Изучение прооксидантного действия p66shc в клетках человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Галимов, Евгений Рафаэлевич

• Галимов, Евгений Рафаэлевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Галимов, Евгений Рафаэлевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Окислительный стресс.

Источники АФК в клетке.

НАДФН-оксидазы.

Производство АФК в митохондиях.

Роль комплекса I дыхательной цепи в продукции АФК.

Роль комплекса III дыхательной цепи в продукции АФК.

Антиоксидантная защита клетки.

Неэнзиматические антиоксиданты.

Глутатион.

Аскорбат. а-токоферол.

Липоевая кислота.

Убихинол (коэнзим Q10).—

Ферментативные системы защиты от окислительного стресса.

Супероксиддисмутаза (СОД).

Каталаза.

Пероксиредоксины (Ргх).

Глутатион-пероксидаза (GPx).

Глутатион трансфераза.

Тиоредоксин.

Митохондриально-направленные антиоксиданты.

Дробление митохондрий.

Белковый аппарат слияния митохондрий.

Фрагментация митохондрий.

Регуляция фрагментации митохондрий.

Механизмы гибели эукариотических клеток.

Некроз.

Апоптоз.

Участие каспаз в апоптозе.

Активация апоптоза с участием мембранных рецепторов.

Митохондриальный путь активации каспаз.

Роль белков семейства Вс1-2 в апоптозе.

Роль митохондриальной поры в клеточной смерти.

РббзЬс.

Р66, окислительный стресс и вызванный им апоптоз.

Механизмы рбб-зависимого повышения внутриклеточных активных форм кислорода рбб-зависимая активация мембранных НАДФН-оксидаз. рббБИс и регуляция экспрессии антиоксидантных ферментов. рббБИс и митохондриальный путь развития апоптоза.

Митохондриальная локализация рббзЬс и его транспорт в митохондрии.

Оксидоредуктазная проапоптотическая активность рббзЬс, приводящая к образованию АФК.

Исследование изолированного СН2-СВ домена. рббэЬс как редокс-сенсор.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Используемые реактивы и препараты:.

Используемые буферные растворы и среды:.

Используемые расходные материалы:.

Оборудование.

Использованные культуры клеток.

Пересев клеток.

Замораживаие и размораживание клеточных культур.

Пересев клеток для экспериментов.

Определение концентрации клеток с помощью камеры Горяева.

Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР).

Лентивирусные конструкции.

Генноинженерные манипуляции.

Получение лентивирусных частиц, заражение и селекция клеток.

Измерение активных форм кислорода.

Измерение выживаемости клеток.

Определение активности каспаз 3 и 7.

Определение некротической гибели с помощью пропидий йодида.

Определение колокализации белка Нурег-тко с митохондриями.

Окрашивание митохондриальной ДНК.

Окрашивание митохондрий и оценка степени дробления митохондрий.

Определение кривой роста клеток.

Выделение препарата белка из эукариотических клеток.

Метод «Western Blotting».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Окислительный стресс, вызванный перекисью водорода в клетках карциномы толстого кишечника человека RKO и в иммортализованных фибробластах.

Создание лентивирусных конструкций и получение стабильных линий клеток с генетическим нокдауном и оверэкспрессией p66shc.

Роль p66shc в окислительном стрессе, индуцированном перекисью водорода.

Действие p66shc на фрагментацию митохондриального ретикулума, индуцированную перекисью водорода.

Эффект изменения экспрессии p66shc на гибель клеток, вызванную окислительным стрессом и аноикис.

Роль p66shc в оксилительном стрессе, вызванном инкубацией в бессывороточной среде.

Окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких А549, вызванные антираковым препаратом таксолом. Роль p66shc.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Галимов, Евгений Рафаэлевич

выводы

1. Под действием перекиси водорода или при лишении сыворотки происходит накопление эндогенных активных форм кислорода (АФК) в митохондриях клеток карциномы толстой кишки человека ШСО и иммортализованных фибробластов кожи человека ЬГОБ

2. С помощью лентивирусных конструкций получены стабильные линии клеток ШСО, карциномы легких человека А549 и иммортализованных фибробластов человека с генетическим нокдауном и оверэкспрессией рббзЬс. Получены клетки ШСО, экспрессирующие белковый сенсор Нурег-шко локализованный в митохондриях.

3. В клетках ШСО и НОР подавление рббзЬс ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода или лишением сыворотки. В клетках с неактивной дыхательной цепью защитный эффект нокдауна по рббБИс не наблюдается.

4. Генетический нокдаун рббзЬс предотвращает зависимую от образования митохондриальных АФК фрагментацию митохондрий и гибель клеток ШСО. Клеточная гибель не зависит от активности каспаз и имеет признаки некроза. Нокдаун рббзЬс не защищает клетки ЯК О с неактивной дыхательной цепью от гибели, вызванной обработкой перекисью водорода.

5. Подавление экспрессии рббзЬс в клетках А549 не влияет на скорость их роста, однако защищает от окислительного стресса и клеточной гибели, вызванных противораковым препаратом таксолом.

6. Данные, полученные на различных моделях окислительного стресса клеток человека свидетельствуют о том, что прооксидантное действие рббзЬс зависит от образования АФК в митохондриях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность научным руководителям академику В.П. Скулачёву и профессору П.М. Чумакову за полученные знания, заботу, внимание и ценные советы во время выполнения диссертационного исследования. Также автор признателен О.Ю. Плетюшкиной за помощь в освоении методов. Кроме того, автор выражает благодарность A.C. Сидоренко, A.B. Терешковой и Г.В. Ильинской за помощь в работе над диссертацией. Особую благодарность выражаю Б.В. Черняку за плодотворные дискуссии, за постоянную поддержку и терпение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе мы исследовали окислительный стресс в клетках ЯК О и ИББ, вызываемый перекисью водорода. Использование специфических антиоксидантов, направленных в митохондрии, а также белкового сенсора перекиси Нурег-пнк) позволило установить, что изучаемые стрессы в значительной степени определяются функционированием митохондрий в клетках человека.

На мышах, нокаутированных по гену рббзЬс, а также на выделенных из них мышиных эмбриональных фибробластах рббзЬс охарактеризован как прооксидантный белок. Мы изучили роль рббзЬс в генерации АФК при окислительном стрессе в культурах клеток карциномы человека ККО и кожных фибробластов человека. Исследования показали, что в клетках человека нокдаун рббзИс ингибирует образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода. Было также обнаружено, что этот эффект зависит от функциональной активности митохондриальной дыхательной цепи.

Ранним маркером окислительного стресса является фрагментация митохондриального ретикулума. Известно, что фрагментация митохондрий зависит от образования эндогенных АФК в митохондриях. Нами впервые установлено, что нокдаун рббБЬс в клетках человека предотвращает фрагментацию митохондриального ретикулума, вызванную перекисью водорода.

В качестве альтернативного способа вызвать окислительный стресс, мы инкубировали клетки в среде без сыворотки. Нахождение клеток в среде без сыворотки относится к стрессам, характерным для раковых клеток, а также клеток, попавших в условия гипоксии. Мы получили новые данные, свидетельствующие о роли рббзЬс в индукции окислительного стресса, вызванного инкубацией в среде без сыворотки. Показано, что этот стресс в значительной степени связан с производством эндогенных АФК митохондриями.

Известно, что рббзЬс участвует в развитии апоптоза. Нами впервые показано, что подавление экспрессии рббзИс также может защищать от каспазнезависимой гибели с признаками некроза, индуцированной перекисью водорода.

Этот тип клеточной смерти зависел от эндогенных АФК, производимых митохондриями. Некротическая гибель в организме ассоциирована с

106 воспалительными реакциями. Хроническое воспаление является одним из канцерогенных факторов. Повышение базального уровня АФК также связывают со стимуляцией пролиферации и канцероегнезом. Возможно по этим причинам уровень экспрессии рббзЬс повышен в различных злокачественных опухолях. Функция рббэЬс в карциногенезе требует дальнейшего изучения.

Опираясь на данные о том, что противораковый препарат таксол вызывает фосфорилирование рббэЬс по серину 36, модификации, которая имеет важное значение для его проапоптотической функции, мы исследовали роль рббвЬс в противораковом действии таксола. Недавно обнаружено, что цитотоксическое действие таксола также связано индукцией окислительного стресса. Нами впервые показано, что рббэИс участвует в индуцированной таксолом генерации АФК и гибели клеток карциномы легких А549.

Полученные результаты позволяют составить более полное представление о функционировании клеток в условиях нарушения редокс-статуса и вносят существенный вклад в понимание механизмов окислительного стресса. Наши данные указывают на то, что прооксидантное действие рббзИс в клетках человека зависит от образования эндогенных АФК в митохондриях. Изучение транслокации рббзИс в митохондрии, его действие на антиоксидантную систему митохондрий, а также механизм генерации АФК требует дальнейших исследований. Изучение механизмов редокс-активности рббэЬс имеет большое значение для этиологии и лечения множества заболеваний, ассоциированных со старением и окислительным стрессом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Галимов, Евгений Рафаэлевич, 2012 год

1. Skulachev, V.P., Role of uncoupled and non-coupled oxidations in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants. Q Rev Biophys, 1996. 29(2): p. 169-202.

2. Cadenas, E. and K.J. Davies, Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic Biol Med, 2000. 29(3-4): p. 222-30.

3. Cerutti, P.A., Prooxidant states and tumor promotion. Science, 1985. 227(4685): p. 37581.

4. Droge, W., Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev, 2002. 82(1): p. 47-95.

5. Gutteridge, J.M. and B. Halliwell, Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. Ann N Y Acad Sci, 2000. 899: p. 136-47.

6. Winterbourn, C.C. and D. Metodiewa, Reactivity of biologically important thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide. Free Radic Biol Med, 1999. 27(3-4): p. 322-8.

7. Imlay, J.A., Pathways of oxidative damage. Annu Rev Microbiol, 2003. 57: p. 395-418.

8. Andreyev, A.Y., Y.E. Kushnareva, and A.A. Starkov, Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species. Biochemistry (Mosc), 2005. 70(2): p. 200-14.

9. Coon, M.J., et al., Cytochrome P450: progress and predictions. FASEB J, 1992. 6(2): p. 669-73.

10. Lewis, R.A., K.F. Austen, and R.J. Soberman, Leukotrienes and other products of the 5-lipoxygenase pathway. Biochemistry and relation to pathobiology in human diseases. N Engl J Med, 1990. 323(10): p. 645-55.

11. Hussain, T., S. Gupta, and H. Mukhtar, Cyclooxygenase-2 and prostate carcinogenesis. Cancer Lett, 2003.191(2): p. 125-35.

12. Yokoyama, Y., et al., Circulating xanthine oxidase: potential mediator of ischemic injury. Am J Physiol, 1990. 258(4 Pt 1): p. G564-70.

13. Babior, B.M., J.D. Lambeth, and W. Nauseef, The neutrophil NADPH oxidase. Arch Biochem Biophys, 2002. 397(2): p. 342-4.

14. Babior, B.M., Phagocytes and oxidative stress. Am J Med, 2000.109(1): p. 33-44.

15. Brown, D.I. and K.K. Griendling, Nox proteins in signal transduction. Free Radic Biol Med, 2009. 47(9): p. 1239-53.

16. Leto, T.L. and M. Geiszt, Role of Nox family NADPH oxidases in host defense. Antioxid Redox Signal, 2006. 8(9-10): p. 1549-61.

17. Banfi, B., et al., Mechanism of Ca2+ activation of the NADPH oxidase 5 (NOX5). J Biol Chem, 2004. 279(18): p. 18583-91.

18. Banfi, B., et al., A Ca(2+)-activated NADPH oxidase in testis, spleen, and lymph nodes. J Biol Chem, 2001. 276(40): p. 37594-601.

19. Clark, R.A., et al., Translocation of cytosolic components of neutrophil NADPH oxidase. Trans Assoc Am Physicians, 1989.102: p. 224-30.

20. Abo, A., et al., Activation of NADPH oxidase involves the dissociation ofp21rac from its inhibitory GDP/GTP exchange protein (rhoGDI) followed by its translocation to the plasma membrane. Biochem J, 1994. 298 Pt 3: p. 585-91.

21. Johnson, J.L., et al., Activation of p47(PHOX), a cytosolic subunit of the leukocyte NADPH oxidase. Phosphorylation of ser-359 or ser-370 precedes phosphorylation at other sites and is requiredfor activity. J Biol Chem, 1998. 273(52): p. 35147-52.

22. Banfi, B., et al., Two novel proteins activate superoxide generation by the NADPH oxidase NOX1. J Biol Chem, 2003. 278(6): p. 3510-3.23,24,25.