Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор медицинских наук Чернуха, Марина Юрьевна

• Чернуха, Марина Юрьевна
• доктор медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Чернуха, Марина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Сравнительный микробиологический анализ неферментирующих грамотрицательных бактерий В.cepacia и P.aeruginosa - возбудителей оппортунистических инфекций.

1.1. Клиническое значение бактерий В.cepacia и патогенез, вызванной ими инфекции.

1.2. Клиническая значимость P.aeruginosa.

1.3. Таксономия бактерий В.cepacia.

1.4. Особенности генома В.cepacia.

1.5. Необычные метаболические свойства В.cepacia.

1.6. Таксономия бактерий рода Pseudomonas.

1.7. Геном P.aeruginosa.

ГЛАВА II. Идентификация бактерий В.cepacia. Сравнительный анализ с идентификацией P.aeruginosa.

2.1. Идентификация и дифференциация бактерий B.cepacia.

2.2. Идентификация бактерий P.aeruginosa.

2.3. Устойчивость к антимикробным препаратам B.cepacia.

ГЛАВА III. Факторы патогенности бактерий комплекса B.cepacia и P.aeruginosa.

3.1. Факторы патогенности бактерий B.cepacia.

3.2. Факторы патогенности P.aeruginosa.

3.3. Биоплёнки, как способ выживания клинически значимых микроорганизмов. Формирование биоплёнки у бактерий комплекса B.cepacia и

P.aeruginosa.

3.4. Пути развития острой или персистентной формы инфекции, вызванной бактериями P.aeruginosa.

3.5. «Quorum sensing» - система регуляции внеклеточных факторов патогенности у бактерий комплекса В.cepacia и P.aeruginosa.

3.6. Изучение патогенеза инфекций, вызванных бактериям комплекса В.cepacia при моделировании на животных.

3.7. Изучение патогенеза инфекций, вызванных бактериями P.aeruginosa при моделировании на животных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1У.Материалы и методы.

4.1. Штаммы.

4.2. Модель персистентной инфекции.

4.3. Анализ кДНК в клетках В.cepacia и P.aeruginosa по матрице иРНК.

4.4. Методы изучения свойств госпитальных штаммов Burkholderia cepacia

4.5. Изучение действия лактонов на бактерии B.cepacia и P.aeruginosa.

4.6. Изучение клеточных иммунных реакций.

4.7. Разработка комплексного микробиологического подхода для идентификации бактерий Burkholderia cepacia.

ГЛАВА V. Создание управляемой модели персистентной инфекции и выяснение причин реализации патогенности бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa.

5.1. Характеристика штаммов, использованных в опыте.

5.2. Создание экспериментальной модели персистентной инфекции.

5.3. Условия перехода персистентной формы инфекции в острую под действием различных индукторов.

5.4. Условия перехода инфекции, вызванной В.cepacia, из острой в персистентную форму.

ГЛАВА VI. Изучение действия субингибирующих концентраций антибиотиков на экспрессию генов, регулирующих продукцию факторов патогенности у бактерий комплекса Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa.

6.1. Изучение влияния ципрофлоксацина на экспрессию генов факторов патогенности.

ГЛАВА VII. Выявление и характеристика компонентов регуляторной системы

Quorum sensing у клинических штаммов бактерий Burkholderia cepacia.

7.1.Выявление компонентов регуляторной системы Quorum sensing у клинических штаммов В.cepacia.

7.2.Изучение продукции потенциальных факторов патогенности клиническими штаммами В.cepacia.

ГЛАВА VIII. Формирование биоплёнок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик.

8.1. Определение способности клинических штаммов бактерий комплекса В.cepacia формировать биоплёнку.

8.2. Продукция потенциальных факторов патогенности бактериями комплекса В.cepacia и их способность к формированию биоплёнок.

8.3. Генотипирование штаммов бактерий комплекса В.cepacia с различной способностью к формированию биоплёнок.

8.4. Корреляция между наличием у штаммов «эпидемических» маркеров и способностью штаммов к формированию биоплёнок.

8.5. Изучение антибиотикочувствительности штаммов с разной способностью к формированию биоплёнки.

ГЛАВА IX. Роль регуляторной системы «QUORUM SENSING» в симбиотическом взаимодействии бактерий BURKHOLDERIA CEPACIA и PSEUDOMONAS AERUGINOSA при смешанной инфекции.

9.1.Взаимоотношения бактерий P.aeruginosa и B.cepacia.

9.2.Взаимоотношение B.cepacia 370 и P.aeruginosa РА103 in vivo.

9.3.Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B.cepacia и P.aeruginosa in vitro.

9.4.Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B.cepacia и P.aeruginosa in vivo.

9.5.Влияние автоиндукторов на образование биоплёнок у бактерий B.cepacia

P.aeruginosa.

ГЛАВА X. Влияние бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.

10.1 .Влияние штаммов B.cepacia и P.aeruginosa на функциональную активность иммунокомпетентных Т- и В- лимфоцитов.

Глава XI. Разработка системы идентификации бактерий Burkholderia cepacia.

11.1.Фенотипические методы для исследования свойств госпитальных штаммов бактерий В .cepacia.

11.2.Молекулярно-биологические методы для исследования госпитальных штаммов бактерий комплекса B.cepacia.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции»

Актуальность работы. В течение последнего десятилетия были получены данные, свидетельствующие о том, что бактерии В.cepacia, ранее относимые к роду Pseudomonas, являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать госпитальные инфекции (раневые, катетер-ассоциированные инфекции, пневмонии). Особую опасность бактерии В.cepacia представляют для лиц с иммунодефицитами различного генеза -больных кистозным фиброзом (или муковисцидозом) и хроническим грануломатозом, у которых данные микроорганизмы способны вызвать эндокардиты, некротизирующую пневмонию с септицемией, зачастую заканчивающуюся летальным исходом (так называемый «цепация - синдром») (Gilligan Р.Н.,1995, Lutter Е., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001). Вопрос, почему бактерии В. cepacia в одних случаях выделяются из мокроты больных муковисцидозом и не вызывают инфекционных осложнений, а в других вызывают тяжёлые поражения лёгких, приводящие к смерти, до настоящего времени остаётся открытым. В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных В. cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции лёгких. Учитывая ограниченные данные, касающиеся микробиологических свойств этого микроорганизма и патогенеза вызываемой им инфекции, можно отнести его к малоизученным возбудителям оппортунистических инфекций.

Одним из наиболее клинически значимых представителей рода Pseudomonas является вид P. aeruginosa. Бактерии P. aeruginosa нередко вызывают тяжёлые поражения лёгких у больных муковисцидозом при смешанной инфекции в ассоциации с бактериями В. cepacia. Учитывая вышесказанное, целесообразным является сравнительное изучение вирулентных свойств видов В. cepacia и P. aeruginosa для определения вирулентности бактерий В. cepacia и путей развития инфекционного процесса при инфицировании В. cepacia.

В 1992 г. вид Р. cepacia на основании секвенирования гена 16S rRNA был отнесен к новому роду Burkholderia, включающему в настоящее время 22 вида, среди которых есть возбудители особо опасных инфекций человека и животных - сапа и мелиоидоза- В. mallei и В. pseudomallei. Вид В. cepacia является наименее изученным представителем этого рода. Бактерии этого вида обитают в почве и воде, а также способны вызывать заболевания у человека, животных и растений, которые можно отнести к сапронозам (Anzai, Kim Y.H., Park J.Y. et al. 2000, Gilligan P.H.,1995, Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001, Luczak J.B., Cannon C.L., Pier G.B., 2002, Gilligan P.H.,1995). Возможность существования этих бактерий в различных средах обитания может быть обусловлена необычно большим геномом (в 2 раза больше, чем у Е. coli и в 1,5 раза больше генома Р. aeruginosa), а также наличием в его составе многочисленных инсерционных последовательностей и 3-х кольцевых репликонов (Mahenthiralingam Е., Urban Т.А., Goldberg J.B., 2005). Данные, касающиеся факторов патогенности В. cepacia и механизмов их регуляции, практически отсутствуют, так же как и недостаточно изучены причины возникновения инфекции у больных с иммунодефицитами различного генеза, механизмы и факторы её передачи и молекулярно-генетические механизмы изменчивости, обеспечивающие высокие адаптационные возможности этого микроорганизма для существования и размножения в различных условиях обитания. До середины 1990-х годов оставалось неясным, являются ли бактерии В. cepacia самостоятельными этиологическими агентами оппортунистических инфекций или они являются микроорганизмами, выявляемыми при тяжелых легочных инфекциях, вызываемых P. aeruginosa и S. aureus. В настоящее время достоверно доказана способность к колонизации В.cepacia в бронхоальвеолярных путях. У клинических штаммов В.cepacia доказано наличие таких факторов патогенности, как пили, адгезины и гемолизин, кроме этого, как и все грамотрицательные бактерии, бактерии В. cepacia имеют липополисахарид- эндотоксин. Можно предположить, что эти факторы детерминируются генами, имеющими сложную структуру и регуляцию и, возможно, обладающими свойствами мобильных генетических элементов -транспозонов, ряд из которых, вероятно, расположен на нескольких кольцевых ДНК. Подтверждением этому является чрезвычайная пластичность комплекса В. cepacia (Mahenthiralingam Е. et al, 2005).

Исследования экспрессии генов факторов патогенности бактерий В. cepacia являются чрезвычайно важными для понимания адаптивной изменчивости этих микроорганизмов, проблем эволюции бактерий В. cepacia, эпидемиологии инфекций, вызываемых этими возбудителями.

Актуальным является вопрос о родстве штаммов В. cepacia, выделяемых из окружающей среды (прежде всего, почвы) и от больных. Это необходимо для понимания эволюции этих микроорганизмов и их устойчивости ко многим антимикробным препаратам, связанной, возможно, с горизонтальной передачей генов. Помимо изучения родства между штаммами В. cepacia необходимо для предупреждения тяжёлых осложнений и назначения эффективного лечения, а также для уточнения таксономии, проводить идентификацию этих бактерий. Несмотря на интенсивные исследования В. cepacia, проведенные в 1990-е годы, многие вопросы, касающиеся идентификации и типирования В. cepacia остаются недостаточно изученными. Прежде всего, это связано с несовершенством микробиологических методов, используемых для выделения и идентификации В. cepacia. В настоящее время 9 фенотипически сходных, но генетически различных видов (геномоваров) в литературе принято называть «комплексом бактерий В. cepacia». Учитывая наличие 9 геномоваров, для окончательного типирования В. cepacia необходимо использовать молекулярно-биологические методы. Бактерии В. cepacia принадлежат к патогенам, идентификация которых требует одновременного использования современных бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов. Подобным комплексом микробиологических методов исследования обладает не каждая бактериологическая клиническая лаборатория, что затрудняет быструю и эффективную диагностику. Можно полагать, что разработка оптимальной схемы идентификации и типирования позволит значительно эффективнее выявлять В. cepacia, а следовательно, решать разнообразные проблемы микробиологии и эпидемиологии ВБИ, вызываемых бактериями В.cepacia.

Цель работы: Выявление свойств В. cepacia, ассоциированных с патогенностью, и путей их различной реализации при острой и персистентной формах экспериментальной инфекции.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель персистентной инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, и изучить условия и факторы, необходимые для перехода персистентной инфекции в острую форму и обратно.

2. Исследовать молекулярно-генетические механизмы перехода острой формы инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, в персистентную инфекцию под действием субингибирующих концентраций некоторых антибиотиков и идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся при острой и персистентной формах инфекции.

3. Выявить продукцию факторов патогенности, в том числе и способность к формированию биоплёнки, у клинических штаммов В. cepacia и определить влияние бактерий В. cepacia на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.

4. Изучить роль регуляторной системы «Quorum sensing» в генетическом контроле экспрессии факторов патогенности В. cepacia.

5. Оценить характер взаимодействия бактерий В. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo на разработанной экспериментальной модели инфекции.

6. Испытать действие химически синтезированных ацилгомосерин лактонов, отличающихся длиной углеродной цепи, на свойства бактерий В. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo.

7. Разработать комплексную микробиологическую систему индикации бактерий В. cepacia у больных и определить эпидемиологическую значимость штаммов, выделенных от больных пневмониями в клиниках г. Москвы.

Научная новизна работы.

Впервые изучены свойства бактерий В. cepacia, ассоциированные с патогенностью, и пути их различной реализации при разных формах экспериментальной инфекции.

Показано, что антибиотик ципрофлоксацин, являющийся ингибитором ДНК-гиразы и подавляющий синтез белков, в субингибирующей концентрации снижает экспрессию гена cepl, регулирующего продукцию синтазы автоиндуктора, у бактерий В. cepacia и гена plcR, отвечающего за продукцию гемолизина P. aeruginosa. Экспрессия гена cepl В. cepacia, который участвует в регуляции экспрессии факторов патогенности, и гена plcR P. aeruginosa обнаружена при острой форме инфекции и подавляется при персистентной форме, созданной с использованием субингибирующей концентрации (СИК) ципрофлоксацина.

Создана управляемая экспериментальная модель персистентной инфекции, вызванной бактериями В. cepacia, на основе полученных данных об ингибировании экспрессии факторов патогенности СИК ряда антибиотиков, позволившая изучить действие различных индукторов и супрессоров на инфекционный процесс. При оценке модели впервые учитывались четыре критерия персистенции: отсутствие гибели экспериментальных животных, высев из органов возбудителя, замедленный рост бактерий на питательных средах с изменением морфологии колоний, а также подавление экспрессии факторов патогенности. Установлено, что сигнальные молекулы лактона у-гидроксибутановой кислоты способствовали индукции перехода персистентной инфекции, вызываемой В. cepacia, в острую форму. Показано, что иммунодепрессант циклофосфан содействовал переходу персистентной инфекции, вызываемой P. aeruginosa, в острую форму. Критерием перехода персистентной формы в острую была гибель мышей, из селезёнки которых выделяли бактерии В. cepacia и P. aeruginosa.

Установлено, что патогенез инфекционного процесса, обусловленного В. cepacia отличается от такового, вызванного бактериями P. aeruginosa, что выражается в различных влияниях В. cepacia и P. aeruginosa на массу иммунокомпетентных органов - селезёнки и тимуса, на образование АОК мышей к гетерологичному антигену (ЭБ) и на пролиферативную активность спленоцитов мышей, вследствие реализации действия различных факторов патогенности бактериями В. cepacia и P. aeruginosa.

Продемонстрировано, что бактерии В. cepacia обладают регуляторной системой CepI/CepR "Quorum sensing". Регуляция экспрессии генов факторов патогенности у бактерий В. cepacia и P. aeruginosa осуществляется с помощью сходных регуляторных систем "Quorum sensing" CepI/CepR (В. cepacia) и LasI/LasR, Rhll/RhlR (P. aeruginosa), относящихся к LuxIR -типу, отличающихся незначительными различиями у автоиндукторов - ацилгомосерин лактонов, а именно длиной углеродной цепи.

Впервые выдвинута гипотеза о том, что у штаммов В. cepacia, имеющих cepl и cepR гены, активация продукции факторов патогенности происходит под действием собственных лактонов, что может быть при моноинфекции, тогда как штаммам В. cepacia, содержащим только cepR ген, для активации продукции факторов патогенности необходимы экзогенные ацилгомосерин лактоны бактерий, имеющих полноценную регуляторную систему "Quorum sensing". Подобное явление может происходить при смешанной инфекции, что подтверждено на модели экспериментальной смешанной инфекции in vitro и in vivo обнаружением синэргического усиления патогенности ассоциации В. cepacia и P. aeruginosa.

Установлена возможность взаимодействия регуляторных систем этих бактерий, включая систему "Quorum sensing", приводящего к взаимовыгодному использованию компонентов регуляторных систем.

Впервые показано, что причиной роста вирулентности бактерий В. cepacia и P. aeruginosa при экспериментальной смешанной инфекции и в опытах с синтетическими ацилгомосерин лактонами in vitro и in vivo может быть совместное действие автоиндукторов системы "Quorum sensing" этих близкородственных микроорганизмов.

Впервые продемонстрировано различное действие отдельных лактонов и их сочетаний на В. cepacia и P. aeruginosa на основании изучения действия искусственно синтезированных ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной боковой цепи на свойства бактерий.

Установлено, что бактерии В. cepacia и P. aeruginosa могут использовать в своей жизнедеятельности сразу несколько экзогенных лактонов, продуцируемых другими близкородственными бактериями, приспосабливаясь, таким образом, к условиям своего обитания in vitro и in vivo.

Впервые показано, что на способность В. cepacia образовывать биоплёнки влияет одновременное добавление в среду выращивания двух ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной цепи, что подтвердило роль системы "Quorum sensing" в этом процессе.

Впервые продемонстрировано, что у штаммов, обладающих выраженной способностью к образованию биоплёнки, наиболее часто выявляются факторы патогенности (гемолитическая и хитинолитическая активность), а также гены cepl и cepR, являющиеся компонентами регуляторной системы "Quorum sensing", что может служить доказательством взаимосвязи между наличием генов системы "Quorum sensing", продукцией факторов патогенности и формированием биоплёнок.

Впервые определены критерии потенциальной способности к формированию биоплёнки у исследуемых штаммов: выявление в ПЦР гена cbl, ответственного за продукцию пилей, участвующих в прикреплении бактерий к поверхности тканей, органов и поверхностей медицинского оборудования при образовании биоплёнок, и принадлежность штаммов преимущественно к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР.

Практическая значимость.

Собрана коллекция из 74 штаммов В. cepacia, включающая 55 клинических штаммов, выделенных от больных пневмониями в больницах г. Москвы, которые используются в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов и в лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН в микробиологических и молекулярно-генетических исследованиях.

Разработан алгоритм индикации бактерий В. cepacia, включающий бактериологический анализ и ПЦР для идентификации геномоваров В. cepacia, генотипирование штаммов с помощью RAPD-ПЦР и выявление эпидемиологических маркеров BCESM (маркера эпидемических штаммов), ISH (гибрида двух инсерционных последовательностей), обнаруженного у эпидемических штаммов, и гена cbl. При использовании этого алгоритма установлено, что клинические штаммы, циркулирующие в различных стационарах города Москвы, относятся к геномовару IIIA, обозначенному как Burkholderia cenocepacia. Доказана эпидемиологическая значимость российских штаммов, у которых были выявлены эпидемиологические маркеры. Показано, что в стационарах г. Москвы циркулируют штаммы типичные для московского региона, и штаммы со специфическими генотипическими характеристиками для каждого стационара. Разработанный алгоритм индикации В. cepacia оформлен в виде методических рекомендаций «Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia» (Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Москва, 2005г.) для клинических бактериологических лабораторий, которые утверждены советом по внедрению ГУ НИИЭМ им

Н.Ф.Гамалеи РАМН. Алгоритм индикации В. cepacia описан в главе «Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью ПЦР» (Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А.) в учебно-методическом пособии «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение в бактериологии» (Ред. Гинцбург A.JI., Романова Ю.М., М., 2006). Алгоритм индикации бактерий B.cepacia используется в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН при обследовании больных муковисцидозом для идентификации бактерий В. cepacia и может быть использован в любой бактериологической лаборатории при наличии приборов и реактивов для проведения ПЦР.

Полученные результаты позволяют представить механизм смешанной инфекции у больных муковисцидозом, вызванной бактериями В. cepacia и Р. aeruginosa, обладающих сходными регуляторными системами "Quorum sensing", и определить, что причиной тяжёлого клинического состояния пациентов является рост вирулентности этих близкородственных бактерий за счёт совместного действия ацилгомосерин лактонов- компонентов системы "Quorum sensing".

Научные программы. Работа была выполнена в рамках грантов РФФИ и МО РФ (1997-2005гг).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Чернуха, Марина Юрьевна

выводы.

1. Впервые разработана модель экспериментальной персистентной инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, с помощью которой выявлено, что причиной перехода острой формы инфекции в персистентную является введение антибиотика в организм животного в субингибирующей концентрации (СИК), подавляющей экспрессию факторов патогенности.

2. Показано, что стимулятор роста бактерий лактон у-гидроксибутановой кислоты для В. cepacia и иммунодепрессант циклофосфан для P. aeruginosa способствовали индукции перехода персистентной инфекции в острую форму.

3. Доказано влияние СИК ципрофлоксацина на экспрессию факторов патогенности В. cepacia и P. aeruginosa. Выявлена дифференциальная экспрессия генов cepl В. cepacia и plcR P. aeruginosa при острой инфекции и персистенции. Экспрессия гена cepl В. cepacia и гена plcR P. aeruginosa была обнаружена при острой форме инфекции и подавлялась при создании персистентной формы инфекции.

4. Установлено, что бактерии В. cepacia могут воспринимать одновременно несколько экзогенных лактонов с различной длиной углеродной цепи. В отсутствии гена cepl - компонента регуляторной системы "Quorum sensing"- бактерии B.cepacia способны использовать сходные ацилгомосерин лактоны, имеющиеся у бактерий P. aeruginosa с полноценной регуляторной системой.

5. Взаимное усиление гемолитической активности В. cepacia и Р. aeruginosa in vitro и вирулентности in vivo свидетельствует о возможности взаимного использования компонентов регуляторной системы "Quorum sensing" близкородственными бактериями. В этом случае бактерии выбирают стратегию развития острой инфекции, что может быть одной из причин ухудшения клинического состояния больных муковисцидозом, страдающих смешанной инфекцией.

6. Впервые продемонстрировано, что более 83% клинических штаммов В. cepacia способны формировать биоплёнку, колонизировать поверхности органов и тканей, вызывать хроническую госпитальную инфекцию, а также формировать постоянные резервуары инфекции в госпитальной среде. Определены маркеры эпидемиологической значимости штаммов В. cepacia с потенциально выраженной способностью к формированию биоплёнки: выявление гена сЫ, принадлежность к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР.

7. Показано, что ацилгомосерин лактоны по-разному действуют на рост и образование биоплёнки у бактерий В. cepacia и P. aeruginosa, что подтверждает роль регуляторной системы "Quorum sensing" в формировании биоплёнок. Выявлено, что лактоны С4,С6,С8 в сочетаниии активируют рост, и гемолитические свойства В. cepacia и P. aeruginosa, тогда как синтетический гомосерин лактон без углеродной цепи (СО) существенно ингибирует рост бактерий P. aeruginosa и формирование биоплёнки. Это указывает на возможность и целесообразность разработки синтетических бактериостатических препаратов, ингибирующих рост и продукцию факторов патогенности бактерий на молекулярном уровне.

8. Разработан алгоритм индикации бактерий В. cepacia, включающий комплекс бактериологических и молекулярно-биологических методов. Впервые в схему исследований включены фенотипический тест — выявление образования биоплёнок и молекулярно-биологические методы - ПЦР для выявления эпидемиологических маркеров (cbl -гена, ISH, BCESM маркеров); RAPD-ПЦР для генотипирования штаммов; ПЦР для определения cepl и cepR генов системы "Quorum sensing". Разработанная схема позволяет а) идентифицировать возбудитель до геномовара; б) определить способность возбудителя вызывать острую или хроническую форму инфекции; в) выявить эпидемиологические связи циркулирующих в стационарах и среди больных штаммов В. cepacia.

9. Установлено, что клинические штаммы комплекса В. cepacia, циркулирующие в различных стационарах г.Москвы, относятся к геномовару III A (Burkholderia cenocepacia). У российских штаммов выявлены эпидемиологические маркеры (cbl -ген, BCESM маркер). Установлено, что в каждом из стационаров циркулируют как типичные только для него штаммы, так и региональные или «московские» штаммы.

Специальное приложение.

Выражаю искреннюю благодарность за консультации и плодотворное сотрудничество академику РАМН А.Л.Гинцбургу, профессору, д.б.н. Ю.М.Романовой, д.б.н. Н.А.Зигангировой, д.м.н. Т.Н.Николаевой, д.б.н. И.А.Хмель.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Чернуха, Марина Юрьевна, 2008 год

1. Ашмарин И.П., Воробьёв А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях// Ленинград, 1962.- С. 70-78.

2. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. "Quorum sensing" или социальное поведение бактерий// Журн. микробиол.- 2003.- № 5. С. 86-93.

3. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом.//Молекуляр. Биология. 2001.- Т.35. -№ 2. - С. 268-277.

4. Зигангирова Н.А., Бархатова О.И., Хойкова О.Ч. , Гинцбург А.Л. Молекулярно-генетические механизмы циркуляции патогенных микоплазм в организме хозяина.//Вестн. РАМН.- 2000.- №1.- С.29-34.

5. Зигангирова Н.А. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биол. наук «Персистенция патогенных микоплазм и ее молекулярно-генетические механизмы»//М.- 2001.

6. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающенй среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития.// Генетика.-2004.-том40.-№11.-С. 1-12.

7. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике// Из-во «Мир». Пер. с англ.- 1976.

8. Мороз А.Ф. Синегнойная инфекция// М.- 1985.

9. Першина М.Ю., Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Прозоровский С.В. Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепной реакции спроизвольными праймерами.// Мол. генетика, микробиол. вирусол. -1998. № 1. - С.29-32.

10. Рыбальченко О.В, Бондаренко В.М. Ультраструктура и функции биоплёнки симбиотических, патогенных и оппортунистических микроорганизмов// Хлопинские чтения. Современные проблемы медицинской микробиологии. Санкт-Петербург.-2007.- С.245-247.

11. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы// Вестн. РАМН.- 2000.- т. 1.- С. 22-28.

12. Штейн И.В., Аренде И.М., Сорокина Т.А и др.И Биотехнология. -1989.-т.5.-С. 133-136.

13. Agodi A., Mahenthiralingam Е., Barchitta М. et al. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis: prevalence, epidemiology, and genomovar status// J.Clinical microbiology. -2001. -Vol. 39.- N.8.- P. 2891-2896.

14. Albus A.M., Pesci E.C., Runyen-Janecky L.J., et al. Vfr controls quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa// J Bacteriol.- 1997.- Vol. 179.- P.3928-35.

15. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.G. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res.- 1997. Vol.25. -P. 3389-3402.

16. Anzai, Kim Y.H., Park J.Y. et al. Phylogenetic affiliation of the pseudomonds based on 16S rRNA sequence// Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2000.-Vol.50.-P. 1563-1569.

17. Appelbaum P.C., Leathers D.J. Evaluation of the rapid NFT system for identification of gram-negative, nonfermenting rods// J.Clin. Microbiol.- 1984.- Vol. 20.-P.730-734.

18. Balandrean J., Viallard V., Cournoyer B. et al. Burkholderia cepacia Genomovar 111 is a common plant associated Bacterium// Applied and Environmental Microbiol. -2001.- N2.-P. 982-985.

19. Baselski V. Microbiologic diagnosis of ventilator-associated pneumonia// Infect.Dis. Clin. North Am.- 1993,- N 7.-P.331-357.

20. Bauernfeind A., Schneider I., Jungwirth R. et al. Discrimination of Burkholderia multivorans and Burkholderia vietnamiensis from Burkholderia cepacia genomovars I,III, and IV by PCR// J.Clinical microbiology. -1999.- Vol.37.- N5.-P.1335-1339.

21. Bernier S.P., Silo-Suh L., Woods D.E. et al. Comparative analysis of plant and animal models for characterization of Burkholderia cepacia virulence// Infect. Immun. -2003.- Vol. 71.-P. 5306-5313.

22. Berry A., Devault J.D., Chakrabarty A.M. High osmolarity is a signal for enhanced algD transcription in mucoud and nonmucoid Pseudomonas aeruginosa strains//J.Bacteriol.- 1989.-Vol. 171.-P. 2312-2317.

23. Bertani I., Sevo M„ Kojic M., Venturi V. Role of GacA, Lasl, Rhll, Ppk, PsrA, Vfr and ClpXP in the regulation of the stationary-phase sigma factor rpoS/RpoS in Pseudomonas// Arch Microbiol .-2003.-Vol. 180.-P.264-271.

24. Bingen E.E., Denamur В., Picard B. et al. Molecular epidemiological analysis of Pseudomonas aeruginosa strains causing failure of antibiotic therapy in custic fibrosis patients// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.Dis.- 1992.- N 11.-P.432-437.

25. Bottone E.J., Perez A.A. II. Pseudomonas aeruginosa folliculitis acquired through use of contaminated loofah sponge: an unrecognized potential public health problem// J.clin.microbial.- 1993.-Vol. 31.-P. 480-483.

26. Brooun A., Liu S., Lewis K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms// Antimicrob Agents Chemother.-2000.-Vol. 44.-P.640-646.

27. Burkholder W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs// Phytophathology.- I950.-Vol. 40.-P. 115-117.

28. Burns J.L., Siman L., Whittier D. et al. Comparison of agar diffusion methodologies of antimicrobial susceptibility testing of pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients// J.Clin Microbiol.- 2000.-Vol.38.-P. 1818-1822.

29. Cha C., Gao P., Chen J.C et al. Mol.Plant-Microbe Interact. Production of Acyl-Homoserine Lactone Qurum-Sensing Signals by Gram-Negative Plant-Associated Bacteria// 1998.- N 11.- P.l 119-1129.

30. Chaparro C., Maurer J., Gutierrez C. et al. Infection with Burkholderia cepacia in Cystic Fibrosis. Outcome following lung transplantation// Am. Journ.

31. Resp. and Crit. care medicine.-2001.-N 163.-P.43-48.

32. Cheng H., T.Lessie Multiple replicons constituting the genome of Pseudomonas cepacia 17616//J.Bacteriol.- 1994.- Vol .176.-P. 4034-4042.

33. Chiarini L., Bevivino A., Dalmastri C., Tabacchioni S., Visca P. Burkholderia cepacia complex species: health hazards and biotechnological potential. //TRENDS in Microbiology.- 2006.-Vol.l4.-N6.-P.277-286.

34. Chung J.W., Altman E., Beveridge TJ. et al. Colonial morphology of Burkholderia cepacia complex genomovar III: implications in exopolysaccharide production, pilus expression, and persistence in the mouse// Infect. Immun.-2003.-Vol .71.-P. 904-909.

35. Chugani S.A., Whiteley M., Lee K.M. et al. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.- Vol .98.- P.2752-2757.

36. Clitnis C.E., Ohman D.E. Genetic analysis of the alginate biosynthesis gene claster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure// Mol.Microbiol.- 1993.- N 8.- P. 583-590.

37. Coleman F.T., Mueschenborn S., Meluleni G. et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection// Medical Sceinces.PNAS.-2003.- Vol.100.-N4.-P.1949-1954.

38. Coenye Т., J.J.LiPuma, D.Henry et al. Burkholderia cepacia genomovar VI, a new member of the Burkholderia cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients//Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 2001.- N 51.-P. 271-279.

39. Coenye Т., E. Mahenthiralingam, D.Henry et al. Burkholderia ambirafaria sp.nov., a novel member of the Burkholderia cepacia complex including biocontroland cystic fibrosis-related isolates// Int.J.Syst.Evol.Microbiol.- 2001.- Vol .51.- P. 1481-1490.

40. Coenye Т., Spilker Т., Martin A. et al. Comparative Assessment of genotyping Methods for epidemiologic study of Burkholderia cepacia genomovar III// J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol. 40.-N9.-P. 3300-3307.

41. Coenye Т., P.Vandamme, J.R.W. Gowan, J.J. Lipuma Taxonomy and identification of the Burkholseria cepacia complex/Л. Clin. Microbiol.- 2001.- Vol. 39.-P. 3427-3436.

42. Coeney Т., Vandamme P., Govan J.R.W. et al. Taxonomy and Identification of the Burkholderi cepacia complex// J. Clinical Microbiol.- 2001.- N 10 (Oct).-P. 3427- 3436.

43. Conway B.A., Chu K.K., Bylund J. et al. Production of exopolysaccharide by Burkholderia cenicepacia results in altered cell-surface interactions and altered bacterial clearance in mice// J. Infect. Dis.- 2004.- Vol. 190(5).-P.957-966.

44. Conway B. A., Greenberg E.P. Quorum sensing signals and quorum sensing genes in Burkholderia vietnamiensis// J. Bacterid.- 2002.- Vol.184.-P.1187-91.

45. Conway B.A., Venu V., Speert D.P. Biofilm formation and acyl homoserine lactone production in the Burkholderia cepacia complex// J. Bacteriol.-2002.- N 184.-P.5678-85.

46. Corbett C.R., Burtnick M.N., Kooi C. et al. An extracellular zinc metalloprotease gene of Burkholderia cepacia// Microbiology.- 2003.- Vol. 149.-P.2263-2271.

47. Cunha M.V., Leitao J.H., Mahenthiralingam et al. Molecular analysis of Burkholderia cepacia complex isolates from Portuguese cystic fibrosis center: a 7-year study// J.Clin. Microbiol. Vol. 41.-P. 4113-4120.

48. Davies J.E. Origins, acquisition and dissemination of antibiotic resistance determinants// In: Chadwick D.J, editor. Antibiotic resistance: origins, evolution, selection and spread. Chinester (UK): John Wiley and Sons Ltd.- 1997. -P. 15-35.

49. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., et al. The involvement of cell-to cell signals in the development of a bacterial biofilm// Science.-1998.- Vol .280.-P.295-298.

50. De Vos D., Lim A., Pirnay J.J.P. et al. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on Vol .35.-P. 1295-1299.

51. De Vos D., Lim A., De Vos A. et al. Detection of outer membrane lipoprotein I and its gene in fluorescent and nonflourescent pseudomonads: its implication for taxonomy and diagnosis// J.Gen. Microbiol.- 1993.- Vol .139.-P. 2215-2223.

52. Donlan R.M. Biofilms and device-associated infections// Emerg Infect ' Dis.- 2001.-N 7.-P.277-281.

53. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms// Clin Microbiol Rev.- 2002.- Vol .15.-P. 167-193.

54. Drenkard E., Ausubel F.M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation// Nature.- 2002.- Vol.416.-740-743.

55. Fick R.B. Pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa lung lession in cystic fibrosis//Chest.- 1989.- Vol .46.- P. 158-164.

56. Fisher M.C., Goldsmith J.F.,Gilligan P.H. Sneakers as a source of Pseudomonas aeruginosa in children with osteomyelitis following puncture wounds// J. Pediatr. -1985.- Vol .106.- P.607-609.

57. FitzSimmons S.C. The changing epidemiology of cystic fibrosis// Curr. Probl. Pediatr.- 1994.- Vol .24.-P.171-179.

58. Flynn J.L., Ohman D.E. Cloning of genes from mucoid Pseudomonasaerugenosa which control spontaneous conversion to the alginate production phenotype// J.Bacteriol.- 1988,-Vol .170.-P. 1452-1460.

59. Foca M.C., Jacob S., Whitter P.D. Endemic Pseudomonas aeruginosa infection in a neonatal intensive care unit// N.Engl. J. Med.- 2000.- Vol .343.-P.695-700.

60. Fuqua W.C, Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators.// J.Bacteriol.- 1994. Vol.176. -N2.- P.269-275.

61. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. // Annu. Rev. Microbiol.- 1996.- Vol. 50.- P. 727-751.

62. Furukawa S, Kuchma S.L., O'Toole G. A. Keeping their options open: acute versus perssistent infections// Minireview. Journal of Bacteriology.- 2006.- Vol. 188.-N4.- P. 1211-1217.

63. Gambello M.J., Kaye S., Iglewski B.H. LasR of Pseudomonas aeruginosa is a transcriptional activator of the alkaline protease gene (apr) and an enhancer of exotoxin A expression. // Infect. Immun. 1993.- Vol. 61. -N 4. - P. 1180-1184.

64. Geiss H.K., Geiss M. Evaluation of a new commercial system for the identification of Enterobacteriaceae and non-fermentative bacteria// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 1992.-N 11.-P.610-616.

65. Gilligan P.H. Microbiology of airway disease in patients with cysticfibrosis// Clin Microbiol. Rev.- 1991.-N 4.- P. 35-51.

66. Gilligan P.H. Pseudomonas and Burkholderia// In "Manual of Clinical Microbiology", 6 th cd„ Washington Press.- 1995.-P. 509-519.

67. Gilligan P.H. Report on the consensus document for microbiology and infectious diseases in cystic fibrosis// Clin. Microbiol. News 1996.-N 18.-P.83-87.

68. Goldstein R., Sun Li, Ru-zhang Jjang et al. Structurally variant classes of pilus appendage fibers coexpressed from Burkholderia (Pseudomonas) cepacia// J.Bacteriol.- 1995.-Vol. 177.-N4.- P.1039-1052.

69. Goodman, A. L., B. Kulasekara, A. Rietsch, D. Boyd, R. S. Smith, and S. Lory. A signaling network reciprocally regulates genes associated with acute infection and chronic persistence in Pseudomonas aeruginosa// Dev. Cell .-2004.-N 7.- P.745-754.

70. Gotschlich A., Huber В., Geisenberger O., et al. Synthesis of multiple N-acylhomoserine lactones is widespread among members of the Burkholderia cepacia complex// Syst Appl Microbiol.- 2001,- Vol .24.-P.1-14.

71. Govan J.R.W., Brown P.H., Maddison J. et al. Evidence for transmission of P.cepacia by social contact in cystic fibrosis// Lancet.- 1993.- Vol .342.- P. 15-19.

72. Govan J.R.W, Deretic V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia// Microbiol. Rev.- 1996.-Vol .60.-P. 539-574.

73. Govan J.R.W., Hughes J.E., Vandamme P. Burkholderia cepacia: medical, taxonomic and ecological issues// J. Med. Microbiol.- 1996.- Vol .45.-P. 395-407.

74. Govan J.R.W., P.Vandamme Agricultural and medical microbiology: atime for bridging gaps// Microbiol.- 1998.- Vol .144.- P. 2373-2375.

75. Grimwood К., M. Tu, Rabin H.R. at al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa exoenzyme expression by subinhibitory antibiotic concentrations// Antimicrob.Agents Chemother.- 1989.- Vol .33.-P. 41-47.

76. Grkovic S., Brown M.H., Skurray R.A. Regulation of bacterial drug export systems// Microbiol Mol .Biol. Rev.- 2002.- Vol .66.-P.671-701.

77. Grundman H., Schneider C., Hartung D. et al. Discriminatory power of three DNA-based typing techniques for Pseudomonas aeruginosa// J. Clin. Microbiol.- 1995.- Vol .33.-P.528-534.

78. Hall-Stoodley, L., J. W. Costerton, and P. Stoodley. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases// Nat. Rev. Microbiol.-2004.-N 2.-P.95-108.

79. Hedberg M. Acetamide agar medium selective for Pseudomonas aeruginosa// Appl. Microbiol. -1969.- Vol .17.-P.481.

80. Henry D., Campbell M, McGimpsey C. et al. Comparison of isolation media for recovery of Burkholderia cepacia complex from respiratory secretions of patients with cystic fibrosis// J.Clinical microbiology.- 1999.- Vol.37.- N 4.- P. 10041007.

81. Henry D.A., Mahenthiralingam E., Vandamme P. et al. Phenotypic methods for determining genomovar status Burkholderia cepacia complex// J.Clinical microbiology. -2001.- Vol.39.- N 3.- P.1073-1078.

82. Henry D.A., E.Mahenthiralingam, P.Vandamme et al. Biochemical and molecular approaches for determining genomovar status of the of Burkholderia cepacia complex//Pediatr. Pulmonol.-1999.- Suppl. 19.-P.271.

83. History of CF.- 2005. http://www3.nbnet.nb.ca/normap/cfhistory.htm.

84. Hogardt, Trebesius M.K., Geiger A.M. et al. Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients// J. Clin. Microbiol. -2000.- Vol .38.-P.818-825.

85. Holden M.T.G. et al. Genomic plasticity of the causative agent ofmelioidosis Burkholderia pseudomallei// Proc. Nait. Acad. Sci. Usa.- 2004.- Vol. 101.-P. 14240-14250.

86. Holland S.P., Pulido J.S., Shires Т.К. et al. Pseudomonas aeruginosa ocular infections// In R.B.Fick, Jr.(ed), Pseudomonas aeruginosa: the Opportunist. CRC Press, Inc., Boca Raton, На.- 1993.-P. 159-176.

87. Holmes A., J.Govan, R. Goldstein. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to human health//Emerg.Infect.Dis.- 1998.- N 4.-P. 221-227.

88. Holt J.G.N., Kreig P.H.A., Sneath J.T. Bergey's Manual of determinative Bacteriology// 9th ed. The Williams & Wilkins Co., Philadelphia,Pa. -1994.-P.93-94, 151-168.

89. Horinouchi S., Berru Т. Autoregulatory factors and communication in actinomycetes//Ann. Rev. Microbiol. Vol .1192.-N.16. - P.377-398.

90. Huber В., Riedel K., Hentzer M., et al. The сер quorum-sensing system of Burkholderia cepacia Hill controls biofilm formation and swarming motility// Microbiology.- 2001.- Vol .147.-P.2517-2528.

91. Hutchison M., Poxton I.R., Govan J.R. Burkholderia cepacia produces a Hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes// Infect.Immun.- 1998.-Vol. 66.-N 5.-P. 2033-2039.

92. International Pseudomonas aeruginosa Typing Study Group. A multicenter comparison of methods for typing strains of Pseudomonas aeruginosa predominantly from patients with cystic fibrosis// J.Infect.Dis.- 1994.-Vol. 169.-P. 134-142.

93. Isles A., I.maclusky, M.Corey et al. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem//J.Pediatr.- 1984,- Vol .104.-P. 206-210.

94. Ivobe S., Kusadocoro H, Ozaki J. et al. Amino acid substitutions in a variant of imp-1 metallo-p-lactamase// Antimicrob. Agents Chemother.-2000.-Vol.44.-P.2023-2027.

95. Jack D.L., Yang N.M., Saier M.H. Jr. The drug/metabolite transportersuperfamily// Eur. J. Biochem.- 2001,- Vol .268.-P.3620-39.

96. Jerne N.K. The somatic generation of immune recognition// Eur.J.Immunol. -1971.- N 1.-P.1-9.

97. Jones A.M., Todd M.E., Webb A.K. Burkholderia cepacia: current clinical issues, environmental controversies and ethical dilemmas// Eur. Respir. J. 2001.-N 17.-P.295-301.

98. Keivit T.R., Iglewski B.H. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships// Infect. Immun.-2000.- Vol .68.-P.4839-4849.

99. Kell D.B., Kaprelyants A.S.,Grafen A. On pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria// Els.Trends.J. 1995. -Vol.10.-N3.-P. 126-129.

100. Kenneth T. Todar's online textbook of bacteriology. http//textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html.-2004.-P.l-9.

101. Kersters K., Ludwig W., Vancanneyt M. et al. Recent changes in the classification of the pseudomonads: an overview// Syst. Appl. Microbiol.- 1996.- Vol .19.-P.465-477.

102. Kiska D.L., Gilligan P.H. Pseudomonas// In: Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H., editors. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington: ASM Press.- 2003.-P. 719-728.

103. Kitch T.T., Jacobs M.R., Appelbaum P.C. Evaluation of the 4-hour RapidID NF Plus method for identification of 345 gram-negative nonfermentativerods//J. Clin. Microbiol. -1992.-Vol. 30.-P.1267-1270.

104. Koh A.Y., Priebe G.P., Pier G.B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia// Infect, and Immun.- 2005.-Vol.73.-P.2262-2272.

105. Komshian S.V., Tablan O.C., Palutke W. et al. Characteristics of left-sided endocarditis due to Pseudomonas aeruginosa in the Detroit Medical Center// Rev. Infect. Dis.- I990.-Vol. 12.-P.693-702.

106. Kothe M., Antl M., Huber B. et al. Killing of Caenorhabditis elegans by Burkholderia cepacia is controlled by the сер quorum- sensing system// Cell. Microbiol.- 2003.-N 5-P.343-351.

107. Krueger C.L., Sheikh W. A new selective medium for isolating Pseudomonas spp. from waterII Appl. Environ. Microbiol.- 1987.-Vol. 53.-P.895-897.

108. Kuchma, S. L., J. P. Connolly, and G. A. O'Toole. 2005. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa//. Bacterid.- Vol.87.-P. 1441-1454.

109. Kulasekara, H. D., I. Ventre, B. R. Kulasekara, A. Lazdunski, A. Filloux, and S. Lory. 2005. A novel two-component system controls the expression of Pseudomonas aeruginosa fimbrial cup genes// Mol. Microbiol.-Vol. 55.-P.368-380.

110. Lambre D.W., Stewart W. Evaluation of pseudosel agar as an aid in the identification of PSEUDOMONAS AERUGINOSA// Appl. Microbiol.- 1972.-Vol.23.-P.377-381.

111. Lamothe J., Thyssen S., Valvano M.A. Burkhoderia cepacia complex isolates survive intracellularly without replication within acidic vacuoles of Acanthamoeba polyphaga// Cell Microbiol.- 2004.-Vol.6.-N 12.-P.1127-1138.

112. Laskowski, M. A., E. Osborn, and В. I. Kazmierczak. 2004. A novel sensor kinase-response regulator hybrid regulates type III secretion and is required for virulencc in Pseudomonas aeruginosa// Mol. Microbiol.- Vol. 54.-P. 1090-1103.

113. Lau Y.J., Liu P.Y.F., Hu B.S. et al. DNA fingerprinting of Pseudomonasaeruginosa serotype Oil by enterobacterial repetitive intergenic consesus-polymerase chain reaction and pulsed-field gel electrophoresis// J. Hosp. Infect.- 1995.- Vol.31.-P.61-66.

114. Lennin E. and B.DeCicco. Plasmid of P.cepacia strains of diverse origins.// Appl.Environ.Microbiol.- 1991.- Vol.57.-P.2345-2350.

115. Lewenza S., Conway В., Greenberg E.P., Sokol P.A. Quorum Sensing in Burkholderia cepacia: Identification of the LuxRI Homologs CepRI // J. Bacterid 1999.- Vol. 181. P. 748-756.

116. Lewenza S., Sokol P.A. Regulation of Ornibactin Biosynthesis and N-Acyl-L-Homoserine Lactone Production by CepR in Burkholderia cepacia. // J. Bacteriol.- 2001.- Vol. 183.- P. 2212-2218.

117. Chiarini L., Bevivino A., Dalmastri C., Tabacchioni S., Visca P. Burkholderia cepacia complex species: health hazards and biotechnological potential. //TRENDS in Microbiology.- 2006.-VoU4.-N6.-P.277-286.

118. LiPuma J.J., E.Mahenthiralingam Commercial use of Burkholderia cepacia//Emerg.Infect.Dis.- 1999.- N5.-P.305-306.

119. Liu P.Y.-F., Lay Y.-J., Hu B.-Sh., Shyr J.-M., Shi Z.-Y., Tsai W.-S., Lin Y.-H., Tseng C.-Y. Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different Molecular Typing Methods.// J.Clin. Microbiol.-1995.- Vol. 33.-P.1779-1783.

120. Liu P.V. Toxins of Pseudomonas aeruginosa// In: Pseudomonas aeruginosa ( clinical manifestation and current therapy). Ed. R.G. Dogett. New York. -1979.-P.90-135.

121. Livermore D.M. Multiple mechanisms of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa: our worst nightmare?// Clin. Infect. Dis. -2002.- Vol. 34.-P.634-640.

122. Loazdunski A.M., Ventre I, Aturgis U.N. Gram-negative bacteria circuits and communication in Gram-negative bacteria// Nature Rev. Microbiol.- 2004.-N2.-P.581-592.

123. Lonon M.K., Woods D.E., Straus D.C. Production of lipase by clinical isolates of Pseudomonas cepacia.// J. Clin. Microbiol.-1988.- Vol. 26. P. 979-984.

124. Luczak J.B., Cannon C.L., Pier G.B. Lung infections associated with cystic fibrosis// Clin Microbiol Rev.- 2002.- Vol. 15.-P. 194-222.

125. Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al. Distribution of Quorum-Sensing Genes in the Burkholderia cepacia complex// Infect.Immun. 2001. - Vol. 69. -N7. -P.4661^666.

126. MacGeorge J., Korolik V., Morgan A.F. et al. Transfer of a chromosomal locus responsible for mucoid morphology in Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients to P.aerugenosa РАО// J. Med.Microbiol.- 1986.- Vol. 21.-P.331-336.

127. Mahenthiralingam E., Baldwin A., Vandamme P. Burkholderia cepacia complex infection in patients with cystic fibrosis // J. Med. Microbiol. 2002.-Vol.51.-P. 533-538.

128. Mahenthiralingam E., Urban T.A., Goldberg J.B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nature Reviews// Microbiology.-2005.- Vol.3.-N.2.-P. 144-156.

129. Marolda CL, Haureder B, John MA, Michel R, Valvano M.A: Intracellular survival and saprophytic growth of isolates from the Burkholderia cepacia complex in free-living amoebae// Microbiology.-1999.- Vol.145.- P.1509-1517.

130. Masuda N., Sakagawa E., Ohya S. Outer membrane proteins responsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa// Antimicrob Agents Chemother.- 1995,- Vol.39.-P.645-649.

131. Mayhall C.G. Nosocomial pneumonia: diagnosis and prevention// Infect.

132. Dis. Clin. North Am.- 1997.-N11.-P.427-457.

133. McDowell A., Mahenthiralingam E., Dunbar K.E.A. et al. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex species recovered from cystic fibrosis patients: issues related to patient segregation// J. Med. Microbiol.- 2004.- Vol.53.-P.663-668.

134. McDowell A., Mahenthiralingam E., Moore J.E. et al. PCR-based detection and identification of Burkholderia cepacia complex pathogens in sputum from cystic fibrosis patients// J.Clinical microbiology.-2001.-Vol.39.-N12.- P.4247-4255.

135. McClean K.H., Winson M.K., Fish L. et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones// Microbiology.-1997.- Vol. 143.-P. 37033711.

136. McCubbin M., Fick R.B. Pathogenesis of Pseudomonas lung disease in cystic fibrosis. In Pseudomonas aerugenosa: the Opportunist// CRC Press.- 1993.-P.189-211.

137. Miller, M.B., Bassler, B.L . Quorum sensing in bacteria. // Annu. Rev. Microbiol.-2001.- Vol. 55.- P. 165-199.

138. Miller S.C.M., LiPuma J.J., Parke J.I. Cultured based and non-growthdependent detection of the Burkholderia cepacia complex in soil environments// Applied and Environmental Microbiol. -2002.-N8(Aug).-P.3750-3758.

139. Monreal J., Rees E.T. The chitinase of Serratia marcescens. // Can. J. Microbiol.- 1969 Vol. 15. - P. 689-696.

140. Moore R.A., DeShazer D., Reckseidler S., et al. Efflux-mediated aminoglycoside and macrolide resistance in Burkholderia pseudomallei// Antimicrob Agents Chemother.-1999.- Vol.43.-P.465-470.

141. Morlin G.L., Hedges D.L., Smith A.L. et al. Accuracy and cost of antibiotic susceptibility testing of mixed morphotypes of Pseudomonas aeruginosa// J. Clin. Microbiol.-1994.- Vol.32.-P. 1027-1030.

142. Morrison A.J., Wenzel R.P. Epidemiology of infections due to Pseudomonas aeruginosa//Rev. Infect. Dis. -1984.- Vol.6.-Suppl.3.-P.S627-S642.

143. Nakazawa Т., Y.Yamada, M. Ishibashi Characterization of hemolysin in extracellular products of Pseudomonas cepacia//J.Clin.Microbiol.- 1987.-Vol.25.-P. 195-198.

144. Neyfakh A.A. Mystery of multidrug transporters: the answer can be simple// Mol Microbiol.- 2002.- Vol.44.-P.l 123-1130.

145. O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development// Annu Rev Microbiol.- 2000.- Vol.54.-P.49-79.

146. Palleroni N.J., Kunisawa R., Contopoulou R. et al. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas// Int. J. Syst.Bacteriol.- 1973.- Vol.23.-P.333-339.

147. Parsek, M. R., and P. K. Singh. 2003. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis// Annu. Rev. Microbiol. Vol .57.-P.677-701.

148. Pearson J.P., Van Delden C., Iglewski B.H. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals// J Bacterid.- 1999.- Vol.l81.-P.1203-1210.

149. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P. Quinoline signaling in the cell- to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa// Proc. Natl. Acad. Sci USA. -1999.- Vol. 96.-P. 11229-11234.

150. Pesci E.C., Pearson J.P., Seed P.C. et al. Regulation of las and rhl Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa// J. Bacteriology.-1997/- Vol. 179.-N10.-P.3127-3132.

151. Philipon L.N., Naas Т., Bouthors A.T. et al. OXA-18, a class D clavulanic acid inhibited extended-spectrum P-lactamase from Pseudomonaqs aeruginosa// Antimicrob. Agents Chemother.- 1997.- Vol.41.-P.2188-2195.

152. Pollack M. Pseudomonas aeruginosa// In G.L. Mandell, J.E. Bennett and R. Dolin (ed.). Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th ed. Churchill Livingstone. Inc. New York. N.Y.-2000.-P. 1980-2003.

153. Poole К. Multidrug efflux pump and antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa and related organisms// J. Mol. Microbiol. Biotechnol.-2001.-N3.-P.255-264.

154. Pujana J., Gallego L., Canduela M.J. et al. Specific and rapid identification of multiple-antibiotic resistant Pseudomonas aeruginosa clones isolated in an intensive care unit// Diagn. Microbiol. Infect. Dis.- 2000.- Vol.36.-P.65-68.

155. Pukatzki S., Kessin R.H., Mekalanos J.J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum// Microbiology. PNAS.-2002.- Vol.99.-N5.-P.3159-3164.

156. Reddi K., Phagoo S.B., Anderson K.D. et al. Burkholderia cepacia-induced IL-8 gene expression in an alveolar epithelial cell line signaling through CD 14 and mitogen-activated protein kinase// Pediatr. Res.- 2003.- Vol.54.-P.297-305.

157. Rhoads S., Marinelli L., Imperatrice C.A. et al. Comparison of the MicroScan Walk-away system and Vitek system for identification of gram-negative bacilli//J. Clin. Microbiol.-1995.- Vol.33.-P.3044-3046.

158. Riedel K., Hentzer M., Geisenberger O. et al. N-Acylhomoserine-lactone-mediated communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in mixed biofilms// Microbiology. -2001.- Vol.147.-P.3249-3262.

159. Rioddan J.R., Romens J.M., Keren B.S. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA// Science.- 1989.-Vol.245.-P. 1066-1073.

160. Robinson A., McCarter Y.S., Tetreault J. Comparison of Crystal enteric/nonfermenter system, API 20E system, and Vitek Automicrobic system for identification of gram-negative bacilli// J. Clin. Microbiol. -1995.- Vol. 33.-P.364-370.

161. Saijan S and J. Forstner. Role of a 22-kilodalton pilin protein in binding of P.cepacia to buccal epithelial cells//Infect.Immun.-1993.- Vol. 61.-P.3156-3163.

162. Sajjan U., Keshvjee S., Forstner J. Responses of well-differentiated airway epithelial cell cultures from healthy donors and patients with cystic fibrosis to Burkhoderia cenocepacia infection// Infect. Immun. -2004.- Vol.72.-N7.-P.4188-4199.

163. Sajjan U., Wu Y., Kent G. et al. Preferential adherence of cable-piliated Burkholderia cepacia to respiratory epithelia of CF knockout mice and cystic fibrosis lung explants // J. Med. Microbiol.- 2000.- Vol. 49.-P.875-885.

164. Saiman L., Siegel J. Infection control in cystic fibrosis// Clinical Microbiology Reviews. -2004.- N1.-P.57-71.

165. Saint-Onge A., Romeyer F., Lebel P. et al. Specificity of the Pseudomonas aeruginosa PA01 lipoprotein I gene as a DNA probe and PCR target region within the Pseudomonadaceae// J. Gen. Microbiol. -1992.-Vol.l38.-P.733-741.

166. Schmidt and Hensel. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis//

167. Clin. Microbiol. Rev.- 2004.- Vol.l7.-P.25-26.

168. Schwab U., Leigh M., Ribeiro C. et al. Patterns of epithelial cell invasion by different species of the Burkholderia cepacia complex in well- differentiated human airwayepithelia// Infect, and Immun.- 2002.- Vol.70.-N 8.-P.4547-4555.

169. Scordilis G.E., H.Ree, T.G. Lessie Identification of transposable elements which activate gene expression in Pseudomonas cepacia//J. Bacteriol.- 1987.-Vol.169.-P.8-13.

170. Shaw D., Poxton I.R., Govan J.R. Biological activity of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia lipopolysaccharide// FEMS Immunol. Mol. Microbiol.-1995.-N11 .-P.99-106.

171. Shelly D.B., T.Spilker, E.J. Gracely et al. Utility of commercial systems for identification of Burkholderia cepacia complex from cystic fibrosis sputum culture//J.Clin.Microbiol.-2000.- Vol. 38.-P.3112-3115.

172. Shen D.F., Tai P.C., Vasil M.L. Nucleotide sequences and expression in Escherichia coli of the in-phase overlapping Pseudomonas aeruginosa plcR genes// J.Bacteriol. 1987.- Vol. 169. - P.4602-4607.

173. Singh P.K., Schaeer A.L., Parsek M.R., et al. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms// Nature .-2000.-Vol.407.-P.762-764.

174. Smith D.L., Gumery L.B., Smith E.G. et al. Epidemic of P.cepacia in an adult cystic fibrosis unit: evidence of person-to-person transmission// J.Clin. Microbiol.- 1993 .-Vol.31 .-P.3017-3022.

175. Smith J.J., Travis S.M., Greenberg E.P.,Welsh M.J. Cystic fibrosis airway epithelia fail to kill bacteria because of abnormal airway surface fluid// Cell.-1996,- Vol. 85.-P.229-236.

176. Sokol P.A., Sajjan U., Visser M.B. et al. The CepIR quorum-sensing system contributes to the virulence of Burkholderia cenocepacia respiratory infections// Microbiology.-2003,- Vol.l49.-P.3649-3658.

177. Speert D.P., Farmer S.W., Campbell M.E. et al. Conversion of Pseudomonas aeruginosa to the phenotype characteristic of strains from patients with cystic fibrosis//J.Clin.Microbiol.- 1990.- Vol.28.-P.188-194.

178. Speert D.P., Steen В., Halsey K. et al. A murine model for infection with Burkholderia cepacia with sustained persistence in the spleen// Inf. and Immun. -1999.- Vol.67.-P.4027-4032.

179. Statistics & CF// http:// www3.nbnet.nb.ca/normap/cfstats.htm.-2005.

180. Stead D.E. Grouping of plant-pathogenic and some other Pseudomonas spp. by using cellular fatty acid profiles// Int. J. Syst. Bacteriol.-1992.- Vol.42.-P.281-295.

181. Stover C.K., Pham X.Q., Erwin A.L. et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen// Nature.-2000.- Vol. 406.-P.959-964.

182. Summer E.J.,Gonzales C.F.,Carlisle T. et al. Burkholderia cenocepacia phage BcepMu and a family of Mu-like phages encoding potential pathogenesis factors// J. Mol.Biol. 2004.- Vol.340.-P.49-65.

183. Sun L., Jiang L.Z., Steinbach S. et al. The emergence of a highly transmissible lineage of cbl+ Pseudomonas (Burkholderia) cepacia causing CF center epidemics in North America and Britain// Nat. Med.- 1995.-N1.-P.661-666.

184. Swift, S., Downie, J.A., Whitehead, N.A et al. Quorum sensing as a population-density-dependent determinant of bacterial physiology// Adv. in Microb. Physiol. -2001. Vol. 45. - P. 199-270.

185. Taga E.M., Bassler B.L. Chemical communication among bacteria. // Proc. Nat. Acad. Sci. 2003. - Vol.100. -Suppl.2. -P.14549 -14554.

186. Tateda K., Ishii Y., Horikawa M. et al. The Pseudomonas aeruginosa Autoinducer N-3-Oxododecanoyl Homoserine Lactone Accelerates Apoptosis in Macrophages and Neutrophils // Infect.Immun. 2003. - Vol.71. - N10. - P.5785-5793.

187. Todar K. Pseudomonas aeruginosa// Todar's Online Textbook of Bacteriology. -2004.-P. 1-9

188. Thomassen M.J., C.Demko, J.Klinger et al. Pseudomonas cepacia colonization among patients with cystic fibrosis a new opportunist //Am. Rev. Respir. Dis.- 1985.- Vol.l31.P.791-796.

189. Tyler S.D., K.R.Rozee, W.M. Johnson Identification of IS1356, a new insertion sequence, and its association with IS402 in epidemic strains of Burkholderia cepacia infecting cystic fibrosis patients// J.Clin.Microbiol.- 1996.- Vol.34.-P.1610-1616.

190. Urban T.A., Griffith A., Torok A.M et al. Contribution of Burkholderia cenocepacia flagella to infectivity and inflammation// Infect.Immun.-2004.- Vol.72.-N9.-P.5126-5134.

191. Vandamme P., B.Pot, M.Gillis et al. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics// Microbiol.Rev.- 1996.- Vol. 60.-P.407-438.

192. Van Delden C., Iglewski B.H. Cell-to-cell signaling and Pseudomonas aeruginosa infections//Emerg. Infect. Dis.- 1998.-N 4.-P.561-570.

193. Vasil M.L., Chamberlain C., Grant C.C.R. Molecular studies of Pseudomonas exotoxin A gene// Infect. Immun.-1986.- Vol. 52.-P.538-548.

194. Venter J.C., Ramington K., Heidelberg J.F. et al. Environmental genome shotgun secueencing of the Sargasso Sea// Science.- 2004.- Vol.304.-P.66-74.

195. Venturi V., Friscina A., Bertani I. et al. Quorum sensing in the Burkholderia cepacia complex// Res. Microbiol. -2004.- Vol.l55.-N4.-P.238-244.

196. Vinion-Dubiel A.D., Goldberg J.B. Lipopolysaccharide of Burkholderia cepacia complex// Endotoxin Res. -2003.-N9.-P.201-213.

197. Vinion-Dubiel A.D., Spilker Т., Dean C.R. et al Correlation of wbil genotype, serotype and isolate source within species of the Burkholderia cepacia complex// J. Clin. Mikrobiol.- 2004.- Vol.42.-P.4121-4126.

198. Visser M.B., Majumdar S., Hani E. et al. Importance of the omibactin and pyochelin siderophore transport systems in Burkholderia cenocepacia lung infections// Infect. Immun. -2004.- Vol.72.-P.2850-2857.

199. Whiteley M., Lee M.K., Greenberg E.P. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa// PNAS.-1999.- Vol.96.-N24.-P.13904-13909.

200. G.L.Woods, J.A.Washington. Antibacteria susceptibility tests: Dilution and disk diffusion methods// Manual of clinical microbiology. 6th edition. ASM. -1995.-P.1327-1341.

201. Xu K.D., McFeters G.A., Stewart P.S. Biofilm resistance to antimicrobial agents//Microbiology.- 2000.- Vol.l46.-P.547-549.

202. Yeager C.M., Bottomley P.J., Arp D.J. Requirement of DNA Repair mechanisms for survival of Burkholderia cepacia G4 upon degradation of trichloroethylene// Appl. and Environmental Microbiol. -2001.- Vol. 67.-N12.-P.5384-5391.

203. Zhang L., Li X.Z., Poole K. SmeDEF multidrug efflux pump contributes to intrinsic multidrug resistance in Stenotrophomonas maltophilia// Antimicrob Agents Chemother.- 2001,- Vol.45.-P.3497-3503.

204. Zhou M., Clark S.E., Gomes-Sanchez C.E. Universal cloning method by ТА strategy. //Biothechniques. 1995. - Vol.19. - P.34.

205. Zierdt C.H. Autolytic nature of iridescent lysis in Pseudomonas aeruginosa// Antonie Leeuwenhoek. -1971.- Vol. 37.-P.319-337.