Влияние аминокислотных замен на спектральные свойства флуоресцентных белков на примере mRFP1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат физико-математических наук Вржещ, Евгений Петрович

• Вржещ, Евгений Петрович
• кандидат физико-математических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Вржещ, Евгений Петрович

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

Задачи исследования.

1. Обзор литературы.

1.1. Флуоресцентные белки, природные источники и применение.

1.2. Биологическая роль ФБ.

1.3. Кристаллическая структура ФБ.

1.3.1. Кристаллическая структура вРР.

1.3.2. Кристаллическая структура ОзЯес!.

1.4. Формирование хромофоров белков.

1.4.1. Формирование хромофора вРР.

1.4.2. Формирование хромофора БэКес!.

1.4.3. Влияние окружения хромофора на созревание.

1.5. Олигомеризация флуоресцентных белков.

1.6. Получение тКРР1 - мономера БвКес!.

1.7. Физические характеристики белков ОБР и DsR.ec!.

1.8. Спектральные характеристики ФБ.

1.8.1. Спектральные характеристики вБР.

1.8.2. Спектральные характеристики DsR.ec!.

1.8.3. Спектральные характеристики пгЕШЧ.

1.8.4. Влияние а.о. в хромофоре на флуоресцентные свойства белка.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние аминокислотных замен на спектральные свойства флуоресцентных белков на примере mRFP1»

Семейство флуоресцентных белков включает в себя способные испускать и поглощать излучение в видимой части спектра белки, обнаруженные у различных представителей типа Кишечнополостные (Сое1еп1ега1а). Флуоресцентные белки имеют сходную структуру, представленную 11-тяжевым (3-бочонком, внутри которого проходит а-спираль с хромофором в ее центральной части (рис. 1): бочонка», фиолетовым — участки а-спиралей. В центре бочонка располагается хромофор (выделен сипим цветом). Серым обозначены петлевые участки.

Хромофор - это гетерогруппа, образующаяся в результате авто каталитической посттрансляционной реакции между тремя смежными аминокислотами. Его наличие обеспечивает окраску белков и возможность флуоресцировать (нефлуоресцирующие формы носят название хромопротеинов). В настоящее время описаны представители данного семейства с различными свойствами, такими как быстрота созревания, стабильность, оптические свойства (спектры поглощения и флуоресценции; квантовый выход флуоресценции, фотовыцветание и пр.).

Долгие годы флуоресцентные белки изучались лишь узким кругом ученых как компоненты биолюминесцентной системы [2]. Решающий прорыв в их практическом применении произошел после того, как в 1992 году клонировали зеленый белок ОРР [3], [4] и было показано, что 8 экспрессия его гена в других организмах также приводит к синтезу флуоресцентного белка [2], [4], [5], [6]. Следовательно, ген содержит всю информацию, необходимую для посттрансляционного синтеза хромофора, и в этом процессе не задействованы какие-либо специфические ферменты [2].

После этого открытия интерес к GFP чрезвычайно возрос, и в настоящее время GFP и его мутанты, а также другие флуоресцентные белки являются наиболее широко используемыми маркерами [2].

Такое активное применение связано, прежде всего, с принципиальным отличием технологии введения флуоресцентной метки от других методов исследования ультраструктуры клеток. Чтобы получить изображение с помощью электронного микроскопа, необходимо, чтобы клетка была мертва, зафиксирована и разделена на ультратонкие срезы. Это, естественно, не позволяет наблюдать клеточные процессы в динамике, и получить полную картину событий становится невозможным.

Флуоресцентные белки прекрасно справляются с задачами, требующими изучения взаимодействий между белками, их локализации в клетке, а также позволяют визуализировать динамику клеточных процессов. Введение флуоресцентной метки, как правило, не влияет на функционирование изучаемого белка и не оказывает токсического воздействия на клетку. Однако медленное созревание хромофора и наличие фоновой флуоресценции накладывает определенные ограничения на использование флуоресцентных белков.

Часто для решения научных задач требуется помечать разные клеточные структуры маркерами разных цветов, что с легкостью осуществимо при помощи флуоресцентных белков. Но для этого необходимо иметь белки, флуоресценция которых приходится на различные участки спектра. Поэтому в последние годы ведется активное создание новых мутантных форм с измененными свойствами.

В 1999 году целый ряд окрашенных белков, включающий красный белок DsRed, был клонирован из кораллов. Однако эти белки являются тетрамерами и часто токсичны для клетки или даже могут привести к ее гибели. Первым мономером, полученным из DsRed, стал mRFPl, для создания которого потребовалось сделать в DsRed 33 аминокислотных замены [7]. Для флуоресцентного белка mRFPl, также как и для DsRed, характерно красное излучение, и поэтому он представляет особый интерес с точки зрения минимизации фоновой зеленой флуоресценции клеточных компонентов [2].

Целью данного исследования является изучение влияния аминокислотных замен на структуру и свойства мутантов красного флуоресцентного белка mRFPl in silico и in vitro с использованием методов квантовой химии, молекулярной динамики, генной инженерии и спектрально-люминесцентной спектроскопии. Исходя из этого, были сформулированы следующие задачи исследования.

Задачи исследования

• создать топологию хромофора белка тЮЛ как нового аминокислотного остатка в силовом поле и вычислить ее параметры;

• создать РБВ-файлы для мутантов белка тКРР1, отредактировать файлы силового поля и создать топологии, соответствующие хромофорам мутантов;

• рассчитать равновесные трехмерные структуры мутантов белка тЯРР1 и провести анализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положению на геометрические параметры белка;

• методом генной инженерии создать плазмиды, содержащие гены 20 мутантных белков на основе белка тКБР1 со всеми вариантами аминокислотных остатков по 66 положению, провести целевую наработку препаратов белка, определить оптические свойства полученных препаратов;

• провести анализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положению на оптические свойства белка и сопоставить с изменением геометрических параметров;

• методами нелинейной лазерной флуориметрии установить истинные фотофизические параметры отдельных молекул белков и концентрации различных форм белка в растворе.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Вржещ, Евгений Петрович

Основные результаты и выводы работы

1. Методами квантовой химии и молекулярной динамики в силовом поле ОРЬБ-АА создана топология хромофора белка тКРР1 как нового аминокислотного остатка и рассчитаны ее параметры. Проведенное молекулярно-динамическое моделирование структуры белка DsR.ec! (с аналогичным хромофором) и сравнение с имеющимися рентгено-структурными данными показало правильность созданной топологии.

2. Методами квантовой химии и молекулярной динамики в силовом поле ОРЬБ-АА созданы топологии и рассчитаны параметры для всех 20 возможных хромофоров с заменами по 66 позиции.

3. Созданы РОВ-файлы структур белка тЯРР1 и его мутантов.

4. Проведено молекулярно-динамическое моделирование пространственных структур белков в растворе. Рассчитаны равновесные структуры белков. Наложение средних по траектории структур показало, что значительных изменений в конформации хромофора и его окружения не произошло, однако имеются некоторые геометрические отличия, которые, видимо, отвечают за сдвиги в спектрах поглощения и флуоресценции у мутантов. В результате анализа структур хромофоров мутантов выяснено, что наиболее вариабельными участками являются область соединения фенольного и имидозалидонового колец хромофора, а также зона присоединения мутированного радикала.

5. Методом олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза гена мономерного красного флуоресцентного белка (тКИМ), клонированного в модифицированной плазмиде рС>ЕМ, получен набор мутантных генов с заменами кодона С1п66. Экспрессия в Е.соИ и последующая аффинная очистка позволили получить серию препаратов из 20 мутантных белков тИФЬ Проведена наработка и выделение целевого белка. Проведенный электрофорез проб показал наличие во всех белка с массой 26 кДа, что соответствует целевому продукту. Измерены оптические свойства препаратов. Из 20 белков окраской и способностью флуоресцировать в видимой области обладают 12. Выявлена корреляция между объемом бокового радикала а.о. по 66 положению и оптическими свойствами полученного белка.

6. Определены индивидуальные оптические характеристики белка шКРР1 и его мутантов (Р66С и (^668), что позволило определить концентрации «зеленой» и «красной» форм хромофоров в растворе. Выявлена зависимость индивидуального коэффициента экстинкции красной формы белка (в максимуме полосы поглощения) от объема аминокислоты по 66 положению, что может быть применено для прогнозирования свойств новых мутантов флуоресцентных белков и синтеза белков с наперед заданными свойствами.

1.9. Заключение

В настоящее время изучение флуоресцентных белков ведется весьма интенсивно. Аспекты, рассматриваемые в многочисленных работах, достаточно разнообразны. Белки этого семейства широко используются в современной биотехнологии и клеточной биологии, но при этом до сих пор остаются неразрешенными важные вопросы, касающиеся механизмов, лежащих в основе реакций образования хромофора флуоресцентных белков, зависимости свойств белка от его структурных особенностей. Ведутся интенсивные поиски новых флуоресцентных белков, которые обладают совокупностью свойств, таких как высокая яркость (высокий квантовый выход флуоресценции и коэффициент экстинкции), мономерное состояние (олигомеризация может приводить, в частности, к неправильной интерпретации данных), высокая фотостабильность, полное и быстрое созревание. В настоящее время получение новых белков ведется путем рандомного мутагенеза, при этом пока не удается получить белок, который бы обладал всеми вышеперечисленными свойствами. Для получения белков с нужными свойствами необходимо понимание взаимосвязи между первичной структурой белков и оптическими свойствами, что стало возможным с применением методов направленного мутагенеза.

2. Молекулярная динамика

2.1. Методы

2.1.1. Метод молекулярной динамики

Метод молекулярной динамики - это один из методов молекулярного моделирования, позволяющий представить молекулярную систему в виде упрощенной модели и получить данные о структуре этой системы. Под молекулярным моделированием обычно понимают процесс описания сложных химических систем в виде реалистичной атомной модели, основанный на вычислениях, проводимых в масштабе атомов, с целью понять и предсказать макроскопические свойства этих систем [54].

Для того чтобы описать свойства молекулярной системы с высокой точностью, надо пользоваться уравнением Шредингера, но что-то более сложное, чем равновесное состояние нескольких атомов, не может быть посчитано на ah initio уровне (без упрощений), потому что это займет чрезвычайно много времени. Значит, необходимы некие приближения, причем, чем сложнее система и длиннее траектория, тем больше требуется приближений [55].

В основе метода молекулярной динамики лежит модельное представление многоатомной молекулярной системы, в которой все атомы представляют собой материальные точки, обладающие массой, причем поведение каждого отдельного атома описывается ньютоновскими уравнениями движения [56]. В классической механике состояние системы из N частиц в момент времени t однозначно определяется заданием набора векторов координат (х) и скоростей (v) частиц. Обозначим кратко эти наборы х = {Xj(t}} HV = {Vj(t)}, которые состоят из 3N чисел (каждый вектор имеет 3 компоненты) [57]. Основная задача механики состоит в том, чтобы найти состояние системы в произвольный момент времени t, если известно состояние системы в начальный момент времени (при t = 0). В классической механике эта задача решается путем вычисления траектории движения x(t). Траектория определяется при решении уравнений движения. В классической механике это хорошо известные уравнения Ньютона. В нашем случае мы должны написать систему 3N уравнений [57]:

1 = 1, 2 . N. где Ш] - масса атома, р1 - соответствующая проекция суммарной силы, действующей на атом со стороны остальных частиц, определяется по формуле:

О)

2) где и(х) - потенциальная энергия, зависящая от взаимного расположения всех атомов.

В методе молекулярной динамики принципиальным моментом является определение способа задания Щх). Потенциальная энергия молекулы в целом обычно задается в виде суммы вкладов [57]: где коэффициенты слагаемых отвечают следующим типам взаимодействий: Ь - химическим связям, а - валентным углам, ср - торсионным углам, Ц - ван-дер-ваальсовым контактам, С -электростатике.

Надо заметить, что такая система потенциалов - весьма приближенный способ задания потенциальной энергии. Его недостатки состоят в том, что энергия взаимодействия представляется в виде суммы парных сферически симметричных взаимодействий. И то и другое, вообще говоря, неверно.

Существуют различные наборы параметров для потенциалов взаимодействий. Их значения определяются из учета различных типов экспериментальных данных (спектральные, калориметрические, кристаллографические) и квантово-химических расчетов и приводятся в силовых полях.

Еще один принципиальный вопрос молекулярной динамики состоит в способе решения системы уравнений движения. Даже для небольшого белка число уравнений составляет порядка 10 000. Основа алгоритма состоит в следующем. Задав координаты и скорости всех частиц в начальный момент времени, вычисляют на каждом последующем шаге все силы и новые координаты и скорости частиц [57].

Задав начальную структуру молекулы и набор межатомных потенциалов, мы можем приступать к численной процедуре решения системы уравнений движения и вычисления траектории. Необходимо задать шаг интегрирования, т.е. минимальный отрезок времени, на котором будет рассчитываться приращение координаты частицы пропорционально мгновенному значению скорости. Шаг интегрирования должен быть много меньше характерного времени самых быстрых движений в молекуле - валентных колебаний. Обычно шаг составляет 1 фемтосекунду

Расчеты проводят либо при постоянной энергии системы или, чаще, при постоянной температуре. Мгновенная температура определяется как средняя кинетическая энергия, приходящаяся на одну степень свободы системы: где Кь - постоянная Больцмана.

Температура получается усреднением ее мгновенных значений Т^) по некоторому интервалу времени [57]. и(х) = иь + иа + иф + иц + ис

3)

Ю-15 с) [57].

4) го

В реальных экспериментах молекулы обычно находятся в растворах и активно взаимодействуют с молекулами растворителя. Температура системы поддерживается за счет энергообмена с внешней средой. Детальный учет взаимодействия молекулы с внешней средой в молекулярно-динамических расчетах часто невозможен. Для учета эффектов энергообмена с внешней средой используются специальные алгоритмы - термостаты [56].

В результате расчета молекулярной динамики получается траекторный файл, содержащий координаты всех атомов в определенные моменты времени (обычно запись координат в траекторный файл осуществляют с шагом 0.1 пс). Количественное изучение динамических свойств молекул проводят с использованием функций распределения и средних значений от различных величин [57].

Весьма важно сравнение вычисляемых таким образом значений с измеряемыми экспериментально величинами.

2.1.2. Силовое поле ОРЬв-АА

Силовое поле строится из двух разных компонентов:

1. набор уравнений (так называемые потенциальные функции), используемых для того, чтобы посчитать потенциальные энергии и их производные - силы;

2. параметры, используемые в этом наборе уравнений.

Для МД-расчетов в качестве исходного было выбрано хорошо известное силовое поле ОРЬБ-АА [58], параметры которого дополнительно оптимизированы для пептидов [59].

В силовом поле ОРЬБ-АА и в нашей работе параметрами, определяющими поведение системы, являются наборы констант, входящие в уравнение потенциальной энергии (5): и = £Ч(гц) + £ Уа(0к1т)+ £ Ум(^порч)+ ^ УгЬ(фГ5Ш)+^Уц(гуш) + ЛУс(гху) (5) г1) 6к1т ?поря Фти Ууиг гху где Уь(гц) - гармонический потенциал изменения длины связи между двумя атомами 1 и ], описываемый формулой (6),

Уа(9к1т) ~ гармонический потенциал изменения величины валентного угла, образованного тремя атомами к, 1 и ш, описываемый формулой (7), а(^поря) - гармонический потенциал изменения величины двугранного угла, образованного четырьмя атомами п, о, р и q, описываемый формулой (8),

Ч-ь (Фгбш) ~ периодический потенциал изменения величины двугранного угла, образованного четырьмя атомами г, в, I и и, описываемый формулой (9),

Уц(гуш) - комбинированный потенциал отталкивания и дисперсионного взаимодействия между двумя несвязанными атомами V и ш (потенциал Леннарда-Джонса), описываемый формулой (10),

Ус(гху) - потенциал электростатического (кулоновского) взаимодействия между двумя несвязанными атомами х и у, описываемый формулой (13).

Ниже приведены формулы для расчета потенциалов, входящих в уравнение потенциальной энергии (5).

Гармонический потенциал изменения длины связи между двумя атомами 1 и ^(гц)=^к5(гц-Ьч)2 (6) где к-- - жесткость связи между атомами 1 и ] [кДж/(мольнм2)], Ц - равновесная длина связи [нм], Гц - текущая длина связи [нм].

Гармонический потенциал изменения величины валентного угла, образованного тремя атомами k, 1 и ш:

Va(9kim) = ~k®)m(6klm - 8£lm)2 (7) где k®lm - жесткость валентного угла [кДжДмольрад2)], образованного атомами k, 1 и ш, 6kim - текущее значение валентного угла (в градусах), 0£]т - равновесное значение угла (в градусах).

Гармонический потенциал изменения величины двугранного угла, образованного четырьмя атомами п, о, р и q: nopqj — knopq(^nopq ?nopq) (8)

E ? где k„opq - жесткость двугранного угла [кДж/(моль рад )], образованного четырьмя атомами п, о, р и q, ^ПорЧ - текущее значение двугранного утла (в градусах), ^Sopq ~ равновесное значение угла (в градусах).

Периодический потенциал изменения величины двугранного угла, образованного четырьмя атомами г, s, t и и:

Vrb^rstu) = 2п=0 С„(с05(фгзш - 180°))» (9) где фГ5Ш - текущее значение двугранного угла (в градусах), Сп - константы потенциала [кДж/моль].

Комбинированный потенциал отталкивания и дисперсионного взаимодействия между двумя несвязанными атомами V и ш (потенциал Леннарда-Джонса):

Уц(г™) = 4г™((^)12-(^)6) (10) где параметры потенциала Леннарда-Джонса: гуш - расстояние между несвязанными атомами V и ш (нм), ауш (нм) задается формулой (11): \ + (11) где Оуу и Оум выражены в нм, а [кДж/моль] задается формулой (12):

12) где £уу и е^лд, выражены в кДж/моль.

Потенциал электростатического (кулоновского) взаимодействия между двумя несвязанными заряженными атомами х и у: гхуЬ-г1-— (13)

4п£0£ггху 4 > где гху - расстояние между заряженными атомами х и у [нм], и - эффективные точечные заряды атомов (в единицах заряда электрона 1.6-10"19 Кл), е0 - абсолютная

9 9 диэлектрическая проницаемость [Дж-м /Кл ], £г - относительная диэлектрическая проницаемость (безразмерная величина).

Для молекулярно-динамических расчетов в качестве описания молекул растворителя была выбрана модель воды Т1Р4Р, расчетные термодинамические характеристики которой наиболее близки к экспериментальным [60].

2.1.3. Программный пакет GROMACS

В данной работе для проведения МД-расчетов использовали программный пакет GROMACS [55]. Данный пакет программ поддерживает применение силового поля OPLS-AA, модель воды TIP4P и отличается высокой производительностью. В работе [55] было проведено сравнение производительности разных пакетов программ для молекулярно-динамических симуляций (AMBER, CHARMM, GROMOS96, GROMACS) для белков, пептидов и фосфолипидных мембран, которое показало преимущество GROMACS в 3-10 раз по скорости счета.

2.2. Схема проведения МД-расчетов

2.2.1. Исходная структура белка DsRed

Для проведения МД-расчетов белка DsRed в виде тетрамера был использован файл PDB ID 1ZGO [1] для задания исходной структуры, полученный на сайте Protein Data Bank (http://www.pdb.org) [61], [62]. В данном файле содержится информация о координатах атомов созревшей формы тетрамера белка DsRed (за исключением атомов водорода) по данным РСА для кристалла этого белка [1].

2.2.2. Задание системы для МД-расчетов

С помощью программы pdb2gmx программного пакета GROMACS к исходной структуре белка DsRed была добавлена информация об атомах водорода белковой молекулы, отсутствующая в PDB файле исходной структуры белка. Полученная структура с помощью той же программы конвертировалась в координатный файл формата GRO.

Для структуры тетрамера белка DsRed, записанной в полученном файле, с помощью программы editconf программного пакета GROMACS были заданы периодические условия. Размеры периодического ящика составили 63.28 А х 76.89 А х 71.43 А.

Далее в тот же файл, содержащий структуру тетрамера белка DsRed в периодическом ящике, с помощью программы genbox [63] было добавлено 12 514 молекул растворителя (воды).

С помощью программы genion в координатном файле, полученном после добавления молекул воды, четыре молекулы воды были заменены на четыре иона Na+.

Таким образом, система для МД-расчетов представляла собой белок-тетрамер DsRed, 12 510 молекул воды и 4 иона натрия.

2.2.3. Минимизации энергии системы integrator steep

Nsteps 100

Emtol 2 000

Emstep 0.01

Nstcomm 1 nstype grid

Rlist 1 rcoulomb 1.0

Rvdw 1.0

Tcoupl no

Pcoupl no genvel no

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Вржещ, Евгений Петрович, 2012 год

1. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. Зубова Н.Н., Булавина А.Ю., Савицкий А.П. 2003 г., Успехи биологической химии, Т. 43, стр. 163-224.

2. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. 2, 1992 г., Gene, T. 111, стр. 229-233.

3. The green fluorescent protein. Tsien R.Y. 1998 г., Annual Review of Biochemistry, T. 67, стр. 509544.

4. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. 5148, 1994 г., Science, T. 263, стр. 802-805.

5. Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. Inouye S., Tsuju F.1.2-3, 1994 г., FEBS Letters, T. 341, стр. 277-280.

6. Creating new fluorescent probes for cell biology. Zhang J., Campbell R.E., Ting A.Y., Tsien R.Y. 12, 2002 г., Nature Reviews Molecular Cell Biology, T. 3, стр. 906-918.

7. Biophysics of the green fluorescent protein. Prendergast F.G. 1999 г., Methods in cell biology, T. 58, стр. 1-18.

8. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. 7, 2002 г., PNAS, T. 99, стр. 4256-4261.

9. Ward W.W. Biochemical and physical properties of green fluorescent protein, авт. книги. Kain S. Chalfie M. Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols. NY: Wiley-Liss, 1998, стр. 45-75.

10. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. 10, 1999 г., Nature Biotechnology, T. 17, стр. 969-973.

11. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Verkhusha V.V., Lukyanov K.A. 3, 2004 г., Nature Biotechnology, T. 22, стр. 289-296.

12. Tsien R.Y. Tsien Laboratory . В Интернете. http://www.tsienlab.ucsd.edu.

13. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Zimmer M. 3, 2002 г., Chemical Reviews, T. 102, стр. 759-781.

14. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Lippincott-Schwartz J., Patterson G.H. 5616, 2003 г., Science, T. 300, стр. 87-91.

15. Evolution of function and color in GFP-like proteins. Matz M.V., Labas Y.A., Ugalde J. 2006 г., Methods of biochemical analysis, T. 47, стр. 139-161.

16. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Salih A., Larkum A., Cox G., Kiihl M., Hoegh-Guldberg O. 6814, 2000 г., Nature, T. 408, стр. 850-853.

17. The molecular structure of green fluorescent protein. Yang F., Moss L.G., Phillips G.N. 10, 1996 т., Nature Biotechnology, T. 14, стр. 1246-1251.

18. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. 5280, 1996 г., Science, T. 273, стр. 1392-1395.

19. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Niwa G., Inouye S., Hirano T., Matsuno T., Kojima S., Massayuki K., Ohashi M., Tsuji F.I. 24, 1996 т., PNAS, T. 93, стр. 13617-13622.

20. Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., Lukyanov S.A. 3, 2000 г., FEBS Letters, T. 479, стр. 127-130.

21. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-Â resolution. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. 2, 2001 г., PNAS, T. 98, стр. 462-467.

22. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Wall M.A., Socolich M.A., Ranganathan R. 12,2000 г., Nature structural biology, T. 7, стр. 1133-1138.

23. Kinetic analysis of maturation and denaturation of DsRed, a coral-derived red fluorescent protein. Verkhusha V.V., Akovbian N.A., Efremenko E.N., Varfolomeyev S.D., Vrzheshch P.V. 12, 2001 г., Biochemistry (Moscow), T. 66, стр. 1342-1351.

24. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Heim R., Prsasher D.C., Tsien R.Y. 26, 1994 г., PNAS, T. 91, стр. 12501-12504.

25. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K. Tsien R.Y. 22, 2000 г., PNAS, T. 97, стр. 11990-11995.

26. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. 22, 2000 г., PNAS, T. 97, стр. 11984-11989.

27. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. 6, 2004 г., Chemistry & Biology, T. 11, стр. 845-854.

28. Analysis of DsRed mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development. Terskikh A.V., Fradkov A.F., Zaraisky A.G., Kajava A.V., Angres B. 10, 2002 г., The Journal of biological chemistry, T. 277, стр. 7633-7636.

29. Oligomerization of DsRed is required for the generation of a functional redfluorescent chromophore. Sacchettia A., Subramaniam V., Jovin T.M., Alberti S. 1-3, 2002 г., FEBS Letters, T. 525, стр. 13-19.

30. A monomeric red fluorescent protein. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. 12, 2002 г., PNAS, T. 99, стр. 7877-7882.

31. High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Verkhusha V.V., Kuznetsova I.M., Stepanenko O.V, Zaraisky A.G., Shavlovsky M.M., Turoverov K.K., Uversky V.N. 26, 2003 г., Biochemistry, T. 42, стр. 7879-7884.

32. X-ray diffraction and time-resolved fluorescence analyses of Aequorea green fluorescent protein crystals. Perozzo M.A., Ward K.B., Thompson R.B., Ward W.W. 16, 1988 г., The Journal of biological chemistry, T. 263, стр. 7713-7716.

33. Improved green fluorescence. Heim R., Cubitt A.B., Tsien R.Y. 6516, 1995 г., Nature, T. 373, стр. 663-664.

34. Fluorescence quantum yields of some rhodamine dyes. Kubin R.F., Fletcher A.N. 4, 1982 г., Journal of Luminescence, T. 27, стр. 455-462.

35. Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Cubitt A.B., Woollenweber L.A., Heim R. 1999 г., Methods in cell biology, T. 58, стр. 19-30.

36. Unnatural amino acid mutagenesis of green fluorescent protein. Wang L., Xie J., Deniz A.A., Schultz P.G. 1, 2003 г., The Journal of organic chemistry, T. 68, стр. 174-176.

37. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. 2, 1995 г., Nature Biotechnology, T. 13, стр. 151-154.

38. Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano. Henderson J.N., Remington S.J. 36, 2005 г., PNAS, T. 102, стр. 12712-12717.

39. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H., Miyawaki A. 20, 2002 г., PNAS, T. 99, стр. 12651-12656.

40. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescence protein. Mizuno H., Mal T.K, Tong K.I., Ando R., Furuta T., Ikura M., Miyawaki A. 4, 2003 г., Molecular Cell, T. 12, стр. 1051-1058.

41. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N., Miyawaki A. 3, 2005 г., EMBO reports, T. 6, стр. 233-238.

42. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. 6, 2001 г., BMC Biochemistry, T. 2.

43. Степанов Н.Ф. Квантовая механика и квантовая химия. Москва : Мир, 2001.

44. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. Lindahl E., Hess В., Spoel D. 8, 2001 г., Journal of Molecular Modeling, T. 7, стр. 306-317.

45. Шайтан K.B., Терешкина К.Б. Молекулярная динамика белков и пептидов. Методическое пособие. В Интернете. http://www.moldyn.ru/library/manual/index.htm.

46. Шайтан К.В. Молекулярная динамика пептидов. В Интернете. http://www.bioeng.ru/doc/stat/moldyn.htm.

47. OPLS all-atom model for amines: Resolution of the amine hydration problem. Rizzo R.C., Jorgensen W.L. 20, 1999 г., Journal of the American Chemical Society, T. 121, стр. 4827-4836.

48. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. Jorgensen W.L., Chaudrasekhar J., Madura J.D., Impey R.W., Klein M.L. 2, 1983 г., The Journal of Chemical Physics, T. 79, стр. 926-935.

49. Solvation energy in protein folding and binding. Eisenberg D., McLachlan A.D. 6050, 1986 г., Nature, T. 319, стр. 199-203.

50. LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations. Hess В., Bekker H., Berendsen H.J.C., Fraaije J.G.E.M. 12, 1997 г., Journal of Computational Chemistry, T. 18, стр. 1463-1472.

51. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Berendsen H.J.C., Spoel D., Drunen R. 1-3, 1995 г., Computer Physics Communications, T. 91, стр. 43-56.

52. Molecular dynamics with coupling to an external bath. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., Gunsteren W.F., DiNola A., Haak J.R. 8, 1984 г., The Journal of Chemical Physics, T. 81, стр. 36843690.

53. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Guex N., Peitsch M.C. 15, 1997 г., Electrophoresis, T. 18, стр. 2714-2723.

54. GROMACS: fast, flexible, and free. Spoel D., Lindahl E., Hess В., Groenhof G., Mark A.E., Berendsen H.J.C. 16, 2005 г., Journal of Computational Chemistry, T. 26, стр. 1701-1718.

55. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. стр. 1659.

56. The Fungal Genetics Stock Center: from molds to molecules. McCluskey K. 2003 г., Advances in applied microbiology, T. 52, стр. 245-262.

57. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва : Мир, 1984. стр. 480.

58. Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Zoller M.J., Smith M. 1983 г., Methods in Enzymology, T. 100, стр. 468-500.

59. Эффективный метод направленного введения мутаций в плазмиды и клонирования однотяжевых фрагментов ДНК. Друца B.JL, Кабердин В.Р., Королева О.Н., Шилов И.А. 11, 1991 г., Биоорганическая химия, Т. 17, стр. 1487-1493.

60. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 12, 1977 г., PNAS, T. 74, стр. 5463-5467.

61. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Bradford M.M. 1976 г., Analytical Biochemistry, T. 72, стр. 248-254.

62. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Laemmli U.K. 5259, 1970 г., Nature, T. 227, стр. 680-685.

63. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. I. Сенсоры рН, ионов Cl-, Са2+, Zn2+, Си2+. Зубова Н.Н., Савицкий А.П. 2005 г., Успехи биологической химии, Т. 45, стр. 391-454.

64. Фадеев В.В., Чекалюк А.М., Чубаров В.В. 2, 1982 г., Доклады АН СССР, Т. 262, стр. 338-341.

65. Saturation spectroscopy as a method for determining the photophysical parameters of complicated organic compounds. Fadeev V.V., Dolenko T.A., Filippova E.M., Chubarov V.V. 1999 г., Optics Communications, T. 166, стр. 25-33.

66. Time-resolved fluorimetry of two-fluorophore organic systems using artificial neural networks. Dolenko S.A., Dolenko T.A., Fadeev V.V., Gerdova I.V., Kompitsas M. 4-6, 2002 г., Optics Communications, T. 213, стр. 309-324.

67. Matrix method in laser fluorimetry of organic compounds. Fadeev V.V., Dolenko T.A., Banishev A.A., Litvinov P.N., Maslov D.V. 2005 г., Proceedings of SPIE, T. 5826, стр. 44-55.

68. Origin of the anomalous two-photon absorption in fluorescent protein DsRed. Nifosi R., Luo Y. 3, 2007 г., The journal of physical chemistry. В, T. Ill, стр. 505-507.

69. Determination of fluorescence quantum yields using a spontaneous raman scattering line of the solvent as internal standard. Chekalyuk A.M., Fadeev V.V., Georgyiev G., Kalkanjiev T. 5, 1982 г., Spectroscopy Letters, T. 15, стр. 355-365.

70. Quinine sulfate as a fluorescence quantum yield standard. Fletcher A.N. 5, 1969 г., Photochemistry and Photobiology, T. 9, стр. 439-444.

71. Study of the uniqueness and stability of the solutions of inverse problem in saturation fluorimetry. Boychuk I.V., Dolenko T.A., Sabirov A.R., Fadeev V.V., Filippova E.M. 7, 2000 г., Quantum Electron, T. 30, стр. 611-616.

72. The nature of fluorescence emission in the red fluorescent protein DsRed, revealed by single-molecule detection. Garcia-Parajo M.F., Koopman M., Dijk E.M., Subramaniam V., Hulst N.F. 25, 2001 г., PNAS, T. 98, стр. 14392-14397.

73. Эльсгольц Л.Э. Дифференциальные уравнения и вариационное исчисление. Москва : Наука, 1956.стр. 424.

74. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I. at al. 2005 г., Biochemistry, T. 44, стр. 57885793.

75. Lukyanov K.A., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., at al. 2000 г., The Journal of biological chemistry, T. 275, стр. 25879-25882.

76. Переплетено ООО «Цифровичок» [phone]; [phone] www.cfr.ru; [e-mail]