Разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Петкевич, Кирилл Дмитриевич

• Петкевич, Кирилл Дмитриевич
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Петкевич, Кирилл Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурные свойства СЖР-иодобных красных флуоресцентных белков.

1.1.1. Кристаллическая структура флуоресцентных белков.

1.1.2. Структура и образование хромофора.

1.2. Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков.

1.2.1. Источники флуоресцентных белков и хромопротеинов.

1.2.2. Агрегация.

1.2.3. Олигомеризация.

1.2.4. Созревание: фолдинг белка и образование хромофора.

1.2.5. Фотостабильность.

1.2.6. рН-устойчивость флуоресценции.

1.3. Улучшенные мономерные красные флуоресцентные белки.

1.4. Фотофизика и фотохимия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом.

1.5. Применение красных флуоресцентных белков.

1.5.1. Красные флуоресцентные белки как репортерные маркеры.

1.5.2. Методы, основанные на индуктивно-резонансном переносе энергии.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Олигодезоксирибонуклеотиды, которые использовались дляПЦР.

2.1.3. Буферные растворы.

2.1.4. Питательные среды для микробиологических исследований.

2.1.5. Среды для клеточной биологии.

2.2. Методы молекулярной биологии.

2.2.1. Амплификация генов.

2.2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазой рестрикции.

2.2.3. Лигирование.

2.2.4. Трансформация бактерий.

2.2.5. Выделение плазмид.

2.2.6. Определение нуклеогидной последовательности.

2.2.7. Мутагенез со случайными заменами.

2.2.8. Направленный мутагенез.

2.2.9. Электрофорез в агарозном геле.

2.2.10. Скринирование библиотек мутантов.

2.2.11. Конструирование плазмид для клеток млекопитающих.

2.3. Выделение и характернзация рекомбинантных РРб.

2.3.1. Выделение и очистка белков.

2.3.2. Электрофорез белков.

2.3.3. Определение основных характеристик рекомбинантных белков.

2.3.4. Кристаллизация белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2.

2.3.5. Сбор данных рентгеновской дифракции, решение и уточнение кристаллических структур.

2.4. Методы клеточной биологии.

2.4.1. Культивация и трансфекция клеток линии НеЬа.

2.4.2. Культивация и трансфекция клеток линий МТЪпЗ,

МТЪпЗ со сверхэкспрессией ЕгЬВ1 и МБА-МВ-231.

2.4.3. Получения клеточных линий стабильно эксперссирующих флуоресцентные белки.

2.4.4. Трансплантация раковых клеток в молочную железу ТКИД мышей.

2.5. Флуоресцентная микроскопия.

2.5.1. Микроскопия бактериальных колоний.

2.5.2. Флуоресцентная микроскопия животных клеток.

2.5.3. Флуоресцентная микроскопия животных клеток в культуре в режиме реального времени.

2.5.4. Прижизненная двухфотонная микроскопия миграции раковых клеток в опухоли.

2.5.5. Анализ поляризации пар ядро-комплекс Гольджи в клетках опухоли.

2.6. Общая схема создания новых красных ЖР.

2.6.1. Стратегия направленной молекулярной эволюции.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Создание красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом.

3.2. Основные физико-химические характеристики очищенных белков Ь88-тК^е1 и Ь88-тКа(е2.

3.3. Кристаллическая структура белков Ь88-тКа(е1 и Ь88-тКа1е2.

3.4. Микроокружение хромофоров в белках Ь88-тКа1с1 и Ь88-тК^е2.

3.5. Зависимость спектральных свойств белков

Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 от рН.

3.6. Температурные и изотопные эффекты в белках Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2.

3.7. Конверсия стандартных флуоресцентных белков во флуоресцентные белки с большим Стоксовым сдвигом.

3.8. Характсризация белков Ь88-тКа1е1 и LSS-mKate2 в живых клетках.

3.9. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Характеристики красных РРэ Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2.

4.2. Зависимость спектральных свойств белков

Ь88-тКа1е1 и 1,88-тКЖе2 от рН.

4.3. Предполагаемый фотоцикл для белков Ь88-тКа1е.

4.4. Свойства мутантных белков с большим Стоксовым сдвигом, полученных из стандартных ЕРв.

4.5. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом»

Актуальность темы. В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных методов исследований в биологии и медицине стала визуализация различных процессов, происходящих в живых организмах, тканях или клетках в режиме реального времени с помощью флуоресцентных маркеров. Особое место среди них занимает зеленый флуоресцентный белок (вРР), его варианты и гомологи. Главными преимуществами ОБР-подобных белков при их использовании являются высокая стабильность и способность к формированию хромофора без участия кофакторов, ферментов или каких-либо субстратов, кроме молекулярного кислорода [1, 2]. Таким образом, возникает возможность образования хромофора и возникновения свечения непосредственно в живых организмах, тканях или клетках [3]. Оказалось, что И- и С-концы флуоресцентных белков (ИРб) доступны для создания гибридных белков, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентного белка с белком-мишенью. При этом флуоресцентный белок (БР) не оказывает влияние на локализацию и функцию исследуемого белка. Это свойство делает ОБР-подобные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, которые стали незаменимыми инструментами для изучения взаимодействия белков, их локализации и транспорта [4, 5], а также биосенсоров внутриклеточных метаболитов, позволяющих определять концентрацию Са2+ и цАМФ, рН, мембранный потенциал, активность некоторых ферментов (например, каспаз, киназ и протеаз) в живой клетке [6, 7, 8]. Разработаны методы, позволяющие детектировать взаимодействия между интересующими белками [9, 10].

Клонирование генов ОРР-подобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальней красной областях спектра, явилось очередным этапом в использование флуоресцентных белков при проведении исследований в области биологии [11]. Одновременное использование нескольких БРб с разными спектральными характеристиками привело к развитию современных методов исследований, позволяющих изучение многофакторных процессов в живой клетке и многоклеточном организме [12]. Последующие научные исследования посттрансляционной химии, структуры и свойств ОРР-подобных белков позволили разработать подходы к созданию новых флуоресцентных белков с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биотехнологии и микроскопии [13-18].

Все красные БРб дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное образование хромофора, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации [19]. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение РР. Получение оптимальных красных РРб является очень актуальной проблемой, решение которой значительно расширяет возможности применения БРв в биологии и биотехнологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных РРб является сочетание случайного и сайтнапрваленного мутагенеза с высоко эффективными техниками сортировки и отбора клеток [20, 21]. Данная стратегия уже была успешно использована для получения ряда РРб с заранее заданными физико-химическими характеристиками [22-24].

Практическая значимость красных флуоресцентных белков особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, так как свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Это объясняется тем, что вода, меланин и гемоглобин, основные вещества, которые поглощают свет в биологических тканях, имеют минимальный коэффициент экстинкции в диапазоне длин волн от 600 до 1100 нм [25]. Данный диапазон длин волн называется "оптическим окном" и является оптимальным для микроскопии биологических тканей и целых организмов. Более того, использование РРэ с максимумом флуоресценции выше 600 нм может повысить чувствительность детекции флуоресценции. Это связано с тем, что автофлуоресценция клеток (флуоресценция флавинов, витаминов, ЫАО(Р)Н) и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны.

На данный момент одним из лучших методов, позволяющих получать высококачественное трехмерное изображение живых тканей на глубину вплоть до 1 миллиметра, является мультифотонная микроскопия [26]. В двухфотонном микроскопе обычно используется сапфировый лазер, испускающий инфракрасное излучение. Использование красных РРв в мультифотонной микроскопии может открыть новые возможности для проведения исследований живых тканей и целых организмов с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Однако красные РРб не могут быть эффективно возбуждены стандартным коммерчески доступным инфракрасным лазером, так как спектры их двухфотонного поглощения лежат в более длинноволновой области относительно рабочего диапазона длин волн двухфотонного лазера [27]. Возможным подходом к решению данной проблемы может быть разработка красного FP спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, или, другими словами, красного FP с большим Стоксовым сдвигом.

В настоящее время существует острая необходимость дальнейшего развития методов визуализации биологических объектов для выяснения фундаментальных основ жизнедеятельности клеток в условиях нормы и патологий различного происхождения. Создание новых вариантов флуоресцентных белков с длиной волны флуоресценции более 600 нм и при этом характеризующиеся большим Стоксовым сдвигом является актуальной задачей, которая имеет большое теоретическое и практическое значение. Более того, сочетание подобных белков с зеленым или синим FPs может быть также использовано для многоцветной мультифотонной микроскопии, что позволит одновременно наблюдать за нескольким клеточными процессами. Введение этих белков в практику экспериментальной работы невозможно без выяснения механизмов, лежащих в основе спектральных свойств FPs, а также изучения связи между их структурой и оптическими, а также биохимическими характеристиками. Изучение механизма большого Стоксового сдвига в красных флуоресцентных белках может позволить рациональный дизайн новых красных FPs с большим Стоксовым сдвигом на основе существующих стандартных флуоресцентных белков.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание на основе гена белка mKate новых мономерных красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, с длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, исследование связи особенностей первичной структуры новых белков с их спектральными свойствами и фотохимическими характеристиками, а также оценка возможности практического применения новых красных FPs в белках слияния с различными клеточными белками в живых клетках в качестве флуоресцентного маркера для многоцветной одно- и мультифотонной микроскопии in vivo.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Методами молекулярного клонирования и эволюции создать новые красные флуоресцентные белки с большим Стоксовым сдвигом, обладающие длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм на основе гена мономерного красного FP mKate (длина волны флуоресценции 635 нм).

2. Измерить спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции, спектры двухфотонного поглощения, определить величины фотостабильности, квантового выхода, коэффициента экстинкции. яркости, скорости созревания хромофора и рН-стабильности флуоресценции, исследовать олигомерное состояние LSS-mKate белков. Сравнить полученные характеристики с соответствующими значениями для существующего красного флуоресцентного белка с большим Стоксовым сдвигом mKeima (Стоксов сдвиг состовляет 180 нм) и другими страндартыми флуоресцентными белками других диапозонов флуоресценции.

3. Установить аминокислотные замены, ответственные за увеличение Стоксового сдвига флуоресценции, а также влияющие на биохимические характеристики новых LSS-mKate белков. Установить молекулярный механизм флуоресценции LSS-mKate белков.

4. Проанализировать возможности практического использования белков LSS-mKate в живых клетках путем создания и анализа экспрессии его химерных генетических конструкций с клеточными белками в клетках млекопитающих, а также с помощью однофотонной микроскопии показать возможности многоцветного мечения клеток новыми LSS-mKate 1 и LSS-mKate2 и уже известными красными FPs в живых тканях.

5. Исследовать возможности практиктического использования белков LSS-mKate 1 и LSS-mKate2 для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей и организмов.

Объект исследования — метод создания мономерных флуоресцентных белков с длиной волны флуоресценции более 600 нм и большим Стокосовым сдвигом, связь первичной структуры с флуоресцентными и биохимическими свойствами новых FPs; возможность их применения в клетчной биологии и онкологии.

Предмет исследования — ген FP mKate, мутантные варианты mKate, флуоресцентные белки LSS-mKate, их первичная, вторичная и третичная структуры, спектральные и фотохимические характеристики, химерные конструкции LSS-mKate белков с клеточными белками.

Методы исслдования - молекулярное клонировние, электрофорез в полиакриламидном геле, методы трансфекции клеток в культуре, случайный и сайт-направленный мутагенезы, анализ первичной структуры ДНК, кристаллизация белков, спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, проточная цитофлуориметрия, флуоресцентная одно- и двухфотонная микроскопии.

Научная новизна полученных результатов. Созданы два новых красных РРб ЬББ-шКа1е1 и Ь88-тКа1е2 с максимумами возбуждения около 460 нм и максимумами флуоресценции более 600 нм. Полученные Ь88-тКа1е белки обладали улучшеными физико-химическими свойствами по сравнению с таковыми для единственного ранее опубликованного красного белка с большим Стоксовым сдвигом тКеппа. Определены аминокислотные последовательности полученных белков. Установлены аминокислотные остатки, ответственные за сдвиг максимумов возбуждения в коротковолновую область и биохимические свойтсва новых белков.

Описаны спектральные и фотохимические свойства Ь88-тКаге1 и Ь88-тКМе2. Измерены полупериоды формирования хромофора, эффективность созревания хромофора и рН-зависимость интенсивности флуоресценции для Ь88-тКа1е белков. Установлено, что флуоресценция Ь88-тКа1е1 и Р88-тКа1е2 является самой рН-стабильной из все известных красных флуоресцентных белков. Установлены структурно-функциональные изменения белка тКа{е, которые определяют флуоресцентные и биохимические свойства ЬЗв-шКаге белков в процессе искусственного отбора.

Впервые показано, при сравнении с аналогичными характеристиками уже существующего красного РТ тКеппа с большим Стоксовым сдвигом, Ь88-тКа1е белки обладают существенными преимуществами для применения в клеточной биологии.

Были решены кристаллические структуры белков Ь88-тКа1с1 и 1>88-тКа1е2 во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5 А. Изучены зависимости спектральных характеристик белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 от температуры, рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя. На основании полученных данных были предложены молекулярные механизмы большого Стоксового сдвига для Ь88-тКа1е1 и Р88-тКа1е2.

Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих стандартных красных флуоресцентных белков. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.

Показано, что новые РРэ Ь88-шКа1е расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных РРб при использовании для многоцветной однофотонной микроскопии. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия с субклеточным разрешением в режиме реального времени живых тканей. Данное преимущество было использовано для анализа взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Высокая фотостабильность LSS-mKate белков сделала возможным длительное наблюдение за отдельно взятой клеткой при ее миграции в раковой опухоли. Анализ полученных изображенный показал, поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных в непоредственной близости от кровеносного сосуда (менее 40 мкм).

Практическое значение полученных результатов. Практическое значение результатов диссертационной работы состоит прежде всего в том, что новые красные флуоресцентные белки LSS-mKate могут быть эффективно использованы для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей. Спектральные характеристики LSS-mKate белков оптимальны для визуализации живых клеток и тканей с субклеточным разрешением в течение длительного времени. Белки LSS-mKate лишены таких серьезных недостатков, как склонность к агрегации в живых клетках, низкая рН-стабильность и остаточная зеленая флуоресценция и, таким образом, имеют большой потенциал применения в биотехнологии. Созданные FPs раскрывают новые возможности многоцветного мечения биологических объектов, поскольку могут быть эффективно спектрально разрешены с другими стандартными флуоресцентными белками. В паре с уже существующими синими FPs, LSS-mKatel и LSS-mKate2 могут использоваться для создания молекулярных биосенсоров, работающих на основе безизлучательного переноса энергии (FRET). Белки LSS-mKate возбуждаются стандартными синими лазерами 407 им и 457 нм проточных цитофлуориметров, благодаря чему могут стать полезным инструментом для биомедицинских исследований.

Предложенная схема рационального дизайна красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом может быть использована для получения новых подобных FPs с улучшенными и заданными свойствами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В 1663 году английский естествоиспытатель Роберт Гук, рассматривая тонкий срез бутылочной пробки под примитивным микроскопом, заметил, что изучаемый предмет пронизан мельчайшими отверстиями и порами. Наблюдаемое напомнило Гуку медовые соты или монашеские кельи, которые назывались "cellula". Роберт Гук дал им название ячейки или клетки, тем самым введя термин для обозначения минимальных строительных блоков всех живых организмов. Изобретенный Гуком микроскоп с 50 кратным увеличением позволил заглянуть в раннее не видимый микроскопический мир. Спустя 330 лет другое знаменательное открытие позволило взглянуть на мир клеток в другом свете. Это был 1994 год, когда Мартин Чалфи с сотрудниками опубликовали в журнале Science статью, в которой показали, что GFP из медузы Aequorea victoria может быть использован как маркер локализации белков, гены которых экспрессируются в клетках бактерий и червей [28]. Совместно с новыми методами микроскопии клонирование гена GFP и его гомологов и последующее успешное их применение в живых клетках качественно изменило проведение исследований в биологии и медицине. В настоящее время GFP и его гомологи являются одними из наиболее широко используемых генетически кодируемых маркеров в различных областях биологии и медицины.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Петкевич, Кирилл Дмитриевич

выводы

В данной диссертационной работе приведены результаты разработки и исследования структурно-функциональных свойств новых красных РРэ Ь58-тКа!е1 и Ь88-тКа1е2 с большим Стоксовым сдвигом: аминокислотной последовательности и замен, ответственных за красную флуоресценцию с большим Стоксовым сдвигом, скорость и эффективность созревания хромофора, зависимость интенсивности флуоресценции от рН. Проведены измерения спектральных и фотохимических характеристик Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 и их сравнение с соответствующими параметрами единственного известного красного БР с большим Стоксовым сдвигом тКета. Белки 1Х8-тКа1е1 и Ь88-тКаге2 характеризуются быстрым и полным созреванием хромофора, высокой рН и фотостабильностью и низкой цитотоксичностью, что делает эти белки привлекательными флуоресцентными маркерами для молекулярной и клеточной биологии. Решены кристаллические структуры ЬЗй-тКаСе 1 и Ь88-тКа1е2 в их флуоресцентном состоянии с разрешением 2.0 и 1.5 А, соответственно. Анализ кристаллических структур Ь88-тКаге1 и Ь88-шКа1е2 совместно с данными мутагенеза и спектроскопическими исследованиями позволили установить молекулярный механизм красной флуоресценции с большим Стоксовым сдвигом. Понимание структурных особенностей белков Ь88-тКа1е позволило разработать стратегию для рационального дизайна РРб с большим Стоксовым сдвигом. Данная стратегия была успешно использована для получения серии новых оранжевых и красных БРб с большим Стоксовым сдвигом. Продемонстрированы возможности и преимущества практического применения Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 как дополнительного красного цвета в клеточной биологии на примерах флуоресцентной микроскопии.

1. Методами молекулярного клонирования и эволюции на основе кДНК мономерного красного БР шКа!е (максимумы возбуждения 588 нм и флуоресценции 635 нм), созданы мономерный красный флуоресцентные белки Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 с максимумами возбуждения и флуоресценции 463/624 нм и 460/605 нм, соответственно.

2. Установлено, что аминокислотнае последовательности новых белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКаГе2 отличается от исходного тКа1е заменами шести аминокислотных остатков, а именно ЬуБб9Туг, Рго13ПЪг, 8ег14801у, Меаб701и, ТЫ-ШБег, МеП96Уа1 и Ьув69Туг, РгоШТЬг, 8ег14801у, Меаб7Азр, ТЬг1838ег, Ме1196Уа1, соотвественно. Введение глутаминовой или аспарагиновой аминокислот (167Glu или 167Asp), которые находятся в микроокружении хромофорного фенольного цикла, приводит к возниконовения красной флуоресценции с большим Стоксовым сдвигом. Мутации Lys69Tyr и Serl48Gly значительно повышают рН- и фотостабильность, а замены ProlSlThr и Thrl83Ser увеличивают скорость и полноту созревания хромофора.

3. В работе представлены результаты измерений основных физико-химических характеристик FP LSS-mKatel и LSS-mKate2: квантовые выходы равны 0.08 и 0.17; молярные коэффициенты экстинкции равны 31,200 и 26,000 М^см"1; рН-стабилыюсть с величинами рКа равными 3.2 и 2.7; полупериод фотообесцвечивания - 60 и 44 секунд; полупериоды созревания при 37°С равные 100 и 150 минутам; и показана мономерность полученных белков. Определены двухфотонные характеристики LSS-mKatel и LSS-mKate2 белков, такие как двухфотонные спектры возбуждения и полупериоды фотообесцвечивания при двухфотонном возбуждении.

4. Показано, что, по сравнению с единственным описанным красным FPs с большим Стоксовым сдвигом mKeima, LSS-mKatel и LSS-mKate2 обладают рядом преимуществ, такими как высокая рН-стабильность и фотостабильность, отсутствие остаточной красной флуоресценции со стандартным Стоксовым сдвигом. Более того LSS-mKatel и LSS-mKate2 являются самыми рН-стабильными белками среди всех красных FPs известных на данный момент.

5. Были решены кристаллические структуры белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5 А. Изучены зависимости спектральных характеристик белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 от температуры. рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя. На основании полученных данных было доказано, что перенос протона в возбужденном состянии ESPT ответсвенен за большой Стоксов сдвиг в белках LSS-mKatel и LSS-mKate2.

6. Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих стандартных красных флуоресцентных белков. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.

7. На модельных экспериментах продемонстрированы возможности Ь88-тКа1е1 и ЬББ-шКа1е2 как флуоресцентных маркеров. Созданы белки слияния Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 с 6-ю различными клеточными белками и 3-мя локализующими пептидами. Отмечена специфическая локализация всех меченых клеточных белков, отсутствие агрегатов и высокая рН- и фотостабильность, что свидетельствует об оптимальности Ь88-тКа1е белков в качестве клеточного маркера.

8. Показано, что новые РРб Ь88-тКа1е расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных РРб при использовании для многоцветной однофотонной микроскопии.

9. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия с субклеточным разрешением в режиме реального времени живых тканей. Данное преимущество было использовано для анализа взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Высокая фотостабильность ЬБ8-тКа1е белков сделала возможным длительное наблюдение за отдельно взятой клеткой при ее миграции в раковой опухоли. Анализ полученных изображенный показал поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных в непоредственной близости от кровеносного сосуда (менее 40 мкм).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Петкевич, Кирилл Дмитриевич, 2011 год

1. Heim R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein / R.Heim, D. C. Prasher, R. Y. Tsien // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1994. - V. 91. - P. 1250112504.

2. Tsien R. Y. The green fluorescent protein / R. Y. Tsien // Annu. Rev. Biochem. 1998. — V. 67. -P. 509-544.

3. Understanding, improving and using green fluorescent proteins / A. B. Cubitt, R. Heim, S. R. Adams et al. // Trends Biochem. Sei. 1995. - V. 20. - P. 448-455.

4. Review — The fluorescent toolbox for assessing protein location and function / B. N. G. Giepmans, S. R. Adams, M. H. Ellisman and R. Y. Tsien // Science. 2006. - V. 312. - P. 217224.

5. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes / O.V. Stepanenko, V.V. Verkhusha, I.M. Kuznetsova et al. // Curr. Protein Pept. Sei. 2008. - V. 9. - P. 338-369.

6. Zacharias D. A. Recent advances in technology for measuring and manipulating cell signals / D. A. Zacharias, G. S. Baird, R. Y. Tsien // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. - V. 10. - P. 416-421.

7. Dynamic redistribution of calmodulin in HeLa cells during cell division as revealed by a GFP-calmodulin fusion protein technique / C. J. Li, R. Heim, P. Lu et al. // J. Cell Sei. 1999.- V. 112. -P. 1567-1577.

8. Transgenic mice expressing a pH and Cl-sensing yellow-fluorescent protein under the control of a potassium channel promoter / F. Metzger, V. Repunte-Canonigo, S. Matsushita et al. // Eur. J. Neurosci. 2002. - V. 15. - P. 40-50.

9. Hu C. D. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis / C. D. Ни, Т. K. Kerppola // Nat. Biotechnol. — 2003.-V. 21.-P. 539-545.

10. Shaner N.C. Advances in fluorescent protein technology / Shaner N.C., Patterson G.H., Davidson M.W. // J. Cell Sei. 2007. - V. 120. - P. 4247-4260.

11. Heim R. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence energy transfer / R. Heim, R.Y.Tsien // Curr. Biol. 1996. - V. 6. - P. 178-182.

12. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina / Shkrob, M.A., Yanushevich, Y.G., Chudakov D.M. et al. // Biochem. J. 2005. - V. 392. - P. 649-654.

13. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore / Mishin A.S., Subach F.V., Yampolsky I.V. et al. // Biochemistry. 2008. - V. 47. -P. 4666-4673.

14. Optimized and far-red-emitting variants of fluorescent protein eqFP611 / Kredel S., Nienhaus K., Oswald F. et al. // Chem. Biol. 2008. - V. 15. - P. 224-233.

15. Global Protein Stability Profiling in Mammalian Cells / Yen H. C. S., Xu Q. K., Chou D. M. et al. // Science. 2008. - V. 322. - P. 918-923.

16. Wu L. Syntheses of highly fluorescent GFP-chromophore analogues / L. Wu, K. J. Burgess // Am. Chem. Soc. 2008. - V. 130. - P. 4089-4096.

17. Piatkevich, K.D., Efremenko, E.N., Verkhusha, V.V., and Varfolomeev, S.D. Red fluorescent proteins and their properties. Russ. Chem. Reviews 2010, 79: 243-258.

18. Campbell RE, Tour O, Palmer AE, Steinbach PA, Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sei USA. 2002 Jun 11;99(12):7877-82.

19. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 2004 Dec;22(l2): 1567-72.

20. Subach OM, Gundorov IS, Yoshimura M, Subach FV, Zhang J, Grüenwald D, Souslova EA, Chudakov DM, Verkhusha VV. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol. 2008 Oct 20;15(10):1116-24.

21. Subach FV, Subach OM, Gundorov IS, Morozova KS, Piatkevich KD, Cuervo AM, Verkhusha VV. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking. Nat Chem Biol. 2009 Feb;5(2):l 18-26.

22. Subach FV, Patterson GH, Manley S, Gillette JM, Lippincott-Schwartz J, Verkhusha VV.Photoaetivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 2009 Feb;6(2): 153-9.

23. König K. Multiphoton microscopy in life sciences. J Microsc. 2000 Nov;200(Pt 2):83-104.

24. Zipfel WR, Williams RM, Webb WW. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 2003 Nov;21(l 1): 1369-77.

25. Drobizhev M, Tillo S, Makarov NS, Hughes TE, Rebane A. Absolute two-photon absorption spectra and two-photon brightness of orange and red fluorescent proteins. J Phys Chem B. 2009 Jan 29;113(4):855-9.

26. Green fluorescent protein as a marker for gene expression / M. Chalfle, Y. Tu, G. Euskirchen et al. // Science. 1994,-V. 263.-P. 802-805.

27. Wall MA, Socolich M, Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat Struct Biol. 2000 Dec;7(12):l 133-8.

28. Yarbrough D, Wächter RM, Kallio K, Matz MV, Remington SJ. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc Natl Acad Sei USA. 2001 Jan 16;98(2):462-7.

29. Vrzheshch PV, Akovbian NA, Varfolomeyev SD, Verkhusha VV. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Lett. 2000 Dec 29;487(2):203-8.

30. Petersen J, Wilmann PG, Beddoe T, Oakley AJ, Devenish RJ, Prescott M, Rossjohn J. The 2.0-A crystal structure of eqFPôll, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J Biol Chem. 2003 Nov 7;278(45):44626-31.

31. He X, Bell AF, Tonge PJ. Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org Lett. 2002 May 2;4(9): 1523-6.

32. Gross LA, Baird GS, Hoffman RC, Baldridge KK, Tsien RY. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sei USA. 2000 Oct 24;97(22): 11990-5.

33. Remington SJ, Wächter RM, Yarbrough DK, Branchaud B, Anderson DC, Kallio K, Lukyanov KA. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry. 2005 Jan 11;44(1):202-12.

34. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'Leary S, Kallio K, Chudakov DM, Remington SJ. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. Biochemistry. 2005 Apr 19;44(15):5774-87.

35. Yampolsky IV, Remington SJ, Martynov VI, Potapov VK, Lukyanov S, Lukyanov KA. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. Biochemistry. 2005 Apr 19;44(15):5788-93.

36. Ugalde JA, Chang BS, Matz MV. Evolution of coral pigments recreated. Science. 2004 Sep 3;305(5689):1433.

37. Sniegowski JA, Lappe JW, Patel HN, Huffman HA, Wächter RM. Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. J Biol Chem. 2005 Jul 15;280(28):26248-55.

38. Bulina ME, Chudakov DM, Mudrik NN, Lukyanov KA. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem. 2002 Apr 24;3:7.

39. Lin MZ, McKeown MR, Ng HL, Aguilera TA, Shaner NC, Campbell RE, Adams SR, Gross LA, Ma W, Alber T, Tsien RY. Autofluorescent proteins with excitation in the optical window for intravital imaging in mammals. Chem Biol. 2009 Nov 25;16(11):1169-79.

40. Nienhaus K, Nar H, Heilker R, Wiedenmann J, Nienhaus GU. Trans-cis. isomerization is responsible for the red-shifted fluorescence in variants of the red fluorescent protein eqFP611. J Am Chem Soc. 2008 Sep 24;130(38):12578-9.

41. Remington S. J. Structural basis for understanding spectral variations in green fluorescent protein / S. J. Remington // Methods Enzymol. 2000. - V. 305. - P. 196-211.

42. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis / T.I. Wood, D.P. Barondeau, C. Hitomi et al. // Biochemistry. 2005. - V. 44. - P. 16211-16220.

43. Amino acid substitutions around the chromophore of the chromoprotein Rtms5 influence polypeptide cleavage / K. Turcic, A. Pettikiriarachchi, J. Battad et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. -2006. V. 340. - P. 1139-1143.

44. Voliani V, Bizzarri R, Nifosi R, Abbruzzetti S, Grandi E, Viappiani C, Beltram F. Cis-trans photoisomerization of fluorescent-protein chromophores. J Phys Chem B. 2008 Aug 28; 112(34): 10714-22.

45. Day RN, Davidson MW. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 2009 0ct;38(10):2887-921.

46. Labas Y A, Gurskaya NG, Yanushevich YG, Fradkov AF, Lukyanov KA, Lukyanov SA, Matz MY. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Apr 2;99(7):4256-61.

47. Wiedenmann J, Elke C, Spindler KD, Funke W Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria). Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Dec 19;97(26):14091-6.

48. Gurskaya NG, Fradkov AF, Terskikh A, Matz MV, Labas YA, Martynov VI, Yanushevich YG, Lukyanov KA, Lukyanov SA. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett. 2001 Oct 19;507(l):16-20.

49. Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S, Chudakov DM. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 2007 Sep;4(9):741-6.

50. Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H, Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 2004 Jul l;381(Pt 1):307-12.

51. Yanushevich YG, Staroverov DB, Savitsky AP, Fradkov AF, Gurskaya NG, Bulina ME, Lukyanov KA, Lukyanov SA. A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett. 2002 Jan 30;511(1-3):11-4.

52. Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Oct 24;97(22):11984-9.

53. Bevis BJ, Glick BS. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(l):83-7.

54. Mizuno H, Sawano A, Eli P, Hama H, Miyawaki A. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry. 2001 Feb 27;40(8):2502-10.

55. Lauf U, Lopez P, Falk MM. Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins. FEBS Lett. 2001 Jun 1;498(1):11-5.

56. Heikal AA, Hess ST, Baird GS, Tsien RY, Webb WW. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Oct 24;97(22): 11996-2001.

57. Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Biotechnol. 2006 May;24(5):577-81.

58. Wang Z, Shah JV, Chen Z, Sun CH, Berns MW. Fluorescence correlation spectroscopy investigation of a GFP mutant-enhanced cyan fluorescent protein and its tubulin fusion in living cells with two-photon excitation. J Biomed Opt. 2004 Mar-Apr;9(2):395-403.

59. Subach FV, Patterson GH, Renz M, Lippincott-Schwartz J, Verkhusha VV. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein lor two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 2010 May 12; 132(18>:6481-91.

60. Jain RK, Joyce PB, Molinete M, Halban PA, Gorr SU. Oligomerization of green fluorescent protein in the secretory pathway of endocrine cells. Biochem J. 2001 Dec 15;360(Pt 3):645-9.

61. Chen JC, Viollier PH, Shapiro L. A membrane metalloprotease participates in the sequential degradation of a Caulobacter polarity determinant. Mol Microbiol. 2005 Feb;55(4):1085-103.

62. Fradkov AF, Verkhusha W, Staroverov DB, Bulina ME, Yanushevich YG, Martynov VI, Lukyanov S, Lukyanov KA. Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem J. 2002 Nov 15;368(Pt 1): 17-21.

63. Kogure T, Kawano H, Abe Y, Miyawaki A. Fluorescence imaging using a fluorescent protein with a large Stokes shift. Methods. 2008 Jul;45(3):223-6.

64. Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, Solovieva EA, Chepurnykh TV, Shcheglov AS, Verkhusha VV, Pletnev VZ, Hazelwood KL, Roche PM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Davidson

65. MW, Chudakov DM. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009 Mar 15;418(3):567-74.

66. Shaner NC, Lin MZ, McKeown MR, Steinbach PA, Hazelwood KL, Davidson MW, Tsien RY. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 Jun;5(6):545-51.

67. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2005 Dec;2(12):905-9.

68. Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010 Jul;90(3):l 103-63.

69. Wang L, Jackson WC, Steinbach PA, Tsien RY. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sei USA. 2004 Nov 30; 101 (48): 16745-9.

70. Shu X, Royant A, Lin MZ, Aguilera TA, Lev-Ram V, Steinbach PA, Tsien RY. Mammalian expression of infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome. Science. 2009 May 8;324(5928):804-7.

71. Violot S, Carpentier P, Blanchoin L, Bourgeois D. Reverse pH-dependence of chromophore protonation explains the large Stokes shift of the red fluorescent protein mKeima. J Am Chem Soc. 2009 Aug 5;131(30):10356-7.

72. Shu X, Wang L, Colip L, Kallio K, Remington SJ. Unique interactions between the chromophore and glutamate 16 lead to far-red emission in a red fluorescent protein. Protein Sei. 2009 Feb;18(2):460-6.

73. Morozova KS, Piatkevich KD, Gould TJ, Zhang J, Bewersdorf J, Verkhusha VV. Far-red fluorescent protein excitable with red lasers for flow cytometry and superresolution STED nanoscopy. Biophys J. 2010 Jul 21;99(2):L13-5.

74. Wiehler J, Jung G, Seebacher C, Zumbusch A, Steipe B. Mutagenic stabilization of the photocycle intermediate of green fluorescent protein (GFP). Chembiochem. 2003 Nov 7;4(11):1164-71.

75. Shu X, Leiderman P, Gepshtein R, Smith NR, Kallio K, Huppert D, Remington S J. An alternative excited-state proton transfer pathway in green fluorescent protein variant S205V. Protein Sei. 2007 Dec;16(12):2703-10.

76. McAnaney TB, Shi X, Abbyad P, Jung H, Remington SJ, Boxer SG. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 3. Temperature dependence of proton transfer. Biochemistry. 2005 Jun 21;44(24):8701-11.

77. Stoner-Ma D, Jaye AA, Ronayne KL, Nappa J, Tonge PJ, Meech SR. Ultrafast Electronic and Vibrational Dynamics of Stabilized A State Mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP): Snipping the Proton Wire. Chem Phys. 2008 Jun 23;350(1-3):193-200.

78. Nienhaus K, Renzi F, Vallone B, Wiedenmann J, Nienhaus GU. Chromophore-protein interactions in the anthozoan green fluorescent protein asFP499. Biophys J. 2006 Dec 1;91(11):4210-20.

79. Girkin JM, Poland S, Wright AJ. Adaptive optics for deeper imaging of biological samples. Curr Opin Biotechnol. 2009 Feb;20(l):106-10.

80. Gould TJ, Gunewardene MS, Gudheti MV, Verkhusha W, Yin SR, Gosse JA, Hess ST. Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropics. Nat Methods. 2008 Dec;5(12):1027-30.

81. Piatkevich KD, Verkhusha VV. Advances in engineering of fluorescent proteins and photoactivatable proteins with red emission. Curr Opin Chem Biol. 2010 Feb;14(l):23-9.

82. Lukyanov KA, Chudakov DM, Lukyanov S, Verkhusha W. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 Nov;6(l 1):885-91.

83. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol. 2005 Dec;23(12):605-13.

84. EGFP and DsRed expressing cultures of Escherichia coli imaged by confocal, two-photon and fluorescence lifetime microscopy / S. Jakobs, V. Subramaniam, A. Schonle et al. // FEBS Lett. 2000. - V. 479.-P. 131-135.

85. Red fluorescent protein (DsRed) as a reporter in Saccharomyces cerevisiae / F. Rodrigues, M. van Hemert, H. Y. Steensma et al. //J. Bacteriol. 2001. -V. 183. - P. 3791-3794.

86. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation / V. V. Verkhusha, H. Otsuna, T. Awasaki et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 29621-29624.

87. Werdien D. FLP and Cre recombinase function in Xenopus embryos / D. Werdien, G. Peiler, G.U. Ryffel //Nucleic Acids Res. 2001. -V. 29. - P. 53.

88. Kawano H, Kogure T, Abe Y, Mizuno H, Miyawaki A. Two-photon dual-color imaging using fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 May;5(5):373-4.

89. Gould TJ, Verkhusha VV, Hess ST. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 2009;4(3):291-308

90. Chudakov DM, Verkhusha W, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol. 2004 Nov;22(ll): 1435-9.

91. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat Protoc. 2007;2(8):2024-32

92. Domingo B, Sabariegos R, Picazo F, Llopis J.Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods. Microsc Res Tech. 2007 Dec;70(12):1010-21.

93. Anderson KI, Sanderson J, Gerwig S, Peychl J. A new configuration of the Zeiss LSM 510 for simultaneous optical separation of green and red fluorescent protein pairs. Cytometry A. 2006 Aug l;69(8):920-9.

94. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer / S. Karasawa, T. Araki, T. Nagai et al.} // Biochem J. -2004.-V. 381.-P. 307-312.

95. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Förster radius / G.-J. Kremers, J. Goedhart, E. B. van Munster, T. W. Gadella // Biochemistry. 2006 - V. 45. - P. 6570-6579.

96. Galperin E. Three-chromophore FRET microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells / E. Galperin, V.V. Verkhusha, A. Sorkin // Nat Methods. 2004. - V. 1. - P. 209-217.

97. Tavare L. Some probabilistic and statistical problems of the analysis of DNA sequences / L. Tavare // Lect. Math. Life Sei. 1986. -V. 17. P. 57-86.

98. Neylon C. Chemical and biochemical strategies for the randomization of protein encoding DNA sequences: library construction methods for directed evolution / C. Neylon // Nucleic. Acids. Res. 2004. - V. 32. - P. 1448-1459.

99. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction / S.N. Ho, H.D. Hunt, R.M. Horton et al. // Gene. 1989. -V. 77. - P. 51-59.

100. Laemmli. U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / U. K. Laemmli //Nature. 1970. - V. 227. - P.680-685.

101. Born M. Principles of Optics: Electromagnetic Theory of Propagation, Interference and Diffraction of Light / M. Born, E. Wolf // New York: Cambridge University Press. 1997.

102. Hillesheim LN, Chen Y, Miiller JD. Dual-color photon counting histogram analysis of mRFPl and EGFP in living cells. Biophys J. 2006 Dec 1;91(11):4273-84.

103. Nagy A, Wu J, Berland KM. Observation volumes and {gamma}-factors in two-photon fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys J. 2005 Sep;89(3):2077-90.

104. Z Otwinowski, W Minor Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode Methods in enzymology, 1997,276, 307-326.

105. Storoni LC, McCoy AJ, Read RJ. Likelihood-enhanced fast rotation functions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Mar;60(Pt 3):432-8.

106. Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1994 Sep l;50(Pt 5):760-3.

107. Emsley P, Cowtan K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt l):2126-32.

108. Hooft RW, Vriend G, Sander C, Abola EE. Errors in protein structures. Nature. 1996 May 23;381(6580):272.

109. R. A. Laskowski, M. W. MacArthur, D. S. Moss and J. M. Thornton PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures J. Appl. Cryst. (1993). 26, 283291.

110. Krissinel E, Henrick K. Secondary-structure matching (SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt l):2256-68.

111. Segall JE, Tyerech S, Boselli L, Masseling S, Helft J, Chan A, Jones J, Condeelis J. EGF stimulates lamellipod extension in metastatic mammary adenocarcinoma cells by an actin-dependent mechanism. Clin Exp Metastasis. 1996 Jan;14(l):61-72.

112. Bailly M, Yan L, Whitesides GM, Condeelis JS, Segall JE Regulation of protrusion shape and adhesion to the substratum during chemotactic responses of mammalian carcinoma cells. Exp Cell Res. 1998 Jun 15;241(2):285-99.

113. Hernandez L, Smirnova T, Kedrin D, Wyckoff J, Zhu L, Stanley ER, Cox D, Muller WJ, Pollard JW, Van Rooijen N, Segall JE. The EGF/CSF-1 paracrine invasion loop can be triggered by heregulin betal and CXCL12. Cancer Res. 2009 Apr l;69(7):3221-7.

114. Sternberg S.R. Biomedical image processing / S.R. Sternberg // IEEE Comput. 1983. — V. 16.-P. 22-34.

115. Rasband WS (1997-2006) ImageJ. National Institutes of Health, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/

116. Kedrin D, Gligorijevic B, Wyckoff J, Verkhusha W, Condeelis J, Segall JE, van Rheenen J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 2008 Dec;5(12):1019-21.

117. Wyckoff J, Wang W, Lin EY, Wang Y, Pixley F, Stanley ER, Graf T, Pollard JW, Segall J, Condeelis J. A paracrine loop between tumor cells and macrophages is required for tumor cell migration in mammary tumors. Cancer Res. 2004 Oct l;64(19):7022-9.

118. Condeelis J, Segall JE. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 2003 Dec;3(12):921-30.

119. Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat Chem Bioh 2009 Jul;5(7):459-61.

120. Nobes CD, Hall A. Rho GTPases control polarity, protrusion, and adhesion during cell movement. J Cell Biol. 1999 Mar 22; 144(6): 1235-44.

121. Wyckoff JB, Jones JG, Condeelis JS, Segall JE. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 2000 May 1 ;60(9):2504-l 1.

122. Flores-Ramírez G, Rivera M, Morales-Pablos A, Osuna J, Soberón X, Gaytán P. The effect of amino acid deletions and substitutions in the longest loop of GFP. BMC Chem Biol. 2007 Jun 26;7:1.

123. Kupfer A, Louvard D, Singer SJ. Polarization of the Golgi apparatus and the microtubule-organizing center in cultured fibroblasts at the edge of an experimental wound. Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Apr;79(8):2603-7.

124. Bershadsky AD, Futerman AH. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A blocks cell polarization and inhibits directed cell migration. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Jun 7;91(12):5686-9.

125. Gotlieb AI, Spector W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 1981 May;103(2):271-82.

126. Wyckoff JB, Wang Y, Lin EY, Li JF, Goswami S, Stanley ER, Segall JE, Pollard JW, Condeelis J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 2007 Mar 15;67(6):2649-56

127. Devreotes P, Janetopoulos C. Eukaryotic chemotaxis: distinctions between directional sensing and polarization. J Biol Chem. 2003 Jun 6;278(23):20445-8.