеют максимумы эмиссии флуоресценции превышающие 560 нм. Все RFPs могут быть разделены на две оольшие группы: перманентно красные флуоресцентные белки и красные флуоресцентные белки, которые требуют УФ или видимого синего света для образования красного хромофора. Также следует упомянуть такие GFP-подобные белки как хромопротеины (CPs), которые способны эффективно поглощать свет, однако при этом не флуоресцируют. CPs имеют один максимум абсорбции на 560610 нм, длина волны максимума поглощения определяет цвет СР. Часто при созревании RFPs проходят через голубое или зеленое флуоресцентное состояние. Это свойство RFPs было использовано для создания флуоресцентных таймеров, которые на ранних стадиях созревания флуоресцируют в голубой или зеленой области спектра, а в полностью созревшем состоянии — в красной.

1.1. Физико-химические свойства GFP-подобных белков

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Верхуша, Владислав Витальевич

выводы

1. Разработаны методы направленной молекулярной эволюции, которые в сочетании с высокоэффективным скринингом с использованием проточной цитофлуорометрии позволили создать мономерные флуоресцентные белки с улучшенными и принципиально новыми фотохимическими и фотофизическими свойствами на основе перманентно флуоресцирующих белков: фотоактивируемые флуоресцентные белки, флуоресцентные белки-таймеры и дальне-красные флуоресцентные белки.

2. Разработан рациональный молекулярный подход формирования путей переноса протона в возбужденном состоянии, позволяющий получать флуоресцентные белки, обладающие заданными спектральными характеристиками и большим стоксовым сдвигом.

3. Создан мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP, который обладает наибольшей яркостью в синем спектральном диапазоне по сравнению с существующими аналогами, и содержит хромофор, образованный имдазольным кольцом и КГ-ацилиминовой группой. Показано, что исключение фенольного кольца тирозинового остатка 64 из системы сопряженных я-связей приводит к формированию хромофора, флуоресцирующего в синей области спектра.

4. Установлено, что формирование БвРеё-подобного хромофора в красных перманентно флуоресцирующих и фотоактивируемых белках осуществляется через стадию образования пП^ВРР-подобного хромофора, флуоресцирующего в синей области спектра.

5. Созданы мономерные флуоресцентные белки-таймеры, позволяющие изучать, пространственно-временные характеристики внутриклеточных процессов и: возраст внутриклеточных белковых молекул.

6. Создан красный фотопереключаемый флуоресцентный белок, фотоконверсия: которого сопровождается существенным, но обратимым изменением формы спектра поглощения. Показана возможность использования этого белка в качестве акцептора в новом методе фотохромного безызлучательно— резонансного переноса энергии для изучения межбелковых взаимодействий в живых клетках.

7. Созданы мономерные фотоактивируемые красные флуоресцентные белки, являющиеся исключительно перспективными маркерами для селективного внутриклеточного мечения молекул в микроскопии сверхвысокого разрешенная: PALM.

8. Создан мономерный дальне-красный флуоресцентный белок, оптимизированный для использования со стандартными красными лазерными источниками света, применяемыми в проточной цитофлуорометрии, для неинвазивной визуализации клеток в живых организмах и в микроскопии сверхвысокого разрешения STED.

9. Созданы мономерные красные флуоресцентные белки с большим стоксовымс сдвигом, позволяющие осуществлять визуализацию процессов в живых тканях с субклеточным разрешением в режиме реального времени.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе разработаны новые мономерные флуоресцентные белки трёх различных групп: перманентно флуоресцентные белки, флуоресцентные белки-таймеры и фотоактивируемые флуоресцентные белки (Таблица 4).

Каждый белок был охарактеризован спектроскопически, фотохимически и биохимически. Основные представители групп белков были закристаллизованы, определены хиические структуры их хромофоров и предложены молекулярные механизмы поведения этих белков. Все созданные белки были исследованы в клетках млекопитающих, экспресированные свободно в цитоплазме и в качестве белков слияния. Основные представители групп были использованы для решения актуальных задач клеточной биологии. Более того, полученные белки были применены в новых методах оптической микроскопии, таких как FRET, pcFRET, 2Р, PALM и STED, многогоцветовой проточной цитофлуорометрии и флуоресцентной визуализации в животных.

Созданные FP, PAFP и FT существенно расширяют возможности современных методов получения флуоресцентных изображений в молекулярной и клеточной биологии и биомедицинских исследованиях. Новые белки можно применять для многоцветового мечения молекул, органелл, клеток и организмов в широком диапазоне видов прокариот и эукариот. Предложенные автокаталитические и фотохимические механизмы формирования и функционирования хромофоров позволят разработать стратегии дизайна следующего поколения генетически-кодируемых флуоресцентных зондов.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Верхуша, Владислав Витальевич, 2011 год

1. Shimomura 0., F.H.Johnson, Y.Saiga. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol., 59, 223-239 (1962).

2. Morise H., O.Shimomura, F.H.Johnson, J.Winant. Intermolecular Energy Transfer in Bioluminescent systems of aequorea. Biochemistry, 13, 2656-2662 (1974).

3. Prasher D.C., V.KEckenrode, W.W.Ward, F.G.Prendergast, M.J.Cormier. Primary structure of the Aequorea victorea green fluorescent protein. Gene, 111, 229-233 (1992).

4. Chalfie M., Y.Tu, G.Euskirchen, W.W.Ward, D.C.Prasher. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 263, 802-805 (1994).

5. Day R.N., M.W.Davidson. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev., 38, 2887-2921 (2009).

6. Miyawaki A. Green fluorescent protein glows gold. Cell, 135, 987-990 (2008).

7. Matz M.V., A.F.Fradkov, Y.A.Labas, A.P.Savitsky, A.G.Zaraisky, M.L.Markelov, S.A.Lukyanov. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. Biotechnol, 17, 969-73 (1999).

8. Labas Y.A., N.G.Gurskaya, Y.G.Yanushevich, A.F.Fradkov, K.A.Lukyanov, S.A.Lukyanov, M.V.Matz. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4256-61 (2002).

9. Wiedenmann J., C.Elke, K.D.Spindler, W , ^-^unke. Cracks in the 3-can: fluorescentproteins from Anemonia sulcata. Proc. ,

10. Acad. Set USA. 97, 14091-140962000).

11. Gurskaya N.G., A.F.Fradkov, A.Terskilcb

12. M.V.Matz, Y.A.Labas, V.l.Marlynov, Y.G.Yanushevich, K.A.Lukyanov, S.A T пъ-,-ulcyanov. GFP-like chromoproteins <source of far-red fluorescent proteins. FEFZ*? т1. Zeti-> 507, 16-20 (2001).

13. Yanushevich Y.G., D.B.Staroverov, A «г ,

14. У' A.F.Fradkov, N.G.Gurskaya,

15. M.E.Bulina, K.A.Lukyanov, S.A.Lukyanc-»^ a

16. A strate§y for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluore^n«.fproteins. FEBS Lett., 511, Ц-142002).

17. Shkrob M.A., Y.G.Yanushevich, D.IvT г^т, ^ ,-Chudakov, N.G.Gurskaya, Y.A.Labas,

18. S.Y.Poponov, N.N.Mudrik, S.Lukyanox^ ^ * т ,

19. K-A.Lukyanov. Far-red fluorescentproteins evolved from a blue chromoprotc- ;^ -p л .ein from Actmia equina. Bio chem. J„ 392649.654 (2005).

20. Wiedenmann J., A.Schenk, C.Rocker, A л т^ ^ ^ .

21. K.D.Spindler, G.U.Nienhaus. A farred fluorescent protein with fast maturatir^r№on and reduced oligomerization tendencyfrom Entacmaea quadricolor (Anthozoa a • ч ^

22. V a, Retinaría). Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99,11646-11651 (2002).

23. Merzlyak E.M., J.Goedhart, D.Shcherbo Лугсг».

24. M.E.Bulina, A.S.Shcheglov, A.F.Fradkov,

25. A.Gaintzeva, K.A.Lukyanov, S.Lukyariov

26. V' T-W.Gadella, D.M.Chudakov. Brightmonomeric red fluorescent protein with . , , „an extended fluorescence lifetime. Nat.

27. Methods, 4, 555-557 (2007).

28. Shcherbo D., E.M.Merzlyak, T.V.Chepurnykh, A.F.Fradkov, G.V.Ermakova, E.A.Solovieva, K.A.Lukyanov, E.A.Bogdanova, A.G.Zaraisky, S.Lukyanov, D.M.Chudakov. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat. Methods, 4, 741-746 (2007).

29. Karasawa S., T.Araki, T.Nagai, H.Mizuno, A.Miyawaki. Cyan-emitting and orange- emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem. J., 381, 307-312 (2004).

30. Bulina M.E., D.M.Chudakov, O.V.Britanova, Y.G.Yanushevich, D.B.Staroverov, T.V.Chepurnykh, E.M.Merzlyak, M.A.Shkrob, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. A genetically encoded photosensitizer. Nat. Biotechnol., 24, 95-99 (2006).

31. Mishin A.S., F.V.Subach, I.V.Yampolsky, W.King, K.A.Lukyanov, V.V.Verkhusha. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry, 47, 4666-4673 (2008).

32. Shaner N.C., R.E.Campbell, P.A.Steinbach, B.N.Giepmans, A.E.Palmer, R.Y.Tsien. Improved monomelic red, orange and yellow fluorescent proteinsderived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol, 22, 15671572 (2004).

33. Strack R.L., D.Bhattacharyya, B.S.Glick, RJ.Keenan. Noncytotoxic orange and red/green derivatives of DsRed-Express2 for whole-cell labeling. BMC Biotechnol., 9, 32 (2009).

34. Tsutsui H., S.Karasawa, Y.Okamura, A.Miyawaki. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat. Methods, 5, 683-685 (2008).

35. Shaner N.C., M.Z.Lin, M.R.McKeown, P.A.Steinbach, K.L.Hazelwood, M.W.Davidson, R.Y.Tsien. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat. Methods, 5, 545-551 (2008).

36. Campbell R.E., O.Tour, A.E.Palmer, P.A.Steinbach, G.S.Baird, D.A. Zacharias, R.Y.Tsien. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 7877-7882 (2002).

37. Bevis B.J., B.S.Glick. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat. Biotechnol., 20, 83-87 (2002).

38. Strack R.L., D.E.Strongin, D.Bhattacharyya, W.Tao, A.Berman, H.E.Broxmeyer, R.J.Keenan, B.S.Glick. A noncytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling. Nat. Methods, 5, 955-957 (2008).

39. Strongin D.E., B.Bevis, N.Khuong, M.E.Downing, R.L.Strack, K.Sundaram, B.S.Glick, R.J.Keenan. Structural rearrangements near the chromophore influence the maturation speed and brightness of DsRed variants. Protein Eng. Des. Sel., 20, 525-534 (2007).

40. Fischer M., I.Haase, E.Simmeth, G.Gerisch, A.Muller-Taubenbcrger. A brilliant monomeric red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictyostelium. FEBSLett., 577, 227-232 (2004).

41. Fischer M., I.Haase, S.Wiesner, A.Mullcr-Taubenberger. Visualizing cytoskeleton dynamics in mammalian cells using a humanized variant of monomeric red fluorescent protein. FEBS Lett., 580,2495-2502 (2006).

42. Kredel S., F.Oswald, K.Nienhaus, K.Deuschle, C.Rocker, R.Heilker, G.U. Nienhaus, J.Wiedenmann. mRuby, a bright monomeric red fluorescent protein for labeling of subcellular structures. PLoS ONE, 4, e4391 (2009)

43. Kogure T., S.Karasawa, T.Araki, K.Saito, M.Kinjo, A.Miyawaki. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color singlelaser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat. Biotechnol., 24, 577-581 (2006).

44. Wang L., W.CJackson, P.A.Steinbach, R.Y.Tsien. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 1674516749 (2004).

45. Fradkov A.F., V.V.Verkhusha, D.B.Staroverov, M.E.Bulina, Y.G.Yanushevich, V.I. Martynov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem. J., 368,17-21 (2002).

46. Terskikh A.V., A.F.Fradkov, A.G.Zaraisky, A.V.Kajava, B.Angres. Analysis of DsRed Mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development. J. Biol. Chem., 277, 7633-7636 (2002).

47. Baird G.S., D.A.Zacharias, R.Y.Tsien. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11984-11989 (2000).

48. Vrzheshch P.V., N.A.Akovbian, S.D.Varfolomeyev, V.V.Verkhusha. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBSLett., 487, 203-208 (2000).

49. Heikal A.A., S.T.Hess, G.S.Baird, R.Y.Tsien, W.W.Webb. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11996-12001 (2000).

50. Wiedenmann J., B.Vallone, F.Renzi, K.Nienhaus, S.Ivanchenko, C.Rocker, G.U.Nienhaus. Red fluorescent protein eqFP611 and its genetically engineered dimeric variants. J. Biomed. Opt., 10,14003 (2005).

51. Kogure T., H.Kawano, Y.Abe, A.Miyawaki. Fluorescence imaging using a fluorescent protein with a large Stokes shift. Methods, 45, 223-226 (2008).

52. Mizuno H., A.Sawano, P.Eli, H.Hama, A.Miyawaki. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and partner for fluorescence energy transfer. Biochemistry, 40, 2502-2510 (2001).

53. Terskikh A., A.Fradkov, G.Ermakova, A.Zaraisky, P.Tan, A.V.Kajava, X.Zhao, S.Lukyanov, M.Matz, S.Kim, I.Weissman, P.Siebert. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science, 290, 1585-1588 (2000).

54. Bulina M.E., D.M.Chudakov, N.N.Mudrik, K.A.Lukyanov. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem., 3, 7 (2002).

55. Kredel S., K.Nienhaus, F.Oswald, M.Wolff, S.Ivanchenko, F.Cymer, A.Jeromin, F.J.Michel, K.D.Spindler, R.Heilker, G.U.Nienhaus, J.Wiedenmann. Optimized and far-red-emitting variants of fluorescent protein eqFP611. Chem Biol., 15, 224-233 (2008).

56. Shaner N.C., P.A.Steinbach, R.Y.Tsien. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods, 2, 905-909 (2005).

57. Gross L.A., G.S.Baird, R.C.Hoffman, K.K.Baldridge, R.Y.Tsien. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11990-11995 (2000).

58. Petersen J., P.G.Wilmann, T.Beddoe, AJ.Oakley, RJ.Devenish, M.Prescott, J.Rossjohn. The 2.0-Â crystal structure of eqFPôll, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J. Biol. Chem., 278, 44626-44631 (2003).

59. Kawano H., T.Kogure, Y.Abe, H.Mizuno, A.Miyawaki. Two-photon dual-color imaging using fluorescent proteins. Nat. Methods, 5, 373-374 (2008).

60. Shu X., A.Royant, M.Z.Lin, T.A.Aguilera, V.Lev-Ram, P.A.Steinbach, R.Y.Tsien. Mammalian Expression of Infrared Fluorescent Proteins Engineered from a Bacterial Phytochrome. Science, 324, 804-807 (2009).

61. Shu X., L.Wang, L.Colip, K.Kallio, S.J.Remington. Unique interactions between the chromophore and glutamate 16 lead to far-red emission in a red fluorescent protein. Protein Sci., 18, 460-466 (2009).

62. Ando R., H.Hama, M.Yamamoto-Hino, H.Mizuno, A.Miyawaki. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12651-12656 (2002).

63. Wiedenmann J., S.Ivanchenko, F.Oswald, F.Schmitt, C.Rôcker, A.Salih, K.D.Spindler, G.U.Nienhaus. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 15905-15910 (2004).

64. McKinney S.A., C.S.Murphy, K.L.Hazelwood, M.W.Davidson, L.L.Looger. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods, 6, 131133 (2009).

65. Tsutsui H., S.Karasawa, H.Shimizu, N.Nukina, A.Vliyawaki. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter EMBO Rep 6,233-238 (2005).

66. Habuchi S., H.Tsutsui, A.B.Kochaniak, A.Miyawaki, A.TVT.van Oijen. mKikGR a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS OT\TJ£, 3? e3944 (2008)

67. Gurskaya N.G., V.V.Verkhusha, A.S.Shcheglov, D.B.Staroverov, T.V.Chepurnykh A.F.Fradkov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol 24 461-465 (2006).

68. Chudakov D.M., A.V.Feofanov, N.N.Mudrik, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov Chromophore environment provides clue to kindling fluorescent protein riddle J. Biol. Chem., 278, 7215-7219 (2003).

69. Chudakov D.M., V.V.Belousov, A.G.Zaraisky, V.V.Novoselov, D.B.Staroverov D.B.Zorov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat. Biotechnol, 21,191-194 (2003).

70. Stiel A.C., M.Andresen, H.Bock, M.Hilbert, J.Schilde, A.Schônle, CEggeling Egner A., S.W.Hell, S.Jakobs. Generation of monomeric reversibly switchable red fluorescent proteins for far-field fluorescence nanoscopy. Biophys J., 95, 2989-2997 (2008).

71. Wall M.A., M.Socolich, R.Ranganathan. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat. Struct. Biol., 7, 1133-1138 (2000).

72. Yarbrough D., R.M.Wachter, K.Kallio, M.V.Matz, S.J.Remington. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 98, 462-467 (2001).

73. He X., A.F.Bell, P.J.Tonge. Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org. Lett., 4,1523-1526 (2002).

74. Mizuno H., T.K.Mal, KJ.Tong, R.Ando, T.Furuta, M.Ikura, A.Miyawaki. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red' conversion of a fluorescent protein. Mol. Cell, 12,1051-1058 (2003).

75. Remington S.J., R.M.Wachter, D.K.Yarbrough, B.Branchaud, D.C.Anderson, K.Kallio, K.A.Lukyanov. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry, 44, 202-212 (2005).

76. Quillin M.L., D.M.Anstrom, X.Shu, S.OLeary, KKallio, D.M.Chudakov, S.J.Remington. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. Biochemistry, 44, 5774-5787 (2005).

77. Yampolsky I.V., S.J.Remington, V.I.Martynov, V.K.Potapov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. Biochemistry, 44, 5788-5793 (2005).

78. Shu X., N.C.Shaner, C.A.Yarbrough, R.Y.Tsien, S.J.Remington. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry, 45, 96399647 (2006).

79. Kikuchi A., E.Fukumura, S.Karasawa, H.Mizuno, A.Miyawaki, Y.Shiro. Structural characterization of a thiazoline-containing chromophore in an orange fluorescent protein, monomeric Kusabira Orange. Biochemistry, 47,11573-11580 (2008).

80. Wood T.I., D.P.Barondeau, C.Hitomi, C.J.Kassmann, J.A.Tainer, E.D.Getzoff. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis. Biochemistry, 44,16211-16220 (2005).

81. Sniegowski J.A., J.W.Lappe, H.N.Patel, H.A.Huffman, R.M.Wachter. Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. J. Biol. Chem., 280, 26248-26255 (2005).

82. Barondeau D.P., J.A.Tainer, E.D.Getzoff. Structural evidence for an enolate intermediate in GFP fluorophore biosynthesis. J. Am. Chem. Soc., 128, 3166-3168 (2006).

83. Ugalde J.A., B.S.Chang, M.V.Matz. Evolution of coral pigments recreated. Science, 305,1433 (2004).

84. Verkhusha V.V., D.M.Chudakov, N.G.Gurskaya, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Common pathway for the red chromophore formation in the fluorescent proteins and chromoproteins. Chem. Biol., 11, 845-854 (2004).

85. Wiehler J., J.von Hummel, B.Steipe. Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore. FEBSLett., 487,384-389 (2001).

86. Pakhomov A.A., V.I.Martynov. Chromophore aspartate oxidation-decarboxylation in the green-to-red conversion of a fluorescent protein from Zoanthus sp. 2. Biochemistry, 46,11528-11535 (2007).

87. Chan M.C., S.Karasawa, H.Mizuno, I.Bosanac, D.Ho, G.G.Prive, A.Miyawaki, M.Ikura. Structural characterization of a blue chromoprotein and its yellow mutant from the sea anemone Cnidopus japonicus. J. Biol. Chem., 281, 37813-37819 (2006).

88. Martynov V.I., B.I.Maksimov, N.Y.Martynova, A.A.Pakhomov, N.G.Gurskaya, S.A.Lukyanov. A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. J. Biol. Chem., 278, 46288-46292 (2003).

89. Pakhomov A.A., N.V.Pletneva, T.A.Balashova, V.I.Martynov. Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactis gigantea. Biochemistry, 45, 7256-72564 (2006).

90. Shu X., P.Leiderman, R.Gepshtein, N.R.Smith, K.Kallio, D.Huppert, S.J.Remington. An alternative excited-state proton transfer pathway in green fluorescent protein variant S205V. Protein Sci., 16, 2703-2710 (2007).

91. Hayashi I., H.Mizuno, K.I.Tong, T.Furuta, F.Tanaka, M.Yoshimura, A.Miyawaki, M.Ikura. Crystallographic evidence for water-assisted photo-induced peptide cleavage in the stony coral fluorescent protein Kaede. Mol. Biol, 372, 918-926 (2007).

92. Nienhaus K., G.U.Nienhaus, J.Wiedenmann, H.Nar. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 9156-9159 (2005).

93. Henderson J.N., S.J.Remington. Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102,12712-12717 (2005).

94. Loos D.C., S.Habuchi, C.Flors, J.Hotta, J.Wiedenmann, G.U.Nienhaus, J.Hofkens. Photoconversion in the red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor: is cis-trans isomerization involved? J. Am. Chem. Soc., 128, 6270-6271 (2006).

95. Nienhaus K., H.Nar, R.Heilker, J.Wiedenmann, G.U.Nienhaus. Trans-cis isomerization is responsible for the red-shifted fluorescence in variants of the red fluorescent protein eqFPôll. J. Am. Chem. Soc., 130, 12578-12579 (2008).

96. Kremers G.J., K.L.Hazelwood, C.S.Murphy, M.W.Davidson, D.W.Piston. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nat. Methods, 6, 355-358 (2009).

97. Goedhart J., J.E.Vermeer, M.J.Adjobo-Hermans, L.van Weeren, T.W.Gadella. Sensitive detection of p65 homodimers using red-shifted and fluorescent protein-based FRET couples. PLoS ONE, 2, elOll (2007).

98. Henderson J.N., Osborn M.F., Koon N., Gepshtein R., Huppert D., Remington S.J. Excited state proton transfer in the red fluorescent protein mKeima. J. Am. Chem. Soc., 131,13212-13213 (2009).

99. Violot S., Carpentier P., Blanchoin L., Bourgeois D. Reverse pH-dependence of chromophore protonation explains the large Stokes shift of the red fluorescent protein mKeima. J. Am. Chem. Soc., 131, 10356-10357 (2009).

100. Wiehler J., Jung G., Seebacher C., Zumbusch A., Steipe B. Mutagenic stabilization of the photocycle intermediate of green fluorescent protein (GFP). Chembiochem, 4, 1164-1171 (2003).

101. Brejc K., Sixma T.K., Kitts P.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2306-2311 (1997).

102. Palm GJ, Zdanov A, Gaitanaris GA, Stauber R, Pavlakis GN, Wlodawer A. The structural basis for spectral variations in green fluorescent protein. Nat. Struct. Biol, 4, 361-365 (1997).

103. Shu X, Kallio K, Shi X, Abbyad P, Kanchanawong P, Childs W, Boxer SG, Remington SJ. Ultrafast excited-state dynamics in the green fluorescent protein variant S65T/H148D. 1. Mutagenesis and structural studies. Biochemistiy, 46, 12005-12013 (2007).

104. McAnaney TB, Shi X, Abbyad P, Jung H, Remington SJ, Boxer SG. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 3. Temperature dependence of proton transfer. Biochemistry, 44, 8701-8711 (2005).

105. Stoner-Ma D, Jaye AA, Ronayne KL, Nappa J, Tonge PJ, Meech SR. Ultrafast electronic and vibrational dynamics of stabilized A state mutants of the green fluorescent protein (GFP): snipping the proton wire. Chem. Phys., 350, 193-200 (2008).

106. Nienhaus K, Renzi F, Vallone B, Wiedenmann J, Nienhaus GU. Chromophore-protein interactions in the anthozoan green fluorescent protein asFP499. Biophys. J., 91,4210-4220 (2006).

107. Hoffman R.M. Recent advances on in vivo imaging with fluorescent proteins. Methods Cell Biol., 85, 485-495 (2008)

108. Zipfel W.R., R.M.Williams, W.W.Webb. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat. BiotechnoL, 21,1369-1377 (2003).

109. Girkin J.M., S.Poland, A.J.Wright. Adaptive optics for deeper imaging of biological samples. Curr. Opin. Biotechnol., 20,106-110 (2009)

110. Patterson G, Davidson M, Manley S, Lippincott-Schwartz J. Superresolution imaging using single-molecule localization. Annu. Rev. Phys. Chem., 61, 345-367 (2010).

111. Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev., 90, 1103-1163 (2010).

112. Chudakov D.M., K.A.Lukyanov. Use of green fluorescent protein (GFP) and its homologs for in vivo protein motility studies. Biochemistry (Mosc.), 68, 952-957 (2003).

113. Kedrin D., B.Gligorijevic, J.Wyckoff, V.V.Verkhusha, J.Condeelis, J.E.Segall, J.van Rheenen. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods, 5,1019-1021 (2008).

114. Chudakov D.M., S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques, 42, 553-557 (2007).

115. Chudakov D.M., S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protoc., 2, 2024-2032 (2007).

116. Anderson K.I., J.Sanderson, S.Gerwig, J.Peychl. A new configuration of the Zeiss LSM 510 for simultaneous optical separation of green and red fluorescent protein pairs. Cytometry A, 69, 920-929 (2006).

117. Peter M., S.M.Ameer-Beg, M.K.Hughes, M.D.Keppler, S.Prag, M.Marsh, B.Vojnovic, T.Ng. Multiphoton-FLIM Quantification of the EGFP-mRFPl FRET Pair for Localization of Membrane Receptor-Kinase Interactions. Biophys. J., 88, 1224-1237 (2005).

118. Tramier M., M.Zahid, J.C.Mevel, M.J.Masse, M.Coppey-Moisan. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry pairs to donor photobleaching on FRET determinationby fluorescence lifetime imaging microscopy in living cells. Microsc. Res. Tech., 69, 933-939 (2006).

119. Piston D.W., G.J.Kremers. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sei., 32, 407-414 (2007).

120. Shcherbo D., E.A.Souslova, J.Goedhart, T.V.Chepurnykh, A.Gaintzeva, I.I.Shemyakina, T.W.Gadella, S.Lukyanov, D.M.Chudakov. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol., 9, 24 (2009)

121. Mutoh H., A.Perron, D.Dimitrov, Y.Iwamoto, W.Akemann, D.M.Chudakov, T.Knöpfel. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced FRET based fluorescent protein voltage probes. PLoS ONE, 4, e4555 (2009).

122. Neylon C. Chemical and biochemical strategies for the randomization of protein encoding DNA sequences: library construction methods for directed evolution. Nucleic Acids Res., 32,1448-1459 (2004).

123. Ho S.N., H.D. Hunt, R.M. Horton. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 77, 51-59 (1989).

124. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685 (1970).

125. Born M., E. Wolf. Principles of optics: electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. New York: Cambridge University Press. (1997).

126. Hillesheim L.N., Chen Y., Müller J.D. Dual-color photon counting histogram analysis of mRFPl and EGFP in living cells. Biophys. J., 91, 4273-4284 (2006).

127. Nagy A., Wu J., Berland K.M. Observation volumes and {gamma}-factors in two-photon fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys. J., 89, 2077-2090 (2005).

128. Otwinowski Z., Minor W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol., 276, 307-326 (1997).

129. Storoni L.C., McCoy A.J., Read R.J. Likelihood-enhanced fast rotation functions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 60, 432-438 (2004).

130. Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 50, 760-763 (1994).

131. Emsley P., Cowtan K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr DBiol Crystallogr., 60, 2126-3132 (2004).

132. Hooft R.W., Vriend G., Sander C., Abola E.E. Errors in protein structures. Nature, 381, 272 (1996).

133. Laskowski R.A., M. W. MacArthur, D. S. Moss and J. M. Thornton PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures J. Appl. Cry St., 26, 283-291 (1993).

134. Krissinel E, Henrick K. Secondary-structure matching (SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 60, 2256-2268 (2004).

135. Hernandez L, Smirnova T, Kedrin D, Wyckoff J, Zhu L, Stanley ER, Cox D, Muller WJ, Pollard JW, Van Rooijen N, Segall JE. The EGF/CSF-1 paracrine invasion loop can be triggered by heregulin betal and CXCL12. Cancer Res., 69, 3221-3227 (2009).

136. Rasband WS ImageJ. National Institutes of Health, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/ (1997-2006).

137. Wyckoff J, Wang W, Lin EY, Wang Y, Pixley F, Stanley ER, Graf T, Pollard JW, Segall J, Condeelis J. A paracrine loop between tumor cells and macrophages is required for tumor cell migration in mammary tumors. Cancer Res., 64, 7022-7029 (2004).

138. Tsien R.Y. Green fluorescent protein. Annn. Rev. Biochem., 67, 509-544 (1998).

139. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 273, 13921395 (1996).

140. Hosoi H., Mizuno H., Miyawaki A., Tahara T. Competition between energy and proton transfer in ultrafast excited-state dynamics of an oligomeric fluorescent protein red Kaede. J. Phys. Chem. B, 110, 22853-22860 (2006).

141. Remington S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. Curr. Opin. Struct. Biol., 16, 714-721 (2006).

142. Bulina M.E., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M., and Lukyanov K.A. Heterooligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins. Biochem. J., 371, 109-114 (2003).

143. Ai H.W., Shaner N.C., Cheng Z., Tsien R.Y., Campbell R.E. Exploration of new. chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. Biochemistry, 46, 5904-5910 (2007).

144. Mena M.A., Treynor T.P., Mayo S.L., Daugherty P.S. Enhanced blue fluorescent proteins isolated from computationally targeted libraries. Nat. Biotechnol., 24, 1569-1571 (2006).

145. Patterson G.H., Piston D.W., Barisas B.G. Förster distances between green fluorescent protein pairs. Anal. Biochem., 284, 438-440 (2000).

146. Nguyen A.W., Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat. Biotechnol., 23, 355-360 (2005).

147. Ohashi T., Galiacy S.D., Briscoe G., Erickson H.P. An experimental study of GFP-based FRET, with application to intrinsically unstructured proteins. Protein Sei., 16, 1429-1438 (2007).

148. Gordon G.W., Berry G., Liang X.H., Levine B., Herman B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys. J., 74, 2702-2713 (1998).

149. Subach F.M., Patterson G.H., Renz M., Lippincott-Schwartz J., and Verkhusha V.V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J. Am. Chem. Soc., 132, 6481-6491 (2010).

150. Barondeau D.P., Kassmann C.J., Tainer J.A., Getzoff E.D. The case of the missing ring: radical cleavage of a carbon-carbon bond and implications for GFP chromophore biosynthesis. J. Am. Chem. Soc., 129, 3118-3126 (2007).

151. Subach F.V., Subach O.M., Gundorov I.S., Morozova K.S., Piatkevich K.D., Cuervo A.M., and Verkhusha V.V. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking. Nat. Chem. Biol., 5,118-126 (2009).

152. Zapata-Hommer O., Griesbeck O. Efficiently folding and circularly permuted variants of the Sapphire mutant of GFP. BMC Biotechnol., 3, 5 (2003).

153. Ai H.W., Hazelwood K.L., Davidson M.W., Campbell R.E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods, 5, 401-403 (2008).

154. Piatkevich K.D., Malashkevich V.N., Almo S.C., and Verkhusha V.V. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift. J. Am. Chem. Soc., 132,10762-10770 (2010).

155. Eskelinen EL, Illert AL, Tanaka Y, Schwarzmann G, Blanz J, Von Figura K, Saftig P. Role of LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Mol. Biol. Cell, 13, 3355-3368 (2002).

156. Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 297, 1873-1877 (2002).

157. Heuser J.E., Anderson R.G. Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking clathrin-coated pit formation. J. Cell Biol., 108, 389-400 (1989).

158. Mao S., Benninger R.K., Yan Y., Petchprayoon C., Jackson D., Easley C.J., Piston D.W., Marriott G. Optical lock-in detection of FRET using synthetic and genetically encoded optical switches. Biophys. J., 94, 4515-4524 (2008).

159. Sorkin A., McClure M., Huang F., Carter R. Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Curr. Biol., 10, 1395-1398 (2000).

160. Yamazaki T., Zaal K., Hailey D., Presley J., Lippincott-Schwartz J., Samelson L.E. Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J. Cell Sci., 115, 1791-1802 (2002).

161. Ando R., Mizuno H., Miyawaki A. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science, 306, 1370-1373 (2004).

162. Rizzo M.A., Springer G.H., Granada B., Piston D.W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol., 22, 446-449 (2004).

163. Drobizhev M., Tillo S., Makarov N.S., Hughes T.E., Rebane A. Absolute two-photon absorption spectra and two-photon brightness of orange and red fluorescent proteins. J. Phys. Chem. B, 113, 855-859 (2009).

164. Nobes C.D., Hall A. Rho GTPases control polarity, protrusion, and adhesion during cell movement. J. Cell Biol., 144, 1235-1244(1999).

165. Wyckoff J.B., Jones J.G., Condeelis J.S., Segall J.E. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res., 60, 2504-2511 (2000).