Изучение Quorum Sensing систем регуляции у Pseudomonas chlororaphis и Burkholderia cepacia тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Веселова, Марина Анатольевна

• Веселова, Марина Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Веселова, Марина Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.QS системы LUXl-LUXR топа грамотрицлтельных бактерий.

I.[Функционирование QS системы LuxI-LuxR типа на примере Vibrio fischeri.

1.2 АГЛ и функионирование Luxl—подобных белков.

1.3 Функционирование LiccR-подобных белков.

2. QS системы грамположительных бдктерий с участием АИ пептидной природы.

3. QS системы, использующие АИ-2.v.

4. Обобщение данных о наиболее изученных синтазах аутоиндукторов, участвующих в синтезе АГЛ и АИ-2.:.;.

5. QS системы бактерий рода PSEUDOMONAS.

5.1. QS система Pi aeruginosa.

5.1.1 LasI-LasR и Rhll-RhlR системы регуляции.

5.1.2 Регуляция QS системы P. aeruginosa дополнительными факторами.

5.2 QS системы других видов Pseudomonas.1.

5.2.1 Pseudomonas aureofaciens /Pseudomonas chlororaphis.

5.2.2. Pseudomonas fluorescens.

5.2.3 Pseudomonasputida.

5.2.4 Pseudomonas syringae.

6. QS система бактерий комплекса burkholder1a cepacia.

Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Среды и условия культивирования.

2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды.

3. Определение продукции АГЛ.

4. Экстракция АГЛ из супернатантов и проведение идентификации АГЛ в культуралъных экстрактах .:.

5. Методы работы с ДНК.

6. Транспозонный мутагенез и определение локализации инсерции минитранспозона.

7. Пласпозонный мутагенез и определение места инсерции пласпозона.

8. Идентификация генов с помощью ПЦР.

9. Клонирование генов.

10. Получение инсерционных мутантов P. chlororaphis 449методом замены генов.

11. Определение экспрессии гена у/г в клеточных лизатах.

12. Анализ ферментативных активностей.

13. Определение способности клеток бактерий к миграции по поверхности среды (сворминг).

14. Определение антагонистической активности.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ

А. ИЗУЧЕНИЕ QUORUM SENSING РЕГУЛЯЦИИ У PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS.

1. Скрининг штаммов, синтезирующих АГЛ, из коллекции почвенных бактерий.

2. Характеристика группы бактерий р: chlororaphis, синтезирующих'АГЛ.69'

2.1 Определение экзопротеазной, хитинолитической, полигалактуроназной и антагонистической активности у штаммов P. chlororaphis.

2.2 Исследование влияния температуры на синтез АГЛ, феназиновых антибиотиков, экзопротеазную активность у штаммов P. chlororaphis.72'

2.3 Идентификация с помощью ПЦР генов двух QS систем и генаphzOy штаммов P. chlororaphis.

3. Quorum Sensing системы p. chloror,iphis449 и изучение их роли в регуляции клеточных процессов.

3.1 Клонирование и секвенироваиие геновphzl, csal из Р. chlororaphis 449.

3.1.1 Клонирование гена рШ из P. chlororaphis 449.

3.1.2 Клонирование гена csal из Р. chlororaphis 449.

3.2 Получение мутации в гене csal у P. chlororaphis 449.

3.3 Исследование влияния мутации в гене csal на свойства P. chlororaphis 449.

3.3.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis с мутацией в гене csal.

3.3.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal.

3.3.3 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 и штамма с мутацией в гене csal.

3.3.4 Полигапактуроназная и псктинметилэстеразная активность в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal.

3.3.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 н штамма с мутацией в гене csal.

3.3.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal.

3.3.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 и штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal к миграции по поверхности среды (сворминг).

3.4 Влияние плазмиды рМЕ6863, содержащей клонированный ген N-ацил-гомосерин лактоназы, на синтез АГЛ и регуляцию клеточных процессов P. chlororaphis 449.

4. Исследование взаимодействия двухкомпонентной системы GacA-GacS с QS системой и ее роли в регуляции клеточных процессов у p. chlororjtphis 449.

4.1 Получение транспозонных мутантов P. chlororaphis 449 с инактивированньш геном gacS.

4.2 Клонирование и секвепирование части гена gacS из P. chlororaphis 449.

4.3 Исследование влияния мутации в гене gacS на свойства P. chlororaphis 449.

4.3.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS.

4.4.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS.

4.4.3 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS.

4.4.4 Полигалактуроназная и пектинметилэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS.

4.4.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449с мутацией в гене gacS.

4.4.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS.

4.4.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS к миграции по поверхности среды (сворминг).

5. КЛОНИРОВАНИЕ, СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА vfr p. chlororaphis449, ИЗУЧЕНИЕ ЕГО РОЛИ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ.

5.1 Идентификация, клонирование и секвенирование гена vfr из P. chlororaphis 449.

5.2 Анализ аминокислотных последовательностей белков — гомологов Vfr и проведение исследования экспрессии гена vfr из P. chlororaphis 449.

5.2.1 Выравнивание последовательностей белков — гомологов Vfr.

5.2.2 Клонирование гена vfr из P. chlororaphis 449 в экспрессионном векторе рЕХ20Т.

5.2.3 Комплементация мутации в гене сгр в клетках Е. coli с помощью гена vfrmP. chlororaphis 449.

5.3 Получение инсерционного мутанта P. chlororaphis 449 с инактивированным геном vfr.

5.4 Исследование влияния мутации в гене vfr на свойства P. chlororaphis

5.4.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr.

5.4.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr.

5.4.3 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr.

5.4.4 Полигалактуроназная и пектинметилэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr.

5.4.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr.

5.4.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr.

3.4.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr к миграции по поверхности среды (сворминг).

6. получение мутаций в генах феназинового оперона P. CHLOROR/tPHIS 449 и характеристика мутантных штаммов.:.

В. ИЗУЧЕНИЕ QUORUM SENSING СИСТЕМЫ BURKHOLDERIA CEPACIA, РЕГУЛЯЦИИ,ЕЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С СИНТЕЗОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ

1. Определение продукции АГЛ в коллекции штаммов в. cepacia.

2. Характеристика штаммов в. cepacia.

2.1 Определение с помощью ПЦР генов QS системы CepI/CepR в коллекции штаммов В. cepacia.

2.2. Изучение продукции потенциальных факторов патогепностиу шташюв В. cepacia.

2.3 Определение антагонистической активности клинических штаммов В." cepacia по отношению к

P. aeruginosa и S. aureus.

3. Изучение QS системы, ее регуляции и роли в регуляции клеточных процессов у в. cepacia 370.

3.1 Клонирование генов ceplu cepR из В. cepacia 370.Ill

3.!.I Клонирование генаceplиз В. cepacia370.

3.1.2 Клонирование гена cepR из В. cepacia 370.

3.2 Получение мутантных штаммов В. cepacia 370 с измененной продукцией АГЛ.

3.3 Исследование влияния мутаций в генахpps, clpX, Ion на свойства В. cepacia 370.

3.3.1 Определение продукции АГЛ.

3.3.2 Определение экзопротеазной и липазной активности.

3.3.3. Подавление роста фитопатогенного гриба Sclcrotinia sclcrotiorum.

3.3.4 Определение гемолитической активности.

3.3.5 Определение способности клеток к миграции по поверхности среды (сворминг).

V. ОБСУЖДЕНИЕ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение Quorum Sensing систем регуляции у Pseudomonas chlororaphis и Burkholderia cepacia»

Последние 10 лет внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, обращено на явление, получившее название Quorum Sensing (QS). QS— особый тип регуляции экспрессии генов, зависящей от плотности популяции бактерий; он основан на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной природы, аутоиндукторов,. которые накапливаются в культуре при высоких плотностях популяции бактерий. С помощью аутоиндукторов осуществляется коммуникация бактерий — передача информации.-между клетками бактерий, принадлежащих к одному и тому же или к разным видам, родам, и даже семействам. Примером аутоиндукторов грамотрицательных бактерий, являются ацил-гомосеринлактоны (АГЛ). Благодаря QS регуляции,бактерии получают возможность координированное контролировать экспрессию генов? во всем сообществе. Передача информации* от клетки к клетке с использованием QS систем, которая приводит к индукции специализированных наборов генов, способствует быстрой адаптации* популяций бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в природной среде.

В настоящее время QS регуляция обнаружена-более чем-у 50 видов< бактерий; Регуляторные. системы типа QS участвуют во взаимодействии- бактерий: с высшими" организмами— животными и растениями, в регуляции вирулентности, формировании1 биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, в конъюгации и др. Исследование QS систем регуляции, их роли в метаболизме и взаимодействии, бактерий-определяет новый подход к изучению-поведения, бактерий в природных условиях. Эти' исследования могут иметь огромное прикладное значение.

Особое внимание уделяется изучению роли QS в регуляции патогенности бактерий; Используя QS системы регуляции, патогенные бактерии, при достижении высокой* плотности популяции начинают синхронный синтез факторов вирулентности, вызывающих разрушение тканей организма, что способствует успешному преодолению бактериями иммунного ответа организма-хозяина. Данный факт обусловил появление нового направления, связанного с использованием QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями. Лекарственные средства, подавляющие функционирование QS систем, направлены непосредственно на подавление патогенности бактерий и получили название «ядов патогенности». В настоящее время этот подход рассматривается как новая, перспективная стратегия антимикробной терапии. Подобные лекарственные препараты могут быть перспективными для использования не только в медицине, но и для борьбы с бактериальными инфекциями животных и растений в сельском хозяйстве, а также в пищевых технологиях.

Большой интерес вызывает изучение QS регуляции у бактерий, используемых для биологической борьбы с заболеваниями растений, вызываемыми фитопатогенными грибами и бактериями. Экологически безопасные биологические методы защиты растений с помощью бактерий — антагонистов фитопатогенов рассматриваются как важная альтернатива традиционным методам, связанным с применением химических пестицидов. Использование и модификации QS систем могут повысить эффективность бактерий, используемых для биологической борьбы с заболеваниями растений.

В данной работе исследуются QS системы грамотрицательных бактерий двух родов — почвенных бактерий Pseudomonas chlororaphis, антагонистов фитопатогенных микроорганизмов, и бактерий Burkholderia cepacia, являющихся патогенами человека.

Цель работы и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение QS систем у Pseudomonas chlororaphis и Burkholderia cepacia, регуляции их функционированиями взаимодействия с клеточными процессами этих бактерий. В соответствии с этим в работе ставились следующие задачи:

1. исследовать распространение способности продуцировать АГЛ у почвенных и. ризосферных бактерий, включающих, различные виды Pseudomonas, и у клинических штаммов В. cepacia-,

2. охарактеризовать ризосферные штаммы P. chlororaphis, продуценты АГЛ, исследовать их способность проявлять антагонистическую активность в отношении фитопатогенов, определить ряд ферментативных активностей, существенных для обитания бактерий в природных условиях;

3. охарактеризовать клинические штаммы В. cepacia, продуценты АГЛ, определить их способность продуцировать потенциальные факторы патогенности;

4. исследовать QS системы штамма P. chlororaphis 449, клонировать и секвенировать гены синтаз АГЛ, изучить взаимосвязь QS систем с регуляцией клеточных процессов;

5. исследовать QS систему штамма В. cepacia 370, идентифицировать гены cepl и cepR;

6. исследовать регуляцию функционирования QS систем P. chlororaphis 449 и В. cepacia 370, выяснить роль некоторых глобальных регуляторов экспрессии бактериальных генов в регуляции QS систем и их участие в регуляции клеточных процессов этих бактерий.

Научная новизна и практическая значимость

Изучена способность к синтезу АГЛ среди большого количества почвенных и ризосферных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о широко распространенной способности псевдомонад синтезировать АГЛ; продукция АГЛ была обнаружена у 17% исследованных штаммов, при этом частота встречаемости продукции АГЛ варьировала у разных видов Psendomonas.

У группы штаммов P. chlororaphis, активных продуцентов АГЛ, выделенных в различных географических зонах, были идентифицированы гены двух QS систем (phzl, phzR и csal, csaR); т.к. все тестируемые штаммы были выделены из очень отдаленных мест, мы сделали вывод о частой встречаемости этих двух систем QS регуляции у почвенных штаммов P. chlororaphis. У штамма P. chlororaphis 449 гены phzl, csal, кодирующие синтазы АГЛ двух QS систем регуляции, были клонированы и .секвенированы. Показано, что клетки штамма 449 продуцируют 4 типа АГЛ, а именно. М-бутаноил-Ь-гомосеринлактон, Т^-гексаноил-Ь-гомосеринлактон, >Т-(3-оксо-гексаноил)-L-гомосерин лактон, а также минорный, не определенный пока тип АГЛ, предположительно, М-(3-оксо-октаноил)-Ь-гомосеринлактон. Сравнение этих данных с имеющимися в литературе для P. chlororaphis позволяет высказать предположение о присутствии в клетках штамма P.' chlororaphis 449 третьей QS^ системы, дополнительной к. уже описанным.

Показано, что исследованные штаммы P. chlororaphis являются антагонистами широкого спектра фитопатогенных грибов и бактерий, синтезируют феназиновые антибиотики. Изучив свойства полученных нами производных штамма P. chlororaphis 449, несущих мутации в генах феназинового оперона (phzA, phzB, phzO), мы определили, что феназины играют существенную роль в антагонизме исследуемого штамма в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Впервые было обнаружено, что штаммы P. chlororaphis проявляют полигалактуроназную (ПГ) и пектинметилэстеразную (ПМЭ) активности (работа проводилась совместно с сотрудниками Института биохимии' РАН Проценко М.А. и Бузой Н.Л.).

На основании изучения мутантов P. chlororaphis 449 с инактивированным геном gacS показано, что GacA-GacS глобальная система регуляции положительно регулирует синтез всех типов АГЛ, феназиновых антибиотиков, экзопротеаз, ПГ, ПМЭ, антагонистическую активность этого штамма и практически не влияет на липазную и фосфатазные активности.

Впервые у P. chlororaphis клонирован, секвенирован, экспрессирован ген vfr, определена его локализация в хромосоме (у P. aeruginosa этот ген является глобальным регулятором и принимает участие в контроле синтеза АГЛ). Показано, что белок Vfr P. chlororaphis 449 гомологичен соответствующему белку P. aeruginosa и белку CRP Escherichia coli, частично комплементирует мутацию в гене crp Е. coli. Изучение полученного инсерционного vfr мутанта показало, что белок Vfr P. chlororaphis 449 не участвует в регуляции синтеза АГЛ, феназиновых антибиотиков и исследованных ферментов.

Изучена способность клинических штаммов Burkholderia cepacia продуцировать АГЛ. Обнаружено, что 94% исследованных штаммов синтезировали АГЛ. У всех штаммов был идентифицирован ген QS системы cepR, у большинства штаммов был определен ген cepl. Было показано, что штамм В. cepacia 370 синтезирует четыре вида АГЛ: М-гексаноил-Ь-гомосеринлактон, М-октаноил-Ь-гомосеринлактон и два минорных компонента, не определенные в настоящее время. Гены cepR и cepl этого штамма были клонированы и секвенированы.

Впервые у бактерий В. cepacia были получены мутанты с инактивированными генами clpX и Ion (кодируют специфические протеиназы, глобальные регуляторы экспрессии! генов), а также мутант с инактивированным геном pps (кодирующим фосфоэнолпируватсинтазу). Показано, что мутации в генах clpX и pps увеличивают синтез АГЛ, а мутация» в гене Ion приводит к его резкому снижению. Определено влияние мутаций в этих генах на синтез потенциальных факторов патогенности (гемолизинов, экзопротеаз, липаз).

Практическая значимость работы связана с возможностью использования полученных данных об антагонистической активности и ее регуляции у P. chlororaphis 449 для/ разработки препаратов для биологической защиты растений на основе P. chlororaphis. Данные о регуляции синтеза потенциальных факторов патогенности у В. cepacia могут быть использованы в разработке методов подавления патогенных свойств данной бактерии.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бактерии способны чувствовать повышение плотности популяции и отвечать на него быстро и скоординированно индукцией определенных наборов генов. Этот тип регуляции получил название Quorum Sensing (QS); он основан на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной природы, аутоиндукторов, которые накапливаются в культуре при высоких плотностях популяции бактерий. QS системы являются глобальными факторами экспрессии бактериальных генов, они играют ключевую роль в регуляции многих метаболических процессов клетки.

В обзоре литературы рассмотрены молекулярные механизмы функционирования QS систем у бактерий различных таксономических групп. Отдельное внимание уделено описанию QS систем у бактерий рода Pseudomonas и бактерий комплекса Burkholderia cepacia.

1. QS системы LuxI-LuxR типа грамотрицательных бактерий

У грамотрицательных бактерий лучше всего изучены QS - системы, 5 функционирующие с участием аутоиндукторов (АИ) N-ацил-гомосеринлактонов (АГЛ). Такие системы были идентифицированы у более чем 30 видов грамотрицательных* бактерий. QS системы включают два белка, гомологичных LuxR и Luxl белкам» Vibriofischeri, рецепторный белок и синтазу АГЛ, соответственно. Используя QS механизм, грамотрицательные бактерии регулируют экспрессию генов в зависимости от плотности популяции [168].

1.1Функционирование QS системы LuxI-LuxR типа на примере Vibrio fischeri

Наиболее подробно изучена QS система у биолюминесцентной морской бактерии V. fischeri. Рассмотрим функционирование QS систем LuxI-LuxR типа на примере этой бактерии.

Экологической нишей для V. fischeri служат светящиеся^ органы морских животных— рыб, головоногих молшосков. Такой симбиоз взаимовыгоден. Бактерии получают от хозяина питательные вещества и укрытие. В случае с головоногим моллюском Euprymna scolopes свечение бактерий, напоминающее лунный свет, делает незаметным хозяина для хищников снизу, т.к. тело моллюска теряет тень.

Свечение зависит от плотности популяции бактерий. В' толще морской воды популяция клеток невелика, и они не светятся. В светящихся органах культура V. fischeri достигает высокой плотности (10п клеток/мл) и происходит свечение [86].

Свечение обеспечивает фермент люцифераза; ее структурные гены (luxAB) являются- частью luxICDABE оперона с промотором Pr (рис. 1). Гены luxA и 1ихВ кодируют, соответственно, субъединицы а и Р люциферазы, гены luxCDE кодируют редуктазу жирных кислот (один из окисляемых субстратов, в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света). Ген luxl кодирует Luxl, ацил-гомосеринлактон синтазу, ответственную за синтез аутоиндукгора 1^-(3-оксогексаноил)-гомосеринлактона. Ген luxR с промотором Pl является второй частью lux регулона, кодирует LuxR, транскрипционный регулятор, ответственный за связывание АИ и за активацию транскрипции luxICDABE оперона.

Схема QS регуляции /шг-оперона V. Jischeri представлена на рис. 1. При низких клеточных плотностях luxICDABE оперон транскрибируется на низком базальном уровне (продуцируется* низкий уровень АИ; гены, кодирующие люциферазу, обеспечивают низкий уровень свечения). АИ могут свободно диффундировать через клеточную стенку, концентрация АИ в окружающей, среде становится равной внутриклеточной концентрации. По мере роста культуры АИ накапливаются до порогового уровня (~1-10 мкг/мл), при достижении которого происходит связывание АИ с цитоплазматическим LuxR белком. Комплекс LuxR—АИ способен связываться с luxICDABE промотором и активировать продукцию АИ и свечение. Комплекс LuxR-АИ также связывается с luxR промотором; действуя как негативный' регулятор экспрессии luxR. Такая обратная связь регулирует механизм усиления, экспрессии luxICDABE, предохраняя* клетку от расходования на свечение значительной части энергии [86; 168].

Белки Luxl и LuxR входят в семью гомологичных белков, имеющихся у разных бактерий [168; 12]. Среди белков, гомологичных Luxl и LuxR белкам V. Jischeri, можно назвать Tral и TraR белки Agrobacterium tumefaciens (контролируют конъюгацию Ti плазмид), LasI, LasR и Rhll; RhlR белки Pseudomonas aeruginosa (контролируют синтез факторов вирулентности; образование биопленки), Esal и EsaR Pantoea stewartii (контролируют биосинтез факторов вирулентности,* капсулярного полисахарида).и-другие белки (таблица 1) [168]!

Низкая клеточная плотность

О 3-ОС6-АГЛ t

-<-------------lux

Высокая клеточная плотность ujxi> о°о 1 о

Vb

30С6-АГЛ Свечение■

Рис. 1. Схема QS регуляции /шг-оперона V. fischeri

Таблица 1

Примеры бактерий, имеющих LuxI/LuxR гомологи, и регулируемые ими функции

Бактерия LuxI/LuxR гомологи Функция

V. fischeri LuxI/LuxR Биолюминесценция

Agrobacterium tumefaciens Tral/TraR Конъюгативный перенос Ti-плазмид

Chromobacterium violaceum Cvil/CviR Синтез пигмента виолацеина, HCN, антибиотиков, экзопротеаз, хитинолитических ферментов

Pantoea stewartii Esal/EsaR Синтез капсулярного полисахарида, факторов вирулентности

Erwinia carotovora ExpI/ExpR Синтез внеклеточных гидролитических ферментов (пектиназ, целлюлаз и др.)

Carl/CarR Синтез антибиотика карбапенема

Pseudomonas aeruginosa LasI/LasR Факторы вирулентности (токсин А, эластаза, экзопротеаза и др.), образование биопленки

Rhll/RhlR Факторы вирулентности (пиоцианин, рамнолипиды и др.)

Pseudomonas aureofaciens PhzI/PhzR Биосинтез феназиновых антибиотиков, образование биопленки,

Csal/CsaR Продукция экзопротеаз, синтез компонентов клеточной поверхности, образование биопленки, колонизация ризосферы растений

Burkholderia cepacia CepI/CepR Синтез внеклеточных гидролитических ферментов (протеаз, хитиназ, полигалактуроназы), продукция сидерофоров, образование биопленки, сворминг

Ccil/CciR Факторы вирулентности

Заключение диссертации по теме «Генетика», Веселова, Марина Анатольевна

VI. ВЫВОДЫ

1. Изучено распространение способности продуцировать АГЛ у 228 штаммов почвенных и ризосферных псевдомонад; продукцию АГЛ наблюдали у 17% исследованных штаммов. Частота встречаемости продукции АГЛ варьировала у разных видов Pseudomonas.

2. У всех исследованных штаммов Pseudomonas chlororaphis, выделенных в различных географических областях и продуцирующих АГЛ, идентифицированы гены двух Quorum Sensing (QS) систем phzl, phzR, csal, csaR.

3. Клонированы и секвенированы гены синтаз АГЛ P. chlororaphis 449 phzl и csal. Показано, что клетки штамма 449 продуцируют 4 типа АГЛ: М-бутаноил-Ь-гомосеринлактон, М-гексаноил-Ь-гомосеринлактон, ]М-(3-оксо-гексаноил)-Ь-гомосерин лактон, а также минорный тип АГЛ. Предполагается присутствие в клетках P. chlororaphis 449 третьей QS системы.

4. Показано, что GacA-GacS глобальная система регуляции положительно регулирует синтез всех типов АГЛ, феназиновых антибиотиков, экзопротеаз, полигалактуроназы, пектинметилэстеразы, антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов и практически не влияет на липазную и фосфатазные активности.

5. Клонирован, секвенирован и экспрессирован ген vfr P. chlororaphis 449, определена его локализация в хромосоме. Белок Vfr P. chlororaphis 449 гомологичен белку Vfr P. aeruginosa (глобальному регулятору экспрессии генов), белку CRP Е. coli; клонированный ген vfr частично комплементирует мутацию в гене crp Е. coli. Показано, что белок Vfr в клетках P. chlororaphis 449 не участвует в регуляции синтеза АГЛ, феназинов, экзопротеаз, антагонистической активности бактерии.

6. Определено, что большинство исследованных клинических штаммов Burkholderia cepacia продуцировали АГЛ; содержали гены CepI-CepR QS системы, синтезировали потенциальные факторы вирулентности — экзопротеазы и липазы, 39% штаммов продуцировали гемолизины.

7. Показано участие глобальных регуляторов протеиназ ClpXP и Lon в регуляции продукции АГЛ у В. cepacia.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Веселова, Марина Анатольевна, 2008 год

1. Беляков В.Д., Ряпис JI.A., Илюхин В.И. 1990. Псевдомонады и псевдомонозы. М., Медицина.

2. Глинка Е.М., Проценко М.А. 1998. Белковый ингибитор полигалактуроназы из клеточной стенки растения. Биохимия. 63, 1189-1195

3. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1997. Роль La протеазы в негативном контроле экспрессии генов IwcICDABE Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. Молекул, биология, 31, 945-949

4. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург A.JL. 2004. Биопленки как способ существования^ бактерий в окружающей среде и организме хозяина, феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Генетика. 40, 1445-1456

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. 1984. Молекулярное клонирование. Москва Издательство «Мир»

6. Манухов И:В., Котова В.Ю:, Завильгельский Г.Б. Шаперон GroEL/GroES и протеиназа Lon< в регуляции экспрессии /шг-оперона Vibrio fischeri в, клетках Escherichia coli (2006) 40:2,277-283

7. Миллер Д. 1976. Эксперименты в молекулярной генетике. Издательство «Мир».

8. Ротанова' Т.В. 2001. Энергозависимый селективный внутриклеточный протеолиз. строение, активные центры и специфичность АТФ-зависимых протеиназ. Вопр.мед.хим. 47(1),3-19»

9. Рубан E.JI. 1986. Физиология и биохимия представителей, рода Pseudomonas. М., Наука,

10. Смирнов В.В. Киприянова Е.А. 1990. Бактерии рода Pseudomonas Наукова Думка, Киев, Украина с. 100-111

11. Хмель И.А. 2006. Quorum Sensing регуляция экспрессии генов, фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий. Микробиология. 457-464

12. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. 2003. Бактерии Комплекса Burkholderia cepacia, Особенности Диагностики, Генома и Метаболизма. Молекул, генетика микробиол. и вирусол. 2,3-10.

13. Штейн И.В., Аренде И.М., Сорокина Т.А. 1989. Отбор микроорганизмов, синтезирующих щелочную липазу. Биотехнология. 5,133-136.

14. Aguilar С., Bertani I., Venturi V. 2003. Quorum-Sensing system and stationary-phase sigma factor (rpoS) of the onion pathogen Burkholderia cepacia genomovar I type strain, ATCC 25416. Appl Environ Microbiol. 69, 1739-1747.

15. Ahmer B. 2004. Cell-to-cell signalling in Escherichia coli and Salmonella enterica Mol. Microbiol 52, 933-945

16. Aiba H, Fujimoto S, Ozaki N. 1982. Molecular cloning and nucleotide sequencing of the gene for Escherichia coli cAMP receptor protein. Nucl. AcidsRes. 10, 1345-1361

17. Albus A, Pesci E, Runyen-Janecky L, West S, Iglewski B. 1997. Vfr controls quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. J Bacterid, 179(12), 3928-35

18. Andreeva N, Sorocina T, Khmel I. 1996. Chitinolytic activity of pigmented Pseudomonas and Xanthomonas bacteria. Microbios. 87, 53-57"

19. Balaban N, Goldkorn T, Gov Y, Hirshberg M, Koyfman N, Matthews H, Nhan R, Singh B, Uziel O. 2001. Regulation of Staphylococcus aureus, pathogenesis via target of RNAIII-activating protein (TRAP). J. Biol. Chem. 276, 2658-2667

20. Bassler B; Wright1 M, Showalter R, Silverman M. 1993. Intercellular signalling in Vibrio harveyi, sequence and function of genes regulating expression of luminescence: Mol Microbiol. 9,773-86.

21. Bassler B, Wright M, Silverman M. 1994. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi, sequence and function of genes encoding a second sensory pathway. Mol Microbiol. 13,273-86.

22. Beatson S, Whitchurch C, Sargent J, Eevesque R; Mattick J. 2002. Differential regulation of twitching motility and elastase production' by Vfr in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol, 184,3605-13

23. Bertani I, Sevo M, Kojic M, Venturi V. 2003. Role of GacA, Lasl, Rhll, Ppk, PsrA, Vfr and ClpX3P in the regulation of the stationary-phase sigma factor rpoS/RpoS in Pseudomonas. Arch Microbiol. 180,264-71.

24. Blumer С, Heeb S, Pessi G, Haas, D. 1999. Global GacA-steered control of cyanide andexoprotease production in Pseudomonas fluorescens involves specific ribosome binding J sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,14073-14078.

25. Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding. Anal. Biochem. 72, 248-254

26. Branny P, Pearson J, Pesci E, Kohler T, Iglewski B, Van Delden C. 2001. Inhibition of quorum sensing by a Pseudomonas aeruginosa dksA homologue. J Bacteriol. 183,1531-9.

27. Brencic A, Winans S. 2005. Detection of and response to signals involved in host-microbe interactions by plant-associated bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 155-94

28. Burrowes E, Abbas A, O'Neill A, Adams C, O'Gara F. 2005. Characterisation of the regulatory RNA RsmB from Pseudomonas aeruginosa РАОГ. Res Microbiol. 156, 7-16.

29. Oalderwood, Ausubel F. 1997. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci: USA 94, 13245-13250.

30. Calfee M, Shelton J, McGubrey J, Pesci E. 2005. Solubility and bioactivity of the

31. Pseudomonas quinolone signal are increased by a Pseudomonas aeruginosa-produced surfac-tant. Infect. Immun. 73, 878-882.i

32. Cha C, Gao P, Chen Y, Shaw P, Farrand S. 1998. Production of acyl-homoserine lactone ' quorum-sensing signals by gram-negative plant-associated bacteria. Mol Plant Microbe1.teract. 11,1119-29

33. Chancey S, Wood D, Pierson III. L. 1999. Two-component transcriptional regulation of Nacyl-homoserine lactone production in Pseudomonas aureofaciens. Appl. Environ.1. Microbiol. 65, 2294-2299.

34. Chancey, S,. Wood D, Pierson III L. 2002. Survival of GacS/GacA mutants of thei"f biological control bacterium Pseudomonas aureofaciens 30-84 in the wheat rhizosphere.

35. Appl. Environ. Microbiol. 68,3308-3314

36. Charney J., Tomarelli R.M. 1947. Determination of the proteolytic activity of duodenaljuice. J. Biochem. 177, 501-505 ji 39. Chatteijee A, Cui Y, Hasegawa H, Chatterjee AK. 2007. PsrA, Pseudomonas Sigma

37. Regulator, controls regulators of epiphytic fitness, quorum sensing signal and plantiinteraction in Pseudomonas syringae pv tomato strain DG3000. Appl Environ Microbiol.2007 Jun;73(l l):3684-94is H

38. Chen X, Schauder S, Potier N, Van Dorsselaer A, Pelczer I, Bassler BL, Hughson FM. 2002. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature. 415, 545-9

39. Cheng H, Lessie T 1994. Multiple replicons constituting the genome of Pseudomonas cepacia 17616.176,4034-4042.

40. Cheryl A. Whistler, Pierson 1П L. 2003. Repression of Phenazine Antibiotic Production in Pseudomonas aureofaciens Strain 30-84 by RpeA J Bacteriol. 185, 3718—3725.

41. Chin-A-Woeng T, van den Broek D, Lugtenberg B, Bloemberg G. 2005. The Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 sigma regulator psrA represses the production of the antifungal metabolite phenazine-1-carboxamide. Mol Plant Microbe Interact. 18,244-53

42. Choi S; Greenberg E. 1991. The C-terminal regiomof the Vibrio fischeri LuxR protein contains an inducer-independent lux gene activating domain. Proc Natl.Acad Sci USA. 88,11115-9.

43. Choi-S, Greenberg E. 1992. Genetic dissection of DNA binding and luminescence gene activation by the Vibrio fischeri LuxR protein. J Bacteriol. 174, 4064-9.

44. Chugani S, Whiteley M, Lee K, D'Argenio D, Manoil C, Greenberg E. 2001. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 2752-7.

45. Chun C, Ozer E, Welsh M, Zabner J, Greenberg E. 2004. Inactivation of a Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal by human airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 3587-3590.

46. Collier, D, Anderson,L, McKnight S, Noah T, Knowles M, Boucher R, Schwab U, Gilligan P, Pesci E. 2002. A bacterial cell to cell signal in the lungs of cystic fibrosis patients. FEMS Microbiol. Lett. 215,41-46.

47. Conway B, Greenberg E, 2002. Quorum-sensing signals and quorum-sensing genes in Burkholderia vietnamiensis. J. Bacteriol. 184, 1187-1191.

48. Costertom J; Stewart P, Greenberg E. 1999. Bacterial biofilms, a common cause of persistent infections Science. 284, 1318-1322

49. Daniels R Vanderleyden J, Michiels J. 2004. Quorum sensing and swarming migration in bacteria FEMS Microbiol Rev. 28,261-89

50. Dassa E, Gahu M, Desjoyaux-Cherel B, Boquet P. 1982. The acid phosphatase with optimum pl l of 2.5 of Escherichia coli. Biol. Chem. 257, 6669-6676

51. Daubaras D, Hershberger C, Kitano K, Chakrabarty A 1995. Sequence analysis of a gene cluster involved! in metabolism; of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid!; by Burkholderia cepacia AC 1100. Appl. Environ. Microbiol. 61, 1279-1289:

52. Delaney S, Mavrod D, Bonsall R, Thomashow L. 2001. phzO, a Gene for Biosynthesis of 2-Hydroxylated Phenazine Compounds in Pseudomonas aureofaciens 30-84 J Bacteriol; 183, 318-327.

53. Dennis J, Zylstra G. 1998. Plasposons, modular self-cloning minitransposon derivatives for rapid geneticanalysis of gram-negative bacterial genomes. Appl Environ* Microbiol. 64, . 2710-5.k

54. Diggle S, Winzer K, Lazdunski A, Williams P, Camara M. 2002. Advancing the quorum in Pseudomonas aeruginosa, MvaT and the regulation of N-acylhomoserine lactone production and virulence gene expression. J Bacterid! 184, 2576-86;

55. Dingle J, Reid W, Solomons G. 1953. The enzymatic degradation of pectin. J. Sci. Food Agric. 4,149-155

56. Dong Y, Wang L, Xu J, Zhang H, Zhang X, Zhang L. 2001. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature. 411, 813-817.

57. Dong Y, Xu J, Li X, Zhang L. 2000. AiiA, an-enzyme that inactivates the acylhomoserinelactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proc.

58. Natl. Acad. Sci. USA. 97,3526-3531.

59. Dubern J, Lugtenberg B, Bloemberg G. 2006. The ppuI-rsaL-ppuR quorum-sensing system regulates biofilm formation of Pseudomonas putida PCL1445 by controlling biosynthesis of the cyclic lipopeptides putisolvins I and II. J Bacteriol. 188(8), 2898-906

60. Dykxhoorn D, St Pierre R, Linn T. 1996. A set of compatible tac promoter expression vectors.Gene. 177, 133-6.

61. Eberl L, Molina S, Givskov M. 1999. Surface Motility of Serratia liquefaciens MG1 Journal of Bacteriology. 181, 1703-1712

62. Eberl L. 2006. Quorum sensing in the genus Burkholderia. Int J Med Microbiol. 296, 10310.

63. Erickson D, Lines J, Pesci E, Venturi V, Storey D. 2004. Pseudomonas aeruginosa relA contributes to virulence in Drosophila melanogaster. Infect Immun. 72, 5638-45.

64. Finney A, Blick R, Murakami K, Ishihama A, Stevens A. 2002. Role of the C-terminal domain of the alpha subunit of RNA polymerase in LuxR-dependent transcriptional activation of the lux operon during Quorum Sensing. J. Bacteriol. 184, 4520-4528.

65. Fuqua C, Greenberg E. 1998. Self perception in,bacteria, quorum sensing with acylated homoserine lactones. Curr Opin Microbiol. 1, 183-9.

66. Fuqua C, Greenberg E. 2002. Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 685-695

67. Fuqua C, Parsek M, Greenberg E. 2001. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication, acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu Rev Genet.35,439-68.

68. Fuqua C, Winans S, Greenberg E. 1996. Census and consensus in bacterial ecosystems, the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. Annu Rev Microbiol. 50, 727-51.

69. Fuqua C, Winans S, Greenberg E. 1996. Census and'consensus in bacterial ecosystems, the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. Annu Rev Microbiol» 50, 727-51.

70. Fuqua W, Winans S, Greenberg E. 1994. Quorum sensing in bacteria, the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol. 176, 269-75

71. Gallagher L, Manoil C. 2001. Pseudomonas aeruginosa PAOl kills aenorhabditis elegans by cyanide poisoning. J. Bacteriol. 183, 6207-6214.

72. Gallagher L, McKnight S, Kuznetsova M, Pesci E, Manoil C. 2002. Functions required for extracellular quinolone signaling by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 6472-80.

73. Gambello M, Iglewski В. 1991. Cloning and characterization of the Pseudomonas aeruginosa lasR gene, a transcriptional activator of elastase expression. J Bacteriol. 173, 3000-9.

74. Gilligan P. 1995. Pseudomonas and Burkholderia. Manual of Clinical Microbiology. 509519.

75. Gilson L, Kuo A, Dunlap P. 1995. AinS and a new family of autoinducer synthesis proteins. J Bacteriol. 177, 6946-51.

76. Girard G, van Rij E, Lugtenberg B, Bloemberg G. 2006. Regulatory roles of psrA and rpoS in phenazine-l-carboxamide synthesis by Pseudomonas chlororaphis PCL1391. Microbiology. 152, 43-58

77. Givskov M," de Nys R, ManefieldM, Gram L, Maximilien R, Eberl L, Molin.S, Steinberg PD, Kjelleberg S. 1996. Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediated prokaryotic signalling. J Bacteriol. 178, 6618-22

78. Gonzalez J, Keshavan N. 2006. Messing with bacterial quorum sensing. Microbiol Mol Biol Rev. 70, 859-75

79. Gould T, Schweizer H, Churchill M. 2004. Structure of the Pseudomonas aeruginosa acyl-homoserinelactone synthase Lasl. Mol Microbiol. 53, 1135-46.

80. Gov Y, Bitler A, Dell'Acqua G, Torres J, Balaban N. 2001. RNAIII inhibiting peptide (RIP), a global inhibitor of Staphylococcus aureus pathogenesis, structure and function analysis. Peptides. 22, 1609-1620

81. Govan J, Deretic V. 1996. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis, mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol: 60, 539-574'.

82. Govan-J, Vandamme P. 1998. Agricultural and medical microbiology, a time for bridging gaps. Microbiol. 144, 2373-2375.

83. Gray K, Passador L, Iglewski B, Greenberg E. 1994. Interchangeability and specificity of components from the quorum-sensing regulatory systems of Vibrio fischeri and Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 176(, 3076-80.

84. Gugi B, Orange N, Hellio F, Burini J, Guillou C, Leriche F, Guespin-Mishel J. 1991. Effect of growth temperature on several exported enzyme activities in the psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens J. Bacteriol. 173, 3814-3820

85. Hanzelka В, Greenberg E. 1996. Quorum sensing in Vibrio fischeri, evidence that S-adenosylmethionine is the amino acid substrate for autoinducer synthesis. J Bacteriol. 178, 5291-4.

86. Heeb S, Blumer C, Haas D. 2002. Regulatory RNA as mediator in GacA/RsmA-dependent global control of exoproduct formation in Pseudomonas fluorescens CHAO. J. Bacteriol. 184, 1046-1056.

87. Heeb S, Haas D. 2001. Regulatory roles of the GacS/GacA two-component system in plant-associated and other gram-negative bacteria. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 1351-1363.

88. Hendrickson E, Plotnikova J, Mahajan-Miklos S, Rahme L & Ausubel F 2001. Differential roles of the Pseudomonas aeruginosa PA14 rpoN gene in pathogenicity in plants, nematodes, insects, and mice. J Bacteriol 183, 7126-7134.

89. Hengge-Aronis R. 2002. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the as (RpoS) subunit of RNA polymerase Microbiol. Molec. Biol.' Revs. 66, 373-395

90. Heurlier K, Denervaud V, Pessi G, Reimmann C, Haas D. 2003. Negative control of quorum sensing by RpoN (sigma54) in Pseudomonas aeruginosa PAOl. J Bacteriol. 185, 2227-35.

91. Hogardt M, Roeder M, Schreff A, Eberl L, Heesemann J. 2004. Expression of Pseudomonas aeruginosa exoS is controlled by quorum sensing and RpoS. Microbiology. 150, 843-51.

92. Holmes A, Govan J, Goldstein R. 1998. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia, a threat to human health. Emerg.Infect.Dis. 4, 221-227.

93. Houdt R. V., Givskov M., Michiels C.W. 2007. Quorum Sensing in Serratia. FEMS Microbiol. Rev. 31,407-424

94. Hubbell D, Morales V, Umali-Garcia M. 1978. Pectolytic enzymes in Rhizobium. Appl Environ Microbiol. 35, 210-3.

95. Huber B, Feldmann F, Kothe M, Vandamme P, Wopperer J, Riedel K, Eberl L. 2004. Identification of a novel virulence factor in Burkholderia cenocepacia Hill required for efficient slow killing of Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 72, 7220-7230.

96. Huber B, Riedel K, Givskov M, Molin S, Eberl L. 2002. Genetic analysis of genes involved in the late stages of biofilm formation in Burkholderia cepacia1 HI 11. Mol. Microbiol. 46, 411-426.

97. Huber B, Riedel K, Hentzer M, Hey dorm A', Gotschlich A, Givskov M, Molin S, Eberl L. 2001. The сер quorum-sensing system of Burkholderia cepacia Hill controls biofilm formation and swarming motility. Microbiology. 147,2517-28.

98. Jude F, Kohler T, Branny P, Perron K, Mayer MP, Comte R, van Delden C. 2003. Posttranscriptional control of quorum-sensing-dependent virulence genes by DksA in Pseudomonas aeruginosa. J Bacterid. 185, 3558-66

99. Juhas M, Wiehlmann L, Huber B, Jordan D, Lauber J, Salunkhe P, Limpert AS, von Gotz F, Steinmetz I, Eberl L, Tummler B. 2004. Global regulation of quorum sensing and virulence by YqsR in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 150, 831-41.

100. Kaplan H, Greenberg E. 1985. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. J Bacterid. 163, 1210-4

101. Kay E, Dubuis C, Haas D. 2005. Three small RNAs jointly ensure secondary metabolism and biocontrol in Pseudomonas fluorescens CHA0 Proc Natl Acad Sci USA. 102, 17136— 17141.

102. Kay E, Humair B, Denervaud Y, Riedel K, Spahr S, Eberl L, Valverde C, Haas D. 2006. Two GacA-Dependent Small RNAs Modulate the Quorum-Sensing Response in Pseudomonas aeruginosa. J Bacterid. 188, 6026-33

103. Kinscherf T, Willis D. 1999. Swarming by Pseudomonas syringae B728a requires gacS (lemA) and gacA but not the acylhomoserine lactone biosynthetic gene ahll. J Bacterid 181,4133-4136.

104. Kiratisin P, Tucker K, Passador L. 2002. LasR, a transcriptional activator of Pseudomonas aeruginosa virulence genes, functions as a multimer. J Bacteriol. 184, 4912-9.

105. Kitten T, Kinscherf T, McEvoy J, Willis D. 1998. A newly identified regulator is required for virulence and toxin production in Pseudomonas syringae. Mol Microbiol 28, 917—929.

106. Kojic M, Venturi V. 2001. Regulation of rpoS gene expression in Pseudomonas, involvement of a TetR family regulator. J Bacteriol. 183, 3712-20

107. Laville J, Voisard C, Keel C, Maurhofer M, Defago G. Haas D. 1992. Global control in Pseudomonas fluorescens mediating antibiotic synthesis and suppression of black root rot of tobacco. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1562-1566.

108. Ledgham F, Soscia C, Chakrabarty A, Lazdunski A, Foglino M. 2003. Global regulation in Pseudomonas aeruginosa, the regulatory protein AlgR2 (AlgQ) acts as a modulator of quorum sensing. Res Microbiol. 154, 207-13.

109. Lefebre M, Valvano M. 2002. Construction and evaluation ofplasmid vectors optimized for constitutive and regulated gene expression in Burkholderia cepacia complex isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5956-5964

110. Lennin E, DeCicco B. 1991. Plasmid of B.cepacia strains of diverse origins. Appl.Knviron.Microbiol. 57,2345-2350.

111. Lequette Y, Lee JH, Ledgham F, Lazdunski A, Greenberg E. 2006. A distinct QscR regulon in the Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing circuit. J Bacteriol. 188, 3365-70.

112. Lewenza S, Conway B, Greenberg E, Sokol PA. 1999. Quorum sensing in Burkholderia cepacia, identification of the LuxRI homologs CepRI. J. Bacteriology. 181, 748-756.

113. Lewenza S, Sokol P. 2001. Regulation of ornibactin synthesis and N-acyl-homoserine lactone production by CepR in Burkholderia cepacia. J. Bacteriol. 183,2212-2218.

114. Lewenza S., Visser M, Sokol P. 2002. Interspecies communication between Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol. 48, 707-16:

115. Lewenza. S, Conway B, Greenberg E, Sokol PA. 1999. Quorum sensing in Burkholderia cepacia, identification of the LuxRI homologs CepRI. J. Bacteriol. 181; 748-756.

116. Lin Y, Xu J, HuJ, Wang L, Ong S, Leadbetter J, Zhang L. 2003. Acyl-homoserine lactone acylase from Ralstonia strain XJ12B represents a novel and potent class of quorum-quenching enzymes. Mol. Microbiol. 47, 849-860.

117. LiPuma J, Mahenthiralmgam E. 1999. Commercial use of Burkholderia cepacia. Emerg.lnfect.Dis. 5,305-306.

118. Lonon M, Woods D, Straus D. 1988. Production of lipase by clinical isolates of Pseudomonas, cepacia.J Clin Microbiol. 26, 979-84

119. Lonon>M.K., Woods D.E., Straus D.C. 1988. Production of lipase by clinical isolates of Pseudomonas cepacia. J. Of Clinical Microbiology, 26, 979-984

120. Lupp C, Ruby G. 2004. Vibrio fischeri LuxS and AinS: comparative study of two signal synthases. J Bacteriol. 186, 3873-81

121. Lyon G, Novick R. 2004. Peptide signaling in Staphylococcus aureus and other Gram-positive bacteria. Peptides. 25,1389-1403

122. MacGregor C, Arora S, Hager P, Dail M, Phibbs P. 1996. The nucleotide sequence of the Pseudomonas aeruginosa pyrE-crc-rph region and the purification of the crc gene product. J Bacteriol. 178, 5627-563

123. Maddula V, Zhang Z, Pierson E, Pierson L 3rd Microb Ecol. 2006. Quorum sensing and phenazines are involved in biofilm formation by Pseudomonas chlororaphis (aureofaciens) strain 30-84. 52,289-301.

124. Mahajan-Miklos S, Tan MW, Rahme LG, Ausubel FM. 1999. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell 96,47-56.

125. Malott R, Baldwin A, Mahenthiralingam E, Sokol P. 2005. Characterization of the ccilR Quorum-Sensing System in Burkholderia cenocepacia. Infect Immun. 73, 4982-4992.

126. Massa C, Degrassi G, Devescovi G, Venturi V, Lamba D. 2007. Isolation, heterologous expression and characterization of an endo-polygalacturonase produced by the phytopathogen Burkholderia cepacia. Protein Expr Purif. 54, 300-308

127. Mavrodi D, Bonsall R, Delaney S, Soule M, Phillips G, Thomashow L. 2001. Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-l-carboxamide from Pseudomonas aeruginosa PAOl. J. Bacteriol. 183, 6454-6465

128. Mavrodi D, Ksenzenko V, Bonsall*R; Cook R, Boronin A, Thomashow L. 1998. A seven-gene locus for synthesis of phenazine-l-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens 2-79. J. Bacteriol. 180,2541-2548

129. McGrath S, Wade D, Pesci E. 2004. Dueling quorum sensing systems in Pseudomonas aeruginosa control the production4 of the Pseudomonas quinolone signal (PQS). FEMS Microbiol Lett. 230, 27-34.

130. McGuire R, Rodriguez-Palenzuela P, Collmer A, Burr T. 1991 Polygalacturonase Production by Agrobacterium tumefaciens Biovar 3. Appl Environ Microbiol. 57, 660-664.

131. McKenney D, Brown K, Allison D. 1995. Influence of Pseudomonas aeruginosa exporoducts on virulence factor production in Burkholderia cepacia, evidence of interspecies communication. J. Bacteriol. 177, 6989-6992.

132. McKnight S, Iglevvski B, Pesci E. 2000. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 182, 2702-8.

133. McLoughlin T, Quinn J, Bettermann A, Bookland R. 1992. Pseudomonas cepacia suppression of sunflower wilt fungus and role of antifungal compounds in controlling the disease. Appl. Environ. Microbiol. 58, 1760-1763.

134. Medina G, Juarez K, Diaz R, Soberon-Chavez G. 2003. Transcriptional regulation of Pseudomonas aeruginosa rhlR, encoding a quorum-sensing regulatory protein. Microbiology. 149,3073-81.

135. Medina G, Juarez K, Valderrama B, Soberon-Chavez G. 2003. Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter. J Bacteriol. 185, 597683.

136. Miller M, Bassler B. 200b. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-99:

137. Miller S, Xavier K, Campagna S, Taga M, Semmelhack M, Bassler B, Hughson F. 2004. Salmonella typhimurium recognizes a chemically distinct form of the bacterial quorum-sensing signal AI-2. Mol. Cell. 15, 677-687

138. Minogue T, Wehland-von Trebra, M, Bernhard, F, von Bodman SB. 2002. The autoregulatory role of EsaR, a quorum-sensing regulator in Pantoea stewartii ssp. stewartii, evidence for a repressor function: Mol Microbiol. 44, 1625-35

139. More M, Finger L, Stryker J, Fuqua C, Eberhard A, Winans S. 1996. Enzymatic synthesis, of a quorum-sensing autoinducer through use of defined substrates. Science. 272,1655-8.

140. Morello J, Pierson E, Pierson L 3rd: 2004. Negative cross-communication among wheat, rhizosphere bacteria, effect on antibiotic production by the biological, control; bacterium Pseudomonas aureofaciens 30-84. Appl Environ Microbiol. 70, 3103-9

141. Nomura K, Kato J, Takiguchi N, Ohtake H, Kuroda A. 2004. Effects of inorganic polyphosphate on the proteolytic and DNA-binding activities of Lon-in Escherichia coli. J Biol Chem. 279,34406-10

142. Novick R. 2003. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal, virulence: Mol. Microbiol. 48, 1429-1449

143. Parsek M, Val D, Hanzelka B, Cronan J, Greenberg E. 1999. Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4360-5.

144. Pearson J, Gray K, Passador L, Tucker K, Eberhard A, Iglewski B, Greenberg E. 1994. Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 197-201.

145. Pearson J, Passador L, Iglewski B, Greenberg E. 1995. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 1490-4.

146. Pearson J, Pesci E, Iglewski B. 1997. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of elastase and rhamnolipid biosynthesis genes. J Bacteriol. 179, 5756-67.

147. Pearson J, Van Delden C, Iglewski B. 1999. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals. J Bacteriol. 181, 1203-10.

148. Pernestig A, Melefors O, Georgellis D. 2001. Identification of UvrY as the cognate response regulator for the BarA sensor kinase in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 276, 225231.

149. Pesci E, Milbank J, Pearson J, McKnight S, Kende A, Greenberg E, Iglewski B. 1999. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 11229-34.

150. Pessi G, Haas D. 2000. Transcriptional4 control of the hydrogen cyanide biosynthetic genes hcnABC by the anaerobic regulator ANR and the quorum-sensing regulators LasR and RhlR in "Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 182, 6940-9.

151. Pessi G, Haas D. 2001. Dual control of hydrogen cyanide biosynthesis by the global activator GacA in Pseudomonas aeruginosa PAOl. FEMS Microbiol Lett. 200, 73-8.

152. Pierson E, Wood D, Cannon J, Blachere F,. Pierson III LS 1998. Mol. Plant-Microbe Interact. 11, 1078-1084,

153. Pierson L, III, Gaffney T, Lam S, Gong F. 1995. Molecular analysis of genes encoding phenazine biosynthesis in the biological control bacterium Pseudomonas aureofaciens 3084. FEMS Microbiol. Lett. 134, 299-307.

154. Pierson L, III, Thomashow L. 1992. Cloning and heterologous expression of the phenazine biosynthetic locus from Pseudomonas aureofaciens 30-84. Mol. Plant-Microbe. Interact. 5, 330-339.

155. Quinones B, Pujol C, Lindow S. 2004. Regulation of AHL production and its contribution to epiphytic fitness in Pseudomonas syringae. Mol Plant Microbe Interact 17, 521—531.

156. Rampioni G, Bertani I, Zennaro E, Polticelli F, Venturi V, Leoni L. 2006. The quorum-sensing negative regulator RsaL of Pseudomonas aeruginosa binds to the lasl promoter. J Bacteriol. 188, 815-9.

157. Rashid M, Rumbaugh K, Passador L, Davies D, Hamood A, Iglewski B, Kornberg A. 2000. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9636-41.

158. Reimmann» C, Valverde C, Kay E, Haas, D. 2005. Posttranscriptional repression, of GacS/GacA-controlled genes by the RNA-binding protein RsmE acting together with RsmA in the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens CHA0. J. Bacteriol. 187, 276-285.

159. Rich J, Kinscherf T, Kitten T. Willis D. 1994. Genetic evidence that the gacA gene encodes the cognate response regulator for the lemA sensor in Pseudomonas syringae. J. Bacteriol. 176, 7468-7475.

160. Rosales A, Thomashow L, Cook R, Mew T. 1995. Isolation and Identifikation of Antifungal Metabolites Produced by Rice-Assotiated Antagonistic Pseudomonas spp. Phytopathology. 1028-1032.

161. Schaefer A, Hanzelka B, Eberhard A, Greenberg E. 1996. Quorum sensing in Vibrio fischeri, probing autoinducer-LuxR interactions with autoinducer analogs. J Bacteriol. 178, 2897-901.

162. Schauder S, Bassler B. 2001. The languages of bacteria. Genes Dev. 15, 1468-80.

163. Schell M, Roberts D, Denny T. 1988. Analysis of the Pseudomonas solanacearum polygalacturonase encoded by pglA and its involvement in phytopathogenicity.J Bacteriol. 170, 4501-8.

164. Schuster M, Hawkins A, Harwood C, Greenberg E. 2004. The Pseudomonas aeruginosa RpoS regulon and its relationship to quorum sensing. Mol Microbiol. 51, 973-85.

165. Schuster M, Lostroh C, Ogi T, Greenberg E. 2003. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes, a transcriptome analysis. J Bacteriol. 185,2066-79.

166. Schuster M, Urbanowski M, Greenberg E. 2004. Promoter specificity in Pseudomonas aeruginosa quorum sensing revealed by DNA binding of purified LasR. Proc Natl Acad Sci USA. 101,15833-9

167. Schweder T, Lee K, Lomovskaya O, Matin A. 1996.- Regulation of Escherichia coli starvation sigma factor by ClpXP protease. J. Bacteriol. 178, 470-476

168. Schweizer H. 1992. Allelic exchange in Pseudomonas aeruginosa using novel ColEl-type vectors and a family of cassettes, containing a portable oriT and the counter-selectable Bacillus subtilis sacB marker. Moll Microbiol. 6,1195-1204.

169. Shaw- P, Ping G, Daly S, Cha C, Cronan Jr J, Rinehart K, Farrand S. 1997. Detecting and characterizing N-acyl-homoserine lactone signal, molecules by thin-layer chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6036-6041

170. Slock. J, VanRiet D, Kolibachuk D, Greenberg E. 1990. Critical regions of the Vibrio fischeri luxR protein defined by mutational analysis. J Bacteriol. 172, 3974-9.

171. Smith R, Harris S, Phipps R, Iglewski B. 2002. The Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone contributes to virulence and induces inflammation in vivo. J. Bacteriol. 184, 1132-1139.

172. Steidle A, Allesen-Holm M, Riedel K, Berg G, GivskovM,Molin S & Eberl L. 2002. Identification and characterization- of an- Nacylhomoserine lactone-dependent quorum-sensing system in Pseudomonas putida strain IsoF. Appl Environ Microbiol 68, 6371-6382.

173. Stevens A, Dolan K, Greenberg E. 1994. Synergistic binding of the Vibrio fischeri LuxR transcriptional activator domain and RNA polymerase to the lux promoter region. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12619-23.

174. Stevens A, FujitaN, Ishihama A, Greenberg E. 1999. Involvement of the RNA polymerase alpha-subunit C-terminal domain in LuxR-dependent activation of the Vibrio fischeri luminescence genes. J Bacteriol. 181, 4704-7.

175. Stevens A, Greenberg E. 1997. Quorum sensing in Vibrio fischeri, essential elements for activation of the luminescence genes. J Bacteriol. 179(2),557-62.

176. Suh S, Runyen-Janecky L, Maleniak T, Hager P, MacGrcgor C, Zielinski-Mozny N, Phibbs P, West S. 2002. Effect of vfr mutation on global gene expression and catabolite repression control of Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 148,1561-9

177. Surrette M, Bassler B. 1998. Quorum sensing in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7046-50

178. Taga M, Bassler B. 2003. Chemical communication among bacteria. PNAS 100, suppl. 2,14549-14554

179. Taylor R, Gaya H, Hodson M 1993. Pseudomonas cepacia, pulmonary infection in patients with cystic fibrosis. Respir. Med. 87, 187-192.

180. Tendeng C, Soutourina OA, Danchin A & Bertin PN 2003. MvaT proteins in Pseudomonas spp. a novel class of H-NS-like proteins. Microbiology 149, 3047-3050

181. Teplitski M, Goodier RI, Ahmer BMM. 2003. Pathways leading from BarA/SirA to motility and virulence gene expression in Salmonella. J1. Bacteriol. 185,7257-7265.

182. Thomashow L, Weller D. 1988. Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici. J. Bacteriol. 170, 3499-3508.

183. Torriani A. 1960. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatases by Escherichia coli Biochim. Biophys. Acta. 38,460-469

184. Yal D, Cronan J. 1998. In vivo evidence that S-adenosylmethionine and fatty acid synthesis intermediates are the substrates for the Luxl family of autoinducer synthases. J Bacteriol. 180(10),2644-51.

185. Vallet-Gely I, Donovan K, Fang R, Joung J, Dove S. 2005. Repression of phase-variable cup gene expression by H-NS-like proteins in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 11082-7.

186. Vannini A, Volpari C, Gargioli C, Muraglia E, Cortese R, De Francesco R, Neddermann P, Marco S. 2002. The crystal structure of the quorum sensing protein TraR bound to its autoinducer and target DNA. EMBO J. 21,4393-401.

187. Ventre I, Ledgham F, Prima V, Lazdunski A, Foglino M, Sturgis J. 2003. Dimerization of the quorum sensing regulator RhlR, development of a method using EGFP fluorescence anisotropy. Mol Microbiol. 48,187-98.

188. Venturi V. 2006. Regulation of quorum sensing in Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 30, 274-91

189. Wagner V, Gillis R, Iglewski B. 2004. Transcriptome analysis of quorum-sensing regulation and.virulence factor expression in Pseudomonas aeruginosa: Vaccine. SI5-20.

190. Walters M, Sperandio V. Quorum sensing in Escherichia coli and Salmonella. 2006. Int. J. Med. Microbiol 296,125-131

191. Waters C, Bassler B. 2005. Quorum sensing, cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 319-46.

192. Watson W, Minogue T, Val D, von Bodman S, Churchill M. 2002. Structural" basis and specificity of acyl-homoserine lactone signal production in bacterial quorum sensing. Mol' Cell: 9, 685-94.

193. Wei J, Tsai Y, Horng Y, Soo P, Hsieh S, Hsueh P, Horng J, Williams P, Lai H. 2006. A mobile quorum-sensing system in Serratia marcescens. J Bacteriol. 188, 1518-25.

194. Weller D. 1988. Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 26, 379-407

195. West S, Sample A, Runyen-Janecky L. 1994. The vfr gene product, required for Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and protease production, belongs to the cyclic AMP receptor protein family. J'Bacteriol 176, 7532-42

196. Whiteley M, Greenberg E. 2001. Promoter specificity elements in Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing-controlled genes. J Bacteriol. 183, 5529-34

197. Whiteley M, Lee K, Greenberg E. 1999. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13904-9.

198. Whiteley M, Parsek M, Greenberg E. 2000. Regulation of quorum sensing by RpoS in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 182, 4356-60.

199. Wood D, Gong M, Daykin M, Williams P, Pierson III L. 1997. N-Acyl-homoserine lactone-mediated regulation of phenazine gene expression by Pseudomonas aureofaciens 30-84 in the wheat rhizosphere. J. Bacteriol. 179,7663-7670

200. Wood D, Pierson L III. 1996. The phzl gene of Pseudomonas aureofaciens 30-84 is responsible for the production of a diffusible signal required for phenazine antibiotic production. Gene. 108,49-53.

201. Xavier K, Bassler B. 2005. Interference with AI-2-mediated' bacterial cell-cell communication. Nature. 437,750-753

202. Xiao G, He J, Rahme L. 2006. Mutation analysis of the Pseudomonas aeruginosa mvfR and pqsABCDE gene promoters demonstrates complex quorum-sensing circuitry. Microbiology. 152, 1679-86.

203. Yao Y, Martinez-Yamout M, Dickerson T, Brogan A, Wright P, Dyson H. 2006. Structure of the Escherichia coli quorum sensing protein SdiA, activation of the folding switch by acyl homoserine lactones. J. Mol. Boil, 355, 262-273.

204. Zhang R, Pappas T, Brace J, Miller P, Oulmassov T, Molyneaux J, Anderson J, Bashkin-J, Winans S, Joachimiak A. 2002. Structure of a bacterial quorum-sensing transcription factor complexed with pheromone and DNA. Nature. 417, 971-4.

205. Zhang Z, Pierson III LS. 200li A second quorum-sensing-system regulates cell surface properties but not phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureofaciens. Appl.' Environ. Microbiol. 67, 4305-4315

206. Zhu J, Beaber JW, More M, Fuqua C, Eberhard A, Winans S. 1998. Analogs of the autoinducer 3-oxooctanoyl-homoserine lactone strongly inhibit activity of the TraR protein of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol. 180, 5398-405.

207. Zhu J, Miller M, Vance R, Dziejman M, Bassler В., Mekalanos J. 2002. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad: Sci. USA. 99,3129-3134

208. Zhu J, Winans S. 2001. The quorum-sensing transcriptional regulator TraR requires its cognate signaling ligand for protein folding, protease resistance, and dimerization. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 1507-12