Митохондрии как центральное звено повреждающих и защитных сигнальных путей при развитии почечной недостаточности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, доктор биологических наук Плотников, Егор Юрьевич

• Плотников, Егор Юрьевич
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Плотников, Егор Юрьевич

Введение.

Обзор литературы.

Функции активных форм кислорода.

Механизмы образования активных форм кислорода.

Окислительный стресс.

Механизмы клеточной защиты от АФК.

Сигнальная функция АФК.

РольЖ) и активных форм азота.

Химическая биология N0.

Синтез N0 в организме.

Цитотоксичность N0 и нитрозильный стресс.

Защитные и сигнальные эффекты N0.

Роль митохондрий в жизнедеятельности клетки.

Энергетическая функция.

Митохондрии как регуляторы редокс состояния.

Митохондрии и старение.

Митохондрии как транспортное средство.

Синтетическая активность митохондрий.

Митохондрии и АФК.

Митохондрии и N0.

Регуляция апоптоза.

Окислительный стресс при различных почечных патологиях.

Ишемия и реперфузия почки.

Рабдомиолиз и миоглобинурия.

Хроническая почечная недостаточность.

Пиелонефрит.

Роль N0 и АФА в патогенезе почечной недостаточности. Повреждающие и протективные эффекты.

Эффекты оксида азота в почке.

Механизмы цитотоксического действия избытка оксида азота. при ишемии почки.

Стратегии защиты почки.

Фармакологическое или физиологическое ингибирование неспецифической проницаемости митохондрий.

Фармакологическое прекондиционирование.

Антиоксиданты.

Клеточная терапия.

Материалы и методы исследования.

В работе использовались следующие среды и реагенты:.

Эксперименты на культурах клеток.

Получение первичной культуры клеток почки крысы.

Моделирование ишемии в культуре.

Облучение клеточных культур ультрафиолетом.

Оценка жизнеспособности клеток.

Оценка состояния митохондрий в клетках почки.

Оценка апоптотической гибели клеток.

Получение культур фетальных стволовых и прогениторных клеток человека.

Получение первичной культуры клеток сердца эмбрионов крысы.

Сокультивирование клеток кардиомиоцитов крысы и мезенхимальных стволовых клеток.

Сокультивирование клеток канальцев почки крысы и мезенхимальных стволовых клеток.

Окрашивание клеток флуоресцентными зондами.

Проточная цитофлуориметрия.

Иммуноцитохимия.

Электронная микроскопия.

Эксперименты на животных.

Моделирование ишемии/реперфузии почки.

Моделирование рабдомиолизау животных.

Исследование гипоксической и ишемической тренировки (прекондиционирования)

Моделирование хронической почечной недостаточности.

Введение стволовых клеток в почку.

Определение содержания адениновых нуклеотидов.

Выделение митохондрий.

Определение концентрации белка.

Определение накопления нитрита.

Определение образования нитрита изолированными митохондриями.

Полярографическое измерение потребления Ог.

Измерение подавления дыхания суспензии митохондрий при активации NOS.

Определение трансмембранного потенциала выделенных митохондрий.

Определение дыхательного контроля митохондрий.

Микроскопическое исследование срезов почек крыс.

Получение срезов корковой зоны почки.

Оценка состояния митохондрий в клетках почки.

Оценка продукции АФК.

Оценка продукции N0.

Оценка колокализации зондов.

Иммуногистохимическое окрашивание срезов почки.

Вестерн-блоттинг.

Определение малонового диальдегида (МДА) и нитрита в сыворотке крови и митохондриях почек крыс.

Инкубация митохондрий с миоглобином in vitro.

Определение митохондриального потенциала и генерации АФК в изолированных канальцах.

Статистика.:.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Участие митохондрий в развитии повреждения при ишемии/реперфузии почки.

Изменение структуры и функций митохондрий клеток витальных срезов почки.

Развитие неспецифической проницаемости митохондрий почки после ишемии/реперфузии.

Повышение продукции активных форм кислорода в ¡слетках витальных срезов почки

Повышение продукции N0 в клетках почки.

Активация апоптотических сигнальных путей при ишемии/реперфузии почки.

Защита клеток почки от повреждения при ишемии/реперфузии.

Роль GSK-3 в реализации защитного эффекта ионов лития при повреждении, вызванном ишемией/реперфузией.

Эффект прекондиционирования на пост-ишемические изменения в ткани почки.

Влияние N0 на функционирование митохондрий почки при ишемии/реперфузии.

Образование нитрита изолированными митохондриями почек.

Влияние NO-синтазы на функционирование дыхательной цепи.

Влияние митохондриальных антиоксидантов на течение ишемической острой почечной недостаточности.

Изменения гематологических параметров под действием препаратов класса SkQ.

Участие митохондрий в развитии повреждения при миоглобин-индуцированной почечной недостаточности.

Развитие острой почечной недостаточности при рабдомиолизе.

Окислительный стресс и дисфункция митохондрий при рабдомиолизе.

Влияние миоглобинана функции митохондрий в системе/« vitro.

Окислительный стресс и продукция N0, спровоцированные миоглобином, в изолированных митохондриях.

Окислительный стресс и дисфункция митохондрий почечных канальцев, спровоцированные миоглобином.

Взаимосвязь фрагментации митохондрий и клеточной гибели в различных моделях окислительного стресса.

Влияние SkQl, инсулина и ионов лития на гибель при ишемии/реоксигенации.

Изменение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки после ишемии/реоксигенации.

Влияние ионов лития и SkQl на гибель фибробластов при облучении ультрафиолетом

Терапия острой и хронической почечной недостаточности стволовыми и прогениторными клетками.

Влияние внутрипочечной трансплантации стволовых и прогениторных клеток на течение хронической почечной недостаточности.

Влияние внутрипочечной трансплантации стволовых и прогениторных клеток на течение посгг-ишемической острой почечной недостаточности.

Внутривенное введение стволовых и прогениторных клеток при хронической почечной недостаточности.

Внутривенное введение стволовых и прогениторных клеток при острой почечной недостаточности.

Межклеточные взаимодействия ММСК и дифференцированных соматических клеток при сокультивировании.

Образование межклеточных контактов между ММСК и кардиомиоцитами.

Передача цитоплазмы между ММСК и кардиомиоцитами.

Передача митохондрий от ММСК к кардиомиоцитам.

Экспрессия кардиоспецифического р-миозинав ММСК.

Транспорт митохондрий и других клеточных компартментов между ММСК и клетками почки.

Обсуждение.

Острая почечная недостаточность, вызванная ишемией почки.

Механизмы почечной дисфункции при рабдомиолизе и миоглобинурии.

Влияние клеточной терапии на течение различных видов почечной недостаточности.279 Межклеточные взаимодействия стволовых и дифференцированных соматических клеток

Выводы.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Плотников, Егор Юрьевич

Выводы

1. При исследовании срезов почки с помощью витальных флуоресцентных зондов показано, что в условиях ишемии/реоксигенации в клетках почки происходит резкое усиление генерации активных форм кислорода и N0, основным источником которых служат митохондрии. При этом происходит нарушение морфо-функционального состояния митохондрий: падение митохондриального трансмембранного потенциала, набухание митохондрий и фрагментация хондриома.

2. При рабдомиолизе развитие почечной недостаточности сопровождается дисфункцией митохондрий почки и развитием окислительного стресса, индуцированного накоплением миоглобина в почечных канальцах. При воздействии in vitro на выделенные митохондрии миоглобин вызывает разобщение окислительного фосфорилирования, возрастание перекисного окисления липидов митохондрий и повышение продукции оксида азота в митохондриях.

3. При ишемии/реоксигенации и при рабдомиолизе в митохондриях клеток почки наблюдаются проапоптотические изменения, такие как выход из митохондрий цитохрома с и транслокация в митохондрии белка Вах. Это свидетельствует об активации в клетках почки апоптотических сигнальных путей под действием ишемии/реоксигенации и миоглобинурии.

4. Ишемическое и гипоксическое прекондиционирование приводит к ингибированию GSK-Зр, что защищает митохондрии клеток почки от развития неспецифической проницаемости, уменьшает генерацию активных форм кислорода и предотвращает гибель клеток почки. Схожий защитный эффект, опосредованный прямым и непрямым ингибированием GSK-Зр, оказывают ионы лития и инсулин, снижая окислительный стресс в почке, гибель клеток и в конечном итоге предотвращая развитие почечной недостаточности.

5. По данным исследований на культивируемых клетках почки и переживающих почечных срезах адресованные в митохондрии антиоксиданты 10-(б'-пластохинонил) децилтрифосфоний (SkQ1) и Ю-(б'-пластолхинонил) децил-родамин (SkQR1) снижают вызванное ишемией/реперфузией повреждение, уменьшают окислительный стресс, предотвращают дисфункцию митохондрий и защищают клетки почки от гибели. Защитное действие SkQ1 и SkQR1 проявляется также в защите животных от гибели после 90-минутной ишемии единственной почки

6. Введение ММСК внутривенно или в ткань почки существенно улучшает функции почки при ОПН и ХПН, что выражается в снижении повышенной концентрации креатинина и мочевины в крови, уменьшении патоморфологических изменений в ткани почки и повышает выживание животных.

7. Введение прогениторных почечных клеток оказывает менее выраженный положительный эффект на функции почки при ОПН и ХПН. Введение этих клеток также снижает концентрации креатинина и мочевины в крови, однако, в меньшей степени, чем при введении ММСК. Выживание животных с почечными патологиями при введении прогениторных почечных клеток тоже улучшается незначительно.

8. Выявлено, что ММСК могут образовывать контакты с различными типами дифференцированных клеток при совместном культивировании. При этом меиеду клетками возможен транспорт клеточного содержимого, в том числе митохондрий, на что указывают данные электронной микроскопии и окрашивание специфическими митохондриальными зондами.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Плотников, Егор Юрьевич, 2009 год

1. Андреева, Л.И., Иванова, Л.И., Титова, М.В., и Петрова B.C. (1996). Программированная клеточная гибель (под ред. B.C. Новикова) Наука, Санкт-Петербург, 51-71.

2. Архипенко, Ю.В., Сазонтова, Т.Т., и Меерсон Ф.З. (1994) Разнонаправленное действие адаптации к непрерывистой и прерывистой гипоксии на антиоксидантные ферменты и уровень продуктов перекисного окисления липидов. Hypoxia Medical J.3,

3. Березов, Т.Т. и Коровкин, Б.Ф. (1998). Биологическая химия. М.: Медицина

4. Биленко, М.В., Шеленкова, Л.Н., и Дибур, Г.Я. (1983). Применение антиоксидантов для профилактики повреждений при острой ишемии и реперфузии почек. Бюлл эксп биол мед 9, 8-11.

5. Брюне, Б., Сандау, К., и фонКнетен, А. (1998). Апоптотическая гибель клеток и оксид азота, механизмы активации и антагонистические сигнальные пути. Биохимия 63, 966-975.

6. Винк, Д.А., Водовоз, Й., Кук, Дж.А., Кришна, М.С., Ким, С., Коффин, Д., ДеГрафф, В., Делюка, A.M., Либманн, Дж., и Митчелл, Дж.Б. (1998). Значение химических свойств оксида азота для лечения онкологических заболеваний. Биохимия 63, 948-957.

7. Владимиров, Ю.А. (1998). Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки. СОЖ 6,12-15.

8. Высоких, М.Ю., Гончарова, Н.Ю., Журавлева, A.B., Зорова, Л.Д., Кириченко, В.В., Красников, Б.Ф., Кузьминова, А.Е., Меликов, К.С., Мелик-Нубаров, Н.С., Самсонов, A.B., Белоусов, В.В., Прищепова, А.Е., и Зоров, Д.Б. (1999). Биохимия 64, 390-398.

9. Горрен, А.К.Ф. и Майер, Б. (1998). Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота. Биохимия 63, 870-880.

10. Джафаров, А.И., Магомедов, Н.М., и Кулиева, Э.М. (1985). Перекисное окисление липидов в наружных и внутренних мембранах митохондрий при аноксии. Бюл. экспер. биол. 10, 433-435.

11. Драчев, В.А. и Зоров, Д.Б. (1986). Докл. Акад. Наук СССР 277, 1237-1238.

12. Зоров, Д.Б. (1988). Структурно-функциональное изучение митохондрий в живой клетке: кабельные свойства митохондриальных систем. Автореф. Дисс. Докт. Биол. Наук

13. Зоров, Д.Б., Банникова, С.Ю., Белоусов, В.В. , Высоких, М.Ю., Зорова, Л.Д., Исаев, Н.К., Красников, Б.Ф., и Плотников, Е.Ю. (2005). Биохимия 70, 265-272.

14. Зоров, Д.Б., Исаев, Н.К., Плотников, Е.Ю., Зорова, Л.Д., Стельмашук, Е.В., Васильева, А.К., Архангельская, A.A., и Хряпенкова, Т.Г. (2007). Митохондрия как многоликий Янус. Биохимия 72, 1371-1384.

15. Казаченко, A.A. (1996). Диагностика и профилактика ишемического повреждения почек при оперативном лечении коралловидного нефролита. Дисс. канд. мед. наук, Москва

16. Кирпатовский, В.И., Никифорова, Н.В., Кудрявцев, Ю.В., и Надточий, О.Н. (1996). Использование эмульсии альфа-токоферола для защиты ишемизированных и консервированных почек. Бюл. экспер. биол. и мед. 121, 499-503.

17. Коваленко Е.А., Ткачук, E.H., Эренбург, И.В., и Шаов, М.Т. (1995). Новый принцип адаптации и лечения в медицине. Сб. научн. трудов "Актуальные проблемы гипоксии"-М. 112

18. Костюченко, A.J1. и Семиголовский, Н.Ю. (2002). Современные реальности клинического применения антигипоксантов. Спб

19. Лопаткин, H.A. (1995). Хроническая почечная недостаточность. Урология, М., Медицина 471-485.

20. Маеда, X. и Акаике, Т. (1998). Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке. Биохимия 63,1007-1019.

21. Малышев, И.Ю. и Манухина, Е.Б. (1998). Стресс, адаптация и оксид азота. Биохимия 63, 992-1006.

22. Меерсон, Ф.З. (1974). Механизмы адаптации к высотной гипоксии. Физиология человека и животных. Физиология человека и животных. Итоги науки и техники. М., ВИНИТИ. 7-62.

23. Надточий, О.Н. (2000). Профилактика постишемических функциональных расстройств почки при операциях с временных прекращениемпочечного кровотока. Дисс. канд. мед. наук

24. Недоспасов, A.A. (1998). Биохимия 63, 881-904.

25. Новиков, B.C., Булавин, Д.В., и Цыган, В.Н. (1996). Программированная клеточная гибель (под ред. B.C. Новикова). Наука, Санкт-Петербург, 30-50.

26. Полякова, И.А., Зоров, Д.Б., и Лейкина М.И. (1995). Докл. Росс. Акад. Наук 342, 553-555.

27. Северина, И.С. (1998). Биохимия 63, 939-947.

28. Скулачев, В.П. (1989). Биоэнергетика: мембранные преобразователи энергии. М.: Высш. шк.

29. Скулачев, В.П. (2007). Биохимия 72, 1385-1396.

30. Стокле, Ж.К., Мюлле, Б., и Андрионцитохайна, Р. (1998). Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов. Биохимия 63, 976-983.

31. Тейлор, Б.С., Аларсон, Л.Х., и Биллиар, Т.Р. (1998). Биохимия 63, 905-923.

32. Adachi, Y., Sasagawa, I., Tateno, Т., Tomaru, M., Kubota, Y., and Nakada, T. (1998). Influence of adenine-induced chronic renal failure on testicular function in the rat. Andrologia 30, 115-8.

33. Adlam, V.J., Harrison, J.C., Porteous, C.M., James, A.M., Smith, R.A., Murphy, M.P., and Sammut, I,A. (2005). Targeting an antioxidant to mitochondria decreases cardiac ischemia-reperfusion injury. FASEB J 19, 1088-95.

34. Agullo, L., Garcia-Dorado, D., Inserte, J., Paniagua, A., Pyrhonen, P., Llevadot, J., and Soler-Soler, J. (1999). L-arginine limits myocardial cell death secondary to hypoxia-reoxygenation by a cGMP-dependent mechanism. Am J Physiol 276, H1574-80.

35. Akerman, K.E. and Wikstrom, M.K. (1976). Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Lett 68, 191-7.

36. Al-Awqati, Q. and Oliver, J.A. (2006). The kidney papilla is a stem cells niche. Stem Cell Rev 2, 181-4.

37. Albina, J.E. and Reichner, J.S. (1998). Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis. Cancer Metastasis Rev 17, 39-53.

38. Antonsson, В., Montessuit, S., Lauper, S., Eskes, R., and Martinou, J.C. (2000). Bax oligomerization is required for channel-forming activity in liposomes and to trigger cytochrome с release from mitochondria. Biochem J 345 Pt 2, 271-8.

39. Armstrong, S., Downey, J.M., and Ganóte, C.E. (1994). Preconditioning of isolated rabbit cardiomyocytes: induction by metabolic stress and blockade by the adenosine antagonist SPT and calphostin C, a protein kinase С inhibitor. Cardiovasc Res 28, 72-7.

40. Auchampach, J.A., Grover, G.J., and Gross, G.J. (1992). Blockade of ischaemic preconditioning in dogs by the novel ATP dependent potassium channel antagonist sodium 5-hydroxydecanoate. Cardiovasc Res 26, 1054-62.

41. Aufricht, C„ Ardito, T., Thulin, G., Kashgarian, M„ Siegel, N.J., and Van Why, S.K.1998). Heat-shock protein 25 induction and redistribution during actin reorganization after renal ischemia. Am J Physiol 274, F215-22.

42. Aulak, K.S., Koeck, T., Crabb, J.W., and Stuehr, D.J. (2004). Dynamics of protein nitration in cells and mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol 286, H30-8.

43. Avad, A.S., Vorobjev, I.A., and Zorov, D.B. (1984). Fragmentation of mitochondrial reticulum. XVI Congress of FEBS abst.XI-80

44. Aydogdu, N., Atmaca, G., Yalcin, O., Batcioglu, K., and Kaymak, K. (2004). Effects of exogenous melatonin on myoglobinuric acute renal failure in the rats. Ren Fail 26, 47986.

45. Aydogdu, N., Atmaca, G., Yalcin, O., Taskiran, R., Tastekin, E., and Kaymak, K. (2006). Protective effects of L-carnitine on myoglobinuric acute renal failure in rats. Clin Exp Pharmacol Physiol 33, 119-24.

46. Babcock, G.T. and Wikstrom, M. (1992). Oxygen activation and the conservation of energy in cell respiration. Nature 356, 301-9.

47. Babior, B.M. (2000). Phagocytes and oxidative stress. Am J Med 109, 33-44.

48. Badr, K.F. (1997). Glomerulonephritis: roles for lipoxygenase pathways in pathophysiology and therapy. Curr Opin Nephrol Hypertens 6, 111-8.

49. Bae, G.U., Seo, D.W., Kwon, H.K., Lee, H.Y., Hong, S., Lee, Z.W., Ha, K.S., Lee, H.W., and Han, J.W. (1999). Hydrogen peroxide activates p70(S6k) signaling pathway. J Biol Chem 274, 32596-602.

50. Bagley, W.H., Yang, H., and Shah, K.H. (2007). Rhabdomyolysis. Intern Emerg Med 2, 210-8.

51. Bakeeva, L.E., Chentsov, Y.u.S., and Skulachev, V.P. (1983). Intermitochondrial contacts in myocardiocytes. J Mol Cell Cardiol 15, 413-20.

52. Bal-Price, A. and Brown, G.C. (2000). Nitric-oxide-induced necrosis and apoptosis in PC12 cells mediated by mitochondria. J Neurochem 75, 1455-64.

53. Barrett, W.C., DeGnore, J.P., Keng, Y.F., Zhang, Z.Y., Yim, M.B., and Chock, P.B.1999). Roles of superoxide radical anion in signal transduction mediated by reversible regulation of protein-tyrosine phosphatase 1B. J Biol Chem 274, 34543-6.

54. Basnakian, A.G., Kaushal, G.P., and Shah, S.V. (2002). Apoptotic pathways of oxidative damage to renal tubular epithelial cells. Antioxid Redox Signal 4, 915-24.

55. Bates, T.E., Loesch, A., Burnstock, G., and Clark, J.B. (1996). Mitochondrial nitric oxide synthase: a ubiquitous regulator of oxidative phosphorylation? Biochem Biophys Res Commun 218, 40-4.

56. Baud, L., Haymann, J.P., Bellocq, A., and Fouqueray, B. (2005). Contribution of stem cells to renal repair after ischemia/reperfusion. Bull Acad Natl Med 189, 635-43; discussion 643-4.

57. Becker, L.B. (2004). New concepts in reactive oxygen species and cardiovascular reperfusion physiology. Cardiovasc Res 61, 461-70.

58. Behrends, M., Walz, M.K., Kribben, A., Neumann, T., Helmchen, U., Philipp, T., Schulz, R., and Heusch, G. (2000). No protection of the porcine kidney by ischaemic preconditioning. Exp Physiol 85, 819-27.

59. Beltran-Parrazal, L., Lopez-Valdes, H.E., Brennan, K.C., Diaz-Munoz, M., de Vellis, J., and Charles, A.C. (2006). Mitochondrial transport in processes of cortical neurons is independent of intracellular calcium. Am J Physiol Cell Physiol 291, C1193-7.

60. Bernal, S.D., Lampidis, T.J., Mclsaac, R.M., and Chen, L.B. (1983). Anticarcinoma activity in vivo of rhodamine 123, a mitochondrial-specific dye. Science 222, 169-72.

61. Bernal, S.D., Lampidis, T.J., Summerhayes, I.C., and Chen, L.B. (1982). Rhodamine-123 selectively reduces clonal growth of carcinoma cells in vitro. Science 218, 1117-9.

62. Beutner, G., Ruck, A., Riede, B., Welte, W., and Brdiczka, D. (1996). Complexes between kinases, mitochondrial porin and adenylate translocator in rat brain resemble the permeability transition pore. FEBS Lett 396, 189-95.

63. Bhat, R.V., Budd Haeberlein, S.L., and Avila, J. (2004). Glycogen synthase kinase 3: a drug target for CNS therapies. J Neurochem 89,1313-7.

64. Bi, B., Schmitt, R., Israilova, M„ Nishio, H., and Cantley, L.G. (2007). Stromal cells protect against acute tubular injury via an endocrine effect. J Am Soc Nephrol 18, 248696.

65. Biju, M.P., Akai, Y., Shrimanker, N., and Haase, V.H. (2005). Protection of HIF-1-deficient primary renal tubular epithelial cells from hypoxia-induced cell death is glucose dependent. Am J Physiol Renal Physiol 289, F1217-26.

66. Bivik, C.A., Larsson, P.K., Kagedal, K.M., Rosdahl, I.K., and Ollinger, K.M. (2006). UVA/B-induced apoptosis in human melanocytes involves translocation of cathepsins and Bcl-2 family members. J Invest Dermatol 126, 1119-27.

67. Biyikli, N.K., Tugtepe, H„ Sener, G., Velioglu-Ogunc, A., Cetinel, S., Midillioglu, S., Gedik, N., and Yegen, B.C. (2006). Oxytocin alleviates oxidative renal injury in pyelonephritic rats via a neutrophil-dependent mechanism. Peptides 27, 2249-57.

68. Blackmore, R.S., Greenwood, C., and Gibson, Q.H. (1991). Studies of the primary oxygen intermediate in the reaction of fully reduced cytochrome oxidase. J Biol Chem 266, 19245-9.