Бактериальные lux-опероны: Механизмы регуляции экспрессии и конструирование биосенсоров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Манухов, Илья Владимирович

• Манухов, Илья Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Манухов, Илья Владимирович

1. Постановка задачи.

2. Литературный обзор.

Экспериментальная часть.

3. Материалы и методы.

4. Результаты и обсуждение.

1) Клонирование генов luxАВ из хромосомы морских бактерий Vibrio harveyi.

2) Клонирование /г/х-оперона наземных бактерий Photorhahdus luminescem штамм Zml и определение нуклеотидной последовательности.

3) Роль Lon - протеазы в негативном контроле экспрессии генов /zalCDABE Photohacterium fischeri в клетках Escherichia coli.

4) Использование /wx-оперона Photobaclerium fischeri для анализа активности мутантных форм Lon - протеазы и влияния молекул РНК, комплементарных

5' - фрагменту мРНК гена lon, на синтез фермента.:.!.

А) Мутантные формы Lon - протеазы Escherichia coli.;.

Б) РНК - интерференция.

5) Конструирование /г/х-биосенсора для количественной оценки рекомбинационной активности бактериальных клеток.

6) Фолдинг и рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз: роль шаперонов DnaK-DnaJ -GrpE (Hsp70) и влияние термостабильности белка на эффективность рефолдинга.

7. ^Выводы.

8 Литература.

Постановка задачи

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Бактериальные lux-опероны: Механизмы регуляции экспрессии и конструирование биосенсоров»

Бактериальные люциферазы являются гетеродимерами (состоят из а- и (3-субъединиц) и катализируют окисление длинноцепочечного альдегида RCHO (природный субстрат - тетрадеканаль) кислородом воздуха при участии восстановленного флавин-мононуклеотида [Meighen Е.А., 1991]: FMNH2 + RCHO + 02 = FMN + Н20 + RCOOH + hv (490 нм) Реакция сопровождается высвечиванием кванта сине-зеленого света (490 нм).

Ранее в нашей лаборатории были клонированы гены luxАВ Photobacterium (ранее Vibrio) fischeri [Чернова Т.А. и Завильгельский Г.Б. 1991]. Однако, в связи с высокой термолабильностью люциферазы этого вида морских бактерий гены lux АВ Ph. fischeri неудобны в качестве репортеров в ряде генно-инженерных исследований. Известно, что люцифераза Vibrio harveyi более термостабильна по сравнению с таковой Ph. fischeri [Szittner R.A., Meighen E.A. 1990]. Поэтому в настоящей работе были клонировали гены lux АВ V. harveyi с целью использования этих генов в качестве репортера при работе как с грамотрицательными, так и с грамположительными бактериями. Также с целью получения более термостабильной люциферазы был клонирован lux - оперон из Photorhabdus luminescens Zml. В работе решались задачи, имеющие значение в области регулирования экспрессии генов, как, например, изучение влияния Lon - протеазы на регуляцию экспрессии /wx-регулона Ph. fischeri, а также использование системы lux - регулон Ph. fischeri - Е. coli в качестве биосенсора для анализа РНК - интерференции. Регуляторные функции клеточных протеаз, а также регуляция экспрессии генов с помощью РНК-дуплексов (РНК - интерференция) в 4 настоящее время относятся к ключевым проблемам в области молекулярной генетики. Актуальна также проблема молекулярной биологии и биофизики - фолдинг и рефолдинг белков и роль белков - шаперонов в этих процессах. В диссертационной работе для этой цели впервые используются бактериальные люциферазы. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении структуры lux - оперонов различных люминесцирующих бактерий и конструирования на их основе специализированных биосенсоров.

В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи исследования: клонирование генов luxАВ из хромосомы морских бактерий Vibrio harveyi; клонирование lux - оперона из хромосомы наземных бактерий Photorhabdus luminescens; определение нуклеотидной последовательности фрагмената ДНК, содержащего полный lux - оперон Photorhabdus luminescens, штамм Zml; поиск гена, определяющего негативный контроль экспрессии /шг-оперона

Photobacterium fischeri в клетках Е. coll при условии "quorum sensing"; анализ активности мутантных форм Lon - протеазы с помощью lux - оперона Ph. fischeri;

- анализ влияния РНК, антипараллельной и параллельной 5'-фрагменту мРНК гена lon, на синтез Lon - протеазы с помощью lux - оперона Ph. fischeri; конструирование плазмиды lux - биосенсора для количественного измерения рекомбинационной активности клеток Е. coli; использование бактериальных люцифераз с различной термостабильностыо для исследования in vivo процесса рефолдинга белков. медицинского направления, т. е. имеющие прикладной характер. Причина тому одна: видоспецифические межклеточные сообщения ("ceil-to-ceil communication"), или социальное поведение бактерий ("community behavior") типа "quorum sensing" играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе гак и при симбиозе. В этом обзоре мы ограничимся лишь примерами грамотрицательных бактерий и ацильными производными лактона L-гомосерина (N-AHL) в качестве химических сигналов. Хотя, конечно, подобные межклеточные взаимодействия имеют место и в группе грамположительных бактерий, а в качестве химической основы «языка» используются также пептиды, модифицированные пептиды, аминокислоты и сходные с ними аминные соединения [Дебабов В.Г., 1999; Олескин А.В. и др., 2000].

По примеру впервые обнаруженной и к настоящему времени подробно описанной /юг-системы типа "quorum sensing" у морских бактерий Photobacterium fischeri [Nealson К.Н. el al., 1970; Eberhard A., 1972], которая определяет характерные особенности биолюминесценции популяции клеток, сейчас все подобные системы относят к механизму регуляции типа: "luxl-luxR" [Fuqua W.C. et al., 1994; 1996]. В морской воде плотность клеток Ph. fischeri обычно не превышает 100 клеток в миллилитре, и они не светятся. Но при достижении популяцией высоких плотностей (выше 109 клеток/мл), что происходит при росте культуры в богатых лабораторных средах или в светящихся органах головоногого моллюска Euprymna seolopes (природная экологическая ниша для этого вида морских бактерий) гены /wx-оперона начинают экспрессироваться, что приводит к резкому возрастанию свечения. Свечение ночных животных головоногих моллюсков обеспечивает им сравнительную безопасность, предохраняя от атаки хищников снизу, из глубин океана: свечение имеет схожесть с лунным светом, в результате чего тело моллюска теряет тень.

Вперые полный /ia-регулон Ph. fischeri был изолирован, клонирован в клетках E.coli и детально анализирован в работе [ Engebrecht J. et al., 1983]. На рис.1 приведена структура /wx-регулона Ph. fischeri /wxRICDABEG.

Vf nrWTll с | D | А | В | E | G

Vh С" I D I А | В I E I G I H I»*-

XI M c I P I A I В | E ft—» i i i i j , ,a i i i,

01 23456789 Kbp

РИС. 1. Организация /г/х-оперонов Ph. ftscheri (Vf), V. harveyi (Vh), Ph. luminescens (XI).

Регулон состоит из двух оперонов: luxR с промотором р/, и /z/xICDABEG с промотором pr. [ Meighen Е.А., 1991]. Структурные гены lux АВ определяют синтез а - и р -субъединиц люциферазы. Гены /wxCDE определяют синтез трех-субъединичной редуктазы жироной кислоты (fatty acid reductase), ведущей восстановление жирной кислоты до альдегида (тетрадеканаль), являющегося субстратом люциферазы. Ген luxG определяет синтез т.н. "probably" флавин-редуктазы, которая, по всей видимости, не активна [Meighen Е.А., 1991; Tu S.-C., and Mager H., 1995]. Гены luxl и luxR являются регуляторными. Белок Luxl -ацил-синтаза, ведущая синтез ацильного производного гомосеринлактона (N-AHL), К-(З-оксогексаноил) лактон L-гомосерина (OHHL) в

УСХУО н о н о н о

РИС. 2. Структуры автоиндукторов (АИ) у бактерий. (.к) - Ph. fischeri, УУ-(3-оксогексаноил)-лактон L-гомосерина (OHHL)

B) - V. harveyi, А^-(3-гидроксибутаноил)-лактон L-гомосерина (HBHL)

C)-A. tumefaciens, Л^-(3-оксооктаноил)-лактон L-гомосерина (OOHL)

D) - P. aeruginosa, УУ-(3-оксододеканоил)-лактон L-гомосерина (OdDHL)

Ацкл-Luxl интермедиа!'

РИС. 3. Предположительный механизм синтеза автоиндуктора (АИ) Luxl-синтазой Ph. fischeri. E-Luxl. табл.1, рис.2), используя для этой цели в качестве субстратов S-аденозилметионин и 3-оксогексаноил кофермента А (СоА) [Eberhard A. et al., 1981] (рис.3). Это низкомолекулярное вещество является автоиндуктором (АИ) и играет ключевую роль в коммуникации между бактериями, т.к. свободно диффундирует через клеточные мембраны [Kaplan Н.В., Greenberg Е.Р., 1985]. Белок LuxR - положительный регулятор (активатор) транскрипции правого оперона /wxICDABEG. Он состоит из 250 аминокислотных остатков и двух доменов, из которых С-домен (аминокислоты от 157 до 250) определяет связь с ДНК, а N-домен определяет связь белка с сигнальной молекулой АИ. При связывании белка LuxR с АИ он способен образовывать комплекс с /г/л-боксбм, представляющим собой инвертированный повтор из 20 н.п., в области промоторарг на расстоянии -42,5 от +1 А (начало транскрипции): lux- бокс

ACCTGTAGGATCGTACAGGTTTAGCGAAGAAAATGGTTTGTL4L4G7X:GAAT^ -42,5 -35 -10 +1

Расстояние -42,5 для /wx-бокса, по-видимому, критично, т.к. его увеличение до -47,5, -52,5 и - 62,5 снимает полностью эффект автоиндукции транскрипции [Egland К.А. and Greenberg Е.Р., 1999; Egland К.А. and Greenberg E.P., 2000]. Промотор pr относится к разряду слабых, т. к. в его составе отсутствует консенсусная последовательность -35 .TTGACA. По-видимому, иначе промотор рг транскрибировался бы конститутивно и не реагировал на наличие в среде АИ. Показано, что LuxR, активный лишь в димерной форме, относится к группе т. н. "ambidextrous" («двуручных») активаторов, т. к. при посадке на ДНК LuxR формирует два вида контактов с РНК-полимеразой: с областью 4

70 субъединицы сг и с С-доменом а-субъединиц (рис.4). Ни LuxR, ни РНК-полимераза в

РИС. 4. Схема посадки «двуручного»( ambidextrous) активатора LuxR с РНК-полимеразой на промотор рг /ux-оперона Ph. fischeri.

РИС. 5. Схема регуляции lux-оперона Ph. fischeri. отдельности не связываются с областью правого промотора рг, и лишь при взаимодействии с комплексом (LuxR-АИ) РНК-полимераза начинает транскрипцию правого оперона (рис.5). Константа связывания LuxR с АИ такова, что стабильный комплекс образуется лишь при достижении в среде критической концентрации АИ (примерно 3 молекулы на клетку). Очевидно, что т. к. ген luxI находится под промотором Pr, то в результате в системе имеет место стремительное возрастание интенсивности биолюминесценции: увеличение количества белка Luxl ведет к значительному возрастанию концентрации АИ, что в свою очередь увеличивает количество активных комплексов LuxR-АИ и. т. д. В физике подобные системы называют системами с положительной обратной связью, и они характеризуются значительной нелинейностью, т.е. малые изменения концентрации АИ (и/или LuxR) приводят в результате к значительному усилению эффекта, в данном случае усилению биолюминесценции клеток. Необходимо отметить, что ген luxR транскрибируется «почти-конститутивно», но с определенными элементами регуляции. Во-первых, транскрипция с промоторар/ активируется (при низкой концентрации LuxR) комплексом cAMP-CRP [Dunlop P.V. and Greenberg E.P., 1988], а во-вторых, белок LuxR при высокой концентрации начинает репрессировать собственную транскрипцию (рис. 5), что обеспечивает необходимое для синтеза продуктов /шс-регулона ограничение системы сверху, иначе бы значительная часть энергии клетки расходовалась на свечение. Отметим, что в регуляции транскрипции lux-оперона Ph. fischeri принимает участие также гистоно-подобный белок H-NS, который, по данным Ulitzur S., в значительной мере репрессирует промоторы lux-оперона в связи с высоким содержанием в регуляторных областях последовательностей типа (dA-dT) [Ulitzur S. etal., 1997; Ulitzur S., 1998]. Активатор транскрипции LuxR способен преодолевать H-NS-индуцируемую репрессию. Иными словами, в штаммах Е. coli hns+ мы наблюдаем LuxR-зависимую активацию биолюминесценци на фоне репрессии, создаваемой белком H-NS, который по современной терминологии относят к «глобальным регуляторам транскрипции» в бактериальной клетке.

Отметим, что из всех известных и подробно изученных видов люминесцирующих бактерий лишь морские бактерии Ph. fischeri и V. harveyi обладают системой свечения типа "/wxI-/wxR". Остальные люминесцирующие бактерии, а именно, морские бактерии Ph. leiognathi, Ph. phosphoreum, а также наземные (terrestrial) бактерии Ph. luminescens (ранее Xenorhabdus luminescens) имеют простые /wx-опероны типа /mxCDABEG с практически неизвесными, пока, системами регуляции (рис. 1).

Ниже приводится список основных коммуникабельных систем типа luxl-luxR подробно изученных.к настоящему времени у нескольких видов грам-отрицательных бактерий (Табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. Системы "quorum sensing" у некоторых видов бактерий.

Бактерия Функция Система Авто индуктор (АИ, производные N-AHL)

1) Ph. fischeri Биолюминесценция luxl-luxR Ы-(З-оксогексаиоил)-лактон L-гомосерина (OHHL,или АИ-1)) ainS-ainR N-октаноил-лактон L-гомосерина (OHL, или АИ-2

2) Vibrio harveyi Биолюминесценция luxLJux М Ы-(З-гидроксибутаноил) лактон luxR, luxN L-гомосерина (HBHL, или АИ-1) luxS-luxQ АИ-2 (не идентифицирован

3) Erwinia carotovora Синтез карбапенема (антибиотик) carl-carR Ы-(З-оксогексаноил)-лактон L-гомосерина (OHHL)

Синтез гидролитических ферментов (пектиназы, целлюлазы и др.) ecal(expl)-ecaR{expR)

4) Agrobacterium tumefaciens Факторы конъюгативного переноса Ti-плазмид traR-tral Ы-(З-оксооктаноил)-лактон L-гомосерина (OOHL)

5) Pseudomonas aeruginosa Факторы вирулентности (токсин А, эластаза) lasl-lasR N-(3 -оксододеканои л)-лактон L-гомосерина (OdDHL,3 ОС 12-HSL)

Факторы вирулентности и вторичные метаболиты (рамнолипиды) rhll-rhlR N-бутаноил-лактон L-гомосерина (BHL, С4-HSL)

Luxl-гомологи, синтезирующие производные N-AHL, по-видимому, могут включаться в метаболизм жирных кислот на различных стадиях, присоединяя N-ацильную группу к лактону L-гомосерина, образующемуся из S-аденозилметионина: в продуктах реакции практически каждого фермента типа Luxl регистрируется смесь производных N-AHL (в табл. 1 указаны лишь доминирующие соединения). Например, LasI синтезирует, помимо основного продукта OdDHL, также минорные продукты OHHL и OOHL [Pearson J.P. et al, 1994], a Rhll, помимо основного продукта BHL, синтезирует минор HHL (в соотношении 15:1) [ Pearson J.P. et al., 1995].

Кроме указанных в табл. 1 видов бактерий можно назвать Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Enterobacter agglomerans, Proteus mirabilis, Erwinia herbicola, энтеропатогенные штаммы E. coli и ряд других, обладающих системой "quorum sensing"Tnna luxl-luxR [Swift S. et al., 1998; Sperandio V. et al., 1999]. В клетках E. coli K12 и Salmonella typhimurium также существует система регуляции типа "quorum sensing": ген sdiA является активатором транскрипции, однако, остается неясной природа АИ [Sitnikov D.M. et al. 1996; Garcia-Lara J. et al, 1996; Ahmer B.M. et al., 1998]. Что же касается производных N-AHL, то в настоящее время известно более 40 подобного сорта молекул, отличающихся строением ацильной группы (с длиной углеродной цепочки от С4 до С14, с замещением в положении 3 на кего- или окси-группы и т.д.) [Shaw P.D. et al1997].

Как правило, бактерии имеют по две "quorum sensing" системы. Например, у Ph. fischeri, помимо классической системы luxl-luxR имеется система ainS-ainR. Кодируемый геном ainS белок AinS ведет синтез N-октаноил-лактон L-гомосерина. OHL, или АИ-2. Однако, влияние АИ-2 на биолюминесценцию клеток Ph. fischeri выражается значительно слабее: лишь в мутантах по гену luxI наблюдается небольшое усиление свечения при высоких плотностях культуры [Gilson L. et al., 1995; Kuo A. et al., 1996]. Более того, в диком штамме Ph. fischeri АИ-2, связываясь с LuxR, конкурентно ингибирует основную регуляторную систему с АИ-1. В результате в мутанте ainS' (в котором АИ-2 отсутствует) старт люминесценции в растущей культуре сдвигается к меньшим плотностям [Kuo A. et al., 1996]. Как и Luxl, AinS является синтазой, но он не гомологичен белку Luxl, а гомологичен белку LuxM из Vibrio harveyi, который ведет синтез Ы-(3-гидроксилбутирил)-лактон L-гомосерина. AinS и LuxM - являются представителями второго семейства N-AHL-синтаз [Gilson L. el al., 1995; Hanzelka B.L. et al., 1999]. Недавно показано, что система luxl-luxK в Ph. fischeri регулирует транскрипцию не только генов lux, но также и других генов, в частности, гена ribB, кодирующего ключевой белок биосинтеза рибофлавина [Callahan S.M. and Dunlap P.V., 2000].

Сенсацией прозвучало в 1992 г. открытие системы типа luxl-luxR у патогенных для растений бактерий Erwinia carotovora, вызывающих мягкую гниль у картофеля и других растений [ Bainton N.J. et al., 1992a,Ь]. До этого момента считалось, что luxI-/z/xR-системы - прерогатива биолюминесцении и морских бактерий. И вдруг - синтез антибиотика карбопенема (группа р-лактамов) и вирулентных для растительной клетки факторов. Природа подобного явления вскоре стала понятной. Бактерии не атакуют растительную клетку, если их мало. Подобно опытному полководцу Средневековья, штурмующего крепость или сильно укрепленный замок, бактерии собирают подкрепления и начинают атаку, лишь когда уверены в своих силах. А это происходит благодаря наличию системы "quorum sensing" автоматически: когда собирают подкрепления и начинают атаку, лишь когда уверены в своих силах. А это происходит благодаря наличию системы "quorum sensing" автоматически: когда плотность бактерий достигает критической, гены вирулентности открываются и благодаря нелинейности системы на растительную клетку обрушивается столь массированный удар из пе'ктиназ, целлюлаз, токсинов и протеаз, уничтожающих клеточную стенку, что организм не успевает включить иммунную систему, противодействующую обычно проникновению в клетку инфекции. Дополнительно бактерии Erwinia carotovora одновременно начинают синтез антибиотика, чтобы уничтожить другие бактерии, случайно попавшие на «пир» победителя. Уже в конце 1998 г. на способность продуцировать автоиндукторы ряда N-AHL, было проверено 106 штаммов, патогенов для растений, принадлежащих 7 родам, и оказалось, что добрая половина из них продуцируют N-AHL, т.е. обладают системой "quorum sensing". Очень интересный пример бактерии - растительного симбионта Pseudomonas aureofaciens. У этих бактерий, как и у Е. carotovora, система типа luxl-luxR контролирует синтез антибиотика феназина (phenazine), что дает возможность защищать растение от внедрения патогенных микробов и даже против грибковых заболеваний [Pearson J.P. et al, 1998]. Используя мутант P. aureofaciens, не способный синтезировать автоиндуктор N-AHL (но сохранивший способность его воспринимать), было проверено около 700 различных бактериальных штаммов, и из них примерно 10% индуцировали синтез антибиотика в клетках P. aureofaciens - яркий пример межвидового и даже межродового «дружеского разговора» у бактерий, несущего гибель клеткам, инициировавшим начало «переговоров».

В составе Ti плазмид Agrobacterium tumefaciens имеются гены traR-tral. Tral -синтаза определяет синтез автоиндуктора OOHL, а комплекс TraR-OOHL открывает транскрипцию генов /га-оперона, а также собственную транскрипцию и транскрипцию гена tral [Fuqua W.C. and Winans S.C., 1994]. Необходимыми кофакторами в этом процессе являются бактериальные белки - опины, в частности, октопин OccR активирует транскрипцию гена traR [Fuqua W.C. and Winans S.C., 1994].

Регуляция типа "quorum sensing", т.е. эффект, зависящий от плотности культуры, определяет у бактерий, принадлежащих к различным родам Proteus, Serratia, Vibrio, Chromobacterium, Bacillus, Clostridium, а также, но менее выражено, у бактерий Salmonella typhimurium и Е. coli, способных прикрепляться и колонизировать поверхности в почве, растениях, насекомых, рыбах и млекопитающих, включая человека, формирование особого типа «умеющих» быстро передвигаться на твердой среде клеток, т. н. «швермеров» ("swarmer cells"), характеризующихся удлиненностю клетки, многоядерностью, а также гиперфлагеляцией (по поверхности клетки формируется много латеральных флагелл) [ Fraser G.M., Hughes С., 1999]. Однако, лишь у Serratia liquefaciens ген swrl (аналог luxl) стимулирует движение швермеров по плотной среде, причем низкомолекулярным АИ является BHL (ЪЦбутаноил-Ь-гомосерин-лактон)) [Eberl L. et al., 1996; Givskov M. et al., 1998]. У Proteus mirabilis формирование и движение швермеров стимулируется пептидами и аминокислотами, в особенности глутамином, образующихся в результате интенсивного протеолиза белков протеазами широкого спектра действия [Allison С. et al, 1993]. Не требуется N-AHL в качестве АИ также для Vibrio parahaemolyticus, хотя в геноме этой бактерии имеется ген ораК, гомолог luxR V. harveyi [McCarter L.L., 1998]. Предполагается, что низкомолекулярные АИ определяют не процесс дифферецировки (формирование швермеров) клеток, а миграцию по поверхности, т.к. их миграция требует высокой плотности популяции и захватывает с собой одиночные клетки-швермеры, не способные передвигаться в одиночку, откуда и возник термин «швермер», т.е. «роение», по аналогии с роением пчел.

Пример системы "quorum sensing", особо привлекающий к себе внимание исследователей из-за патогенности бактерий для человека, - это «синегнойная палочка» Pseudomonas aeruginosa. У этого вида бактерий тоже имеются две системы типа luxl-luxR: las -система (LasR-LasI, АИ - 30C12-HSL) контролирует синтез различных вирулентных факторов (протеазы LasA и LasB, экзотоксин А), и система rhl (RhlR-Rhll, АИ - C4-HSL) контролирует синтез рамнолипида, пилей типа IV, формирование биопленки и др [ Glessner A. et al., 1999; Whiteley М. et al., 1999; Parsek M.R. and Greenberg E.P., 2000]. Система qourum sensing действует следующим каскадным образом. При низкой плотности клеток LasI синтезирует небольшой (базовый) уровень 30C12-HSL. При достижении популяцией критической плотности образуется активный комплекс LasR-АИ, который активирует транскрипцию генов lasl (положительная обратная связь), rhlR (в результате открывется вторая система RhlR-Rhll), а также ряда вирулентных генов (lasB, toxА и др.). Система RhlR-Rhll в свою очередь активирует транскрипцию генов, ответственных за синтез различных вторичных метаболитов, включая цианистый водород, пиоцианин (pyocyanin) и др. [Pesci Е.С., Iglewski В.Н., 1997]. В геноме Ps. aeruginosa в результате случайного инсерционного мутагенеза обнаружено 39 генов, транскрипция которых зависит от плотности популяции [ Whiteley М. et al., 1999]. Эти гены называются </,ус-генами и составляют глобальную регуляторную систему (регулон). Одна группа генов активируется с помощью 30C12-HSL, а остальные для максимальной индукции требуют наличия в среде обоих видов АИ. Предполагается, что на самом деле t/лс-гены составляют примерно 4% генома (полный геном состоит из 6000 генов). Рядом с одним из кластеров qsc-генов обнаружена последовательность, кодирующая белок, гомолог LuxR. Однако гомолога Luxl не обнаружено (данные анализа нуклеотидной последовательности полного генома Ps. aeruginosa). Необходимо заметить, что в настоящее время количество видов микробов, патогенных для человека и обладающих системами типа luxl-luxR, насчитывается дюжинами. Бактерии Ps. aeroginosa тем более опасны, что они формируют биопленку (biofilm), защищающую популяцию бактерий от антибиотиков', детергентов и от иммунной системы организма. Недавно у Ps. aeruginosa обнаружен новый тип внутриклеточного сигнала , включенного в индукцию гена lasB. Это - 2-гептил-З- гидрокси- 4 - хинолон (обозначается как PQS) [ Pescl Е.С. et al, 1999; McKnight S.L. et al., 2000; ]. Показано, что PQS участвует в индукции в основном гена rhll, а при индукции гена lasB наблюдается кооперативный эффект PQS и АИ, ацильного производного лактон L-гомосерина (Табл. 1). PQS синтезируется в достаточном количестве лишь при достижении культурой поздней стационарной фазы. Предполагается, что PQS определяет связь между системами "quorum sensing" las и rhl, но не определяет саму зависимость эффекта от плотности бактерий [Pesci Е.С. et al., 1999; McKnight S.L. et al., 2000]. Помимо PQS P. aeruginosa продуцирует еще один никомолекулярный и способный диффундировать через мембрану вид сигнальной молекулы. Это - дикетопиперазины (DKP), или циклические дипептиды [Holden М.Т. et al., 1999]. При высокой концентрации циклические дипептиды DKP связываются с LasR и активируют его. Это явление получило наименование "chemical crosstalk". Предполагается, что молекулы DKP действуют не при «разговоре» бактерий друг с другом, а при их «разговоре» с растительными и животными клетками, т.к. DKP характеризуются высокой биологической и фармакологической активностями по отношению к клеткам высших организмов [ Holden М.Т. et al., 2000]. Формирование биопленки у Ps. aeruginosa также определяется системой 'quorum sensing'. Мутанты lasl, не способные синтезировать 30C12-HSL, не образуют биопленку [Davies D.G.,et al., 1998]. Предполагается, что системы "quorum sensing"ftrpaioT важную роль не только при взаимодействии бактерий друг с другом, но и при взаимодействии с растительными и животными клетками [ Parsek M.R. and Greenberg Е.Р., 2000].

В заключение раздела приведем основные характеристики системы "quorum sensing" у люминесцирующих морских бактерий Vibrio harveyi, которые в отличие от Ph. fischeri являются свободно живущими. Белки-гомологи Luxl и LuxR у V. harveyi не обнаружены [Belas R. et al., 1982; Cohn D.H. et al., 1983; Baldwin Т.О. et al., 1984; Bassler B. et al., 1993]. Система регуляции биолюминесценции у V. harveyi имеет сложную структуру [ Bassler В. et al., 1993; Bassler В. et al, 1994a; Bassler B. et al, 1994b], Автоиндукторы АИ-1 и АИ-2, которые синтезируются синтазами LuxL,LuxM (АИ-1) и LuxS (АИ-2) взаимодействуют с белками-сенсорами LuxN и LuxQ соответственно (табл.1), которые встроены в мембрану и являются двухдоменными протеинкиназами-фосфатазами (в зависимости от наличия в среде АИ) двух-компонентной системы регуляции [ Freeman J.A. et al, 2000]. Белкт LuxN и LuxQ состоят из двух доменов каждый, сенсорного и регуляторного. Информация от этих белков передается через вспомогательный белок LuxU главному регулятору системы белку LuxO, который является репрессором /wx-оперона. При низкой концентрации автоиндукторов АИ-1 и АИ-2 LuxN и LuxQ действуют как киназы и фосфорилируют (с помощью посредника белка LuxU) LuxO; образующееся при этом производное P-LuxO репрессирует lux-оперон [Freeman J.A. and Bassler B.R., 1999аЬ]. При высокой концентрации автоиндукторов АИ-1 и АИ-2 LuxN и LuxQ действуют как фосфатазы и дефосфорилируют (опять же через промежуточное звено белок-посредник LuxU) репрессор P-LuxO, и в результате (дефосфорилированный LuxO как репрессор не активен) репрессия /цх-оперона снимается. Белок LuxU гомологичен группе известных фосфорилирующих белков ArcB, BvgS,Ypdl с ключеаым для реакции гистидиновым остатком His58 [Freeman J.A. and Bassler B.L., 1999а]. Комплекс LuxN - АИ-1 проявляет значительно более высокую активность по сравнению с LuxQ - АИ-2 по отношению к LuxO и, следовательно, сильнее регулирует уровень биолюминесценции клетки [Freeman J.A. et al., 2000]. Недавно показано, что LuxO при комплексировании с стэ4 (ген rpoN) становится активатором транскрипции как негативного регулятора lux-генов, так и ряда других генов в хромосоме V. harveyi [Lilley B.N., Bassler B.L, 2000]. Отметим, что ген luxS в настоящее время обнаружен также в геномах различных штаммов Е. coli (в частности, в штамме MG1655), Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori. Все эти бактерии синтезируют АИ-2, который при добавлении к клеткам Vibrio harveyi индуцирует биолюминесценцию клеток [Surette M.G. et al., 1999; Sperandio V. et al., 1999; Joyce E.A. et al., 2000]. Можно предположить, что производное N-AHL продукт синтазы LuxS является АИ в клетках Е. coli и взаимодействует с белком SdiA, регулятором транскрипции кластера генов ftsQAZ, определяющих деление клетки [Sitnikov D.M. et а/., 1996; Whiters H.L. and Nordstrom К., 1998]. Гены luxS, luxO, luxU, lux?, luxQ содержатся также в геноме нелюминесцирующих бактерий Vibrio cholerae El Tor, причем гены /mxOSU расположены на хромосоме 1, а гены ZwxPQ - на хромосоме 2. Однако, неизвестно, за какую функцию клетки отвечает этот типа "quorum sensing" регуляторный комплекс.

В дополнение к двухкомпонентной фосфорилирующей -дефосфорилирующей системе регуляции транскрипции в клетках Vibrio harveyi имеется и прямой активатор транскрипции типа LuxR (однако, не гомологичный LuxR Ph. fischeri), прямо связывающийся с промоторной областью оперона /mxCDABEGH [Showaiter R. et ah, 1990; Swartzman E. et ah, 1992; Swartzman E. and Meighen EA, 1993; Chatterjee J. el al., 1996]. Клетки E. coli, трансформированные плазмидой, содержащей полный lux-оперон V. harveyi под собственным промотором, практически не светят [Miyamoto С.М. et al., 1987]. Однако, если ввести в клетки также плазмиду с геном luxR, то наблюдается некоторое усиление свечения. LuxR в комплексе с АИ-1 значительно стимулирует не только транскрипцию lux-оперона, но и собственную транскрипцию, а свободный LuxR является репрессором на собственном промоторе [ Miyamoto С.М. et al., 1998]. В отличие от Ph. fischeri, у V. harveyi регуляторные гены не сцеплены с lux-опероном, а разбросаны по всему геному, что и привело в результате к значительной задержке выяснения механизмов регуляции биолюминесценции у этого вида морских бактерий [Miyamoto CM.etah, 1985; Miyamoto С.М. et ah, 1989]. Гомологи LuxR V. harveyi обнаружены и в других видах бактерий. Например, у патогенов Vibrio parahaemolyticus белок OpaR, у Vibrio cholerae белок HapR и у Vibrio vulnificus белок SmcR контролируют транскрипцию генов вирулентности [McCarter L.,1998; Jobling and Holmes, 1997; McDougald D. et ah, 2000]. Предполагается, что белки семейства LuxR V. harveyi имеют единого предшественника и что этот ген широко распространен среди различных видов рода Vibrio. Двухкомпонентная система с ключевыми белками LuxO и LuxU обнаружена недавно и у Ph. fischeri [Miyamoto С.М. et ah, 2000]. В геноме Ph. fischeri имеются гены, высокогомологичные генам lux О и lux U V. harveyi, а клетки мутанта Ph. fischeri lux О люминесцируют значительно ярче, по сравнению с клетками дикого типа, особенно при низких плотностях. При введении в мутант lux О" плазмиды с активным геном lux О и при условии суперпродукции белка LuxO кривая зависимости интенсивности биолюминесценции от оптической плотности вновь, как и в случае дикого штамма, характеризуется значительным лаг-периодом. Предполагается, что двухкомпонентная регуляторная система LuxO-LuxU является более распространенной системой регуляции типа "quorum sensing" для генов биолюминесценции. Т.о., /их-опероны Ph. fischeri и V. harveyi, подобно классическому lac-оперону Е. coli, регулируются двояко, как с помощью белка-репрессора (LuxO у морских бактерий, LacI - у Е. coli), так и с помощью белка-активатора (LuxR у морских бактерий, CRP - у Е. coli). В заключение отметим, что системы "quorum sensing" оказались значительно сложнее, чем это представлялось по первым публикациям.

Глава 2. Использование lux-генов в качестве репортеров.

Люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены-репортеры), при биохимических анализах, при массовом скрининге химических загрязнений окружающей среды (экология), в генно-инженерных работах (селекция) и др. Высокая чувствительность и простота детектирования светового сигнала с помощью люминометра или сцинтилляционного счетчика, прямая пропорциональность между количеством фермента-люциферазы и интенсивностью биолюминесценции в широких пределах (до десяти порядков величины), возможность с равным успехом измерять активность фермента как in vitro, так и in vivo, без разрушения клеток и ряд других преимуществ определяют применение генов люцифераз как бактериального (гены lux), так и эукариотического (светлячкового, гены luc) происхождения в различных генетических и биохимических тестах как, например, при поиске и анализе промоторных и регуляторных участков ДНК, при скрининге ДНК-тропных соединений, при измерении микроколичеств АТФ и других.

Бактериальные люциферазы являются гетеродимерами (состоят из а- и (3-субъединиц) и катализируют окисление длинноцепочечного альдегида (RCHO) кислородом воздуха с помощью восстановленного флавин-мононуклеотида [Meighen Е.А. 1991; Baldwin Т.О. et al., 1995; Tu S.-C. and Mager Н., 1995]:

FMNH2 + RCHO + 02 = FMN + H20 + RCOOH + hv (490 нм) Реакция сопровождается высвечиванием кванта сине-зеленого света (490 нм)

Заключение диссертации по теме «Генетика», Манухов, Илья Владимирович

ВЫВОДЫ

1. На основе клонированного фрагмента хромосомы морских бактерий Vibrio harveyi сконструирована плазмида - биосенсор с генами lux АВ, кодирующими люциферазу. которая может использоваться как вектор как в грамотрицательных. так и в грамположительных бактериях.

2. Сравнение нуклеотидной последовательности /шг-оперона бактерий Photorhabdus luminescens штамма Zml (6961 н.п.) с таковыми штаммов Hm/Hb и Hw показывает промежуточное положение штамма Zml, а расположение спейсерных специфических ERIC - последовательностей у Zml заметно отличается от такового у штаммов Hm/Hb и Hw.

3. Показано, что Lon - протеаза Е. coli осуществляет негативный контроль экспрессии lux - генов Photobacterium fischeri, деградируя белок LuxR, активатор транскрипции lux - оперона.

4. Разработан /wx-тест для анализа in vivo протеолитической активности мутантных форм Lon - протеазы, а также для оценки эффектов «секвестрирования» (определяется связь с субстратом) и негативного доминирования (определяется взаимодействие субъединиц Lon - протеазы). Показано, что N-домен Lon -протеазы участвует в связывании субстрата, а для прочной связи субстрата с Lon - протеазой необходима АТФазная активность А-домена, что проявляется в эффекте «секвестрирования». Домен А и, в меньшей степени, домен Р необходимы для взаимодействия субъединиц с формированием активного тетрамера Lon. Формирование тетрамера Lon не зависит от АТФазной активности фермента.

5. На модели гена lon и с помощью lux-теста показан in vivo эффект ингибирования экспрессии гена при введении в клетку гибридных плазмид, определяющих синтез молекул РНК, комплементарных в антипараллельном и параллельном направлениях 5'-фрагменту мРНК гена. Впервые показано, что параллельный РНК-дуплекс ингибирует экспрессию гена эффективнее по сравнению с антипараллельным РНК-дуплексом. Обнаружен феномен исчезновения эффекта ингибирования экспрессии к 40-50-му делениям клетки.

6. На основе генов lux АВ Ph. fischeri сконструирована плазмида pF8, lux -биосенсор для количественного измерения рекомбинационной (RecA -зависимой) активности клетки и. разработан кинетический биолюминесцентный lux-метод. С

72 ее помощью показана ключевая роль ДНК-геликазы II (UvrD) в SOS -индуцированной гиперрекомбинации, а также установлено* что гиперрезистентные к ДНК - тропным агентам (ионизирующая радиация, фотосенсибилизаторы, УФ) мутанты Е. coli проявляют одновременно "hyper-rec" фенотип.

7. Измерены in vivo кинетика и уровень рефолдинга термоинактивированных бактериальных люцифераз. Показана ключевая роль в рефолдинге белков -шаперонов семейства DnaKJ (Hsp70). Установлена отрицательная корреляция между термостабильностью люциферазы и уровнем рефолдинга: чем термостабильнее фермент, тем медленнее и в меньшем размере осуществляется DnaKJ - зависимый рефолдинг.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Манухов, Илья Владимирович, 2000 год

1. Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Мутантные аллели радиорезистентности у штаммов Е. coli Gamr444: клонирование и предварительная характеристика // 1994. Генетика. Т. 30. С. 756-762.

2. Дебабов В.Г. Жизнь бактерий за стенами лабораторий // 1999. Мол. биол. Т. 33. С. 1074-1084.

3. Дужий Д.Е., Завильгельский Г.Б. Бактериофаг А,::1их: конструирование и экспрессия люминесценции в клетках Е. coli К12 // 1994. Мол. генет. микробиол. вирусол. № 3. С. 36-39.

4. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // 2000. Микробиология. Т. 69. С. 309-327.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование,- М.: Мир, 1984.

6. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. «Мир», М., 1976. 436 с.

7. Расулова Ф.С., Дергоусова Н.И., Мельников Э.Э., Гинодман Л.М., Ротанова Т.В. Получение и исследование модифицированных в области N-концевого домена форм АТФ зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli Н 1998. Биоорганическая химия. Т. 24. С. 370-375.

8. Семенова Е.В. "Мобилизируемые векторы для лактобацилл и других грамположительных бактерий."// Авторефератканд.дисс. 1994. ГосНИИгенетика. М.

9. Чернова Т.А., Завильгельский Г.Б. Клонирование /га-генов морских бактерий V. fischeri в клетках Е. coli. II1991. Биотехнология. N. 3. С. 17-18.

10. Adar Y.Y., Simaan М., Ulitzur S. Formation of the LuxR protein in the Vibrio fischeri lux system is controlled by HtpR through the GroESL proteins // 1992. J. Bacteriol. V. 174. P. 7138-7143.

11. Allison C., Lai H.C., Gugi D., Hughes C. Cell differentiation of Proteus mirabilis is initiated by glutamine, a specific chemoattractant for swarming cells // 1993. Mol Microbiol. V. 8. P. 53-60.

12. Bainton N.J., Stead P., Chhabra S.R., Bycroft B.W., Salmond G.P.C. Stewart G., Williams P. N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone regulates carbapenem antibiotic production in Envinia carotovorall 1992b. Biochem J. V. 288. P. 997-1004.

13. Baldwin Т.О. Christopher J.A., Raushel F.M., Sincjair J.F., Ziegler M.M., Fisher A.J., Rayment I. Structure of bacterial luciferase // 1995. Current Opinion in Structural Biology. V. 5. P. 798-809.

14. Band L., Henner D.J. Bacillus subtilis requires a "stringent" Shine-Dolgarno region for the gene expression// 1984. DNA. V. 3. P. 17-21.

15. Bassler B.L. How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing// 1999. Curr. Opin. Microbiol. V. 2. P. 582-587.

16. Bassler В., Wright M., Silverman M. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in V. harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway// 1994. Molecular Microbiol. V. 13. P. 273-286.

17. Bassler В. Wright M., Silverman M. Sequence and function of luxO, a negative regulator of luminescence in V. harveyi.ll 1994. Molecular Microbiol. V. 12. P. 403-412.

18. Bassler B.L., Wright M., Showalter R.E., Silverman M.R. Intercellular signalling in V. harveyi: sequence and function of genes regulating expression of luminescence // 1993. Molecular Microbiol. V. 9. P. 773-786.

19. Belas R., Milehani A., Cohn D., Hilmen M., Simon M., Silverman M. Bacterial bioluminescence: isolation and expression of the luciferase genes from Vibrio harveyi И 1982. Science. V. 218. P. 791-793.

20. Ben-Israel O., Ben-Israel H., Ulitzur S. Identification and quantification of toxic chemicals by use of Escherichia coli carrying lux genes fused to stress promoters // 1998. Appl. Environ. Microbiol. V. 64. P. 4346-4352.

21. Boivin R., Challfour F., Dion P. Construction of a Tn5 derivative encoding bioluminescence and its introduction in Pseudomonas, Agrobacterium and Rhizobium // 1988. Mol. Gen. Genet. V. 213. P. 50-55.

22. Boylan M., Pelletier J., Meighen E.A. Fused bacterial luciferase subunits catalyze light emission in eukaryotes and prokaryotes // 1989. J. Biol. Chem. V. 264. P. 1915-1918.

23. Bukau В., Horwich A.L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines // 1998. Cell. V. 92. P. 351-366.

24. Callahan S.M. and Dunlap P.V. LuxR- and Acyl-homoserine lactone controlled noi\-lux genes define a quorum-sensing regulon in Vibrio fischeri II2000. J. Bacteriol. V. 182. P. 2811-2822.

25. Cancell D., Devyn E., Huisman O. Proteolysis and modulation of the activity of the cell division inhibitor SulA in E. coli lon mutants // 1990. J. Bacteriol. V. 172. P. 7297-7300.

26. Chatterjee J., Meighen E.A. Biotechnological applications of bacterial bioluminescence (lux) genes.// 1995. Photochem. Photobiol. V. 62. P. 641-650.

27. Chatterjee J., Miyamoto C.M., Meighen E.A. Autoregulation of luxR, the Vibrio harveyi lux-operon activator functions as a repressor // 1996. Molecular Microbiol. V. 20. P. 415426.

28. Cohn D.H., Ogden R.C., Abelson J.N., Baldwin Т.О., Nealson K.H., Simon M.I., Mileham A.J. Cloning of the Vibrio harveyi luciferase genes: use of a synthetic oligonucleotide probe // 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 80. P. 120-123.

29. Danilov V.S., Ismailov A.D. Bacterial luciferase as a biosensor of biologically active compounds // 1989. Biotechnology. V. 11. P. 39-78.

30. Davidov Y., Rozen R., Smulski D.R., Van Dyk Т.К., Volmer A.C., Elsemore D.A., LaRossa R.A., Belkin S. Improved bacterial SOS promoter and Colon::lux fusions for genotoxicity detection//2000. Mutat. Res. V. 466. P. 97-107.

31. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. The involvement of cell-to-cell signals in the development a bacterial biofilm // 1998. Science. V. 280. P. 295-298.

32. De Lorenzo V., Herrero M-., Jakubzik U., Timmis K.N. Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing and chromosomal insertion of cloned DNA in Gram-negative eubacteria// 1990. J. Bacteriol. V. 172. P. 6568-6572.

33. Doherty M.J., Morrison P.T., Kolodner R. Genetic recombination of bacterial plasmid DNA. Physical and genetic analysis of the products of plasmid recombination in E. coli // 1983. J. Mol. Biol. V. 167. P. 539-560.

34. Dolan K.M., Greenberg E.P. Evidence that GroEL, not sigma-32, is involved in transcriptional regulation of the Vibrio fischeri luminescence genes in Escherichia coli II 1992. J. Bacteriol. V. 174. P. 5132-5135.

35. Dunlop P.V., Greenberg E.P. Control of Vibrio fischeri lux gene transcription by a cyclic AMP receptor protein LuxR protein regulatory circuit 11 1988. J.Bacleriol. V. 170. P. 4040-4046.

36. Eberhard A. Inhibition and activation of bacterial luciferase synthesis // 1972. J. Bacteriol. V. 109. P.1101-1105.

37. Eberhard A., Burlingame A.L., Eberhard C., Kenyon G.L., Nealson K.H., Oppenheimer N.J. // Structural identification of autoinducer of Photobaclerium fischeri luciferase //1981. Biochemistry. V. 20. P. 2444-2449.

38. Egland K.A., Greenberg E.P. Quorum sensing in Vibrio fischeri: elements of the lux I promoter II 1999. Mol. Microbiol. V. 31. P. 1197-1204.

39. Egland K.A., Greenberg E.P. Conversion of the Vibrio fischeri transcriptional activator, LuxR, to a repressor// 2000. J. Bacteriol. V. 182. P. 805-811.

40. Ellis R.J., Hartl F.U. Principles of protein folding in the cellular environment. // 1999. Curr. Opin. Struct. Biol. V. 9. P. 102-110.

41. Engebrecht J., Nealson K., Silverman M. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri II 1983. Cell. V. 32. P. 773-781.

42. Farinha M.A., Kropinski A.M. Construction of broad-host-range plasmid vectors for easy visible selection and analysis of promoters // 1990. J. Bactewriol. V. 172. P. 3496-3499. 1990.

43. Fishel R.A., James A.A., Kolodner R. recA-independent general genetic recombination of plasmids // 1981. Nature. V. 294. P. 184-186.

44. Forst S., Nealson K.AH. Molecular biology of symbiontic-pathgenic bacteria Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp. // 1996. Microbiol. Rev. V. 60. P. 21-43.

45. Forst S., Dowds В., Boemare N., Stackebrandt E. Xenorhabdus and Photorhabdus spp.: Bugs that kill Bugs // 1997. Annu. Rev. Microbiol. V. 51. P. 47-72.

46. Frackman S., Anhalt M., Nealson K.H. Cloning, organization, and expression of the bioluminescence genes оf Xenorhabdus luminescens.il 1990. J. Bacteriol. V. 172. P. 57875773.

47. Fraser G.M., Hughes C. Swarming motility // 1999. Curr. Opin. Microbiol. V. 2. P. 630-635.

48. Freeman J.A., Bassler B.L.' Sequence and function of LuxU: a two-component phosphorelay protein that regulates quorum sensing in Vibrio harveyi. II 1999. J. Bacterid. V. 181. P. 899-906.

49. Freeman J.A., Bassler B.L. A genetic analysis of the function of LuxO, a two- component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi II 1999. Mol. Microbiol. V. 31. P. 665-677.

50. Freeman J.A., Lilley B.N., Bassler B.L. A genetic analysis of the functions of LuxN: a two-component hybrid sensor kinase that regulates quorum sensing in Vibrio harveyi // 2000. Mol.Microbiol. V. 35. P. 139-149.

51. Frydman J., Nimmesgern E., Ohtsuka K., Hartl F.-U. Folding of nascent polypeptide chains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones // 1994. Nature. V. 370. P. 111-117.

52. Fuqua W.C., S.C.Winans, E.P.Greenberg. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // 1994. J. Bacteriol. V. 176. P. 269-275.

53. Fuqua W.C. S.C.Winans. A LuxR-LuxI type regulatory system activate Agrobacterium Ti plasmid conjugal transfer in the presence of a plant-tumor metabolite. // 1994. J. Bacteriol. V. 176. P. 2796-2808.

54. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum sensing transcriptional regulators // 1996. Annu.Rev. Microbiol. V. 50. P. 727-751.

55. Garcia-Lara J., Shang L.H., Rothfield L.I. An extracellular factor regulates wxpression of sdiA, a transcriptional activator of cell division genes in Escherichia coli II 1996. J. Bacteriol. V. 178. P. 2742-2748.

56. Gil G.C., Mitchell R.J., Chang S.T., Gu M.B. A biosensor for the detection of gas toxicity using a recombinant bioluminescent bacterium // 2000. Biosens. Bioelectron V. 15. P. 23-30.

57. Gilson L., Kuo A., Dunlop P.V. AinS and a new family of autoinducer synthesis proteins. // 1995. J. Bacteriol. V. 177. P. 6946-6951.

58. Givskov M., Ostling J., Eberl L., Lindum .W., Christensen А.В., Christensen G., Molin S., Kjelleberg S. Two separate regulatory systems participate in control of swarming motility of Serratia liquefaciens MG1 // 1998. J. Bacterid. V.18. P. 742-745,

59. Glessner A., Smith E.S., Iglewski B.H., Robinson J.P. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum sensing system s in control of twitching motility // 1999. J. Bacterid. V. 181. P. 1623-1629. 1999.

60. Gottesman S. Regulation by proteolysis: developmental switches // 1999. Current Opinion in Microbiology. V. 2. P. 142-147.

61. Hanzelka B.L, Parsek M.R., Val D.L., Dunlop P.V., Cronan J.E., Greenberg E.P. Acyl-homoserine lactone synthase activity of the Vibrio fischeri AinS protein. // 1999. J. Bacteriol. V. 181. P. 5766-5770.

62. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding // 1996. Nature. V. 381. P. 571579.

63. Hesterkamp Т., Bukau B. Role of the DnaK and HscA homologs of Hsp70 chaperones in protein folding in E. coli // 1998. The EMBO J. V. 17. P. 4818-4828.

64. Holden M.T., Swift S., Williams P. New signal molecules on the quorum-sensing block // 2000. Trends in Microbiol. V. 8. P. 101-103.

65. Holland J., Holland I.В., Ahmad S.I. DNA damage by 8-methoxypsoralen plus nearultraviolet light (PUVA) and its repair in Escherichia coli: genetic analysis // 1991. Mutation Res., DNA Repair. V. 254. .P. 289-298.

66. Hulton C.S., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of E. coli, S. typhimurium, and other Enterobacteria //1991. Mol. Microbiol. V. 5. P. 825-834.

67. G. Jobling M.G., Holmes R.K. Characterization of hapR , a positive regulator of the Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homologue of the Vibrio harveyi luxR gene // 1997. Mol. Microbiol. V. 26. P. 1023-1034.

68. Kaplan H.B., Greenberg E.P. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system // 1985. J. Bacteriol. V. 163. P. 1210-1214.

69. Kaplan H.B., Greenberg E.P. Overproduction and purification of the luxR gene product: transcriptional activator of the Vibrio fischeri luminescence system// 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 84. P. 6639-6643.

70. Kodikara C.P., Crew H.H., Stewart G.S. Near on-line detection of enteric bacteria using lux recombinant bacteriophage //1991. FEMS Microbiol. Lett. V. 67. P. 261-265.

71. Komura K., Sekiquchi M. Identification of the uvrD gene product of E. coli as DNA -helicase II and its induction by DNA damaging agents // 1984. J. Biol. Chem. V. 259. P. 1560-1565.

72. Krebs F. The luminescent bacteria test for clean water legislation // 1992. Schriftenr. Ver. Wasser Boden Lufthyg. V. 89. P. 591-624.

73. Kuo A., Callahan S.M., Dunlop P.V. Modulation of luminescence operon expression by N-octanoyl-L-homoserine lactone in ainS mutants of Vibrio fischeri II1996. J. Bacteriol. V. 178. P. 971-976.

74. Laban A., Cohen A. Interplasmidic and intraplasmidic recombination in E. coli K12 // 1981. Mol.Gen. Genet. V. 184. P. 200-207.

75. Lahue R., Au K., Modrich P. DNA mismatch correction in a defined system // 1989. Science. V. 245. P. 160-164.

76. Lilley B.N., Bassler B.L. Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO and sigma-54. // 2000. Mol. Microbiol. V.36. P. 940-954.

77. Livshits V.A., Torban E.B., Iomantis J.V., Doroshenko V.G., Semenova E.V. "A new broad host range plasmid from Lactobacillus fermentum. " ИIUMS Congress: Bacteriology and Mycology-Osaka-Japan- 1990.

78. McCarter L., Silverman M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus // 1989. J. Bacteriol. V. 171. P. 731-736.

79. McCarter L.L. OpaR, a homolog of Vibrio harveyi LuxR, controls opacity of Vibrio parahaemolyticus И 1998. J. Bacteriol. V. 180. P. 3166-3173.

80. McDougald D., Rice S.A., Kjelleberg S. The marine pathogen Vibrio vulnificus encodes a putative homologue of the Vibrio harveyi regulatory gene, luxR: a genetic and phylogenetic comparison // 2000. Gene. V. 248. P. 213-221.

81. McKnight SL, Iglewski BH, Pescl E.C. The Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa H 2000. J. Bacteriol. V. 182. P. 2702-2708.

82. Meighen E.A. Molecular biology of bioluminescence. //1991. Microbiol.Rev. V. 55. P. 123142.

83. Meighen E.A. , Szittner R.B. Multiple repetitive elements and organization of the lux operons of luminescent terrestrial bacteria// 1992. J. Bacteriol. V. 174. P. 5371-5381.

84. Messing J. New M13 vectors for cloning // 1983. Methods Enzymol. V. 101. P. 20-78.

85. Miyamoto C., Boylan M, Cragg L., Meighem E.A. Comparison of the Lux systems in Vibrio harveyi and Vibrio fisheri II 1989. J. Bioluminescence and chemiluminescence. V. 3. P. 193-199.

86. Miyamoto C.M., Graham A.D., Boylan M., Evans J., Hasel K., Meighen E.A., Graham A.F. Polycistronic mRNAs code for polypeptides of the Vibrio harveyi luminescence system. // 1985. J. Bacteriol. V.161. P. 995-1001.

87. Miyamoto C.M., Byers D., Graham A.F., Meighen E.A. Expression of bioluminescence by E. coli containing recombinant Vibrio harveyi DNA. // 1987. J. Bacteriol. Y.169. P. 247-253.

88. Miyamoto C.M., Sun W., Meighen E.A. The LuxR regulator protein controls synthesis of polyhydroxybutyrate in Vibrio harveyi И 1998. Biochim. Biophys. Acta. V. 1384. P. 356364.

89. Miyamoto C.M., Lin Y.H., Meighen E.A. Control of bioluminescence in Vibrio fischeri by the lux О signal response regulator // 2000. Mol Microbiol. V. 38. P. 594-607.

90. Nealson K.H., Piatt Т., Hastings J.W. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system // 1970. J. Bacteriol. V. 104. P. 313-322.

91. Olson O., Escher A., Sandberg G., Schell J., Konez C., SzalayA. Engineering of monomeric bacterial luciferases by fusion of luxA and lux В in Vibrio harveyi II 1989. Gene. V. 81. P. 335-347.

92. Orren D., Selby C., Hearst J., Sancar A. Post-incision steps of nucleotide excision repair in E. coli. Disassembly of the UvrBC -DNA complex by helicase II and DNA polymerase I // 1992. J. Biol. Chem. V. 267. P. 780-788.

93. Park S.F., Nissen U. A., Stewart G.S. The cloning and expression of lmrAB in Listeria monocytogenes II 1991. In: Bioluminescence and Chemiluminescence. Current Status. Ed. by Stanley P.F. and Kricka L.J. Chichester. John Wiley. P. 35-38.

94. Parsek M.R., Greenberg E.P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram-negative bacteria: a signaling mechanism involved in association with higher organisms // 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 97. P. 8789-8793.

95. Pesci E.C., Iglewski B.H. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing // 1997. Trends Microbiol. V. 5. P. 132-135.

96. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P., McKnight S., Kende A.S., Greenberg E.P., Iglewski B.H. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa // 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 11229-11234.

97. Pearson J.P., Gray K.M., Passador L., Tucker K.D., Eberhard A., Iglewski B.H., Greenberg E.P. Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes // 1994. Proc. Natl. Ac. Sci USA. V. 91. P. 197-200.

98. Pearson J.P.,, Passador L., Iglewski B.H. , Greenberg E.P. A second N-acyl-homoserine lactone signal produced by Pseudomonas aeruginosa I1 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 92. P. 1490-1494.

99. Pearson J.P., Pesci E.C., Iglewski B.H. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum sensing systems in control of elastase and rhamnolipid biosynthesis genes // 1997. J. Bacteriol. V. 179. P. 5756-5787. 1998.

100. Ptitsyn L.R., Hornecek G., Komova O., Kozubek S., Krasavin E.A., Bonev M., Rettberg P. A biosensor for environmental genotoxin screening based on an SOS lux assay in recombinant E. coli cells // 1997. Appl. Environ. Mivrobiol. V. 63. P. 4377-4384. .

101. Rastorguev S.M., Zavilgelsky G.B., Tchurikov N.A. InC II plasmid R64 encodes the ArsR protein that alleviates type I restriction // 1998. FEBS Lett. V. 426. P. 21-23.

102. Salmond G.P.C., B.W.Bycroft, G.S. A.B.Stewart, P.Williams. The bacterial "engima": cracking the code of cell-cell communication. // 1995. Molecular Microbiol. V. 16. P. 615624.

103. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors II 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 74. P. 5463-5468.

104. Schroder H., Langer Т., Hartl F.-U., Bukau B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage // // 1993. EMBO J. V. 12. P.4137-4144.

105. Sevigny P., Gossard F. Construction of cloning vectors using the Vibrio harveyi luminescence genes lux A and lux В as markers. // 1990. Gene. V. 93. P. 143-146.

106. Sharpies T.M., Lloyd R.D. A novel repeated sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes // 1990. Nucleic Acids Res. V. 18. P. 6503-6508.

107. Shaw P.D., Ping G., Daly S.L., Cha C., Cronan Jr. J.E., Rinehart K.L., Farrand S.K. Detecting and characterizing N-acyl-L-homoserine lactone signal molecules by thin layer chromatography // 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 94, P. 6036-6041.

108. Shine J., Dalgarno L. The 3'-terminal sequence of E. coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites // 1974. Proc. Natl Acad. Sci. USA. V. 71. P. 1342-1346.

109. Showalter R., Martin M., Silverman M. Cloning and nucleotide sequence of lux R, a regulatory gene controlling bioluminescence in V. harveyi.il 1990. J. Bacteriol. V. 172. P. 2946-2954.

110. Sitnikov D.M., Schineller J.В., Baldwin Т.О. Control of cell division in Escherichia coli: regulation of transcription offtsQ A involves both rpoS and SdiA-mediated autoinduction// 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. P. 336-341.

111. Sperandio V., Mellies J.L., Nguyen W., Shin S., Kaper J.B. Quorum sensing controls expression of the type III secretion in enterohemorrhangic and enteropathogenic Escherichia coli. II 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 15196-15201.

112. StarkovaN.N., Koroleva E.P., RumshL. D., Ginodman L.M., Rotanova Т. V. Mutations in the proteolytic domain of E. coli protease Lon impair the ATPase activity of the enzyme // 1998. FEBS Letters. V. 422. P. 218-220.

113. Stewart G.S.A., Williams P. lux genes and the application of bacterial bioluminescence. // 1992. J. Gen. Microbiol. V. 138. P. 1289-1300.

114. Stewart G.S. Challenging food microbiology from a molecular perspective // 1997. Microbiology. V. 143. P. 2099-2108.

115. Strauss E. A symphony of bacterial voices.// 1999. Science. V. 284. P. 1302-1304.

116. Stuber D., Bujard P. Organization of transcriptional signals in plasmids pBR322 and pACYC184. // 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 78. P. 167-171.

117. Surette M.G., Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Vibrio harveyi: a new family of genes responsible for autoinducer production// 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 1639-1644.

118. Swartzman E., Silverman M., Meighen E.A. The luxR gene product of Vibrio harveyi is a transcriptional activator of the lux promoter. // 1992. J. Bacteriol. V. 174. P. 7490-7493.

119. Swartzman E., Meighen E.A. Purification and characterization of a poly (dA-dTO /ux-specific DNA-binding protein from Vibrio harveyi and identification as LuxR. // 1993. J. Biol. Chem. V. 268. P. 16706- 16716.

120. Swift S., N.J.Bainton, M.K.Winson. Gram-negative bacterial communication by N-acyl homoserine lactones: a universal language? // 1994. Trends in Microbiol. V. 2. P.193-197.

121. Swift S., G.S. A.B. Stewart, P. Williams. The inner working of a quorum sensory signal generator// 1996. Trends in Microbiol. V. 4. P. 463-466.

122. Swift S., Throup J., Bycroft В., Williams P., Stewart G. Quorum sensing: bacterial cell-cell signaling from bioluminescence to pathogenicity // 1998. Molecular Microbiology. NATO ASI Series. Vol. H 103. Ed. by S.J.W.Busby et al, 1998.

123. Szittner R., Meighen E. Nucleotide sequence, expression and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.// 1990. J. Biol. Chem. V. 265. P. 1658116587.

124. Tomoyasu Т., Ogura Т., Tatsuta T. Bukau B. Levels of DnaK and DnaJ provide tight control of heat shock gene expression and protein repair in Escherichia coli II 1998. Mol. Microbiol. V. 30. P. 567-581.

125. Trisler P., Gottesman S. Lon transcriptional regulation of genes necessary for capsular polysaccharide synthesis in Escherichia coli K12 // 1984. J. Bacteriol. V. 160. P. 184-191.

126. Tu S.-C., Mager H.L. . Biochemistry of bacterial bioluminescence. // 1995. Photochem.Photobio 1. V. 62. P. 615-624.

127. Ulitzur S. H-NS controls the transcription of three promoters of Vibrio fischeri lux cloned in Escherichia coli II 1998. J. Biolumin. Chemilumin. V. 13. P. 185-188.

128. Ulitzur S., Matin A., Fraley C., Meighen E. H-NS protein represses transcription of the lux systems of Vibrio fischeri and other luminous bacteria cloned into Escherichia coli II 1997. Curr. Microbiol. V. 35. P. 336-342.

129. Van Melderen L. and Gottesman S. Substrate sequestration by a proteolytically inactive Lon mutant // 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 6064-6071.

130. Versalovic J., Koeuth Т., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in Enterobacteria and application in fingerprinting of bacterial genomes //1991. Nucleic Acids Res. V. 19. P. 6823-6831.

131. Vollmer A.C., Belkin S., Smulski D.R., Van Dyk Т.К., LaRossa R.A. Detection of DNA damage by use of Escherichia coli carrying recAv.lux, uvrA::lux, or alkA'v.lux reporter plasmids // 1997. Appl. Environ. Microbiol. V. 63. P. 2566-2571.

132. Watanabe H. and Hastings J.W. Inhibition of luminescence in Photobacterium phosphoreum by sulfamethizole and its stimulation by thymine // 1990. Biochem. Biophys. Acta. V. 197. P. 229-234.

133. Whiteley M., Lee K.M., Greenberg E.P. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa II 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 1390413909.

134. Wickner S., Maurizi M.R., Gottesman S. Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins // 1999. Science. V. 286. P. 1888-1893.

135. Withers H. L., Nordstrom K. Quorum sensing acts at initiation of chromosomal replication in Escherichia coli II 1998. Proc.Natl. Acad. Sci. V. 95. P. 15694-15699.

136. Wolk C.P., Cai Y., Panoff J.M. Use of a transposon with luciferase as a reporter to identify environmentally responsive genes in cyanobacterium //1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 88. P. 5355-5359.

137. Woodgate R., Bridges B.A., Kelly C. Non-mutability by UV in uvrD recB derivatives of E. coli WP2 uvrA is due to inhibition of RecA protein activation // 1989. Mutat. Res. V. 226. P.141-144.