Получение мономерной формы флуоресцентного белка SAASoti и применение его в методах субдифракционной и флуоресцентной корреляционной микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Соловьев Илья Дмитриевич

• Соловьев Илья Дмитриевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Соловьев Илья Дмитриевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика флуоресцентных белков

1.2. Олигомерное состояния флуоресцентных белков

1.3. Получение мономерных фотоконвертируемых флуоресцентных белков

1.4. Методы определения олигомерного состояния флуоресцентных белков и их особенности

1.5. Методы супер-разрешающей микроскопии

1.5.1. Методы микроскопии, основанные на изменении формы функции распределения точечного источника света

1.5.2. Методы локализационной микроскопии

1.5.3. Методы флуктуационной микроскопии

1.6. Особенности фотопревращений флуоресцентных белков, используемых в методах субдифракционной микроскопии

1.6.1. Необратимая фотоконверсия (зелёный^-красный)

1.6.2. Праймированная фотоконверсия

1.6.3. Обратимое фотопереключение (флуоресцентное^-тёмное состояние)

1.6.4. Триплетные состояния флуоресцентных белков

1.6.5. Другие виды превращений фототрансформируюемых флуоресцентных белков

1.6.6. Бифотохромные белки

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Приборы

2.3. Общие методики

2.3.1. Получение генетических конструкций и трансформация клеток E. coli

2.3.2. Выделение и очистка различных мутантных форм флуоресцентного белка SAASoti

2.3.3. Гель-фильтрация (анализ олигомерного состояния)

2.3.4. Химическая модификация янтарным ангидридом

2.3.5. Спектральные и флуоресцентные методы

2.3.6. Масс-спектрометрический анализ

2.3.7. Ведение культуры клеток млекопитающих

2.3.8. Получение субдифракционных изображений методом PALM

2.3.9. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) и флуоресцентная микроскопия с временным разрешением (FLIM)

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Анализ олигомерного состояния и поверхностных аминокислотных остатков

3.2. Сайт-направленный мутагенез для получения мономерной формы флуоресцентного белка SAASoti

3.3. Определение олигомерного состояния вариантов SAASoti методом 2fFCS

3.4. Физико-химические свойства различных вариантов SAASoti

3.6. Необратимая фотоконверсия (зеленый^красный) в живых клетках

3.7. Обратимое фотопереключение зеленой формы

3.8. Фотопереключение красной формы V127T SAASoti

3.9. Масс-спектрометрический анализ образцов V127T SAASoti после фотопереключения зеленой формы

3.9. Экспрессия в клетках млекопитающих и субдифракционная микроскопия

3.10. FRET-сенсор на основе флуоресцентного белка SAASoti для изучения активности каспазы-3 после индукции апоптоза в живых клетках

3.11. Обсуждение результатов

Выводы

Список используемой литературы

Список сокращений, упоминающихся в работе

Флуоресцентные белки (длины волн в максимуме возбужения/эмиссии, нм): CFP - циановый флуоресцентный белок (456/480); Citrine - жёлтый флуоресцентный белок (516/529);

DendFP - флуоресцентный белок, фотоконвертируемый из зеленого (492/508) в красный (557/575) цвет;

Dendra2 - усовершенствованная версия DendFP;

Dreiklang - жёлто-зеленый флуоресцентный белок (511/529), фотопереключаемый из флуоресцирующего в темное состояние;

Dronpa - зеленый (503/518) флуоресцентный белок, фотопереключаемый из

флуоресцирующего в темное состояние;

DsRed - красный флуоресцентный белок (558/583);

eGFP - зеленый флуоресцентный белок (488/507), усовершенствованная версия GFP; EosFP - флуоресцентный белок, фотоконвертируемый из зеленого (506/516) в красный (571/581) цвет;

IrisFP - бифотохромный флуоресцентный белок (фотоконвертируемый зеленый (488/516) - красный (551/580) и фотопереключаемый из флуоресцирующего в темное состояние), производное EosFP;

Kaede - флуоресцентный белок, фотоконвертируемый из зеленого (508/518) в красный (572/580) цвет;

KFP - красный флуоресцентный белок (580/600), фотопереключаемый из темного во флуоресцирующее состояние;

mTFP0.7 - синий (453/488) флуоресцентный белок, фотопереключаемый из флуоресцирующего в темное состояние;

SAASoti - бифотохромный флуоресцентный белок (фотоконвертируемый из зеленого (509/519) в красный (573/579 цвет и фотопереключаемый из флуоресцирующего в темное состояние);

TagRFP - красный флуоресцентный белок (555/584); YFP - желтый флуоресцентный белок (514/527).

Сокращения:

DLS - Dynamic Light Scattering, метод динамического светорассеяния;

FCS - Fluorescence Correlation Spectroscopy, флуоресцентная корреляционная

спектроскопия;

2fFCS - Dual-Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy, двухфокусная флуоресцентная корреляционная спектроскопия;

FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy флуоресцентная микроскопия по временам жизни в возбужденном состоянии;

FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer, флуоресцентный резонансный перенос энергии;

MALDI, TOF - Matrix-Assisted Laser Desorbtion/Ionization, Time Of Flight, масс-спектрометрический анализ матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетным детектором;

OSER - Organized Smoothed Endoplasmic Reticulum, организация гладкого эндоплазматического ретикулума;

PALM - PhotoActivated Localistation Microscopy, фото-активационная локализационная микроскопия;

SOFI - Stochastic Optical Fluctuation Imaging, микроскопия стохастических оптических флуктуаций;

STED - STimulated Emission Depletion, субдифракционная микроскопия основанная на истощении флуоресценции вынужденным излучением;

STORM - Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, стохастическая оптическая реконструкция;

TIRF - Total Internal Reflection Fluorescence, возбуждение флуоресценции при полном внутреннем отражении пучка возбуждающего света;

RESOLFT - REversible Saturable/Switchable OpticaL Fluorescence Transitions, флуоресцентная микроскопия обратимых насыщаемых оптических переходов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение мономерной формы флуоресцентного белка SAASoti и применение его в методах субдифракционной и флуоресцентной корреляционной микроскопии»

Введение

Актуальность и разработанность темы исследования. Открытие флуоресцентных белков предоставило новые возможности для развития биологических исследований. После открытия первого флуоресцентного белка (GFP) из организма Aquoria victoria в 1960-х гг. [1] потребовалось 30 лет для получения последовательности аминокислотных остатков и первого применения в живых организмах [2]. В следующие 20 лет происходит интенсивное развитие исследований флуоресцентных белков и применение их в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки при наблюдениях за живыми организмами. Помимо этого, создаются новые инструменты, флуоресцентные сенсоры, основанные на изменении спектральных свойств самих флуоресцентных белков и их производных [3] или явлении резонансного переноса энергии (FRET) между белком-донором и белком-акцептором [4], позволяющие наблюдать за процессами внутри живых клеток и организмов и оценивать внутренние параметры (ионы, pH, лиганды, окислительно-восстановительный потенциал) не инвазивно [5]. Обнаруженные фотофизические и фотохимические способности некоторых флуоресцентных белков менять свои спектральные свойства под действием облучающего света привели к появлению методов микроскопии, позволяющих преодолеть ограничение разрешения по критерию Аббе и наблюдать тонкие молекулярные структуры внутри живых клеток [6].

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Объектом исследования является флуоресцентный белок SAASoti, выделенный впервые сотрудниками лаборатории физической биохимии (Институт биохимии им. А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН) из коралла Stylocoeniella armata, найденного в лагуне острова Оти Большого Барьерного рифа в Австралии на глубине порядка 10 метров, как фотоконвертируемый флуоресцентный белок. По скорости фотоконверсии SAASoti превосходит некоторые известные фотоконвертируемые флуоресцентные белки, что делает его конкурентоспособным для применения в методах субдифракционной микроскопии. Дикий тип белка SAASoti существует в виде тетрамеров, склонных к образованию агрегатов большей молекулярной массы, что затрудняет его использование в качестве флуоресцентной метки. Поэтому отдельная часть работы была посвящена получению вариантов белка SAASoti, в которых были произведены замены аминокислотных остатков в интерфейсах взаимодействия для получения его в мономерной форме. В ходе данного исследования впервые было обнаружено свойство обратимого фотопереключения белка SAASoti (перехода из зеленой

флуоресцентной формы в темную под действием света Х=470 нм), что делает его

6

уникальным из описанных к настоящему времени флуоресцентных белков, бифотохромным флуоресцентным белком, так как оба эти свойства изначально присутствуют в белке дикого типа, в то время как остальные бифотохромные белки были получены путем замены аминокислотных остатков в микроокружении хромофора. Таким образом, SAASoti не вписывается в общепринятые положения о возможных механизмах фотопревращений и требует отдельного изучения. В этой связи в данной работе подробно изучались его фотохимические свойства.

Практическая значимость работы

Разработка флуоресцентной метки, которая характеризуется улучшенными кинетическими параметрами фотопревращений, ведет к увеличению скорости регистрации изображений и, как следствие, к использованию меньших доз облучающего и иногда токсичного света при работе с живыми объектами. Обладая уникальной способностью к двум видам фотопревращений (необратимой фотоконверсии из зеленой в красную форму и обратимому фотопереключению из флуоресцентной в темную форму), SAASoti имеет высокую практическую значимость для использования в субдифракционных методах флуоресцентной микроскопии. Данные методы представляют собой уникальные научные инструменты и способствуют развитию фундаментальных исследований биологических процессов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение мономерной формы флуоресцентного белка SAASoti и характеристика его физико-химических свойств для последующего применения в качестве уникального инструмента в методах супер-разрешающей флуоресцентной микроскопии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- анализ и модификация интерфейсов взаимодействия внутри тетрамера методами генной инженерии;

- оценка скоростей необратимой фотоконверсии и обратимого фотопереключения и сравнение с известными флуоресцентными белками;

- получение субдифракционного изображения с использованием SAASoti в качестве флуоресцентной метки;

- применение SAASoti в качестве донора флуоресценции в составе FRET-пары сенсора каспазы-3 для проведения in vivo измерений методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

Положения, выносимые на защиту

1. Замена аминокислотных остатков лизина (K145) в зарядовом интерфейсе приводит к получению стабильных тетрамеров, в то время как замена V127T в гидрофобном интерфейсе - к получению мономерной формы флуоресцентного белка SAASoti.

2. SAASoti превосходит коммерчески доступный фотоконвертируемый флуоресцентный белок Dendra2 по скорости фотоконверсии.

3. SAASoti обладает свойством обратимого фотопереключения из флуоресцентного состояния в темное для зеленой формы и частичного фотопереключения для красной формы. Аминокислотный остаток M164 подвергается окислению при длительном облучении светом Х=470 нм.

4. SAASoti применим в качестве флуоресцентной метки для метода фотоактивационной локализационной микроскопии (PALM).

5. Флуоресцентный сенсор SAASoti-23-KFP на основе FRET-пары, содержащий флуоресцентный белок V127T SAASoti в качестве донора и флуоресцентный белок KFP в качестве акцептора флуоресценции, соединенные линкером, содержащим аминокислотную последовательность -DEVD-, позволяет детектировать активацию каспазы-3 при апоптозе в клетках млекопитающих.

6. SAASoti в составе сенсора SAASoti-23-KFP является инструментом для одновременного измерения вязкости и ферментативной активности методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

Личный вклад автора. Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование, выполнение экспериментов, сбор и обработку данных, оформление и публикацию результатов. Измерения 2fFCS проводили на установке в лаборатории Йорга Андерляйна в Геттингенгском университете (г. Геттинген, Германия). Изображения в режиме TIRF и PALM были получены в лаборатории д.б.н. Киреева И.И. на микроскопе Nikon N-STORM в ИФХБ им. А.Н. Белозерского, генетические конструкции были получены при участии к.б.н. Ивашиной Т.В. в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и к.х.н. Малошенок Л.Г. в ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН. Моделирование структуры и взаимодействий внутри тетрамера SAASoti были проведены д.ф.-м.н. Хреновой М.Г. на химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. Масс-спектрометрический анализ проводился в ЦКП ФИЦ Биотехнологии РАН.

Степень достоверности. Представленные в данной работе результаты получены с использованием современных физико-химических методов и статистической оценки погрешности результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде тезисов и докладов на следующих всероссийских и международных конференциях: ADFLIM (Сочи, Октябрь 2016 г.), Saratov Fall Meeting (Саратов, Октябрь 2017 г.), Ломоносов-2018 (Москва, Апрель 2018 г.), Biocatalysis-2019 (Санкт-Петербург, Июнь 2019 г.), Topical Problems of Biophotonics (Нижний Новгород, Июль 2019 г.).

Публикации

По результатам данной работы было опубликовано 4 статьи в журналах, которые индексируются в Web of Science, Scopus и РИНЦ, а также 6 тезисов на международных конференциях.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика флуоресцентных белков

Третичная структура флуоресцентных белков представляет собой 11 антипараллельных Р-листов, формирующих, так называемый, «Р-бочонок», в центре которого располагается а-спираль с хромофором, обуславливающим спектральные и флуоресцентные характеристики флуоресцентного белка [7], [8]. Важно подчеркнуть, что хромофор образуется автокаталитически при участии кислорода из триады аминокислотных остатков -XYG-, причем аминокислотные остатки тирозина и глицина являются консервативными для всех флуоресцентных белков. Такая структура защищает хромофор от внешних воздействий и позволяет сохранять флуоресцентные свойства, защищая от широкого круга протеаз. Гидролизу, однако, могут подвергаться N или ^ концы полипептидной цепи, выходящие за пределы Р-тяжей. Также структура флуоресцентных белков устойчива в денатурирующих условиях [9].

Флуоресцентные белки склонны к образованию агрегатов [10], [11], что ограничивает их использование при экспрессии в живых клетках и организмах, флуоресцентном мечении органелл и структурных белков, а также при создании флуоресцентных FRET-сенсоров. При получении слитых белковых конструкций (т.н., фьюжн-белков) с флуоресцентным белком нередко возникают непредвиденные изменения свойств полученной конструкции, что может приводить к отклонению в функционировании исследуемого объекта или влиянию на флуоресцентные свойства белка-маркера, который может совсем утратить свойства флуоресценции. Помимо этого, олигомеризация флуоресцентных белков сильно зависит от величины pH. В средах с низким значением pH белки склонны к агрегации [12]. Внутри гомо-олигомеров флуоресцентных белков может возникать гомо-FRET, меняться флуоресцентные, фотохимические, фотофизические свойства белка за счет перераспределения поглощенной энергии между молекулами [13]. Преимуществом стабильных тетрамеров является увеличенное значение поглощения, что может быть полезным при использовании данного белка как акцептора при создании сенсоров на основе FRET-пары [14], а также для увеличения общей яркости флуоресцентного белка [11]. Поэтому одной из первых задач при изучении генов новых флуоресцентных белков является получение их мономерных вариантов, что обычно достигается методом направленной эволюции и сайт-направленного мутагенеза.

1.2. Олигомерное состояния флуоресцентных белков

Первый известный зеленый флуоресцентный белок (GFP), выделенный из медузы Aequoria victoria, при больших концентрациях склонен образовывать гомодимеры с константой диссоциации Кд=0,1 мМ [15]. При малых концентрациях белок GFP преимущественно пребывает в мономерной форме [16]. В случае GFP, выделенного из другого организма (Renilla reniformis), димерная форма является настолько стабильной, что разрушается лишь в денатурирующих условиях [17]. Были получены как димерная, так и мономерная изоморфные кристаллические структуры GFP [8], [15]. Со временем появились «усиленная» яркая мутантная форма (eGFP), спектрально смещенные синяя (CFP) и желтая (YFP) формы, также образующие слабые димеры. В работе [18] было показано, что ключевую роль в образовании димеров играют гидрофобные аминокислотные остатки. Единичные замены гидрофобных остатков A206K, L221K или F223R на положительно заряженные остатки лизина и аргинина в случае GFP, CFP, YFP приводит к значительному увеличению константы диссоциации, особенно для замены A206K. Так, в случае YFP Кд = 0,11 мМ, а для A206K YFP Кд = 74 мМ.

Поиск флуоресцентных белков со смещением спектра в красную область привел к открытию красного флуоресцентного белка drfp583 или DsRed в кораллах [19]. DsRed -тетрамер, как и большинство белков, выделенных из кораллов. В структуре тетрамера выделяют два вида взаимодействий (Рис. 1А): 1) AB-интерфейс, образованный полярными и заряженными аминокислотными остатками; 2) гидрофобный AC-интерфейс, характерный для многих белков, осуществляющих высоко-аффинные белок-белковые взаимодействия. Субъединицы тетрамера ориентированы в симметричном порядке, причем каждый интерфейс образован контактами между одинаковыми аминокислотными последовательностями двух субъединиц, поэтому кажется, что тетрамер образован димерами. Стратегия получения мономерных форм флуоресцентных белков учитывает разную природу контактов внутри интерфейсов тетрамера и подразумевает использование рациональной замены аминокислотных остатков вместе с методом направленной эволюции. Например, в случае флуоресцентного белка DsRed (Рис. 1) введение единичной аминокислотной замены в область заряженного интерфейса привело к его димеризации, хотя данная форма приобрела более слабые флуоресцентные свойства и увеличенное время созревания хромофора, чем для белка дикого типа. Флуоресцентные свойства, однако, могут быть восстановлены последующими четырьмя циклами направленной эволюции. Для получения ярких мономерных вариантов часто необходимо вводить замены аминокислотных остатков сразу в оба интерфейса внутри тетрамера. Первый мономерный

красный флуоресцентный белок был получен путем введения 33 замен аминокислотных остатков в флуоресцентном белке DsRed, 13 из которых были внутри интерфейсов тетрамера [20]. Другими словами, замены, положительно влияющие на олигомерное состояние, могут отрицательно сказываться на других важных свойствах: времени созревания хромофора, коэффициенте экстинкции, квантовом выходе, спектральных смещениях. Так, замена I125R привела к нарушению интерфейса AC и переходу белка в димерную форму, но при этом - к получению флуоресцентного белка с меньшим значением коэффициента экстинкции и частичным сдвигом спектра эмиссии в зеленую область. В итоговом варианте - белке mRFP - AC интерфейс содержал следующие замены аминокислотных остатков: I125R, V127T и I180T, направленные на замену гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные, а в случае интерфейса AB - R153E, Ш62^ A164R, L174D, Y192A, Y194K, H222S, L223T, F224G, L225A, зарядовые и гидрофобные изменения.

Рисунок 1. Структура A) тетрамера; Б) димера и В) мономера флуоресцентного белка DsRed и замены аминокислотных остатков, произведенные для получения мономерного белка mRFP [20].

Интересно рассмотреть другой красный флуоресцентный белок из анемона ЕМасшава quadricolor. Изначально eqFP578 - димер, который был оптимизирован как по флуоресцентным свойствам, так и по олигомерному состоянию. В результате случайного мутагенеза по определенным позициям был получен мономерный белок TagRFP, склонный к димеризации [21], с относительно большим значением коэффициента экстинкции (е=100 000 М-1*см-1). Один из интерфейсов, «гидрофобный», был модифицирован заменой N126R, как успешная замена при мономеризации белка eqFP611[22]. Помимо этого, были произведены замены в зарядовом интерфейсе R162E, Q166D, S180N, F198V, F200Y, направленные на изменение знака заряда на противоположный [21].

1.3. Получение мономерных фотоконвертируемых флуоресцентных белков

Ввиду того, что объектом исследования является фотоковертируемый флуоресцентный белок SAASoti, отдельно следует выделить получение мономерных форм

фотоконвертируемых флуоресцентных белков, так как несмотря на консервативность третичной структуры белков семейства GFP, первичная структура в случае подгруппы фотоконвертируемых белков заметно отличается. Всего известно ограниченное число генов фотоконвертируемых флуоресцентных белков: Kaede [23], EosFP [24], mClavGR [25], mMaple [26], KikGR [27], PSmOrange[28], SAASoti [29]. Отличительной особенностью этих белков является наличие консервативного остатка гистидина в триаде (-HYG-) аминокислотных остатков, образующих хромофор. Такие флуоресцентные белки претерпевают необратимый разрыв пептидной цепи с изменением сопряженной системы хромофора, в результате чего происходит спектральный сдвиг в более длинноволновую область. Первым обнаруженным фотоконвертируемым белком был Kaede [23]. Флуоресцентный белок Kaede существует в виде тетрамера, однако работ по получению мономерной формы данного белка не проводилось.

Следующим был обнаружен тетрамерный белок EosFP и получена его мономерная форма mEosFP [24]. Для получения мономерной формы был учтен успешный опыт работы с белком DsRed, описанный выше. Однако гидрофобный интерфейс содержал меньшее число гидрофобных аминокислотных остатков, и для получения димерного белка ограничились заменой V123T. AB-интерфейс белка EosFP по сравнению с DsRed также уже содержал положительно заряженные остатки. В этом интерфейсе была произведена замена треонина на гистидин ^158^ по аналогии с мономеризацией белка RTMS5 [30]. Двойная замена привела к мономеризации белка, константа диссоциации димера mEosFP равна 0,1 мМ, что сравнимо с GFP и его производными. В настоящий момент существует 3 поколения флуоресцентного белка EosFP, связанных с улучшением флуоресцентных свойств, а также варианты, имеющие свойства фотопереключения.

Для получения мономерной формы белка IrisFP в мономерном белке mEosFP были проведены замены A69V, F173S, Ю45! Y189A, при этом замена F173S отвечает за появление свойства обратимого фотопереключения хромофора, а замена A69V, наиболее вероятно, также влияет на свойства хромофора, так как данный аминокислотный остаток расположен на альфа-спирали ведущей к хромофору, Ю45! и Y189A имеют дополнительное воздействие на интерфейс-AC [31].

Еще один фотконвертируемый белок - Dendra - и его коммерчески доступная версия Dendra2 претерпел замены следующих аминокислотных остатков, произведенных в белке DendFP: Ш2Ж, M123T, Y188A [32]. Замены Ш21К и М123Т также увеличивают положительный заряд и гидрофильность гидрофобного интерфейса, а замена аминокислотного остатка Y188A была произведена аналогично интерфейсу AB в белке

DsRed. В отличие от своего белка-предшественника DendFP, Dendra2 существует в мономерной форме, склонной к слабой димеризации.

Получение мономерных фотоконвертируемых белков возможно проводить альтернативным способом. Так, Hoi и коллеги [25] взяли за основу синий флуоресцентный белок mTFP, ранее полученный в мономерной форме, и произвели в нем замены консервативных аминокислотных остатков на основе выравниваний первичных последовательностей известных фотоконвертируемых белков, включая свойственный для хромофора фотоконвертируемых белков остаток H66, формирующий хромофор. Такой белок (mClavGR1) стал отправной точкой для множественных циклов направленной эволюции. Для мономерной формы снова оказалась критичной замена V127T, для mClavGR2 олигомеры не наблюдались вплоть до концентрации 1 мМ. Флуоресцентный белок mClav в дальнейшем претерпел несколько этапов модификации, новые варианты приобрели название Maple. Для получения mMaple в направлении олигомеризации были изменены аминокислотные остатки на С-конце (-HSGLP- на -RNSTD-), отвечающие за димеризацию флуоресцентных белков, выделенных из кораллов [26]. Существует 3 поколения белков mMaple, в которых улучшались флуоресцентные свойства и эффективность фотоконверсии данного белка. За основу был взят опыт получения белка KikGR [27], который также претерпел последующую мономеризацию [33]. Успешные замены аминокислотных остатков, которые привели к изменению олигомерного состояния различных флуоресцентных белков, представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Замены аминокислотных остатков в двух интерфейсах и их влияние на олигомерное состояние различных флуоресцентных белков.

Исходный белок Олигомерное состояние до Введенные замены Интерфейс Олигомерное состояние после

GFP, eGFP, CFP, YFP Слабый димер A206K L221K AB Мономер

DsRed Тетрамер I125R, V127T I180T AC Мономер

R153E, H162K, A164R, L174D, Y192A, Y194K, H222S, L223T, F224G, L225A AB

eqFP578 Тетрамер N126R AC Мономер

R162E, Q166D, S180N, F198V, F200Y AB

EosFP Тетрамер V123T AC Мономер

T158H AB

IrisFP Тетрамер V123T AC Мономер

^58^ Ю45! Y189A AB

DendFP Тетрамер Ш2Ж, M123T, AC Мономер и слабый димер

Y188A AB

1.4. Методы определения олигомерного состояния флуоресцентных белков и их особенности

Для определения олигомерного состояния флуоресцентных белков применяются различные методы, и на данный момент не существует единого стандарта. Каждый метод имеет свой «рабочий диапазон» концентраций и особенности проведения измерений. В первых работах, связанных с изучением GFP и производных флуоресцентных белков, для определения константы диссоциации (Кд) и олигомерных форм флуоресцентных белков широкое применение получил метод аналитического ультрацентрифугирования [17]. В данном методе на белок действуют конкурирующие диффузия и центробежная сила. Можно определять или скорость седиментации, или регистрировать равновесие, устанавливающееся между частицами различной массы. Для этого метода допустимы широкий диапазон концентраций и использование практически любых буферных систем. Основные ограничения связаны c системой детекции, обычно используется фотометрический детектор [34]. Так, в случае определения константы диссоциации производных флуоресцентного белка YFP значение Кд=74 мМ дается с комментарием о большой величине ошибки определения параметра из-за измерений на пределе возможностей прибора [18].

Наиболее распространенным методом определения молекулярных масс и олигомерного состояния белков является эксклюзионная хроматография или гель-фильтрация, основанная на свойстве молекул различного размера по-разному взаимодействовать с матрицей. Так, молекулы более мелкого размера проникают в поры матрицы, поэтому время их удерживания на хроматографической колонке больше. Например, данный метод использовали для изучения равновесия между олигомерными формами при работе с EosFP [24]. Главным недостатком системы является носитель -матрица для разделения белков по размерам, так как в любом случае она будет иметь неспецифические взаимодействия с исследуемым объектом. Возможно использование ограниченного числа буферных систем с повышенным значением ионной силы для нивелирования неспецифических взаимодействий. Как было показано выше, флуоресцентные белки имеют разнообразные сочетания аминокислотных остатков, находящихся на поверхности, в связи с чем все белки имеют разные поверхностные заряды

и степени гидрофобности, поэтому вероятны отклонения от калибровки, выполненной даже на основе изученных флуоресцентных белков. Помимо реализации неспецифичных взаимодействий хроматографические колонки имеют ограничения по количеству наносимого белка. При детектировании можно одновременно сочетать несколько методов, имеющих разные диапазоны измерений. В случае флуоресцентных белков применяются в основном фотометрический и флуоресцентный методы.

Для быстрого определения олигомерного состояния при отборе клонов было предложено использование «полу-нативного» гель-электрофореза [11], который методически отличается от стандартного гель-электрофореза по Лэммли лишь тем, что не требует прогревания проб перед нанесением на гель в течение 5 мин при 95 °С. Флуоресцентные белки в таких условиях обычно сохраняют флуоресцентные свойства и легко детектируются в геле по флуоресценции. Подвижность белка в таком методе будет зависеть от суммарного заряда белка и размера молекулы, а заряд белка, в свою очередь, будет зависеть от вносимых мутаций, поэтому данный метод полезен для экспрессного первичного отсева мутантных форм напрямую из лизатов клеток.

Метод динамического светорассеяния (DLS) [35] основан на анализе автокорреляционной функции, полученной от флуктуаций луча света, рассеянного на молекулах белка. Количественно сложно определять соотношения равновесных форм, если отличия между ними составляют менее 30%. Ввиду существования малых отличий в значениях коэффициента диффузии бывает затруднительно установить равновесие «мономер-димер» при анализе автокорреляционной кривой. Метод требует наличия образцов высокой степени чистоты и относительно большой концентрации белка. Такой метод удобен для изучения агрегации белков при высокой концентрации.

На анализе корреляционных кривых также основан метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Корреляционная кривая строится на основе данных

0 флуктуации сигнала флуоресценции в фокальном объеме конфокального флуоресцентного микроскопа. Фокальный объем определяется числовой апертурой объектива и диафрагмой в регистрирующем канале (пинхолом) и обычно составляет около

1 фемтолитра. При малых концентрациях флуорофора (нМ) в фокальном объеме находится от одной до нескольких молекул флуорофора. Диффундируя через фокальный объем, флуорофор порождает флуктуации сигнала флуоресценции (Рис. 2А). На основании корреляционных кривых можно определить коэффициент поступательной диффузии по сравнению с образцом с точно известным коэффициентом диффузии, определенным альтернативными методами. Этот метод регистрирует только флуоресцирующие молекулы, поэтому его можно использовать в сложных системах и в клетках [36], однако его

16

использование также сильно ограничено концентрационным диапазоном измерений. При низких значениях концентрации (<10-10 М) количество флуоресцентного сигнала мало, что сопровождается увеличением времени накопления сигнала и приводит к низкому соотношению «сигнал-шум». При высоких концентрациях (выше десятков нМ) корреляционная амплитуда автокорреляционной кривой сильно падает (Рис. 2Б). Таким образом, можно определять олигомерное состояние флуоресцентных белков в сильноразбавленных растворах, что было впервые продемонстрировано для GFP, так как он имеет мономерную форму при малых концентрациях [16].

А

фокальный объем

Б

флуоресцентная частица

флуоресцентный сигнал

время

Рисунок 2. А) Принцип флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Б) Зависимость корреляционных кривых от размера и концентрации флуорофора [www.picoquant.com].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Соловьев Илья Дмитриевич, 2019 год

Список используемой литературы

1. O. Shimomura, F.H. Johnson, Y. Saiga. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. // Journal of Cellular and Comparative Physiology - 1962. - Vol. 59 - p. 223-239.

2. M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen, W.W. Ward, D.C. Prasher. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. - 1994. -Vol. 263. - p. 802-805.

3. A. I. Kostyuk, A.D. Demidovich, D.A. Kotova, V.V. Belousov, D.S. Bilan. Circularly Permuted Fluorescent Protein-Based Indicators: History, Principles, and Classification // International Journal of. Molecular Sciences - 2019. - Vol. 20. - p. 4200.

4. Богданов А.А., Соловьев И.Д., Савицкий А.П. / Сенсоры для визуализации протеолитической активности и их применение в моделях болезни человека // Успехи биологической химии. — 2019. — Т. 59. — С. 3-38.

5. A. Germond, H. Fujita, T. Ichimura, T. M. Watanabe. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. // Biophysical Reviews. - 2016. - Vol. 8(2). - p. 121-138.

6. K. Nienhaus, G. Ulrich Nienhaus. Fluorescent proteins for live-cell imaging with superresolution // Chemical Society Reviews - 2014. - Vol. 43(4). - p. 1088-1106.

7. M. Ormo, A.B. Cubitt, K. Kallio, L.A. Gross, R.Y. Tsien, S. James Remington. Crystal Structure of the Aequorea Victoria Green Fluorescent Protein // Science - 1996. - Vol. 273. - P. 1392-1395.

8. F. Yang, L.G. Moss, G.N. Phillips. The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein // Nature Biotechnology - 1996. - Vol. 14(10). - p. 1246-1251.

9. H. Fukuda, M. Arai, K. Kuwajima. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant // Biochemistry. - 2000. - Vol.39(39). - p. 12025-32.

10. L.M. Costantini, M. Fossati, M. Francolini, E.L. Snapp. Assessing the Tendency of Fluorescent Proteins to Oligomerize Under Physiologic Conditions // Traffic. - 2012. - Vol. 13 (5). - p. 643-649.

11. Y.G. Yanushevich, D.B. Staroverov, A.P. Savitsky, A.F. Fradkov, N.G. Gurskaya, M. E. Bulina, K. A. Lukyanov, S. A. Lukyanov. A Strategy for the Generation of Non-Aggregating Mutants of Anthozoa Fluorescent Proteins // FEBS Letters. - 2001. - Vol. 511(1-3). - p.11-14.

12. N. N. Zubova, N. V. Rudenko, A. P.Savitsky. Aggregation Strongly Influence the pH-Profile of the Yellow Fluorescent Protein zFP538. In Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications. Savitsky // SPIE, 2003.

13. S. Warren, A. Margineanu, M. Katan, C. Dunsby, P. French. Homo-FRET Based Biosensors and Their Application to Multiplexed Imaging of Signalling Events in Live Cells // International Journal of Molecular Sciences - 2015. - Vol. 16(12). - p. 14695-14716.

14. A.P. Savitsky, A.L. Rusanov, V.V. Zherdeva, T.V. Gorodnicheva, M.G. Khrenova, A.V. Nemukhin. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins // Theranostics - 2012. - Vol. 2(2). - p. 215-226.

15. G. N. Phillips, Jr. Structure and Dynamics of Green Fluorescent Protein // Current Opinion in Structural Biology - 1997. - Vol. 7 (6). - p. 821-827.

16. B. R. Terry, E. K. Matthews, J. Haseloff, Molecular Characterization of Recombinant Green Fluorescent Protein by Fluorescence Correlation Microscopy // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1995. -Vol. 217 (1). - p. 21-27.

17. Tsien, R. Y. THE GREEN FLUORESCENT PROTEIN // Annual Review of Biochemistry -1998. - Vol. 67 (1) - p. 509-544.

18. D.A. Zacharias. Partitioning of Lipid-Modified Monomeric GFPs into Membrane Microdomains of Live Cells // Science - 2002. - Vol. 296(5569) - p. 913-916.

19. M.V. Matz, A.F. Fradkov, Y.A. Labas, A.P. Savitsky, A G. Zaraisky, M L. Markelov, S.A. Lukyanov. Fluorescent Proteins from Nonbioluminescent Anthozoa Species // Nature Biotechnology - 1999. - Vol. 17 (10). - p. 969-973.

20. RE. Campbell, O.Tour, A.E. Palmer, P.A. Steinbach, G S. Baird, D.A. Zacharias, R.Y. Tsien, A Monomeric Red Fluorescent Protein // Proceedings of the National Academy of Sciences - 200. - Vol. 99(12). - p. 7877-7882.

21. E.M. Merzlyak, J. Goedhart, D. Shcherbo, M.E. Bulina, A.S. Shcheglov, A.F. Fradkov, A. Gaintzeva, K.A. Lukyanov, S. Lukyanov, T.W. J. Gadella. Bright Monomeric Red Fluorescent Protein with an Extended Fluorescence Lifetime // Nature Methods - 2007. - Vol. 4 (7). - p. 555557.

22. J. Wiedenmann, B. Vallone, F. Renzi, K. Nienhaus, S. Ivanchenko, C. Röcker, G.U. Nienhaus. Red Fluorescent Protein eqFP611 and Its Genetically Engineered Dimeric Variants // Journal of Biomedical Optics. - 2005 - Vol. 10 (1). - p. 14003.

23. R. Ando, H. Hama, M. Yamamoto-Hino, H. Mizuno, A. Miyawaki. An Optical Marker Based on the UV-Induced Green-to-Red Photoconversion of a Fluorescent Protein // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. 99 (20). - p. 12651-12656.

24. J. Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. Rocker, A. Salih, K.-D. Spindler,

G.U. Nienhaus. EosFP, a Fluorescent Marker Protein with UV-Inducible Green-to-Red Fluorescence Conversion // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2004. - Vol. 101 (45). - p. 15905-15910.

25. H. Hoi, N.C. Shaner, M.W. Davidson, C.W. Cairo, J. Wang, RE. Campbell. A Monomeric Photoconvertible Fluorescent Protein for Imaging of Dynamic Protein Localization // Journal of Molecular Biology. - 2010. - Vol. 401 (5). - p. 776-791.

26. A.L. McEvoy, H. Hoi, M. Bates, E. Platonova, P. J. Cranfill, M. A. Baird, M. W. Davidson,

H. Ewers, J. Liphardt, R. E. Campbell. mMaple: A Photoconvertible Fluorescent Protein for Use in Multiple Imaging Modalities // PLoS ONE. - 2012. 7 (12). - p. e51314.

27. H. Tsutsui, S. Karasawa, H. Shimizu, N. Nukina, A.Miyawaki. Semi-Rational Engineering of a Coral Fluorescent Protein into an Efficient Highlighter. // EMBO reports. - 2005. - Vol. 6 (3). -p. 233-238.

28. O. M. Subach, G. H. Patterson, L.-M. Ting, Y. Wang, J. S. Condeelis and V. V. Verkhusha1. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange // Nature Methods. - 2011. - Vol. 8(9). - p. 771-777.

29. G., Lapshin, A., Salih, P., Kolosov, M., Golovkina, Y., Zavorotnyi, T. Ivashina, A. Savitsky. Fluorescence Color Diversity of Great Barrier Reef corals // Journal of Innovative Optical Health Sciences. - 2015. - Vol. 8(4). - p. 1550028.

30. M. Prescott, M. Ling, T. Beddoe, A. J. Oakley, S. Dove, O. Hoegh-Guldberg, R. J. Devenish, J. Rossjohn, The 2.2 Â Crystal Structure of a Pocilloporin Pigment Reveals a Nonplanar Chromophore Conformation // Structure - 2003. - Vol 11 (3). - p. 275-284.

31. J. Fuchs, S. Böhme, F. Oswald, P. N. Hedde, M. Krause, J. Wiedenmann & G U. Nienhaus. A Photoactivatable Marker Protein for Pulse-Chase Imaging With Superresolution // Nature Methods. - 2010. - Vol. 7(8). - p. 627.

32. N.G. Gurskaya, V. V.Verkhusha, A.S. Shcheglov, D.B. Staroverov, T V. Chepurnykh, A.F. Fradkov, S. Lukyanov, K.A. Lukyanov. Engineering of a Monomeric Green-to-Red Photoactivatable Fluorescent Protein Induced by Blue Light // Nature Biotechnology. - 2006. -Vol. 24 (4). 461-465.

33. S. Habuchi, H. Tsutsui, A.B. Kochaniak, A. Miyawaki, A.M. van Oijen. mKikGR, a Monomeric Photoswitchable Fluorescent Protein // PLoS ONE - 2008. - Vol. 3 (12). - p. e3944. https://doi .org/10.1371/journal.pone.0003944.

34. J. Liu, J. D. Andya, S. J. Shire, A Critical Review of Analytical Ultracentrifugation and Field Flow Fractionation Methods for Measuring Protein Aggregation // The AAPS Journal. - 2006. -Vol. 8 (3). - p. E580-E589.

35. R. Schmidt, Dynamic Light Scattering for Protein Characterization // Encyclopedia of Analytical Chemistry, 2010.

36. Radek Machan and Martin Hof, Fluorescence Correlation Spectroscopy, Picoquant Gmbh

37. T. Dertinger, V. Pacheco, I. von der Hocht, R. Hartmann, I. Gregor, J. Enderlein. Two-Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy: A New Tool for Accurate and Absolute Diffusion Measurements // ChemPhysChem - 2007. - Vol. 8 (3). - p. 433-443.

38. J.R. Lakowicz "Principles of Fluorescence Spectroscopy" Springer 3rd edition

39. H. Zhang, Q. Wu, M. Y. Berezin, Fluorescence Anisotropy (Polarization): From Drug Screening to Precision Medicine // Expert Opinion on Drug Discovery. - 2015. - Vol. 10 (11). -P. 1145-1161.

40. P. Kapusta Time-resolved fluorescence anisotropy measurements made simple. PicoQuant Gmbh

41. P. J. Cranfill, B. R. Sell, M. A. Baird, J. R. Allen, Z. Lavagnino, H. M. de Gruiter, G.-J. Kremers, M. W. Davidson, A.Ustione, D. W. Piston, Quantitative Assessment of Fluorescent Proteins // Nature Methods - 2016. - Vol. 13 (7). - P. 557-562.

42. http://olympus.magnet.fsu.edu

43. S. Hell and Ernst H. K. Stelzer. Properties of a 4Pi confocal fluorescence microscope // Journal of the Optical Society of America A. - 1992. - Vol. 9(12). - p. 2159-2166.

44. MG Gustafsson, DA Agard, JW Sedat. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution // Journal of Microscopy. - 1999. - Vol. 195 - p. 10-6.

45. M. G. L. Gustafsson, Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. SHORT COMMUNICATION // Journal of Microscopy. -2000. - Vol. 198 (2). - p. 82-87.

46. S. W. Hell. Fluorescence nanoscopy: Breaking the diffraction barrier by the RESOLFT concept // NanoBiotechnology. - 2005. - Vol. 1(3). - p. 296-297.

47. S. W. Hell, & J. Wichmann, Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy // Optics Letters. - 1994. - Vol. 19(11). -p. 780.

48. B. R., Rankin, G., Moneron, C. A., Wurm, J. C., Nelson, A., Walter, D., Schwarzer, ... S. W. Hell, Nanoscopy in a Living Multicellular Organism Expressing GFP // Biophysical Journal. -2011. - Vol. 100(12). - p. 63-65.

49. T.J. Chozinski, L.A. Gagnon, J.C. Vaughan. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. - 2014. - Vol. 588(19). - p. 3603-12.

50. S. Schnorrenberg, T. Grotjohann, G. Vorbruggen, A. Herzig, S.W. Hell, S Jakobs. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster // Elife. - 2016. - Vol. 5. - p. e15567.

51. M. J., Rust, M., Bates, & X. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) // Nature Methods. - 2006. - Vol. 3(10). - p. 793-796.

52. E. Betzig, G. H Patterson, R. Sougrat, O. W. Lindwasser, S. Olenych, J. S. Bonifacino, H. F. Hess, (2006). Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science, 313(5793), 1642-1645. https://doi.org/10.1126/science.1127344

53. H. Shroff, C. G. Galbraith, J. A. Galbraith, H. White, J. Gillette, S. Olenych. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes // PNAS. - 2007. - Vol. 104(51). - p. 20308-20313.

54. M. W. Davidson, E. Betzig, HP Kao, AS Verkman. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position // Biophys J. - 1994. - Vol. 67(3). - p. 1291-300.

55. T. Dertinger, R. Colyer, G. Iyer, S. Weiss, J. Enderlein. Fast, background-free, 3D superresolution optical fluctuation imaging (SOFI) // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - Vol. 106(52). - p. 22287-22292.

56. G. Donnert, C. Eggeling, S.W. Hell. Triplet-relaxation microscopy with bunched pulsed excitation // Photochemical and Photobiological Sciences. - 2009. - Vol. 8(4). - p. 481-5.

57. R.M. Dickson, A.B. Cubitt, R.Y. Tsien, W.E. Moerner. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein // Nature. - 1997. - Vol. 388(6640). -p. 355-8.

58. А. С. Мишин, К. А. Лукьянов Флуоресцетная микроскопия сверхвысокого разрешения живых клеток // Успехи биологической химиит. - 2019. - т. 59. - с. 39-6639

59. C. Duan, V. Adam, M. Byrdin, J. Ridard, S. Kieffer-Jaquinod, C. Morlot, D. Bourgeois. Structural Evidence for a Two-Regime Photobleaching Mechanism in a Reversibly Switchable Fluorescent Protein // Journal of the American Chemical Society, - 2013. - Vol. 135(42). - p. 15841-15850.

60. J., Icha, M., Weber, J. C., Waters, & C. Norden, Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it // BioEssays. - 2017. - Vol. 39(8). - p. 1700003.

61. X. Zhang, X. Chen, Z. Zeng, M. Zhang, Y .Sun, P. Xi, J. Peng, P. Xu. Development of a reversibly switchable fluorescent protein for super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI) // ACS Nano. - 2015. - Vol. 9(3). - P.2659-67.

62. Wachter, R. Photoconvertible Fluorescent Proteins and the Role of Dynamics in Protein Evolution. International Journal of Molecular Sciences. - 2017 - 18(8), 1792. https://doi.org/10.3390/ijms18081792

63. H. Kim, T. Zou, C. Modi, K. Dörner, T.J. Grunkemeyer, L. Chen, Wachter, R. M. (2015). A Hinge Migration Mechanism Unlocks the Evolution of Green-to-Red Photoconversion in GFP-like Proteins. Structure, 23(1), 34-43. https://doi.org/10.1016/j.str.2014.11.011

64. N.V. Klementieva, K.A. Lukyanov, N.M. Markina, S.A. Lukyanov, E.V. Zagaynova, A.S. Mishin. Green-to-red primed conversion of Dendra2 using blue and red lasers. Chem. Commun. 2016, 52, 13144-13146.

65. M. A. Mohr, A. Yu. Kobitski, L. R. Sabater, K. Nienhaus, C. J. Obara, J. Lippincott-Schwartz, G.U. Nienhaus, P. Pantazis. A triplet state mechanism of primed conversion enables rational engineering of photoconvertible fluorescent proteins for dual color fluorescence nanoscopy // Angewandte Chemie. - 2017. - Vol. 56(38). - p. 11628-11633.

66. B. Turkowyd et al. A General Mechanism of Photoconversion of Green-to-Red Fluorescent Proteins Based on Blue and Infrared Light Reduces Phototoxicity in Live-Cell Single-Molecule Imaging // Angewandte Chemie International Edition. 2017. - Vol. 56, - № 38. - P. 11634-11639.

67. V Adam, P Carpentier, S Violot, M Lelimousin, C Darnault, GU Nienhaus, D.Bourgeois Structural basis of X-ray-induced transient photobleaching in a photoactivatable green fluorescent protein // Journal of American Chemical Society. - 2009. - Vol. 131(50). - p. 18063-5.

68. R Ando, H Mizuno, A Miyawaki. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting // Science. - 2004. - Vol. 306(5700) - p.1370-3.

69. C., Duan, V., Adam, M., Byrdin, & D. Bourgeois. Structural Basis of Photoswitching in Fluorescent Proteins // In Methods in Molecular Biology (pp. 177-202). Springer New York. (2014).

70. V. Adam, M. Lelimousin, S. Boehme, G. Desfonds, K. Nienhaus, M. J. Field, D. Bourgeois, Structural characterization of IrisFP, an optical highlighter undergoing multiple photo-induced transformations // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2008. - Vol. 105(47). - p. 18343-18348.

71. M. Quillin, D. M. Anstrom, X. Shu, S. O'Leary, K. Kallio, D. M. Chudakov, and S. J. Remington. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 Ä resolution. // Biochemistry - 2005. - Vol. 44(15) - p.5774-5787.

72. M. Andresen, A.C. Stiel, J. Fölling, D. Wenzel, A. Schönle, A. Egner, C. Eggeling, S.W. Hell, S Jakob. Photoswitchable fluorescent proteins enable monochromatic multilabel imaging and dual color fluorescence nanoscopy // Nature Biotechnology. - 2008. - Vol 26(9). P.1035-40.

73. J. Petersen, P. G. Wilmann, T. Beddoe, A. J. Oakley, R. J. Devenish, M. Prescott, J. Rossjohn, The 2.0-Ä Crystal Structure of eqFP611, a Far Red Fluorescent Protein from the Sea Anemone Entacmaea quadricolor. Journal of Biological Chemistry, - 2003. - Vol. 278(45). - p. 4462644631.

74. J.N. Henderson, H.W. Ai, R.E. Campbell, S.J. Remington. Structural basis for reversible photobleaching of a green fluorescent protein homologue // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007 - Vol. 104(16) - p. 6672-7.

75. M. El Khatib, A. Martins, D Bourgeois, JP Colletier, V Adam. Rational design of ultrastable and reversibly photoswitchable fluorescent proteins for super-resolution imaging of the bacterial periplasm // Scientific Reports. - 2016. - Vol.6 - p.18459.

76. N. Coquelle, M. Sliwa, J. Woodhouse, G. Schiro, V. Adam, A. Aquila, M.Weik. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography // Nature Chemistry. - 2017. - Vol. 10(1). - p. 31-37.

77. T., Brakemann, A. C., Stiel, G., Weber, M., Andresen, I., Testa, T. Grotjohann, S.Jakobs, A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching // Nature Biotechnology. - 2011. - Vol. 29(10). - p. 942-947.

78. M., Byrdin, C., Duan, D., Bourgeois, & K. Brettel, A Long-Lived Triplet State Is the Entrance Gateway to Oxidative Photochemistry in Green Fluorescent Proteins // Journal of the American Chemical Society. - 2018. - Vol. 140(8). - p. 2897-2905.

79. A. Roy, M. J. Field, V. Adam, D. Bourgeois. The Nature of Transient Dark States in a Photoactivatable Fluorescent Protein // JACS. -2011. - Vol. 133(46). - p. 18586-18589.

80. M.E. Bulina, DM. Chudakov, O.V. Britanova, Y.G. Yanushevich, D.B. Staroverov, TV Chepurnykh, EM Merzlyak, MA Shkrob, SA Lukyanov, KA Lukyanov. A genetically encoded photosensitizer // Nature Biotechnology. - 2006. - Vol. 24(1). - p. 95-9.

81. M. F. Garcia-Parajo, G. M. J. Segers-Nolten, J.-A. Veerman, J. Greve, and N. F. van Hulst Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2000. - Vol. 97(13). - p. 72377242.

82. T. Ha and P. Tinnefeld Photophysics of Fluorescence Probes for Single Molecule Biophysics and Super-Resolution Imaging // Annual Review of Physical Chemistry. - 2012. Vol. 63. - P. 595617.

83. M.B. Elowitz, M.G. Surette, P.-E. Wolf, J. Stockand S. Leibler. Photoactivation turns green fluorescent protein red // Current Biology. - 1997 - Vol. 7(10). - p. 809-12.

84. KE Sawin, P. Nurse Photoactivation of green fluorescent protein // Current Biology - 1997. -Vol. 7(10). - p. 606-7.

85. A. M., Bogdanov, A. S., Mishin, I. V., Yampolsky, V. V., Belousov, D. M., Chudakov, F. V. Subach, K. A. Lukyanov. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors // Nature Chemical Biology. - 2009. - Vol. 5(7). - p. 459-461.

86. DM Chudakov, VV Verkhusha, DB Staroverov, EA Souslova, S Lukyanov, KA Lukyanov. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nature Biotechnology. - 2004. -Vol. 22(11). - p. 1435-9.

87. DM Chudakov, S Lukyanov, KA Lukyanov. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2 // Nature Protocols. - 2007. - Vol. 2(8). - p. 2024-32.

88. JJ van Thor, T Gensch, KJ Hellingwerf, LN Johnson. Phototransformation of green fluorescent protein with UV and visible light leads to decarboxylation of glutamate 222 // Nature Structural Biology. - 2002. - Vol.9(1). - p.37-41.

89. GH Patterson, J. Lippincott-Schwartz A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells // Science. - 2002. - Vol. 297(5588). - p. 1873-7.

90. V., Adam, B., Moeyaert, C. C., David, H., Mizuno, M., Lelimousin, P., Dedecker, J.Hofkens Rational Design of Photoconvertible and Biphotochromic Fluorescent Proteins for Advanced Microscopy Applications // Chemistry & Biology. - 2011. - Vol. 18(10). - p. 1241-1251.

91. D. BourgeoisDeciphering Structural Photophysics of Fluorescent Proteins by Kinetic

Crystallography // International Journal of Molecular Sciences. - 2017. - Vol. 18(6). - p. 1187.

92

92. A. I. Chizhik, I. Gregor, B. Ernst, & J. Enderlein, Nanocavity-Based Determination of Absolute Values of Photoluminescence Quantum Yields // ChemPhysChem. - 2013. - Vol. 14. -p. 505-513

93. Г.Д. Лапшин, Л.М. Винокуров, А.П. Савицкий. Идентификация химически модифицированных аминокислотных остатков методом МАЛДИ // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 6

94. TJ Lambert, FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. -2019. - Vol. 16. - p. 277-278.

95. I. Hayashi, et al. Crystallographic evidence for water-assisted photo-induced peptide cleavage in the stony coral fluorescent protein Kaede // Journal of Molecular Biology. - 2007. - Vol. 372.

- p. 918-26.

96. G., Vâmosi, N., Mücke, G., Müller, J. W., Krieger, U., Curth, J., Langowski, & K.Toth, EGFP oligomers as natural fluorescence and hydrodynamic standards // Scientific Reports. - 2016. - Vol. 6(1).

97. M. Chattoraj, et al. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: Multiple states and proton transfer // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1996. - Vol. 93.

- p. 8362-8367.

98. M. Yoon, R. D. Moir, V. Prahlad & R. G. Goldman. Motile properties of vimentin intermediate filament networks in live cell. Journal of Cell Biology. - 1998. - Vol 143. - p. 147-157.

99. M. Andresen, M. C. Wahl, A. C. Stiel, F. Grater, L. V. Schafer, S. Trowitzsch, G. Weber, C. Eggeling, H. Grubmuller, S. W. Hell, and S. Jakobs. Structure and mechanism of the reversible photoswitch of a fluorescent protein // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2005.

- Vol. 102(37). - p. 13070-13074.

100. H. Mizuno, P. Dedecker, R. Ando, T. Fukano, J. Hofkens, and A. Miyawaki. Higher resolution in localization microscopy by slower switching of a photochromic protein // Photochemical & Photobiological Sciences. - 2010. - Vol. 9(2). - p. 239-248.

101. T. Roebroek, S. Duwé, W. Vandenberg, and P. Dedecker. Reduced fluorescent protein switching fatigue by binding-induced emissive state stabilization // International Journal of Molecular Sciences. - 2017. - Vol. 18(9). - p. 2015.

102. A. Rusanov, V. A. Mironov, A. S. Goryashenko, B. L. Grigorenko, A. V. Nemukhin, and A. P. Savitsky. Conformational partitioning in pH-induced fluorescence of the kindling fluorescent protein (KFP) // The Journal of Physical Chemistry B. - 2011. - Vol. 115(29). - p. 9195-9201 .

103. H. Ai, and R. Campbell. Teal fluorescent proteins: characterization of a reversibly photoswitchable variant // Proceedings of SPIE. - 2008 - p. 6868, 68680D.

104. A. Stiel, S. Trowitzsch, G. Weber, M. Andresen, C. Eggeling, S.W. Hell, S. Jakobs, and M.C. Wahl . 1.8 Â bright-state structure of the reversibly switchable fluorescent protein Dronpa guides the generation of fast switching variants // Biochemical Journal. - 2007. - Vol. 402(1). - p. 3542.

105. S. Habuchi, P. Dedecker, J. Hotta, C. Flors, R. Ando, H. Mizuno, A. Miyawaki, and J. Hofkens. Photoinduced protonation/ deprotonation in the GFP-like fluorescent protein Dronpa: mechanism responsible for the reversible photoswitching // Photochemical & Photobiological. Sciences - 2006. - Vol. 5(6). - p. 567-576.

106. X. He, A. Bell, and P. Tonge. Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore // FEBS Letters. - 2003. - Vol. 5491(1-3). - p. 35-38.

107. V. V. Zherdeva, N. I. Kazachkina, V. I. Shcheslavskiy, A. P. Savitsky. Long-term fluorescence lifetime imaging of a genetically encoded sensor for caspase-3 activity in mouse tumor xenografts // Journal of Biomedical Optics. - 2018. - Vol. 23(3). - p. 1.

108. R., Wang, & M. G. Brattain. The maximal size of protein to diffuse through the nuclear pore is larger than 60 kDa // FEBS Letters. - 2007. - Vol. 581(17). - p. 3164-3170.

109. S., Raut, J., Kimball, R., Fudala, H., Doan, B., Maliwal, N., Sabnis, Z.Gryczynski, A homodimeric BODIPY rotor as a fluorescent viscosity sensor for membrane-mimicking and cellular environments // Physical Chemistry Chemical Physics. - 2014. - Vol. 16(48). - p. 2703727042.

110. B. Moeyaert, N.N. Bich, E. De Zitter, S. Rocha, K. Clays, H. Mizuno, L. Van Meervelt, J. Hofkens, P. Dedecker, Green-to-Red Photoconvertible Dronpa Mutant for Multimodal Superresolution Fluorescence Microscopy // ACS Nano - 2014. - Vol. 8. - p. 1664-1673.

111. Z. W. Zhao, M. D. White, Y. D. Alvarez, J. Zenker, S. Bissiere, & N. Plachta, Quantifying transcription factor-DNA binding in single cells in vivo with photoactivatable fluorescence correlation spectroscopy // Nature Protocols. - 2017. - Vol. 12(7). - p. 1458-1471.

112. A. P. Singh, R. Galland, M. L. Finch-Edmondson, G. Grenci, J.-B. Sibarita, V. Studer, T. E. Saunders. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus // Biophysical Journal. - 2017. - Vol. 112(1). - p. 133-142.

Intensity (a.u.)

Intensity (a.u.)

Рисунок П1.1 Зависимости интенсивности флуоресценции красной формы фотоконвертируемых флуоресцентных белков от времени при различных значениях рН.

dendra2 V127T K145N K145E

pH И A У0 И k2 A У0 И k2 A У0 И k2 A У0

9,20 0,01 730 50,00 0,02 0,01 81 12,00 0,01 0,00 171 14,00 0,01 0,000 294 12,00

8,70 0,01 803 56,00 0,02 0,00 142 18,00 - - - - 0,01 0,001 390 12,00

8,34 0,01 802 42,00 0,01 0,01 174 25,00 0,01 0,00 245 4,00 0,01 0,002 374 23,00

7,98 0,01 900 40,00 0,02 0,01 182 23,00 0,01 0,00 400 2,00 0,03 0,005 443 17,00

7,54 0,01 1080 35,00 0,03 0,01 212 13,00 0,04 0,01 330 3,00 0,07 0,008 400 0,00

7,20 0,01 940 14,00 0,05 0,02 190 20,00 0,10 0,01 230 2,00 0,13 0,020 264 34,00

7,03 0,01 1080 30,00 0,06 0,02 205 19,00 0,10 0,01 260 0,00 0,16 0,022 230 39,00

6,56 0,02 1050 37,00 0,16 0,04 160 22,00 0,26 0,02 130 25,00 0,36 0,037 151 22,00

5,96 0,03 990 0,00 0,50 0,07 92 19,00 0,64 0,04 100 10,00 0,53 0,078 160 18,00

5,68 0,03 950 0,00 0,57 0,06 71 19,00 0,68 0,05 80 9,00 0,62 0,074 140 15,00

5,28 0,03 956 0,00 0,50 0,08 91 18,00 0,80 0,06 92 9,00 0,72 0,110 164 13,00

4,84 0,03 960 2,00 0,70 0,08 66 17,00 -- 0,09 104 7,00 -- 0,110 134 9,00

4,54 0,02 1000 0,00 0,70 0,09 53 15,00 0,09 83 8,00 0,70 0,110 150 10,00

4,36 0,03 880 3,00 0,70 0,08 49 15,00 0,80 0,11 87 8,00 -- 0,110 77 7,00

К149М WT

РН к1 k2 A У0 k2 A У0 ^ k2 A у0

9,20 0,01 0,00 100,00 25,00 0,02 0,00 197,00 10,00 0,01 0,00 81,00 20,00

8,70 0,01 0,00 120,00 14,00 0,02 0,01 205,00 7,00 0,01 0,00 141,00 23,00

8,34 0,01 0,00 127,00 16,00 0,04 0,01 214,00 7,00 0,02 0,00 182,00 18,00

7,98 0,01 0,00 330,00 16,00 0,08 0,01 192,00 18,00 0,01 0,00 300,00 18,00

7,54 0,03 0,01 270,00 10,00 0,24 0,02 113,00 23,00 0,03 0,00 370,00 14,00

7,20 0,09 0,01 181,00 6,00 0,31 0,03 85,00 22,00 0,08 0,00 250,00 7,00

7,03 0,14 0,01 141,00 17,00 0,46 0,02 64,00 18,00 0,08 0,05 280,00 5,00

6,56 0,29 0,02 101,00 22,00 - 0,03 39,00 15,00 0,24 0,01 180,00 0,00

5,96 0,52 0,06 80,00 20,00 0,80 0,08 43,00 12,00 0,56 0,02 150,00 20,00

5,68 0,97 0,06 65,00 14,00 0,07 32,00 10,00 0,42 0,04 160,00 14,00

5,28 0,60 0,08 63,00 10,00 0,05 22,00 9,00 0,59 0,06 150,00 10,00

4,84 0,70 0,09 64,00 6,00 1,60 0,07 29,00 7,00 0,64 0,09 160,00 9,00

4,54 0,60 0,08 48,00 5,00 1,10 0,14 22,00 8,00 0,28 0,11 150,00 --

4,36 0,67 0,15 60,00 6,00 0,90 0,13 20,00 9,00 1,35 0,11 140,00 5,00

Значения параметров кинетик фотоконверсии при различных значениях рН рассчитанных по уравнению 7

[Н+]

[Н+]

[Н+]

0,10-1

H

V127T

pK1~6.2(0.1)

1E-J

1E-I

TFTT|-

1E-4

[Hi

Dendra2

0,03 n

0,02

0,01 -\

B

- CopyOfHyperbl (Usei

»„del CopyOfHyperbl (User)

Equation y = P1*xAn/(P2 + x"n)+yO

Reduced Chi-Sqr

Adj. R-Square 0,96086

Value Standard Error

B P1 0,02066 0,00116

B P2 1.52772E-7 4.22237E-8

B n 1 0

B yO 0,0058 9.42348E-4

0,00 ......

1E-9

ttti]-

1E-8

-nri!-

1E-7

-nri!-

1E-6

1E-5

1E-4

[Ю

Рисунок П1.2 Зависимости констант фотопревращений от рН и их анализ по уравнению 5

Приложение 2 БС8 в клетках ИеЬа

Рисунок П2.1. Конфокальные флуоресцентные изображения клеток ИеЬа в красном канале транссфицированных А) свободным У127Т 8АА8ой Б) 8АА8ой-23-КРР В) 8АА8ой-23-КРР при индукции апоптоза. На рисунке отмечены точки проведения измерений БС8 и значения времен удерживания в фокальном объеме для данных точек. Цвет соответствует значению времени диффузии соотвественно шкале под изображениями. Желтым обозначены точки, в которых не наблюдалось корреляционной кривой.

ißt-I

Intensity Image [Cnts] П 334

I 0

Average Lifetime [ns]

в;

Intensity Image [Cnts] □ 800

Average Lifetime [ns]

Intensity Image [Cnts]

g 1861

Average Lifetime [ns]

Рисунок П2.2 БЫМ изображения, представляющие распределния времен жизни флуоресценции красной формы БААБой в цветовой шкале клеток НеЬа трансфицированных А) свободным У127Т БААБой Б) 8АА8ой-23-КРР В) 8АА8ой-23-КРР при добавлении стауроспорина, где у одной из клеток наблюдается апоптоз и гидролиз сенсора.

Нормализованные кривые

Рисунок П2.3 Корреляционной кривой при разных мощностях возбуждающего света. Оранжевый - полная мощность лазерного источника, синий - 1/10 мощности А) исходные кривые Б) нормализованные по 0(0).

Рисунок П2.4 Времена диффузии, определенные для одной и той же клетки с разной мощностью возбуждающего света для свободного У127Т БААБой. Слева 1/10 мощности лазера, справа полная мощность возбуждаемого лазера.

ыш 141

360 300 250 200 150 100 50

Lag Time [ms]

Рисунок П2.5 Расчет параметров диффузии зеленой формы V127T SAASoti в PBS pH 7.4 методом FCS. Фитинг проводили с использованием триплетной модели время удерживания в фокальном объеме составило 0,26±0,07мс и время жизни «триплетного» состояния 0,07±0,06мс.

Рисунок П2.6 Пример расчета параметров диффузии красной формы свободного V127T SAASoti внутри клетки HeLa. Фитинг проводили с использованием модели время удерживания в фокальном объеме составило 0,26±0,07мс и время жизни «триплетного» состояния 0,07±0,06мс.

Рисунок П2.7 Пример расчета параметров диффузии красной формы V127T SAASoti в составе сенсора SAASoti-23KFP внутри клетки HeLa. Фитинг проводили с использованием триплетной модели время удерживания в фокальном объеме составило 1,1 мс и время жизни «триплетного» состояния 0,08мс.

Рисунок П2.8 Пример расчета параметров диффузии красной формы V127T SAASoti в составе сенсора SAASoti-23KFP внутри клетки HeLa при запуске апоптоза и увеличении среднего времени жизни флуоресценции сенсора. Фитинг проводили с использованием триплетной модели время удерживания в фокальном объеме составило 2,2 мс и время жизни «триплетного» состояния 0,12 мс.