Синтез и свойства хромофоров белков семейства зеленого флуоресцентного белка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Ямпольский, Илья Викторович

• Ямпольский, Илья Викторович
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ямпольский, Илья Викторович

Список сокращений.

Введение.

ГЛАВА 1. Биохимия флуоресцентных белков и их хромофоров (обзор литературы).

1.1 Введение.

1.2 Флуоресцентные белки - гомологи зеленого флуоресцентного белка (GFP).

1.2.1 Краткая история флуоресцентных белков.

1.2.2 Структура GFP-подобных белков.

1.2.3 Биохимия и спектральные свойства GFP-подобных белков.

1.3 Хромофоры флуоресцентных белков.

1.3.1 Методы синтеза хромофоров.

1.3.2 Структурные и химические особенности хромофоров.

1.3.2.1 Кислотно-основные свойства.

1.3.2.2 Цис-транс изомерия. Термическая изомеризация.

1.3.2.3 Окислительно-восстановительные свойства.

1.3.2.4 Прочие химические свойства.

1.3.3 Спектральные свойства хромофоров.

1.3.3.1 Поглощение.

1.3.3.1.1 Структурные факторы.

1.3.3.1.2 Сольватохромные свойства.

1.3.3.2 Флуоресценция.

1.3.3.3 Специфическое влияние окружения на спектральные свойства

1.3.3.4 Фотоизомеризация.

1.3.4 Перспективы.

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение.

2.1 Синтез и свойства хромофора красного хромобелка asFP595 {Anemonia sulcata).

2.1.1 Синтез.

2.1.2 Спектральные свойства.

2.1.3 Обсуждение.

2.2 Синтез и свойства хромофора красного фотоконвертируемого белка Kaede (Trachyphyllia geoffroyi) и его структурных аналогов.

2.2.1 Синтез.

2.2.2 Спектральные свойства.

2.3 Синтез и свойства хромофора желтого флуоресцентного белка YFP {Zoanthus sp.).

2.3.1 Синтез.

2.3.2 Химические и спектральные свойства.

2.3.3 Обсуждение.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.

3.1 Материалы, оборудование, программное обеспечение.

3.2 Синтез.

Выводы.

Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и свойства хромофоров белков семейства зеленого флуоресцентного белка»

Бурно развивающиеся в последние годы технологии флуоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические процессы. Одним из важнейших инструментов изучения живой клетки являются флуоресцентные маркеры, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми структурами или процессами в режиме реального времени. Особенно широко используются генетически кодируемые метки — флуоресцентные белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP, формирующие хромофорную группу внутри молекулы белка за счет посттрансляционных модификаций собственных аминокислотных остатков. Исследования последних лет показали большое разнообразие спектральных характеристик и структур хромофоров в GFP-подобных белках.

Данная работа посвящена синтезу и изучению химических и. спектральных свойств хромофорных групп GFP-подобных белков. Впервые разработаны методы синтеза хромофоров флуоресцентных и хромобелков — гомологов GFP, поглощающих и флуоресцирующих в красной области видимого спектра. Синтезированы хромофоры пурпурного хромобелка asFP595, красного фотоконвертируемого флуоресцентного белка Kaede и желтого флуоресцентного белка zFP538. Синтетические хромофоры позволили провести детальный анализ ауксохромных свойств заместителей в данном ряду окрашенных соединений, а также их сольватохромных и кислотно-основных свойств. Выявлена химическая природа сложного спектрального поведения хромопептидов из белка zFP538, приведшего к неправильному определению их структуры. Обнаружена необычная перегруппировка 2-ацил-5-арилиден-3,5-дигидро-4//-имидазол-4-онов в уникальные производные 2,6-дикетопиперазина, встречающиеся в природе среди метаболитов грибов. Полученные в настоящей работе флуорогены (красители, практически нефлуоресцентные в свободном состоянии в растворе, но приобретающие яркую флуоресценцию после прочного связывания с целевой молекулой, например, белком или ионом металла) и их аналоги могут найти применение для различных флуоресцентных методов детекции.

ГЛАВА 1. Биохимия флуоресцентных белков и их хромофоров (обзор литературы)

1.1 Введение

Белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP широко известны благодаря уникальному механизму формирования хромофорной группы, а также благодаря возможности их использования в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток для прижизненной визуализации процессов жизнедеятельности отдельных клеток и целых организмов [1, 2]. Отличительной особенностью белков этого семейства является уникальный автокаталитический механизм формирования хромофора. В отличие от обычных ферментов, производящих какую-либо одну реакцию множество раз, флуоресцентные белки в ходе своего созревания один раз проводят 2-3 совершенно разные реакции, приводящих к синтезу хромофора внутри молекулы белка за счет посттрансляционных модификаций собственных аминокислотных остатков.

Первый зеленый флуоресцентный белок был найден в гидроидной медузе Aequorea victoria [3, 4]. Позже в коралловых полипах были открыты желтые, оранжевые и красные флуоресцентные белки, а также нефлуоресцентные хромобелки [2, 5]. Исследования последних лет показали, что спектральное разнообразие белков семейства GFP обеспечивается разнообразием химических структур их хромофоров [6, 7].

Синтез модельных хромофоров флуоресцентных белков тесно связан с проблемой определения химического строения нативных хромофоров.

Доказательство строения GFP-хромофора проходило в несколько этапов.

Вначале первооткрывателем GFP Шимомурой была установлена аминокислотная последовательность пептида, полученного при 6 гидрировании окрашенной фракции лизата GFP и выделен п-гидроксибензальдегид в качестве продукта гидролиза хромофора, показано спектральное сходство синтезированного de novo хромофора и окрашенного продукта протеолиза GFP [8]. Значительно позже, после успешного клонирования гена GFP [4], было проведено сравнение структур белкового и синтетического хромофоров методом масс-спектрометрии [9], а также непосредственное определение структуры нативного белка с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [10, 11]. В настоящее время PC А стал основным методом исследования структуры хромофоров в различных флуоресцентных белках [7]. В то же время, кристаллографическое определение структуры не всегда допускает однозначную интерпретацию и малоинформативно при изучении химии и фотохимии хромофоров. Именно поэтому синтез и изучение низкомолекулярных модельных соединений остаются важными задачами, особенно ввиду возрастающего разнообразия известных структур хромофоров.

Несмотря на то, что ковалентная структура большинства известных белковых хромофоров считается надежно установленной, детали стереохимии, кислотно-основных взаимодействий, а также реакционной способности возбужденного состояния остаются недостаточно изученными. В то же время, перечисленные особенности хромофоров важны для понимания таких процессов, происходящих в нативных белках, как фотоактивация [12], фотопереключение [13], фотообесцвечивание [14], фототоксичность [15], созревание сложных хромофоров и др.

В данном обзоре рассмотрены структурные и биохимические особенности флуоресцентных белков — гомологов GFP, методы синтеза соединений, моделирующих хромофоры GFP-подобных белков, обобщены результаты, полученные при изучении этих соединений, и их использование для объяснения спектральных и биохимических свойств флуоресцентных белков.

1.2 Флуоресцентные белки - гомологи зеленого флуоресцентного белка (GFP)

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Ямпольский, Илья Викторович

Выводы

1. Разработан общий метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4//имидазол-4-онов, имеющих ацильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор окрашенного белка asFP595, изучено его спектрохимическое поведение в различных условиях. Показана тождественность структуры модельного соединения структуре хромофора в белке.

2. Разработан новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4//-имидазол

4-онов, имеющих функционализированный этенильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор флуоресцентного фотопереключаемого белка Kaede (красная форма). Также синтезированы б структурных аналогов хромофора Kaede, соответствующих замене гистидина на другие аминокислоты в хромофоре. Изучены спектрохимические характеристики полученных хромофоров. Показано, что хромофор Каеёе-типа, содержащий остаток аспарагина вместо гистидина обладает наиболее длинноволновым поглощением.

3. Получен хромофор желтого флуоресцентного белка zFP538.

Независимо показано, что в нативном zFP538 хромофор существует в форме внутримолекулярного имина. Выявлена химическая природа сложного рН-зависимого спектрального поведения хромофора ZFP538.

4. Обнаружена самопроизвольная перегруппировка 5-арилиден-2-ацил

3,5-дигидроимидазол-4-онов в 3-арилиден-5-алкил-2,6дикетопиперазины в водных и спиртовых растворах в кислой среде.

Благодарности

Автор выражает сердечную благодарность своим научным руководителям, Константину Анатольевичу Лукьянову и Виктору Кузьмичу Потапову за всестороннюю помощь в планировании и осуществлении данной работы. Автор благодарит заведующего лабораторией Молекулярных технологий ИБХ РАН Сергея Анатольевича Лукьянова и заведующего лабораторией Структуры и Функций Генов Человека Евгения Давидовича Свердлова, в чьих лабораториях проводилась работа, а также всех сотрудников этих лабораторий, в дружеском коллективе которых автор имеет удовольствие работать. Автор благодарит Вадима Сергеевича Кублицкого и Игоря Адамовича Прохоренко за постоянную помощь. Также автор благодарен своему коллеге Александру Кислухину, работавшему под его руководством, и внесшим вклад в настоящую работу. Автор благодарит своего коллегу Павла Ивашкина за ценные научные дискуссии по теме работы, а также за помошь в оформлении работы. Автор благодарит сотрудников лабораторий ЯМР и масс-спектрометрии ИБХ РАН, в особенности Тамару Андреевну Балашову и Рустама Хусмановича Зиганшина, за помощь в регистрации и расшифровке спектров. Автор благодарен официальным оппонентам Андрею Альфредовичу Формановскому и Юрию Исаевичу Смушкевичу за их ценные критические замечания, которые автор постарался учесть при оформлении работы. Автор также благодарит членов своей семьи и родственников за помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ямпольский, Илья Викторович, 2009 год

1. Tsien, R.Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 1998, 67, 509544.

2. Chudakov, D.M., Lukyanov, S., Lukyanov, K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotech 2005, 23, 605-613.

3. Johnson, F.H., Yo Saiga, O.S., Gershman, C.L., Reynolds, G. Т., Waters, J.R. Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea. J Cell Comp Physiol 1962, 60, 85-103.

4. Prasher, D.C., Eckenrode, V.K., Ward, W.W., Prendergast, F.G., Cormier, M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 1992,111,229-233.

5. Matz, M., Fradkov, A., Labas, Y., Savitsky, A., Zaraisky, A., Markelov, M., Lukyanov, S. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol 1999,17, 969 973.

6. Pakhomov, A.A., Martynov, V.J. GFP family: Structural insights into spectral tuning. Chem and Biol 2008, 15, 755-764.

7. Remington, S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. Curr Opin Struct Biol 2006,16, 714-721.

8. Shimomura, O. Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. FEBSLett 1979,104, 220-222.

9. Niwa, H., Inouye, S., Hirano, Т., Matsuno, Т., Kojima, S., Kubota, M., Ohashi, M., Tsuji, F. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93, 13617-13622.

10. Ormo, M., Cubitt, A., Kallio, K., Gross, L., Tsien, R., Remington, S. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science 1996, 273, 1392 1395.

11. Yang, F., Moss, L., Phillips, G. The molecular structure of green fluorescent protein. Nat Biotechnol 1996, 14, 1246 1251.

12. Lukyanov, K.A., Chudakov, D.M., Lukyanov, S., Verkhusha, V.V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 2005, 6, 885891.

13. Greenbaum, L., Rothmann, C., Lavie, R., Malik, Z. Green fluorescent protein photobleaching: a model for protein damage by endogenous and exogenous singlet oxygen. Biol Chem 2000, 381, 1251-1258.

14. Bulina, M.E., Chudakov, D.M., Britanova, O.V., Yanushevich, Y.G., Staroverov, D.B., Chepurnykh, Т. V., Merzlyak, E.M., Shkrob, M.A., Lukyanov, S., Lukyanov, K.A. A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol 2006, 24, 95-9.

15. Shimomura, O. Bioluminescence: Principles and Methods 2006, World Scientific.

16. Pinton, P., Rimessi, A., Romagnoli, A., Prandini, A., Rizzuto, R. Biosensors for the detection of calcium and pH. Methods Cell Biol 2007, 80, 297-325.

17. Morise, H., Shimomura, O., Johnson, F.H., Winant, J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. Biochemistry 1974, 13, 2656-62.

18. Ward, W.W., Cody, C.W., Hart, R.C., Cormier, M.J. Spectrophotometric identity of the energy transfer chromophores in Renilla and Aequorea green fluorescent proteins. Photochem Photobiol 1980, 31, 611-615.

19. Chalfie, M., Tit, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994, 263, 802-805.

20. Inouye, S., Tsuji, FJ. Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. FEBS Lett 1994, 341,277-80.

21. Heim, R., Prasher, D.C., Tsien, R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91, 12501-12504.

22. Verkhusha, V. V., Lukyanov, K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotech 2004, 22, 289-296.

23. Gurskaya, N., Fradkov, A., Terskikh, A., Matz, M., Labas, Y., Martynov, V., Yanushevich, Y., Lukyanov, K, Lukyanov, S. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett 2001, 507, 16-20.

24. Mikhail V. Matz, K.A.L., Sergey A. Lukyanov, Family of the green fluorescent protein: Journey to the end of the rainbow. Bioessays 2002, 24, 953-959.

25. Bidina, M., Chudakov, D., Mudrik, N., Lukyanov, K. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochemistry 2002, 3, 7.

26. Surrey, Т., Elowitz, M.B., Wolf, P.-E., Yang, F., NF©dF©lec, F.o., Shokat, K., Leibler, S. Chromophore-assisted light inactivation and self-organization of microtubules and motors. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95, 4293-4298.

27. Tour, O., Meijer, R.M., Zacharias, D.A., Adams, S.R., Tsien, R.Y. Genetically targeted chromophore-assisted light inactivation. Nat Biotechnol 2003, 21, 1505-1508.

28. Bulina, M.E., Lukyanov, K.A., Britanova, O.V., Onichtchouk, D., Lukyanov, S., Chudakov, D.M. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protocols 2006, 1, 947-953.

29. Giepmans, B.N.G., Adams, S.R., Ellisman, M.H., Tsien, R.Y. Review The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science 2006, 312,217-224.

30. Remington, S.J., Wachter, R.M., Yarbrough, D.K., Branchaud, В., Anderson, D.C., Kallio, K., Lukyanov, K.A. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry 2005, 44, 202-212.

31. Cody, C.W., Prasher, D.C., Westler, W.M., Prendergast, F.G., Ward, W.W. Chemiocal structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green fluorescent protein. Biochemistry 1993, 32, 1212-1218.

32. Mccapra, F., Razavi, Z., Neary, A.P. The Fluorescence of the Chromophore of the Green Fluorescent Protein of Aequorea and Renilla. J Chem Soc Chem Comm 1988, 790-791.

33. Yang, F., Moss, L.G., Phillips, G.N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nat Biotechnol 1996, 14, 1246-1251.

34. Wachter, R.M. Chromogenic cross-link formation in green fluorescent protein. Acc Chem Res 2007, 40, 120-127.

35. Zhang, L., Patel, H.N., Lappe, J.W., Wachter, R.M. Reaction Progress of Chromophore Biogenesis in Green Fluorescent Protein. J Am Chem Soc 2006, 128, 4766-4772.

36. Barondeau, D.P., Tainer, J.A., Getzoff, E.D. Structural evidence for an enolate intermediate in GFP fluorophore biosynthesis. J Am Chem Soc 2006, 128,3166-3168.

37. Rosenow, M.A., Huffman, H.A., Phail, M.E., Wachter, R.M. The crystal structure of the Y66L variant of green fluorescent protein supports a cyclization-oxidation-dehydration mechanism for chromophore maturation. Biochemistry 2004, 43, 4464-4472.

38. Patterson, G.H., Knobel, S.M., Sharif, W.D., Kain, S.R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J 1997, 73, 2782-2790.

39. Waldo, G.S., Standish, B.M., Berendzen, J., Tenvilliger, T.C. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein. Nat Biotechnol 1999, 17, 691695.

40. Pedelacq, J.D., Cabantous, S., Tran, Т., Terwilliger, T.C., Waldo, G.S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol 2006, 24, 79-88.

41. Chattoraj, M., King, B.A., Bublitz, G.U., Boxer, S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: Multiple states and proton transfer. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93, 8362-8367.

42. Ward, W.W., Prentice, H.J., Roth, A.F., Cody, C.W., Reeves, S.C. Spectral perturbations of the Aequorea green fluorescent protein. Photochem Photobiol 1982, 35, 803-808.

43. Heim, R., Cubitt, А.В., Tsien, R.Y. Improved Green Fluorescence. Nature 1995,373, 663-664.

44. Brejc, 1С, Sixma, Т.К., Kitts, P.A., Kain, S.R., Tsien, R.Y., Ormo, M., Remington, S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 2306-2311.

45. Bell, A.F., Stoner-Ma, D., Wachter, R.M., Tonge, P.J. Light-driven decarboxylation of wild-type green fluorescent protein. J Am Chem Soc 2003, 125, 6919-6926.

46. Wachter, R.M., Elsliger, M.A., Kallio, K., Hanson, G.T., Remington, S.J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. Struct Fold Des 1998, 6, 1267-1277.

47. Wachter, R.M., Yarbrough, D., Kallio, 1С, Remington, S.J. Crystallographic and energetic analysis of binding of selected anions to the yellow variants of green fluorescent protein. JMol Biol 2000, 301, 157-171.

48. Mishin, A.S., Subach, F. V., Yampolsky, I. V., King, W., Lukyanov, K.A., Verkhusha, V. V. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that fonns a red chromophore. Biochemistry 2008, 47, 4666-4673.

49. Yarbrough, D., Wachter, R., Kallio, K, Matz, M., Remington, S. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0 A resolution. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98, 462 467.

50. Quillin, M.L., Anstrom, D.A., Shu, X.K, O'Leary, S., Kallio, K, Chudakov, D.A., Remington, S.J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata:

51. Dark-state structure at 1.38 angstrom resolution. Biochemistry 2005, 44, 5774-5787.

52. Shu, X.K., Shaner, N.C., Yarbrough, C.A., Tsien, R.Y., Remington, S.J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry 2006, 45, 9639-9647.

53. Ando, R., Hama, II, Yamamoto-Hino, M., Mizimo, II, Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 12651-12656.

54. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K.D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101, 15905-15910.

55. Mizuno, H., Mai, Т.К., Tong, K.I., Ando, R., Furuta, Т., Ikura, M., Miyawakil, A. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Molecular Cell 2003, 12, 1051-1058.

56. Nienhaus, K., Nienhaus, G.U., Wiedenmann, J., Nar, H. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. Proc Natl Acad Sci USA 2005,102, 9156-9159.

57. Shaner, N.C., Patterson, G.H., Davidson, M.W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 2007,120, 4247-60.

58. Schwede, T.F., Retey, J., Schulz, G.E. Crystal structure of histidine ammonia-lyase revealing a novel polypeptide modification as the catalytic electrophile. Biochemistry 1999, 38, 5355-5361.

59. Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G.N., Kuipers, O.P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci 2007, 65, 455-476.

60. Devasia, G.M., Shafi, M. Synthesis of Unsaturated 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones From Amidines. Indian J Chem 1979, 17B, 526-527.

61. Devasia, G.M., Shafi, M. A Convenient Synthesis of Unsaturated 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones. Indian J Chem 1981, 20B, 657.

62. Kojima, S., Ohkawa, H., Hirano, Т., Maki, S., Niwa, H., Ohashi, M., Inouye, S., Tsuji, F.I. Fluorescent properties of model chromophores of tyrosine-66 substituted mutants of Aequorea green fluorescent protein (GFP). Tetr Lett 1998,39, 5239-5242.

63. Shaft, P.M. Quantitative synthesis of 2-aryl-4-arylidene-2-imidazolin-5-ones with NaL Curr Sci 1985, 54, 1231-1232.

64. Ekeley, J.B., Ronzio, A.R. The Action of Aromatic Aldehydes upon the Addition Products Obtained from Aromatic Amidines and Glyoxal. J Am Chem Soc 1935, 57, 1353.

65. Kidwai, A.R., Devasia, G.M. A New Method for the Synthesis of Amino Acids. Synthesis of Amino Acids and Their Derivatives through 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-onesl. J Org Chem 2002, 27, 4527-4531.

66. Kjaer, A. Reactions between Imino Esters and alpha-Amino Acid Esters. III. 2-Phenyl-5(4)-imidazolone and its Reactions. Acta Chem Scand 1953, 7, 1030-1035.

67. Rao, Y.S., Filler, R. Geometric Isomers of 2-Aryl(Aralkyl)-4-arylidene(alkylidene)-5(4H)-oxazolones. Synthesis 1975, 1975, 749-764.

68. Tripathy, P.K., Mukerjee, A.K. A Facile Synthesis of N-Substituted 2-Acylamino-2-alkenamides. Synthesis 1985, 1985, 285-288.

69. Yampolsky, I.V., Remington, S.J., Martynov, V.I., Potapov, V.K., Lukyanov, S., Lukyanov, K.A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 Chromoprotein from Anemonia sulcata. Biochemistry 2005, 44, 5788-5793.

70. Oumouch, S., Bourotte, M., Schmitt, M., Bourguignon, J.-J. An Expeditious Synthesis of 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones. Synthesis 2005, 2005, 2527.

71. Henichart, J.P., Bernier, J.L. A Convenient Method for the Preparation of cj-Dialkylaminoalkyl Isothiocyanates. Synthesis 1980, 311-312.

72. He, X., Bell, A.F., Tonge, P.J. Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org Lett 2002, 4, 1523-1526.

73. He, X, Bell, A.F., Tonge, P.J. Isotopic labeling and normal-mode analysis of a model green fluorescent protein chromophore. J Phys Chem В 2002, 106, 6056-6066.

74. Bell, A.F., He, X, Wachter, R.M., Tonge, P.J. Probing the ground state structure of the green fluorescent protein chromophore using Raman spectroscopy. Biochemistry 2000, 39, 4423-4431.

75. He, X., Bell, A.F., Tonge, P.J. Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore. FEBSLetters 2003, 549, 35-38.

76. Dong, J., Solntsev, K.M., Tolbert, L.M. Solvatochromism of the green fluorescence protein chromophore and its derivatives. J Am Chem Soc 2006, 128, 12038-12039.

77. Nifosi, R., Ferrari, A., Arcangeli, C., Tozzini, V., Pellegrini, V., Beltram, F. Photoreversible dark state in a tristable green fluorescent protein variant. J Phys Chem В 2003, 107, 1679-1684.

78. Dong, J., Abalwerdi, F., Baldridge, A., Kowalik, J., Solntsev, K.M., Tolbert, L.M. Isomerization in Fluorescent Protein Chromophores Involves Addition/Elimination. J Am Chem Soc 2008,130, 14096-14098.

79. Voliani, V., Bizzarri, R., Nifosi, R., Abbruzzetti, S., Grandi, E., Viappiani, C., Beltram, F. Cis-trans photoisomerization of fluorescent-protein chromophores. JPhys Chem В 2008,112, 10714-10722.

80. Hager, В., Schwarzinger, В., Falk, H. Concerning the thermal diastereomerization of the green fluorescent protein chromophore. Monatsh Chem 2006,137, 163-168.

81. Voityuk, A.A., MichelBeyerle, M.E., Rosch, N. Protonation effects on the chromophore of green fluorescent protein. Quantum chemical study of the absorption spectrum. Chem Phys Lett 1997, 272, 162-167.

82. Weber, W., Helms, V., McCammon, J., Langhoff, P. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 6177-6182.

83. Devasia, G.M., Shafi, P.M. Synthesis of Acylamino Acids and Acylamino Acid Amides by Simultaneous Reduction and Hydrolysis of Unsaturated 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones. Indian J Chem В 1986, 25, 204-206.

84. Kojima, S., Hirano, Т., Niwa, H., Ohashi, M., Inoaye, S., Tsuji, F.L. Mechanism of the redox reaction of the Aequorea green fluorescent protein (GFP). Tetr Lett 1997, 38, 2875-2878.

85. Mustafa, A., Harhash, A.H.E. Grignard Reagents. J Org Chem 1956, 21, 575.

86. Argyropoulos, N.G., Coutouli-Argyropoulou, E., Siacavara, C. 1,3-DipoIar cycloaddition reactions of 4-arylidene-2-phenyl-l,4-dihydroimidazoI-5-ones with nitrile oxides. JHeterocycl Chem 1990, 27, 2097-2100.

87. Girgis, A.S. Facile Regioselective Synthesis of 1,2,6,8-Tetraazaspiro4.4.nona-2,6-dien-9-ones. Zeit Naturforsch В 2000, 55, 222226.

88. El-Maghraby, M.A., El-Ela, A.A., Khalafalla, A.K., El-Shami, E. Synthesis of some New Derivatives of Imidazole Compounds. JInd Chem Soc 1985, 62, 676-680.

89. Kidwai, M., Sapra, P., Bhushan, K.R., Misra, P. Microwave-Assisted Solid-Support Synthesis of Pyrazolino/Iminopyrimidino/Thioxopyrimidino Imidazolines. Synthesis 2001, 2001, 1509-1512.

90. Badr, M.Z.A., Mahgoub, S.A.E.-S. Synthesis and reactions of imidazolinones and triazolo3,4-f.[ 1,2,4]triazines. Indian J Chem В 1989, 28, 829-837.

91. Hayashi, 1., Mizuno, H., Tong, K.I., Furuta, Т., Tanaka, F., Yoshimura, M., Miyawaki, A., Ikura, M. Crystallographic evidence for water-assisted photo-induced peptide cleavage in the stony coral fluorescent protein kaede. J Mol Biol 2007, 372,918-926.

92. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y.X., Verkman, A.S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J1998, 74, 1591-1599.

93. Wachter, R.M., King, В.A., Heim, R., Kallio, K., Tsien, R.Y., Boxer, S.G., Remington, S.J. Crystal structure and photodynamic behavior of the blue emission variant Y66H/Y145F of green fluorescent protein. Biochemistry 1997, 36, 9759-9765.

94. Voityuk, A.A., Michel-Beyerle, M.E., Rosch, N. Quantum chemical modeling of structure and absorption spectra of the chromophore in green fluorescent proteins. Chem Phys 1998, 231, 13-25.

95. Pruger, В., Bach, T. Synthesis of model chromophores related to the gold fluorescent protein (GdFP). Synthesis 2007, 1103-1106.

96. Dong, J., Solntsev, K.M., Tolbert, L.M. Activation and Tuning of Green Fluorescent Protein Chromophore Emission by Alkyl Substituent-Mediated Crystal Packing. J Am Chem Soc 2009,131, 662-670.

97. Dong, J., Solntsev, K.M., Poizat, O., Tolbert, L.M. The meta-green fluorescent protein chromophore. J Am Chem Soc 2007,129, 10084-10085.

98. Follenius-Wund, A., Bourotte, M., Schmitt, M., Iyice, F., Lami, H., Bourguignon, J.J., Haiech, J., Pigault, C. Fluorescent derivatives of the GFP chromophore give a new insight into the GFP fluorescence process. Biophys J 2003,85, 1839-1850.

99. Wu, L.X., Burgess, K. Syntheses of highly fluorescent GFP-Chromophore analogues. J Am Chem Soc 2008,130, 4089-4096.

100. Voityuk, A.A., Kummer, A.D., Michel-Beyerle, M.E., Rosch, N. Absorption spectra of the GFP chromophore in solution: comparison of theoretical and experimental results. Chem Phys 2001, 269, 83-91.

101. Lewis, F.D., Yang, J.S. Molecular structure and photochemistry of (E)- and (Z)-ethyl 3-(2-indolyl)propenoate. Ground state conformational control of photochemical behavior and one-way E->Z photoisomerization. J Phys Chem 1996,100, 14560-14568.

102. Nielsen, S.B., Lapierre, A., Andersen, J.U., Pedersen, U.V., Tomita, S., Andersen, L.H. Absorption spectrum of the green fluorescent protein chromophore anion in vacuo. Phys Rev Lett 2001, 8722, 8102-8107.

103. Andersen, L.H, Bluhme, H., Boye, S., Jorgensen, T.J.D., Krogh, I~L, Nielsen, I.В., Nielsen, S.B., Svendsen, A. Experimental studies of the photophysics of gas-phase fluorescent protein chromophores. Phys Chem Chem Phys 2004, 6, 2617-2627.

104. Yang, J.S., Huang, G.J., Liu, Y.H., Peng, S.M. Photoisomerization of the green fluorescence protein chromophore and the meta- and para-amino analogues. Chem Comm 2008, 1344-1346.

105. Maddalo, S.L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochem Photobiol 2006, 82, 367-372.

106. Toniolo, A., Olsen, S., Manohar, L., Martinez, T.J. Conical intersection dynamics in solution: the chromophore of Green Fluorescent Protein. Faraday Discuss 2004,127, 149-163.

107. Mandal, D., Tahara, Т., Webber, N.M., Meech, S.R. Ultrafast fluorescence of the chromophore of the green fluorescent protein in alcohol solutions. Chem Phys Lett 2002, 358, 495-501.

108. W&.Litvinenko, K.L., Webber, N.M., Meech, S.R. Internal conversion in the chromophore of the green fluorescent protein: Temperature dependence and isoviscosity analysis. J Phys Chem A 2003,107, 2616-2623.

109. Patterson, G.H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science 2002, 297, 1873-1877.

110. Habuchi, S., Ando, R., Dedecker, P., Verheijen, W., Mizuno, H., Miyawaki, A., Hofkens, J. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. P Natl Acad Sci USA 2005,102, 9511-9516.

111. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W.W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. P Natl Acad Sci USA 1998, 95, 13573-13578.

112. Tretyakova, Y.A., Pakhomov, A.A., Martynov, VI. Chromophore Structure of the Kindling Fluorescent Protein asFP595 from Anemonia sulcata. J Am Chem Soc 2007, 129, 7748-7749.

113. Baird, G., Zacharias, D., Tsien, R. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 11984 11989.

114. Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., Steinbach, P.A., Baird, G.S., Zacharias, D.A., Tsien, R.Y. A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 7877-7882.

115. Layer, R. W. The chemistry of imines. Chem Rev 1963, 63, 489-510.

116. Heng Suen, Y., Kagan, H.B. Iminomagne'siens. III. Proprie'te's d'acylimines et acyle'namines. Bull Soc Chim Fr 1965, 5, 1460-1463.

117. Pakhomov, A.A., Martynova, N.Y., Gurskaya, N.G., Balashova, T.A., Martynov, V.I. Photoconversion of the chromophore of a fluorescent protein from Dendronephthya sp. Biochemistry-Moscow 2004, 69, 901-908.

118. Labas, Y.A., Gurskaya, N.G., Yanushevich, Y.G., Fradkov, A.F., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A., Matz, M. V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 4256-4261.

119. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protocols 2006, 1, 960-967.

120. Helms, V. Electronic excitations of biomolecules studied by quantum chemistry. Curr Opin Struct Biol 2002,12, 169-175.

121. Nemukhin, A.V., Topol, I.A., Burt, S.K. Electronic excitations of the chromophore from the fluorescent protein asFP595 in solutions. J Chem Theor Comput 2006, 2, 292-299.

122. Yampolsky, I.V., Balashova, T.A., Lukyanov, K.A. Synthesis and Spectral and Chemical Properties of the Yellow Fluorescent Protein zFP538 Chromophore. Biochemistry 2009,

123. Singh, S.B., Tomassini, J.E. Synthesis of Natural Flutimide and Analogous Fully Substituted Pyrazine-2,6-diones, Endonuclease Inhibitors of Influenza Virus. J Org Chem 2001, 66, 5504-5516.

124. Chinworrungsee, M., Kittakoop, P., Saenboonrueng, J., Kongsaeree, P., Thebtaranonth, Y. Bioactive Compounds from the Seed Fungus Menisporopsis theobromae BCC 3975. J Nat Prod 2006, 69, 1404-1410.