АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспрессии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Мелькина, Ольга Евгеньевна

• Мелькина, Ольга Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мелькина, Ольга Евгеньевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Цели и задачи

Научная новизна и практическая значимость работы

Структура работы

Апробация работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Quorum Sensing системы

1.1. LuxI/LuxR-зависимая регуляция биолюминесценции у морских бактерий A. fischeri

1.2. Ацил-Ь-гомосерин лактоны (AHL) и их взаимодействие с LuxRподобными белками

1.3. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов, входящих в регулоны систем QS

Глава 2. АТФ-зависимые протеазы и шапероны

2.1. Молекулярные шапероны бишаперонной системы DnaKJE-ClpB

2.2. Шаперонины GroEL/GroES

2.3. Участие малых белков-шаперонов и шаперона ClpA в процессах дезагрегации и рефолдинга белков

2.4. АТФ-зависимые протеазы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

3.2. Генно-инженерные методы

3.3. Конструирование плазмид

3.4. Выделение и очистка химерных белков

3.5. Измерение экспрессии генов /torlCDABEG A. fischeri в клетках coli

3.6. Термоинактивация и рефолдинг люциферазы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 46

Глава 4. Исследование влияния и*механизма действия*шаперонина

GroEE на фолдинг- белкаЬихЫ и его делетированных форм 46'

4.1. Ролыиаперонина GroEL и кошаперонина GroES-в регуляции экспрессии генов livc-onepouaA.fîscheri в клетках Е. coli

4l2i Аффинная очистка белка LuxR; его С - и N - доменов

Электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле белка LuxR, его С - и N - доменов*

4.3*. Компенсация gro мутации высокимиконцентрациями аутоиндуктора

Глава1 5: Роль АТФ-зависимых протеаз Lon и» GlpXP в регуляции экспрессии генов /шс-оперона A.fischeri в клетках^. coli

5.1'. Протеолитический контроль регуляции экспрессии генов /ш:-оперона

A. fischeri в клетках Е. coli

5.2. Защитное действие АИ против протеаз Lon и ClpXP

5;3. Исследование влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм

5.4. Сравнение цельного LuxR и его С-домена по эффективности действиям качестве активатора транскрипции /шг-оперона A.fischeri

Глава 6. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов при термоинактивации белков* в клетке

6.1. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов семейства HsplOO при термоинактивации бактериальной люциферазы А. fischeri в клетках Е. coli

6.2. Влияние мутации в гене clpA на индукцию белков «теплового шока»

6.3. Влияние шаперонов IbpAB на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальной люциферазы A. fischeri в клетках Е. coli

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспрессии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri»

Актуальность проблемы. Системы регуляции экспрессии генов- типа "Quorum Sensing" (QS) у бактерий определяют тесную связь процесса транскрипции с плотностью популяции, - экспрессия группы генов начинается^ лишь при достижении популяцией бактерий определенной (критической) концентрации. Сам термин QS был впервые введен-в обиход в 1994 г Greenberg Е.Р. с сотр. (Fuqua W.C., et al., 1994). Однако феномен типа QS был обнаружен значительно раньше (в 1970-е гг) у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы /гаг-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). По названию ключевых генов /г/х-оперона A. fischeri livcl и luxR в последствие подобные системы относили к механизму регуляции типа LuxI/LuxR (Meighen Е.А., 1991).

В настоящее время QS регуляция обнаружена у большого числа видов как грам-положительных, так и грам-отрицательных бактерий и показано, что QS системы играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации и др.

Особенно велика роль QS систем в регуляции процессов взаимодействия патогенных бактерий с эукариотическим организмом - хозяином. Инфекционный процесс непосредственно связан с достижением популяцией патогенных бактерий критической плотности и соответственно с синхронным синтезом факторов вирулентности.

QS система также регулирует экспрессию генов, участвующих в формировании биопленки, которая является существенным фактором патогенности, так как при этом значительно повышается устойчивость бактерий к антибактериальным препаратам и защитному действию иммунной системы хозяина. Поэтому использование блокаторов QS системы в настоящее время рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии.

Представляет особый интерес определить связь систем QS с основными* энергозависимыми системами в клетке, а именно, с АТФ-зависимыми протеазами и шаперонами, которые осуществляют деградацию денатурированных и ошибочно синтезированных белков (протеазы) ж проводят фолдинг и рефолдинг белков (шапероны).

Известно, что АТФ-зависимые протеазы и* шапероны также играют важную роль в ряде регуляторных каскадов, например, при переходе клеток, в стационарную фазу, при<"тепловом -шоке" и др. (Gottesman S., 1999; Weihart D. et al, 2003; TomoyasuT. et al, 2001). В настоящей работе на модели /их-оперона морских бактерий A. fischeri проведено изучение роли АТФ-зависимых протеаз и шаперонов в качестве модуляторов QS системы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена поиску генов в хромосоме бактерий Escherichia coli, белки-продукты которых влияют на эффективность действия системы регуляции типа-QS. В'качестве модельной системы QS используется /шг-оперон- (/mxRICDABEG) морских светящихся бактерий A. fischeri. Предполагалось исследовать влияние белков-шаперонов и АТФ-зависимых протеаз на активность, белков-регуляторов, системы QS и ферментов люцифераз, гены которых (/шАВ) входят в состав /ш;-оперона. В работе решались следующие задачи:

1. Исследование влияниями механизма действия шаперонинов GroEL/GroES (семейство Hsp60) на фолдинг белка LuxR и его делетированных форм.

2. Исследование влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм. Проведение сравнительного анализа влияния Ьоп-протеазы на1 экспрессию генов lux-оперона A. fischeri в специально сконструированных модельных системах, в состав которых входят как плазмида с генами /их-оперона, так и плазмиды с фрагментами ДНК, кодирующими полный LuxR или его С-домен.

3. Изучение механизма защитного действия белков - шаперонов семейства HsplOO и малых белков - шаперонов при термоинактивации белков в клетке. Получение данных о влиянии- белков - шаперонов семейства С1р на рефолдинг белков.

Научная новизна. Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N — домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Ьоп-протеазы и определяющий контакт полипептида с шапероном GroEL, необходимого для сборки нативной структуры LuxR. Впервые показано, что при DnaK-DnaJ-GrpE-зависимом рефолдинге денатурированных белков в клетках Е. coli значительное влияние на скорость и уровень рефолдинга оказывают малые шапероны- IbpA и особенно IbpB, а также шаперон ClpA, принадлежащий семейству HsplOO.

Практическая значимость. Основные результаты работы могут быть использованы на' практике: применение плазмиды с генами ibpAb при суперпродукции гетерологичных белков в бактериальных клетках Е. coli для повышения их растворимости; использование генов, кодирующих АТФ-зависимые протеазы, для ингибйрования систем QS и, как следствие, для снижения активности вирулентных генов у патогенных бактерий.

Структура работы. Диссертация изложена на 95 листах машинописного текста, включая 30 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает 125 работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Мелькина, Ольга Евгеньевна

выводы

1 Показано, что шаперонин GroEL системы GroEL/ES необходим для фолдинга цельного LuxR, но не его С-домена;

2 Показано, что АТФ-зависимые протеазы Lon и ClpXP осуществляют протеолитический контроль экспрессии генов /шс-оперона Aliivibrio fischeri в клетках Escherichia coli;

3 Показано, что мишенью для протеазы Lon является цельный LuxR, а не его С-домен;

4 Показано участие шаперона ClpA (семейство HsplOO) в рефолдинге термоинактивированной люциферазы при пролонгированной термоинактивации;

5 Показано, что мутации в генах ibpA и ibpB снижают скорость и уровень рефолдинга, причем недостаток шаперона IbpB сказывается сильнее, чем недостаток шаперона IbpA;

6 Показано, что повышенное содержание белков IbpA и IbpB, компенсируя дефекты в генах ibpA и ibpB, не компенсирует дефекты в гене clpA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляторный белок LuxR состоит из двух доменов. N - домен (162 аминокислотных остатка) ответственен за связывание с АИ, а С - домена (88 аминокислотных остатков) ответствен за связывание с ДНК. В настоящей работе впервые показано, что действие шаперонинов GroEL/GroES и АТФ -зависимой протеазы Lon ограничивается N-доменом. В то время как С -домен резистентен к действию Lon протеазы, а его фолдинг не зависит от активности GroEL/GroES шаперонинов. Показано также, что в отсутствии GroEL/GroES шаперонинов высокие концентрации АИ (примерно в 100 раз выше нормы) обеспечивают правильную сборку белка LuxR. При связывании АИ с LuxR комплекс LuxR-АИ становится резистентным к действию протеаз. Настоящие результаты свидетельствуют, что у LuxR-подобных регуляторов собственно регуляторную функцию осуществляет N -домен, который «чувствует» не только наличие в среде специфических АИ, но также и определенные стрессовые воздействия как, например, «тепловой шок», переход клетки в стационарную фазу и др.

В настоящей работе впервые показано влияние шаперона С1рА (семейство НврКЮ) на РпаКШ зависимый рефолдинг термоинактивированных люцифераз. Показано, что влияние С1рА имеет место лишь при пролонгированном инкубировании клеток при высокой температуре, т.е. при условии формирования в клетке крупных белковых агрегатов. Малые шапероны 1ЬрАВ (семейство БШр) также участвуют в БпаЮЕ - зависимом рефолдинге люцифераз, однако в отличие от шаперона С1рА их действие проявляется и при малых временах термоинактивации. Показано, что наличие в клетке избытка шаперонов 1ЬрАВ не компенсирует недостачу шаперона С1рА. Предполагается, что шапероны 1ЬрАВ и С1рА действуют на разных этапах процессов дезагрегации и ренатурации белков и независимо друг от друга.

Результаты нашего исследования подтверждают гипотезу о регуляторной роли шаперонинов ОгоЕЬЛлгоЕЗ и АТФ - зависимых протеаз Ьоп и С1рХР в экспрессии генов С^Б системы типа Ьих1/Ьих11, в то время как шапероны С1рА, 1ЬрАВ и БпаКШ, необходимы для дезагрегации и рефолдинга термоденатурированных структурных белков /шс-оперона А. Азскеп.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мелькина, Ольга Евгеньевна, 2010 год

1. Atkinson S., Throup J.P., Stewart G.S., Williams P. 1999. A hierarchical quorum-sensing system in Yersinia pseudotuberculosis is involved in the regulation of motility and clumping. Mol Microbiol. 33, 1267-77.

2. Ahmer B.M., van Reeuwijk J., Timmers C.D., Valentine P.J., Heffron F. 1998. Salmonella typhimurium encodes an SdiA homolog, a putative quorum sensor of the LuxR family, that regulates genes on the virulence plasmid // J. Bacteriol. 180, 1185-1193.

3. Baldwin T.O., Christopher J.A., Raushel F.M:, Sincjair J.F., Ziegler M.M., Fisher A.J., Rayment I. 1995. Structure of bacterial luciferase. // Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 798-809.

4. Bairoch A., Apweiler R. 2000. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL 2000. // Nucleic Acids Res. 28, 45-48.

5. Bansal K., Yang K., Nistala G.J., Gennis R.B., Bhalerao K.D. 2010. A positive feedback-based gene circuit to increase the production of a membrane protein. // J Biol Eng. May 25; 4:6.

6. Bauer W.D., Robinson J.B. 2002. Disruption of bacterial quorum sensing by other organisms. // Curr Opin Biotechnol. 13, 234-7.

7. Ben-Zvi A.P., Goloubinoff P. 2001. Review: mechanism of disaggregation and refolding of stable protein aggregates by molecular chaperones. // J. Struct Biol. 135,84-93.

8. Bertani I., Rampioni G., Leoni L., Venturi L. 2007. The Pseudomonas putida Lon protease is involved in N-acyl homoserine lactone quorum sensing regulation II BMC Microbiology. 7, 71-79.

9. Bukau B., Horwich A. 1. 1998. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. I/Cell. 92, 351-366.

10. Campbell J., Lin Q., Geske G.D., Blackwell H.E. 2009. New and unexpected insights into the modulation of LuxR-type quorum sensing by cyclic ¿peptides.//ACS Chem Biol. 4, 1051-1059.

11. Chatterjee J., Meighen E.A. 1995. Biotechnical applications of bacterial bioluminescence (lux) genes. // Photochem. Photobiol. 62, 641-650.

12. Chai Y., Winans S.C. 2004. Site-directed mutagenesis of a LuxR-type quorum-sensing transcription factor: alteration of autoinducer specificity. // Mol Microbiol. 51, 765-76.

13. Chandu D., Nandi D. 2004. Comparative genomics and functional roles of the ATP-dependent proteases Lon and Clp during cytosolic protein degradation. // Res. Microbiol. 155,710-719

14. Cohn D.H., Ogden R.C., Abelson J.N., Baldwin T.O., Nealson K.H., Simon M.I., Mileham A.J. 1983. Cloning of the Vibrio harveyi luciferase genes: use of a synthetic oligonucleotide probe. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 120-123.

15. Cyr D.M., Langer T., Douglas M.G. 1994. DnaJ-like proteins molecular chaperones and specific regulators of Hsp70. //Trends Biochem. Sci. 19, 176181.

16. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. 1998. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 280, 295-298.

17. Diamant S., Ben-Zvi A.P., Bukau B., Goloubinoff P. 2000. Size-dependent disaggregation of stable protein aggregates by the DnaK chaperone machinery. HJ. Biol. Chem. 275, 21107-21113.

18. Dougan D.A., Reid B.G., Horwich A.L., Bukau B. 2002. ClpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. //Mol. Cell. 9, 673-683.

19. Dougan D.A., Mogk A., Bukau B. 2002. Protein folding and degradation in bacteria: to degrade or not to degrade? That is the question. // Cell. Mol Life Sci. 59, 1607-1616

20. Dunlap P.V., Greenberg E.P. 1988. Control of Vibrio fischeri lux gene transcription by a cyclic AMP receptor protein-luxR protein regulatory circuit. H J. Bacteriol. 170, 4040-4046.

21. Eberhard A. 1972. Inhibition and activation »of bacterial luciferase synthesis. // J: Bacteriol 109,1101-1105.

22. Eberhardi A., Burlingame A.L., Eberhard C., Kenyon G.L., Nealson K.H., Oppenheimer N.J.1981. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase // Biochemistry. 20, 2444-2449.

23. Egland K.A., Greenberg E.P. 1999. Quorum1 sensing in Vibrio fischeri: elements of the luxl promoter. Il Mol. Microbiol 31,1197-1204.

24. Egland K.A., Greenberg E.P. 2000. Conversion of the Vibrio fischeri transcriptional activator, LuxR, to a repressor. // J. Bacteriol 182, 805-811.

25. Engebrecht J., Nealson K., Silverman M. 1983. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri II Cell 32,. 773781. '

26. Fuqua W.C., Greenberg E.P: 1998. Self perception in bacteria: quorum sensing with acylated homoserine lactones. // Curr. Opin. Microbiol 1, 183-189.

27. Fuqua C., Parsek M.R., Grenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. 2001. // Annu. Rev. Genet. 35, 439-468

28. Fuqua W.C., Winans S.C. 1994. A LuxR-LuxI type regulatory system activates Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant tumor metabolite. II J. Bacteriol 176, 2796-2808.

29. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1994. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. // J. Bacteriol 176, 269-275.

30. Fuqua C., Winans S.C., Greenberg E.P. 1996. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. // Annu. Rev. Microbiol 50, 727-751.

31. Garcia-Lara J., Shang L.H., Rothfield L.I. 1996. An extracellular factor regulates expression of sdiA, a transcriptional activator of cell division genes in Escherichia coli. II J. Bacteriol. 178, 2742-2748.

32. Georgopoulos C.P., Hendrix R.W., Casjens S.R., Kaiser A.D. 1973. Host participation in bacteriophage lambda head assembly. // J. Mol. Biol. 76, 43-60.

33. Givskov M, de Nys R, Manefield M, Gram L, Maximilien R, Eberl L, Molin S, Steinberg PD, Kjelleberg S. 1996. Eukaryotic interference with, homoserine lactone-mediatedprokaryotic signalling. // J Bacteriol. 178, 6618-22.

34. Glessner A., Smith E.S., Iglewski B.H., Robinson J.P. 1999. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of twitching motility. // J. Bacteriol. 181, 1623-1629.

35. Goloubinoff P., Mogk A., Ben-Zvi A.P., Tomoyasu T., Bukau B. 1999. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. UProc: Natl. Acad. Sei. USA. 96, 1373213737.

36. Gottesman S., Roche E., Zhou Y., Sauer R.T. 1998. The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. // Gen. Dev. 12, 1338-1347

37. Gottesman S. 1999. Regulation by proteolysis: developmental switches. // Curr. Opin Microbiol. 2, 142-147.

38. Han M-J., Yoon S.S., Lee S.Y. 2001. Proteomic analysis of metabolically engineered Escherichia coli producing poly (3-hydroxybutyrate). // J. Bacteriol. 183,301-308.

39. Hartl F.U. 1996. Molecular chaperones in cellular protein folding. I ¡Nature. 381,571-570.

40. HoldenM.T., Swift S., Williams P. 2000. New signal molecules on the quorum-sensing block // Trends Microbiol. 8, 101-103.

41. Horwich A.L., Apetri A.C., Fenton W.A. 2009 The GroEL/GroES cis cavity as a passive anti-aggregation device. // FEBS Lett. 583, 2654-2662.

42. Hoskins J.R., Pak M., Maurizi M.R., Wickner S. 1998. The role of the ClpA chaperone in,proteolysis by ClpAP. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1213512140.

43. Hoskins J.R., Singh S.K., Maurizi M.R., Wickner S. 2000. Protein binding'and unfolding by the chaperone ClpA and degradation by the protease ClpAP. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 8892-8897.

44. Hoskins J.R., Yanagihara K., Mizuuchi K., Wickner S. 2002. ClpAP and ClpXP degrade proteins with tags located in the interior of the primary sequence. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 11037-11042.

45. Ishikawa T., Maurizi M.R., Steven A.C. 2004. The N-terminal substrate-binding domain of ClpA unfoldase is highly mobile and extends axially from the distal surface of ClpAP protease. IIJ. Struct. Biol. 146, 180-188.

46. Jenal U., Hengge-Aronis R. 2003. Regulation by proteolysis in bacterial cells. // Curr. Opin. Microbiol. 6, 163-172.

47. Kaplan H.B., Greenberg E.P. 1985. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. // J. Bacteriol. 163, 12101214.

48. Kiratisin P., Tucker K.D., Passador L. 2002. LasR, a transcriptional activator of Pseudomonas aeruginosa virulence genes, functions as a multimer. // J Bacteriol. 184,4912-9.

49. Koch Bl, Liljefors T., Persson T.*, Nielsen J.1, Kjelleberg S., Givskov M. 2005. The LuxR receptor: the sites of interaction with quorum-sensing signals and. inhibitors. II Microbiology. 151, 3589-602.

50. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head" of bacteriophage T4'. Nature. 227:680-685.

51. Langer T., Pfeifer G., Martin J., Baumeister W., Hartl F.-U. 1992. Chaperonin-mediated protein folding GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein-substrate within its central cavity. I/EMBO J. 11, 4757-4765.

52. Laskowska E., Wawzynow A'., Taylor A. 1996. IbpA and" IbpB, the new heat-shock proteins, bind to endogenous Escherichia coli proteins aggregated intracellularly by heat shock. IIBiochimie. 78, 117-122.

53. Luo Z.Q., Su S., Farrand S.K. 2003. In situ activation of the quorum-sensing transcription factor TraR by cognate and noncognate acyl-homoserine lactone ligands: kinetics and consequences. 11J Bacteriol. 185, 5665-72.

54. Lutz R., Bujard H. 1997. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Ii-l2 regulatory elements. // Nucleic Acids Research. 25, 1203-1210.

55. Makovets S., Titheradge A J., Murray N.E. 1998. ClpX and ClpP are essential for the efficient acquisition of genes specifying type IA and IB restriction systems. // Mol. Microbiol. 28, 25-35

56. Mandel M., Higa A. 1970. Calcium dependent bacteriophage DNA infection. // J.Mol.Biol. 53, 154-162.

57. Maniatis T., Fritsh F., Sambrook J. 1989. Molecular cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.

58. Manefield M., Rasmussen T.B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. 2002. Halogenated fiiranones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover. // Microbiology. 148, 1119-27.

59. Marketon M.M., Gronquist M.R., Eberhard A., Gonzales J.E. 2002. Characterization of the Sinorhizobium meliloti sinR/sinl locus and the production of novel N-acyl homoserine lactone. // J. Bacteriol. 184, 5686-5695.

60. Mayer M.P., Bukau B. 1998. Hsp70 chaperone systems: diversity of cellular functions and mechanism of action. UBiol. Chem. 379, 261-268.

61. McKnight S.L., Iglewski B.H., Pesci E.C. 2000. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. II J. Bacteriol. 182, 2702-2708.

62. Medina G., Juarez K., Valderrama В., Soberon-Chavez G. 2003. Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter. II J. Bacteriol. 185, 5976-5983.

63. Meighen E.A. 1991.Molecular biology of bacterial bioluminescence. I I Microbiol. Rev. 55, 123-142.

64. Миллер Дж. 1979. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир.

65. Miller S.T., Xavier К.В., Campagna S.R., Taga M.E., Semmelhack M.F., Bassler B.L., Hughson F.M. 2004. Salmonella typhimurium recognizes a chemically distinct form of the bacterial quorum-sensing signal AI-2. // Mol. Cell. 15, 677-687.

66. Minogue T.D, Wehland-von Trebra M, Bernhard F, von Bodman S.B. 2002. The autoregulatory role of EsaR, a quorum-sensing regulator in Pantoea stewartii ssp. stewartii: evidence for a repressor function. // Mol Microbiol. 44, 1625-35.

67. Mogk A., Deuerling E., Vorderwwulbecke S., Yierling E., Bukau B. 2003. Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional trade in reversing protein aggregation. I I Molecular Microbiol. 50, 585-595.

68. Mogk A., Tomoyasa Т., Goloubinoff P., Rudiger S., Roder D., Langen H., Bukau B. 1999. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins:prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. HEMBO J. 18, 6934-6949.

69. Nasser W., Reverchon S. 2006. New insights into the regulatory mechanisms of the LuxR family of quorum sensing regulators. // Anal Bioanal Chem. 387, 381-390

70. Nealson K.H., Piatt T., Hastings J.W. 1970. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system. // J. Bacteriol. 104, 313-322.

71. Nicoll W.S., Boshoff A., Ludewig M.' H., Hennessy F., Jung M., Blatch G. 2006. Approaches tothe isolation and characterization of molecular chaperones. //Protein Expression and Purification. 46, 1-15.

72. Ortega J., Lee H.S., Maurizi M.R., Steven A.C. 2004. ClpA and ClpX ATPases bind simultaneously to opposite ends of ClpP peptidase to form active hybrid complexes. HJ. Struct. Biol. 146, 217-226.

73. Parsek M.R., Greenberg E.P. 2000. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram*- negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 8789-8791.

74. Patterson S.D., Aebersold R 1995. Mass-spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins. // Electrophoresis. 16, 1791—1814.

75. Pearson J.P., Gray K.M., Passador L., Tucker K.D., Eberhard A., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1994. Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes // Proc. Natl. Ac. Sci USA. 91, 197200.

76. Pearson J.P., Passador L., Iglewski B.H., Greenberg E.P. 1995. A second N-acylhomoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1490-1494.

77. Pesci E.C., Iglewski B.H. 1997. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing. // Trends Microbiol. 5, 132-135.

78. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P., McKnight S., Kende A.S., Greenberg E.P., Iglewski B.H. 1999. Quinolone signaling in the cell-to-cell communicationsystem of Pseudomonas aeruginosa II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1122911234.

79. Prakash S., Matouschek A. 2004. Protein unfolding in the cell. //Trends in Biochem. Sci. 29, 593-600.

80. Qin N., Callahan S.M., Dunlap P.V., Stevens A.M. 2007. Analysis of LuxR regulon gene expression during Quorum Sensing in Vibrio fischeri. II J. Bacteriol. 189,4127-2134.

81. Raviol H, Sadish H, Rodriguez F, Mayer MP, Bukau B. 2006. Chaperone network in the yeast cytosol: HspllO is revealed as an Hsp70 nucleotide exchange factor. UEMBOJ. 25, 2510 2518.

82. Ruby E.C., McFall-Ngai M.J. 1992. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. // J. Bacteriol. 174, 4865-4870.

83. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5468.

84. Schuster M., Lostroh C.P., Ogi T., Greenberg E.P. 2003. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: a transcriptome analysis. // J Bacteriol. 185, 2066-79.

85. Shah I.M, Wolf R.E. 2006. Inhibition of Lon-dependent degradation of the Escerichia coli transcription activator SoxS by interaction with 'soxbox' DNA or RNA polymirase. // Molecular. Microbiology. 60, 199-208.

86. Singh S.K., Grimaud R., Hoskins J.R., Wickner S., Maurizi M.R. 2000. Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases ClpXP and ClpAP. IIPNAS USA. 97, 8898-8903.

87. Sitnikov D.M., Schineller J.B., Baldwin T.O. 1996. Control of cell division in Escherichia coli: regulation of transcription of ftsQA involves both rpoS and SdiA-mediated autoinduction. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 336-341.

88. Smith R.S., Iglewski B.H. 2003. P. aeruginosa quorum-sensing systems and virulence. // Curr Opin Microbiol. 6, 56-60.

89. Smith R.S., Guyomarc'h S., Mandel T., Reinhardt D., Kuhlemeier C., Prusinkiewicz P. 2006. A plausible model of phyllotaxis. // Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1301-6.

90. Stewart G.S. 1997. Challenging food microbiology from a molecular perspective. II Microbiology. 143, 2099-2108.

91. Surette M.G., Miller M., Bassler B. 1999. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimuium, and Vibrio harveyi: A new family, of genes responsible for autoinducer production. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1639-1644.

92. Swift S., Stewart G.S., Williams P. 1996. The inner workings of a quorum sensing signal generator. // Trends Microbiol. 4, 463-466.

93. Tatsuta T., Joo D.M., Calendar R., Akiyama Y., Ogura T. 2000. Evidence for an active role of the DnaK chaperone system in the degradation of a .11 FEBS Lett. 478, 271-275.

94. Tomoyasu T., Mogk A., Langen H., Goloubinoff P., Bukau B. 2001. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in Escherichia coli cytosol. // Molecular. Microbiol. 40, 397-413.

95. Tu S.-C., Mager H.L. 1995. Biochemistry of bacterial bioiuminescence. // Photochem. Photobiol. 62, 615-624.

96. Ulitzur S. 1998. H-NS controls the transcription of three promoters of Vibrio fischeri lux cloned in Escherichia coli. II J. Biolumin. Chemilumin. 13, 185-188.

97. Ulitzur S. 1999 // Microbial Ecology and Infectious Disease / Ed. Rosenberg E. Washington: American Society for Microbiology, P. 123-132.

98. Ulitzur S., Dunlop P. 1995.Regulatory circuitry controlling luminescence autoinduction in Vibrio fischeri.!I Photochem. Photobiol. 62, 625-632.

99. Urbanowski M.L., Lostroh C.P., Greenberg E.P. 2004. Reversible acyl-homoserine lactone binding to purified Vibrio fischeri LuxR protein. // J. Bacteriol. 186,631-7.

100. Vannini A., Volpari C., Gargioli C., Muraglia E., Cortese R., De Francesco R., Neddermann P., Marco S.D. 2002. The crystal structure of the quorum1 sensing protein TraR bound to its autoinducer and target'DNA. // EMBO J: 2; 21, 4393401.

101. Weber-Ban E.-U., Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. 1999. Global unfolding of substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. /'/Nature. 401, 90-93.

102. Weichart D., Querfurth N., Dreger M:, Hengge-Aronis R. 2003. Global role for ClpP-containing proteases in stationary-phase adaptation of Escherichia coli. H J. Bacteriol. 185, 115-125.

103. Weissman J.S., Hohl C., Kovalenko O., Kashi Y., Chen S., Braig K., Saibil H.R., Fenton W.A., Horwich A.L. 1995. Mechanism of GroEL action: productive release of polypeptide from a sequestered position under GroES. I/Cell. 83, 577-587.

104. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. 1999. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,13904-13909.

105. Whitehead N.A., Barnard A.M., Slater H., Simpson N.J., Salmond G.P.et al., 2001 G.P. 2001. Quorrum-sensing in Gram-negative bacteria. // FEMS Microbiol. Rev. 25, 365-404.

106. Whitehead N.A., Byers J.T., Commander P., Corbett M.J., Coulthurst S.J., Everson L., Harris A.K., Pemberton C.L., Simpson N.J., Slater H., Smith D.S.,

107. Welch M., Williamson N., Salmond G.P. 2002. The regulation of virulence-in phytopathogenic Erwinia species: quorum sensing, antibiotics and ecological considerations. // Antonie Van Leeuwenhoek. 81,223-31.

108. Wickner S., Gottesman S., Skowyra D., Hoskins J., McKenney K., Maurizi M.R. 1994. A' molecular chaperone, ClpA, functions like DnaK and DnaJ. UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 12218-12222.

109. Zhu J., Beaber J.W., Moré M.I., Fuqua C., Eberhard A., Winans S.G. 1998. Analogs of the autoinducer 3-oxooctanoyl-homoserine lactone strongly inhibit activity of the TraR protein of Agrobacterium tumefaciens. II J Bacteriol. 180, 5398-405.

110. Zhu J., Winans S.C. 1999. Autoinducer binding by the quorum-sensing regulator TraR increases affinity for target promoters in vitro and decreases TraR turnover rates in whole cells. // Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4832-7.

111. Zhu J., Winans S. C. 2001. The quorum-sensing transcriptional regulator TraR requires its cognate signaling ligand for protein folding, protease resistance, and dimerixation II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 1507-1512.

112. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1994. Lon-протеаза участвует в регуляции транскрипции /юс-оперона Vibrio fischeri. II Генетика. 30, 337341.

113. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. 1997. Роль Ьа-протеазы в негативном контроле экспрессии lux CD ABE генов Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli.H Молекуляр. биология. 31, 945-949.

114. Manukhov I.V., Eroshnikov G.E., Vyssokikh M.Y., Zavilgelsky G.B. 1999. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heatOshock proteins. IIFEBS Lett. 448, 265-268.

115. Хмель И.А., Метлицкая А.З. 2006. Quorum sensing регуляция эксарессии генов перспективная модель для создания лекарств против патогенных бактерий. // Молекуляр. биология. 40, 195 - 211.1. Благодарности :

116. C.B. Машко (ЗАО «АГРИ», Москва) за предоставление штаммов BW25113, JW3664, JW3663 и JW0013;

117. С.З. Миндлин (ИМГ РАН, Москва) за предоставление штаммов серии gro мутантов;

118. S. Gottesman (США) за предоставление штаммов SG20250, SG22099, SG22163 и SG22186;

119. N.E. Murray (Англия) за предоставление штаммов NK113 и NK114; Т.К. Van Dyk (США) за предоставление плазмиды pDEW201.