Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Нескородов, Ярослав Борисович

• Нескородов, Ярослав Борисович
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Нескородов, Ярослав Борисович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ И ТАБЛИЦ.

ВВЕДЕНИЕ.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Краткая история культуры подсолнечника и его систематическое положение.

1.2 Этапы генетической модификации подсолнечника.

1.2.1 Выбор генотипа подсолнечника для последующей работы.

1.2.2 Получение асептического растительного материала.

1.2.3 Культивирование эксплантов подсолнечника в условиях in vitro.

1.2.4 Генетическая трансформация подсолнечника.

1.2.5 Канамицин как селективный агент.

1.2.6 Фосфинотрицин как селективный агент.

1.3 Некоторые направления биотехнологии подсолнечника в мире.

1.3.1 Подсолнечник, устойчивый к абиотическим стрессам.

1.3.2 Подсолнечник, как продуцент.

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.4 Использованные генотипы подсолнечника.

2.5 Получение асептического растительного материала.

2.5.1 Способ стерилизации №1.

2.5.2 Способ стерилизации №2.

2.5.3 Определение качества семян подсолнечника.

2.6 Условия культивирования растений iп vitro.

2.6.1 Состав питательных сред для культивирования растений.

2.6.2 Состав питательных сред для культивирования бактерий.

2.6.3 Способ получения эксплантов для регенерации №1.

2.6.4 Способ получения эксплантов для регенерации №2.

2.7 Процедура генетической трансформации эксплантов подсолнечника

2.7.1 Определение летальной концентрации РРТ для подсолнечника in vitro.

2.7.2 Использованные антибиотики.

2.7.3 Селективный отбор трансформантов.

2.7.4 Метод прививки и адаптация растеиий-регенерантов к условиям теплицы.

2.7.5 Отбор растений, устойчивых к действию гербицида.

2.7.6 Определение уровня устойчивости трансгенных растений к действию фисфинотрицина.

2.8 Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений.

2.8.1 Параметры ПЦР-анализа гена bar.

2.8.2 Параметры ПЦР-анализа v/r-генов Ágrobacterium tiimefaciens.

2.8.3 Параметры блот-гибридизации.

2.8.4 Определение экспрессии гена bar.

2.8.5 Определение компетентности эксплантов к заражению A. tumefaciens.

2.8.6 Электорофоретический анализ.

2.9 Статистическая обработка данных.

2.9.1 Дисперсионный анализ.

2.9.2 Наименьшая существенная разница.

2.10 Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.11 Микроскопы и другое оборудование.

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Получение стерильного растительного материала.

3.2 Экспресс-метод оценки жизнеспособности семян подсолнечника.

3.3 Влияние типа экспланта и генотипа на частоту регенерации побегов in vitro

3.3.1 Способ получения эксплантов № 1.

3.3.2 Способ получения эксплантов № 2.

3.3.3 Сравнение эффективности 2-х способов.

3.4 Генетическая трансформация эксплантов, полученных способом №2.

3.4.1 Индукция множественного побегообразования.

3.4.2 Регенерация экспланта и его генетическая трансформация.

3.5 Получение канамицин-устойчивых ГМ растений подсолнечника.

3.6 Получение фосфинотрицин-устойчивых ГМ растений подсолнечника

IV ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка эффективной системы регенерации подсолнечника (Helianthus annuus L.) in vitro для получения трансгенных растений»

Актуальность работы

Подсолнечник (Helianthus annuus L.), совместно с соей (Glycine max (L) Merrill) и рапсом (Brassica napus L.) является одной из трёх важнейших масличных культур мира. В настоящее время Россия занимает лидирующие позиции в мире в области выращивания и переработки данной культуры [1]. Генетическая модификация подсолнечника позволит решить широкий круг фундаментальных научных вопросов. Таких, например, как изучение регуляции генов сложноцветных, ответственных за формирование соцветия. Предполагается, что изменения в подобных генах (ответственных за контроль развития) может быть главной причиной морфологических преобразований в процессе эволюции [2] и с этой точки зрения изучения сложноцветных представляет большой интерес, так как они являются вершиной эволюции цветковых растений. Подобная задача была успешно решена на таком модельном объекте семейства крестоцветных, как резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana), изучение гомеозисных мутантов которой позволило в 1991 году построить модель контроля органогенеза цветка (ABC-модель) [3], однако для сложноцветных коллекция подобных мутантов ещё не создана и процессы их генетического контроля высоко консервативных механизмов развития цветка ещё только предстоит выяснить. Данная проблема может быть эффективно исследована через получение трансгенных растений. Посредством генетической трансформации в геном подсолнечника могут быть искусственно внесены либо маркерные гены, выявляющее тот или иной процесс, либо изменена (усилена или уменьшена) активность родных генов.

Также генетическая трансформация подсолнечника может представлять большой практический интерес, так как в данной культуре наблюдается низкое разнообразие ценных сельскохозяйственных признаков, что делает процесс селекции всё более трудоёмким и малоэффективным. К тому же методами традиционной селекции получить многие востребованные признаки либо чрезвычайно сложно, либо вообще невозможно. К таким признакам можно отнести устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам (например - устойчивость к неселективным гербицидам).

Известно, что в посевах подсолнечника могут произрастать более 20-ти видов сорных растений [на стр. 80] [4]. Притом, что подсолнечник обладает сравнительно высокой конкурентной способностью по отношению к сорнякам, тем не менее, потери от засорения полей сорняками могут достигать 40 %.

Сорная растительность на полях является хорошей средой обитания таких опасных вредителей, как, например, жук-фитофаг щелкун кубанский (Agriotes litigiosus Rossi), от деятельности которого могут быть потеряны до 100 % урожая [5].

В настоящее время, для борьбы с сорняками в посевах подсолнечника, применяют препараты на основе трифлюралина (Трефлан®, Трифлюрекс0), прометрина (Гезагард®), S-метолахлора (Дуал Голд®) и пендиметалина

Стомп ). Данные препараты достаточно эффективны, однако они обладают высокой токсичностью для людей и окружающей среды [6,7,8,9], что создаёт серьёзные трудности в их применении и хранении [Таблица 1]. К тому же, перечисленные препараты плохо поддаются биологическому распаду, что приводит к токсическому засорению почв и водоёмов. Например, в 2006 г. было проведено обследование почвы вокруг мест складирования и захоронения пестицидов. Пробы почвы отбирали в районе склада ГУП «Сельхозхимия» Аткарского р-на Саратовской области и в р-не «Областного пункта захоронения пестицидов» в Хворостянском р-не Самарской области. В пробах почвы обнаружены ХОП - ДДТ, ДДЕ и гербициды Трефлан® и 2,4-Д [10].

Также почвы, загрязненные остаточным количеством гербицида Трефлана® на уровне 1,9 ОДК, обнаружены в Самарской области (Ставропольский р-н ЗАО «Луначарск») [10].

Перечисленных выше недостатков (высокая токсичность и медленный распад) лишены гербициды, действующим веществом которых является фосфинотрицин, способный к быстрому и полному распаду в окружающей среде.

Мы полагаем, что создание генетически модифицированных растений подсолнечника, обладающих устойчивостью к гербицидам на основе фосфинотрицина (глюфосината) [11], позволит отказаться от использования экологически небезопасных гербицидов. Учитывая преимущества данного типа гербицидов, в сравнении с употребляемыми ранее, в 2007 году уже была озвучена идея о необходимости получения подсолнечника подобного типа [12], однако к настоящему времени подобных растений получено не было.

Таблица 1 Используемые гербициды с точки зрения безопасности использования

Гербицид Опасность для здоровья Опасность для окружающей среды в аварийных ситуациях (Утечка) Воспламеняемость

Дуал Голд Может вызвать сенсибилизацию при попадании на кожу. Очень токсично для водорослей. Очень токсично для рыб. Вредно для дафний. Очень токсично для пчёл. Легко воспламеняющееся вещество.

STOMP Вреден для здоровья при проглатывании. Раздражает глаза и кожу. Очень токсичен для водных организмов, в водоёмах может в течение длительного времени оказывать вредное воздействие. Легко воспламеняющееся вещество.

TREFLAN 48 HERBICIDE Вреден для здоровья при проглатывании. Раздражает глаза и кожу. Очень токсичен для водных организмов. Легко воспламеняющееся вещество.

Гезагард 50 WP Вреден для здоровья при проглатывании. Раздражает глаза и кожу. Очень токсичен для водных организмов. Легко воспламеняющееся вещество.

Несмотря на тот факт, что Agrobacterium tumefaciens (Smith and Townsend) Conn является давно описанным естественным патогеном подсолнечника, тем не менее, процесс генетической трансформации данной культуры остаётся малоэффективным и трудоёмким.

При генетической трансформации подсолнечника наиболее сложным этапом, «бутылочным горлышком» всего процесса, является индукция регенерации эксплантов и их селекция в культуре in vitro. Связано это с тем, что экспланты подсолнечника сравнительно легко формируют каллус, который, при правильном подборе условий культивирования, можно получить уже к концу второй недели, однако задача эффективного перевода ткани от каллусогенеза в сторону органогенеза всё ещё не решена.

Также существует проблема эффективного отбора генетически трансформированных клеток экспланта в процессе селекции. К настоящему времени все описанные в литературе трансгенные растений подсолнечника были получены с использованием антибиотика канамицина (Канатуcinum), который использовался в качестве селективного агента. Однако было отмечено, что при использовании данного препарата не происходит эффективный отбор клеток и получаемые растения-регенеранты (Т0) во всех описанных случаях получались химерными, а часть из них вообще были ложными трансформантами, сформировавшими устойчивость к канамицину неясной природы.

Также было отмечено ингибирующее действие канамицина на процесс эмбриогенеза подсолнечника в культуре in vitro. Ещё в 1987 году [109], когда впервые был получен трансгенный подсолнечник, авторы высказывали идею о необходимости поиска альтернативных канамицину селективных агентов, однако к настоящему моменту все опубликованные исследования выполнены с использованием антибиотиков аминогликозидной группы [Таблица 6 и Таблица 7].

В свете описанной проблемы мы полагаем, что использование фосфинотрицина при селекции клеток подсолнечника in vitro представляет большой интерес.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение регенерационной компетентности сортов подсолнечника (Helianthus annuus L.) отечественной селекции и создание трансгенных линий, с использованием селективного гена bar.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Определить для каждого из исследуемых генотипов тип эксплантата с целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации.

2. Определить компетентность к агробактериальной трансформации выбранного экспланта подсолнечника, используя для оценки маркерный ген uidA (GUS).

3. Получить трансгенные растения подсолнечника, несущие ген bar, обуславливающий устойчивость к фосфинотрицину (действующему веществу гербицида Баста) и определить наличие экспрессии данного гена.

4. Оценить устойчивость полученных трансгенных линий к действию гербицида Баста в поколениях.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов

1. Разработана эффективная система стерилизации семян подсолнечника, позволяющая получать 100% стерильных семян со 100% всхожестью, что позволяет проводить их массовое проращивание в культуре in vitro\

2. Разработан экспресс-метод оценки качества семян подсолнечника, который может быть использован как в производстве, так и в лабораторных условиях;

3. Разработан высокоэффективный метод регенерации подсолнечника in vitro, в котором в качестве источников эксплантов используются зрелые зародыши (семена). Метод позволяет получать с одного семени подсолнечника четыре экспланта с высоким регенерационным потенциалом.

Частота регенерации побегов на данном типе экспланта составила от 83,5 до 90,3 %;

4. Разработан эффективный способ индукции множественного побегообразования подсолнечника in vitro, основанный на удалении основного побега экспланта, что позволило индуцировать развитие от 2-х и более побегов на эксплант с частотой 78 %. На настоящий момент - это наиболее эффективный способ регенерации эксплантов подсолнечника. Разработанный способ индукции множественной регенерации побегов может быть использован при клональном микроразмножении ценного материала;

5. Были определены параметры селекции клеток подсолнечника in vitro с использованием фосфинотрицина в качестве селективного агента. Было показано, что фосфинотрицин может эффективно применяться в селекции как в условиях in vitro, так и in planta;

6. Впервые получены трансгенные растения подсолнечника, экспрессирующие ген bar, и показана их высокая устойчивость к фосфинотрицину in vitro (200 мг/л) и гербициду Баста (3 л/га) в условиях теплицы;

7. Полученные трансгенные образцы подсолнечника, устойчивые к действию фосфинотрицина, являются ценным исходным материалом и, в дальнейшем, могут служить донорами устойчивости при селекции новых сортов и гибридов;

8. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений подсолнечника с другими хозяйственно-ценными генами.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на IX Международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященному 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); на Ist

Workshop on plant molecular biotechnology XV biotechnology summer school (Gdansk. Poland, 2009); на II международной научной конференции «Генетически модифицированные (биотехнологические) растения: перспективы использования и проблемы биобезопасности» (Киев, Украина, 2009); на 8ТН European sunflower biotechnology conference SUNBIO 2010 (Antalya, Turkey, 2010).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Я.Б. Нескородов, Я.В. Мишуткина, А.К. Гапоненко, К.Г. Скрябин. Метод регенерации in vitro побегов подсолнечника (Helianthus annuus L.) из асептических семян, как эксплантатов для генетической трансформации. 2007. Биотехнология. Т 6: 27-33.

2. Я.Б. Нескородов, К.Г. Скрябин. Индукция множественного побегообразования у эксплантов подсолнечника (Helianthus annuus L.) в культуре in vitro. 2009. Масличные культуры. Вып. 2 (141), с. 6-10.

3. Ya.B. Neskorodov, A.L. Rakitin, A.M. Kamionskaya, K.G. Skryabin. Developing phosphinothricin-resistant transgenic sunflower {Helianthus annuus L.) plants. 2009. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 100:65-71.

4. Ya.B. Neskorodov, A.M. Kamionskaya, K.G. Skryabin. Agrobacterium-mediated transformation of sunflower (Helianthus annuus L.) using direct shoot regeneration protocol. Sunflowers: cultivation, nutrition, and biodiesel uses. 2010. Editors: Victor C. Hughes.c. 1-37. NOVA publishers. ISBN: 978-1-61209-325-3 2011

Тезисы докладов

1. А.К Гапоненко, В.С.Фадеев, А.Н. Маркеев, Я.Б. Нескородов «Модификация и моделирование метаболических путей в трансгенных растениях». Материалы III Всероссийского научного конгресса генетиков и селекционеров. Москва, 2004. С. 473.

2. Я.Б. Нескородов, А.К. Гапоненко. «Регенерация подсолнечника in vitro». Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». Москва, 2005. С. 197.

3. Я.Б. Нескородов, А.К. Гапоненко. «Определение оптимальной концентрации селективного антибиотика для селекции in vitro трансгенных растений подсолнечника». Материалы 1(1Х) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург. 2006. С. 176.

4. Я.Б. Нескородов. Генетическая трансформация подсолнечника {Helianthus annuus L.). IX Международная конференция «Биология клеток in vitro и биотехнология». 2008. Звенигород. С.21 в.

5. Я.Б. Нескородов. Генетическая трансформация подсолнечника (Helianthus anmius L.) геном bar. Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина. V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 2009. с. 380.

6. Ya.B. Neskorodov. "Regeneration and genetic transformation of Russian sunflower cultivars and production of herbicide-resistant plants". 1st Workshop on plant molecular biotechnology XV biotechnology summer school. 2009. Gdansk. Poland.

7. Я.Б. Нескородов. «Генетическая трансформация подсолнечника {Helianthus annuus L.) сортов российской селекции». II международная научная конференция «Генетически модифицированные (биотехнологические) растения: перспективы использования и проблемы биобезопасности». Киев, Украина, 2009.

8. Ya.B. Neskorodov, K.G. Skryabin Regeneration and genetic transformation of Russian sunflower cultivars and production of herbicide-resistant plants.

TH

SUNBIO 2010. 8 European sunflower biotechnology conference. Antalya, Turkey, p.36.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

При работе с настоящим обзором литературы, посвященной проблеме регенерации эксплантов подсолнечника в культуре in vitro и генетической трансформации этой культуры, используя систему взаимных ссылок, удалось объединить подавляющее большинство опубликованных англоязычных и отечественных работ по данной тематике.

К сожалению, в настоящий обзор не вошло несколько публикаций, ссылки на которые встречаются в некоторых статьях, так как не удалось обнаружить ни электронные копии данных публикаций, ни оригиналы изданий. Однако, основываясь на том факте, что другие авторы единично ссылаются на отсутствующие в данном обзоре публикации, можно предположить, что изложенные в них результаты могут внести небольшие коррективы в некоторых разделах настоящего обзора, оставив без изменения материал в целом [Приложение 1].

В настоящем обзоре целенаправленно не рассмотрена тема получения и культивирования протопластов подсолнечника, так как это направление непосредственно не связано с темой настоящей работы, хотя и базируется на технике культивирования клеток этого растения in vitro.

Также, в настоящем обзоре не учтены работы, проводимые по исследуемой теме в различных коммерческих компаниях, таких как «Pioneer», «Monsanto» и других крупных производителей сельскохозяйственной продукции, которые не публикуют результаты собственных исследований в открытой печати и все упоминания в настоящем обзоре о проводимых ими исследований почерпнуты из косвенных источников (таких как тезисы конференций, справочники и т.п.).

Термин «биотехнология» был придуман и предложен в 1917 венгерским инженером Карлом Эреки, который использовал его для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свёклы [13]. Однако в настоящее время этот термин используется в значительно более расширенной трактовке. Сам автор термина давал следующее определение - это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». В настоящее время биотехнология представляет собой научную дисциплину являющеюся пограничной между биологией и техникой.

В узком смысле биотехнология - совокупность методов и приемов создания полезных для человека продуктов и явлений с помощью биологических агентов. В состав биотехнологии входят генная, клеточная и экологическая инженерии.

Поскольку биотехнология используется в различных отраслях промышленности и затрагивает многие сферы жизни человека, в мире была принято решение о классификации направлений в этой области деятельности и введена следующая «цветовая» классификация:

1. «красная» биотехнология — биотехнология, связанная с обеспечением здоровья человека и потенциальной коррекцией его генома, а также с производством биофармацевтических препаратов (протеинов, ферментов, антител);

2. «зеленая» биотехнология - направлена на разработку и создание генетически модифицированных (ГМ) растений, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, определяет современные методы ведения сельского и лесного хозяйства;

3. «белая» - промышленная биотехнология, объединяющая производство биотоплива, биотехнологии в пищевой, химической и нефтеперерабатывающей промышленности;

4. «серая» - связана с природоохранной деятельностью, биоремедиацией;

5. «синяя» биотехнология - связана с использованием морских организмов и сырьевых ресурсов [14].

Настоящая работа относится к области «зелёной» биотехнологии, методы которой за последние 10 лет стали широко применяться в сельском хозяйстве. По данным Международной службы по внедрению сельскохозяйственной биотехнологии (18ААА) суммарная площадь генетически модифицированных культур в 2008 году превысила 800 млн. га. Из 25 стран (55 % населения Земли), выращивающих подобные культуры, -10 стран являются развитыми, а 15 - развивающимися [15].

К сожалению, по причинам разного характера, Российская Федерация, на данный момент существенно отстаёт в этом направлении от ведущих стран. Отставание столь значительное, что, по оценкам 18ААА, только через 10 лет интенсивного развития агробиотехнологии, в России смогут быть сформированы серьезные предпосылки для того, чтобы в последующие годы оказывать конкуренцию лидирующим в этой отрасли странам, а российские разработки соответствовать мировому уровню и занять свое место на рынке биотехнологических культур. Глобальная стоимость этого рынка в 2008 году составила 7.5 млрд. долл. США [15].

По оценкам экспертов Общества биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова и Союза предприятий биотехнологической отрасли широкое использование биотехнологий в сельском хозяйстве РФ позволит решать следующие проблемы и добиться следующих результатов [14]:

1. увеличить производительности в отрасли (увеличение урожайности, в том числе путем проявления устойчивости растений к вредителям);

2. получить растения, устойчивые к вирусным, грибковым и бактериальным болезням, с улучшенными качественными характеристиками;

3. уменьшить использование пестицидов и гербицидов (экологические и экономические выгоды);

4. сократить выброс углекислого газа (сокращение выброса благодаря биотехнологическим с/х культурам в 2007 году, по данным 18ААА, составило 14.2 млрд. кг С02);

5. сохранить и увеличить биоразнообразие (в том числе путем использования меньшей площади сельскохозяйственных земель);

6. предотвратить эрозию почв (за счет перехода на метод обработки почвы, не требующий вспахивания).

Прогнозируется, что подобная модернизация сельского хозяйства должна дать положительный социально-экономический эффект, который будет заключаться как в улучшении уровня благосостояния работников сельскохозяйственного направления и улучшении здоровья потребителей за счет снижения содержания в потребляемых продуктах пестицидов, инсектицидов и прочих вредных химикатов, так и в снижении загрязнённости воды, воздуха и почвы.

Вопреки существующему стабильному негативному отношению общества к идее использования ГМ растений, в настоящее время в России уже созданы генетически модифицированные сорта таких важных для отечественного сельского хозяйства культур, как картофель, устойчивый к колорадскому жуку [16] и сахарная свёкла, устойчивая к фосфинотрицину [17]. Есть публикации, сообщающие о получении генетически модифицированной пшенице, льне, томатах и некоторых плодовых деревьев.

Несмотря на большое значение подсолнечника для России, отечественное направление исследований в области генетической модификации этой культуры развито слабо. К настоящему времени генетически модифицированных растений подсолнечника отечественным авторами получено не было, а имеющиеся публикации посвящены одной из проблем всего процесса, а именно — регенерацию эксплантов в культуре in vitro [18, 19, 20, 21 22, 23, 24, 25]. Первая публикация была выпущена в 1987 году, а последняя - 1995. Подобное положение дел нельзя назвать удовлетворительным, потому как результаты работы, выполненной иностранными исследователями, в которой впервые упоминается подсолнечник, культивируемый in vitro, были опубликованы ещё в 1923 году [26].

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Нескородов, Ярослав Борисович

1УВЫВОДЫ

1. Показано, что заражённые семена подсолнечника изменяют цвет при взаимодействии с раствором гипохлорита натрия. Это позволило разработать эффективную систему стерилизации семян, позволяющую получать стерильные семена со 100%-ным результатом, и экспресс-метод оценки качества семян подсолнечника, который может быть использован как в производстве, так и в лабораторных условиях;

2. Разработан высокоэффективный метод регенерации подсолнечника in vitro, использующий в качестве источников эксплантов зрелые зародыши (семена). Метод позволяет получать из одного семени подсолнечника 4 экспланта с высоким регенерационным потенциалом. Частота регенерации побегов на полученных эксплантах составила 83,5 % - 90,3 %. Произведено сравнение разработанного нами метода с методом, использующим в качестве источников эксплантов проростки на стадии первых листьев. Частота регенерации побегов по разработанной нами методике была выше в 5-6 раз. Разработанный нами способ регенерации побегов не зависит от генотипа используемого растения. Применение в процедуре агробактериальной трансформации данного типа экспланта позволило получить трансгенные растения подсолнечника;

3. Разработан эффективный способ индукции множественного побегообразования у эксплантов подсолнечника, основанный на удалении первого регенерирующего побега экспланта. Он позволяет получать от 2-х и более побегов на эксплант с частотой 78 %. На настоящий момент - это наиболее эффективный способ регенерации эксплантов подсолнечника;

4. Впервые получены трансгенные растения подсолнечника, несущие ген bar и обладающие высокой устойчивостью к действию фосфинотрицина in vitro (200 мг/л) и гербициду Баста (3 л/га) в условиях теплицы;

5. Показано, что фосфинотрицин может эффективно применяться при селекции подсолнечника как на уровне клеток in vitro, так и in planta.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Нескородов, Ярослав Борисович, 2011 год

1. Theissen G., Saedler H. MADS-box genes in plant ontogeny and phylogeny: Haeckel's 'biogenetic law' revisited. 1995. Curr Opin Genet Dev 5: 628-639.

2. Coen E.S., Meyerowitz E.M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. 1991. Nature. Vol.353. 31-37

3. Лукомец B.M., Пивень B.T., Тишков H.M., Шуляк И.И. Защита подсолнечникаю. 2008.

4. Защита и карантин растений. №2. 78(2)-96(20)

5. Михальцов В.П., Воблов А.П. Как снизить численность проволочников. Защита и карантин растений. 1998. №4. с. 55-56.

6. Инструкция по технике безопасности. Дуал Гол 960 ЕС. 2001. Syngenta.

7. Инструкция по технике безопасности. Гезагард 50 WP. 2001. Syngenta.

8. Паспорт безопасности. STOMP. 2006. BASF.

9. Карта данных по безопасности. Treflan 48 herbicide. 1994. Dow AgroSciences.

10. Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды. Обзор загрязнения природной среды в российской федерации за 2006 г. Москва.

11. Basta® Non-Selective Herbicide. Material safety data sheet. 2007. Bayer Cropscience. 1-6 p.

12. Cantamutto M, Poverene M. Genetically modified sunflower release: Opportunities and risks.2007. Field Crops Research. 133-144

13. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Москва. Мир. 2002.

14. Общество биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова. Союз предприятий биотехнологической отрасли. Рабочие материалы к стратегии развития биотехнологической отрасли промышленности до 2020 года (проект). 2009. Москва.

15. Международная служба по внедрению агробиотехнологических разработок (ISAAA).2008. Обзор № 39. Найроби, Кения.

16. Патент на изобретение №2231551 от 27 июня 2004. Стародубцева (Камионская) A.M., Белоусова М.Б., Конов A.JL, Скрябин К.Г. Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Голубизна с помощью Agrobacterium tumefaciens.

17. Мишуткина Я.В., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений сахарной свеклы, экспрессирующих ген bar. Прикладная биохимия и микробиология. 2010, т. 46. № 1: 80-86.

18. Антонова Т.С., Маляровская В.И. Индукция адвентивных побегов в культуре апикальных меристем подсолнечника. 1987. Научно-технический бюллетень Всесоюзного научно-исследовательского института масличных культур.вып. 4 (99).

19. Антонова Т.С., Боровков А.Ю., Зезуль Т.Г., Краснянский С.Ф. Прямой соматический эмбриогенез из семядолей зрелых и незрелых зародышей подсолнечника. 1988. НТБ ВНИИМК. 4(103) 16-21.

20. Пушкаренко А.Я., Игнатова С.А., Лукьяшок С.Ф. Культура незрелых зародышей подсолнечника in vitro. 1988. ВСГИ (сборник научных трудов). 72-76.

21. Пушкаренко А.Я. Игнатова С.А., Лукьянюк С.Ф. Влияние эндогенных фенолов на индукцию каллусообразования и регенерацию in vitro у подсолнечника. 1989. НТБ ВСГИ. Т. 1. с. 36-42

22. Зезуль Т.Г., Антонова Т.С., Боровков А.Ю. Регенерационная способность каллуса из гипокотилей проростков различных генотипов подсолнечника. НТБ ВНИИМК. 1990. Вып. 2(109). С.3-7.

23. Ульянов А.Н. Каллусообразование у двух генотипов подсолнечника. 1990. НТБ ВНИИМК. 2(109) 8-10

24. Антонова Т.С., Краснянский С.Ф., Челюстникова Т.А., Зезуль Т.Г. Соматический эмбриогенез в каллусе из семядолей незрелых зародышей подсолнечника. 1991. Доклады ВАСХНИЛ. №4: 9-13

25. Зезуль Т. Г., Горбатенко Э.В., Ралдугина Г.Н. Регенерация in vitro растений подсолнечника (Helianthus annuus L.) через соматический эмбриогенез. 1995. Генетика. Том 31, №2, с. 228-233

26. Robbins J. Wm., Maneval W.E. Further experiments on growth of excised root tips under sterile conditions. 1923. Botanical Gazette.Vol.76, No.3. pp.274-287.

27. Тахтаджян A.JI. Система магнолиофитов. 1987. Л. Наука.439 с.

28. Seiler, G. Utilization of wild sunflower species for the improvement of cultivated sunflower. 1992. Field Crop Research, 30: 191-194.

29. Skoric, D., 1993. Wild species use in sunflower breeding results and future directions. Plant Genetic Resource Newsletter, 93: 17-23.

30. Heiser C.B., Smith D.M., Clevender S.B., Martin W.C., The North Americsn sunflower (.Helianthus). 1969. Mem. Torrey Bot. Club. V.22. № 3. p. 1-218.

31. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. Изд. 2-е переработан, и дополн. 1964. Л. Колос. 792 с.

32. Пустовойт B.C. Подсолнечник. 1975. М. Колос. 700 с.

33. Сациперов В.Ф. К вопросу классификации сортов подсолнечника. 1913. Тр. Прикладной ботаники. T.VI.

34. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. 1950. М.: Советская наука.С.206-210.

35. Heiser С.В. Species crosser in Helianthus. Ill Delimination of "section". 1965. Ann. Missouri. Bot. Gard. V.52. №3. p.364.

36. Seiler, G., Rieseberg, L.H., 1997. Systematic, Origins and Germoplasm resources of Wild and Domesticated Sunflower. In: Sclineiter, A.A. (ed.), Sunflower Technology and Production, 35: 21-65. Agronomy, Madison, Wisconsin, USA.

37. Shilling E.E., Heiser C.B. Infrageneric classification of Helianthus (Compositae). 1981. Taxon. №30. p.393-403.

38. Анащенко A.B. К систематике рода Helianthus L.1974. Бот. Жур. T.59-N 10.С.1472-1481.

39. Анащенко A.B. Филогенетические связи в роде Helianthus L. 1979. Труды по прикл. бот. ген. и сел. Т.64-Вып.2-с. 146-156.

40. Анащенко А.В. Центры происхождения геномов и центры наибольшего разнообразия видов и форм рода Helianthus L. 1982. Вести с-х науки.№ б.с. 47-52.

41. Schuster, W.H., 1993. Die Ztichtung der Sonnenblume (Helianthus annuns L.). Paul Parey Scientific Publishers. Berlin and Hamburg 184 p.

42. Gentzbittel Z., Pernault A., Nicolas P., Molecular phylogeny of the Helianthus genus, based on nuclear restriction fragment length polymorphism analysis. 1992. Mol. Biol. Evol. V.9-p. 872-892.

43. Венцлавович Ф.С. Подсолнечник (.Helianthus annuus L.). Мировые растительные ресурсы как исходный материал для селекции. 1935. М.-Л.:ВАСХНИЛ. выпУ1.:Масличные культуры. Технические культуры. С.5-39.

44. Калайджян А.А., Головин В.П., Петренко И.М., Трубилин А.И., Горковенко Л.Г., Вартанян В.В. Подсолнечник и его изменчивость. 2003. Монография. Симферополь: Таврия. С. 217.

45. Heiser С.В. Variation and subspeciation in the common sunflower, Helianthus annuus. 1954. Am Midland Naturalist. 51:287-305

46. Piperno D.R. On Maize and the Sunflower.2001.Science. Vol. 292. no. 5525, pp. 2260 2261

47. Тищенко E.H., Михальская С.И. Агробактериальная трансформация подсолнечника. 2006. Физиология и биохимия растений. Т.38. №3. 187-196

48. Paniego N., Heinz R, Fernandez P., Talia P., Nishinakamasu V., Hopp H.E. Genome mapping and molecular breeding in plants. Volume 2. Oilseeds. 2007. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 153-177

49. Афонин A.H., Гринн С.Л., Дзюбенко Н.И., Фролов А.Н. Интерактивный Атлас полезных растений, их вредителей и агроэкологических факторов России и сопредельных стран Интернет-версия 1.0. 2006. http://www.agroatlas.ru

50. ФГУ Госсорткомиссия. http://gossort.ru/lists/catalogll.html

51. James С. Global Status of Commercialized Biotech GM Crops: 2005 International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA). http://www.isaaa.org

52. Dalton Rex. Superweed study falters as seed firms deny access to transgene. 2002. Nature. Vol. 419. 655.

53. Sarrafi A., Roustan J.P., Fallot J., Alibert G. Genetic analysis of organogenesis in the cotyledons of zygotic embryos of sunflower (Helianthus annuns L.) 1996. Theor. Appl. Genet. 92:225-229

54. Deglene L., Lesignes P., Alibert G., Sarrafi A. Genetic control of organogenesis in cotyledons of sunflower (Helianthus annuus). 1997. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 48:127-130.

55. Bronner R., Jeannin G., Hahne G. Early cellular events during organogenesis and somatic embryogenesis induced on immature zygotic embryos of sunflower (Helianthus annuus). 1994. Can.J.Bot. 72: 239-248

56. Daimon Y., Takabe K„ Tasaka M. The CUP-SHAPED COTYLEDON genes promote adventitions shoot formation on calli. 2003. Plant Cell Physiol. 44: 113-121.

57. Henrickson C.E. The flowering of sunflower explants in aseptic culture. 1954. Plant Physiol. 29 (6): 536

58. Bohorova N.E., Cocking E.C., Power J.B. Isolation, culture and callus regeneration of protoplasts of wild and cultivated Helianthus species. 1986. Plant Cell Reports. 5:256-258

59. Espinasse A., Lay C. Shoot regeneration of callus derived from globular to torpedo embryos from 59 sunflower genotypes. 1989. Crop Sci. 29:201-205

60. Berrios E.F., Gentzbittel L., Alibert G., Griveau Y., Berville A., Sarrafi A. Gcnetic control of in vitro-organogenesis in recombinant inbred lines of sunflower (.Helianthus annuus L.). 1999. Plant Breeding. 118: 359-361.

61. Nestsres G., Zorzoli R., Mroginski L., Picerdi L. Heriatbility of in vitro plant regeneration capacity in sunflower. 2002. Plant Breeding. Volume 121 Issue 4, Pages 366 368.

62. Воронина И. П. Разработка системы генетической трансформации подсолнечника (.Helianthus annum L. ). Диссертация. Москва. 1992.

63. Сангван Х.С. Получение и исследование трансгенных растений подсолнечника Helianthus annum L. 1993. Москва. Диссертационная работа на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

64. Riker A.J., Gutsche А.Е. The growth of sunflower tissue in vitro on synthetic media with various organic and inorganic sources of nitrogen. American Journal of Botany. 1948. Vol. 35, No. 4. pp. 227-238.

65. Мишуткина Я.В., Гапоненко A.K. Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) in vitro. 2006. Генетика. 42: 210-218.

66. Alibert G., Aslane-Chanabe C., Burrus M. Sunflower tissue and cell cultures and their use in biotechnology. 1994. Plant Physiol. Biochem. 32: 31-44

67. Heupel Т., Kutschera U. Effect of white light on meristematic activity in developing sunflower hypocotyls. 1996. Protoplasma. 123-129.

68. Hildebrandt A.C., Riker A.J., Duggar B.M. The influence of the composition of the medium on growth in vitro of excised tobacco and sunflower tissue cultures. 1946. Amer. Jour. Bot. 33:591-597

69. White P.R. A handbook of plant tissue culture. 1943. The Ronald Press Company, New York. Pp. 1-277.

70. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. 1962. Physiologia Plantarum 15 (3), 473-497

71. Moyne A.-L., Thor V., Pelissier В., Bergounioux C., Freyssinet G., Gadal P. Callus and embryoid formation from protoplasts of Helianthus annum. 1988. Plant Cell Reports. 7:437 440

72. Fischer C., Klethi P., Hahne G. Protoplasts from cotyledon and hypocotyl of sunflower (Helianthus annuus L.): shoot regeneration and seed production. 1992. Plant Cell Reports. 11:632-636.

73. Jeannin G., Bronner R., Haline G. Somatic embryogenesis and organogenesis induced on the immature zygotic embryo of sunflower (Helianthus animus L.) cultivated in vitro: role of the sugar. 1995. Plant Cell Reports. 15:200-204.

74. Chraibi B.K.M., Latche A., Roustan J.-P., Fallot J. Stimulation of shoot regeneration from cotyledons of Helianthus annuus by the ethylene inhibitors, silver and cobalt. 1991. Plant Cell Reports. 10: 204-207.

75. Knittel N., Escandon A.S., Hahne G. 1991. Plant regeneration at high frequency from mature sunflower cotyledons. Plant Sci 73: 219-226

76. Chraibi B.K.M., Castelle J.-C., Latche A., Roustan J.-P., Fallot J. 1992. Enhancement of shoot regeneration potential by liquid medium culture from mature cotyledons of sunflower (Helianthus annuus L.).Plant Cell Reports. 10:617-620.

77. Sadhu M.K. Effect of different auxins on growth and differentiation in callus tissue from sunflowers stem pith. 1974. Indian J. Exp. Biol. V.12, n. 1 P. 110-111.

78. Greco В., Tanzarella O.A., Carrozzo G., Blanco A. Callus induction and shot regeneration in sunflower (Helianthus annuus L.). 1984. Plant Sci. Lett. V.36, n.l. P. 73-77

79. Paterson K.E., Everett N.P. Regeneration of Helianthus annuus inbred plants from callus. 1985. Plant Science. 42:125-132.

80. Cavallini A., Lupi M.C. Cytological study of callus and regenerated plants of sunflower (#. annuus L.). 1987. Plant Breed. V.99, n.3.-P.203-208.

81. Lupi M.C., Bennici A., Locci F., Gennai D. Plantlet formation from callus and shoot-tip culture of Helianthus annuus (L.). 1987. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 11: 47-55

82. BogorovaN.E., Atanassov A.I., Antonova G.P. In vitro isolation of anthers from interspecific hybrids in the Helianthus genus. 1980. CR Acad Sci Bulg 33: 1545-1548.

83. Федорова T.C., Никитина Н.И. Цитология каллусогенеза пыльников подсолнечника в культуре in vitro. 1983. НТВ ВНИИМК.В.82. с. 17-22.

84. Gelebart P. Lean Han San. Production of haploid plants of sunflower (Helianthus annus L.) by in vitro culture of nonfertilized ovaries and ovules. 1987. Agronomie. V.7. n.2. P.81-86.

85. Фролова JI.B. Особенности популяции культивируемых клеток. 1981. Культура клеток растений. Москва. Наука, с. 167.

86. Лопатин М.И. Поражаемость растений возбудителем корневого рака растений Bast, TumefaciensSm.A.Town. 1936. Микробиология. Т.5. вып. 5. с. 716-724.

87. Linsmaier Е.М, Skoog F. Organic growth factor requirement of tobacco tissue culture. 1965. Physiol Plant 18:100-127

88. Егорова T.A., Клунова С.M., Живухина E.A. Основы биотехнологии: Учебное пособие для высш. пед. учеб. заведений. 2005. 2-е изд., стер. М: Издательский центр «Академия», 2005. - 208 с.

89. Смирнов Ю.С. Общее содержание фенолов у H. annuus (Asterасеае) при обогащении среды микроэлементами. 1982. Ботанический журнал. Т.67, №4, С. 440-446.

90. Смирнов Ю.С. Активность полифенолоксидазы у растений H. annuus L. (Compositae) при обогащении среды микроэлементами. 1978. Т.63, № 11, с. 1636-1639.

91. Finer J.J. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of hybrid sunflower (.Helianthus annuus L.) on a high sucrose-containing medium. 1987. Plant Cell Reports. 6:372-374.

92. Freyssinet M., Freyssinet G. Fertile plant regeneration from sunflower (Helianthus annuus) immature embryo. 1988. Plant Science. 56: 177-181

93. Chraibi B.M.K., Latché A., Roustan J.P., Fallot J. Stimulation of shoot regeneration from cotyledons of Helianthus annuus by the ethylene inhibitors, silver and cobalt. 1991. Plant Cell Reports. 10:204-207.

94. Berrios E.F., Gentzbittel L., Serieys H., Alibert G., Sarrafi A. Influence of genotype and gelling agents on in vitro regeneration by organogenesis in sunflower. 1999. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 59:65-69.

95. Pélissier В., Bouehefra О., Pépin R., Freyssinet. Production of isolated somatic embryos from sunflower thin cell layers. 1990. Plant Cell Reports. 9: 47-50.

96. Espinasse A., Lay C., Volin J. Effects of growth regulator concentrations and explant size on shoot organogenesis from callus derived from zygotic embryos of sunflower {Helianthus annuus L.). 1989. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 17:171-181.

97. Power C.J. Organogenesis from Helianthus annuus inbreds and hybrids from the cotyledons of zygotic embryos. 1987. Am. J. Bot. 74:497-503

98. McCann A.W., Cooley G., Van Dreser J. A system for routine plantlet regeneration of sunflower {Helianthus annuus L.) from immature embryo-derived callus. 1988. Plant cell, tissue and organ culture. 14: 103-110.

99. Jeannin G., Bronner R., Hahne G. Somatic embryogenesis and organogenesis induced on the immature zygotic embryo of sunflower (Helianthus annuus L.) cultivated in vitro: role of the sugar. 1995. Plant Cell Reports. 15:200-204.

100. Sujatha M., Prabakaran A.J. High frequency embryogenesis in immature zygotic embryos of sunflower. 2001. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 65: 23-29.

101. Полевой B.B. Физиология растений: Учеб. для биол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.-464 е.: цв.ил.

102. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Монография. 2001. Саратов. «Слово», с.256 с ил.

103. Paal Н.А., Kurnika Е., Szobo L. Plantlet regeneration from in vitro shoot-tip culture of sunflower. Novenytermeles 30: 201-209.

104. Paterson E.K. Shoot tip culture of Helianthus annuus flowering and development of adventitious and multiple shoots. 1984. American Journal of Botany. 71(7):925-931.

105. Ceriani M.F., Норр H.E., Hahne G., Escandon A.S. Cotyledons: an explant for routine regeneretion of sunflower plants. 1992. Plant Caell Physiol. 33(2): 157-164.

106. Everett N. P., Robinson К. E. P., Mascarenhas D. Genetic Engineering of Sunflower СHelianthus annuus L.). 1987. Nature Biotechnology 5, 1201 1204.

107. Peerbolte R., Dek G.J. 1991. The Everett transformation-protocol for sunflower hypocotyls. Why doesn't it work? In: Proceedings of the first International Sympsium on 'Sunflower Biotechnology in Europe, Cell Biology, Mittelwihr, France, P.3.

108. Bidney D., Scelonge C., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G. Microprojectile bombardment of plant tissue increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens. 1992. Plant Molecular Biology. 18:301-313

109. Grayburn W.S., Vick B.A. 1995. Transformation of sunflower (Iielianthus annuus L.) following wounding with glass beads. Plant Cell Rep. 14: 285-289.

110. Weber S., Friedt W.5 Landes N., Molinier J. 2003. Improved Agrobacterium-medi?i\&<i transformation of sunflower (Helianthus annuus L.): assessment of macerating enzymes and sonication. Plant Cell Rep. 21: 475-482.

111. The Netherlands Culture Collection of Bacteria (NCCB, formerly LMD and Phabagen) http://www.cbs.knaw.nl/About/nccb.aspx

112. Manavella P.A., Chan R.L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. 2009. Nature protocols. Vol.4 №.11 1699-1707.

113. Matzke M.A., Susani N., Lewis E.D., Rubenstein I., Matzke A.J.M. 1984. Transcription of a zein gene introduced into sunflower using Ti plasmid vector. EMBO J. 3: 1525-1531.

114. Helmer G., Casadaban M., Bevan M., Kayes L., Chilton M. 1984. A new chimeric gene as a marker for plant transformation: The expression of Echerichia coli /?-galactosidase in sunflower and tobacco cells. Biotechnology, 2: 520-527.

115. Goldsborough P.B., Gelvin S.B., Larkins B.A. 1986. Expression of maize zein genes in transformed sunflower cells. Mol. Gen. Genet., 202: 374-381.

116. Schrammeijer B., Sijmons P.C., Peter J.M. van der Elsen, Hoekema A. Meristem transformation via Agrobacterium. 1990. Plant Cell Reports. 9:55-60.

117. Escandon A.S., Hahne G. 1991. Genotype and composition of culture medium are factors important for transformed sunflower (Helianthus annuus L) callus. Physiol. Plant., 81: 367376.

118. Knittel N, Lenee P., Ben Tahar S. 1992. Transformation of sunflower (Helianthus annum. L.). Du gène à l'entreprise, Forum jeunes chercheurs, Amiens, France, 122.

119. Pugliesi C., Biasini M.G., Fambrini M., Baroncelli S. 1993. Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens in the interspecific hybrid Helianthus annum x Helianthus tuberosus. Plant Sci., 93: 105-115.

120. Knittel N., Gruger V., Hahne G., Lénéé P. 1994. Transformation of sunflower (.Helianthus annuus L.): A reliable protocol. Plant Cell Rep., 14: 81-86.

121. Laparra H., Burras M., Huonold R., Damm B., Bravo-Angel A. M., Bronner R., Hahne G. 1995. Expression of foreign genes in sunflower (Helianthus annuus L.) evaluation of three gene transfer methods. Euphytica, 85: 63-74.

122. Burras M., Molinier J., Himber C., Hunold R., Bronner R., Rousselin P., Hahne G. Agrobacterium-mediated transformation of sunflower {Helianthus annuus L.) shoot apices: transformation patterns. 1996. Molecular Breeding. 2: 329-338.

123. Gtirel E., Kazan K. 1998. Development of an efficient plant regeneration system in sunflower (.Helianthus annuus L.). Tr. J. of Botany. 22: 381-387.

124. Rao K.S., Rohini V.K. 1999. Agrobacterium-mediated transformation of sunflower (Helianthus annum L.): A simple protocol. Annals of Botany, 83: 347-354.

125. Lucas 0., Kallerhoff J., Alibert G. 2000. Production of stable transgenic sunflowers (Helianthus annuus L.) from wounded immature embryos by particle bombardment and co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens. Mol. Breed., 6:476-487.

126. Miiller A., Iser M., Hess D. Stable transformation of sunflower (Helianthus annuus L.) using a non-meristematic regeneration protocol and green fluorescent protein as a vital marker. 2001 Transgenic research 10: 435-444.

127. Molinier J., Thomas C., Brignou M., Hahne G. 2002. Transient expression of ipt gene enhances regeneration and transformation rates of sunflower shoot apices (Helianthus annuus L.). Plant Cell Rep., 21: 251-256.

128. Trifi M., Mezghani S., Marrakchi M. Vegetative propagation of the sunflower Helianthus annuus L. by in vitro culture. 1981. Physiol. Veg. 19:99-102.

129. Ivanov P., Enchiva J., Ivanova I. A protocol to avoid precocious flowering of sunflower plantlets in vitro. 1998. Plant Breed 117:582-584.

130. Mayor M.L., Nestares G., Zorzoli R, Picardi L.A. Reduction of hyperhydricity in sunflower tissue culture. 2003. Plant Cell Tissue Organ Cult. 72:99-103

131. Dekeyser R., Claes В., Marichal M., Montagu V.M., Caplan A. Evalution of selectable markers for rice transformation. 1989. Plant Physiol. 90:217-223.

132. Lloyd MA., Barnason A.R., Rogers S.G., Byrne M.C., Fraley R.T., Horsch R.B. Transformation of Arabidopsis thaliana with Agrobacterium twnefaciens. 1986. Science. Vol. 234. no. 4775, pp. 464 466

133. Radonic L.M., Zimmermann J.M., Zavallo D, Lopez N., Bilbao M.L. Rooting in Km selective media as efficient in vitro selection method for sunflower genetic transformation. 2006. Electronic Journal of Biotechnology. Vol.9. No 3.

134. Murakami Т., Anzai H., Imai S., Satoh A. Nagaoka K., Thompson C.J. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 42-50.

135. Lindsey К. Genetic manipulation of crop plants. J. Biotech. 1992. V. 26. P. 1-28.

136. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusion: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. 1987. EMBOJ. V.6.P.3901-3907

137. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. Beta-glucuronidase from Escherichia coli as a genefusion marker. 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.83.P.8557-8451

138. Зверева С.Д., Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования. 2000. Физиология растений. T.47.C. 479-488.

139. Aono М., Kubo A., Saji Н., Tanaka К., Kondo N. Enhanced tolerance to photooxidative stress of transgenic Nicotiana tabacum with high chloroplastic glutathione reductase activity. 1993. Plant and Cell Physiology. 34: 129-135

140. Jaglo-Ottosen K.R., Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. 1998. Science. Vol. 280. no. 5360, pp. 104-106

141. Center for environmental risk assessment. GM crop database. X81359.

142. Baumgartner J. R., A1 Khatib K., Currie S.R. 1999. Common sunflower resistance to imazethapyr and chlorimuron in northeast Kansas. Proceedings of the Western Society of Weed Science. 52: 12-15.

143. Seiler J.G. Improving oil quality in sunflower using its wild relatives. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Crop Science Laboratory, Fargo, ND 58105

144. Cornish K., Scott D. Biochemical regulation of rubber biosynthesis in guayule (.Parthenium argentatum Gray). 2005. Ind. Crop Prod. 22 (1), 49-58.

145. Veatch M., Ray D., Май C., Cornish K. Growth, rubber, and resin evaluation of two-year-old transgenic guayule. 2005. Ind. Crops Prod. 22 (1), 65-74.

146. Murashige, Т., Skoog, F. A., Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol., 1962. V. 15. P. 473-476

147. Gamborg, O., The effects of amino acid and ammonium on the growth of plant cells in suspension cultures. Plant Physiol., 1970. V. 45. P. 372-375

148. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. New Agrobacterium helper strains for gene transfer to plants. Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 208-218.

149. Bertani G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Bacteriol, 1951. Bd. 62, Nr. 3, S.293-300.

150. Lichtenstem C., Draper J. Genetic engineering of plants, mDNA cloning. A practical approach. 1985. IRL Press, Oxford, UK, pp. 67-1 19.

151. Навашин C.M., Фимина Н.П. Справочник по антибиотикам. 1974. Москва. «Медицина», с.415.

152. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. Часть вторая. Издание двенадцатое, переработанное и дополненное. Москва. "Медицина". 1993.

153. Пустовойт B.C. Подсолнечник (монография). 1975. Под общей редакций академика B.C. Пустовойта М. «Колос». 592 с. с ил.

154. Habermanhn Н., Wallace R. Н. Transfer of flowering stimulus from stock to scion in grafted Helianthus annum L. 1958. Amer. J. Bot. 45: 479-482.

155. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol.Biol.Rep. 1987. v. 1. p. 19-21.

156. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 3-17.клонирование. 1984. М.: Мир, 480 с.

157. Strategic Diagnostics Inc: www.sdix.com

158. Vitha S. Histochemical localization of P-glucuronidase (GUS) reporter activity in plant tissues. Microscopy and Imaging Center, Texas A & M University http://www.tamu.edu/mic

159. Падегимас JI.С., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solarium tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину. Мол. Биол. 1993. Т. 27. №4. С.947-951.

160. Becker D. Binary vectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes. Nucleic Acids. Res. 1990. V. 18. P. 203.

161. Гуляев Г.М., Гужов Ю.Л. Селекция и семеноводство полевых культур. 1987. Агропромиздат. 447 с.

162. Taylor A.G., Hill H.J., Xue-lin Huang, Tai-gi Min. Determining seed viability. United States petent. 1990. PNA4975364

163. Dadlania M., Agrawala P.K. Factors influencing leaching of sugars and electrolytes from carrot and okra seeds. 1983. Scientia Horticulturae. 19: 39-44.

164. Taylor A.G., Hill H.J., Xue-lin Huang, Tai-gi Min. Determining seed viability. 1990. United States patent 4975364.