Изучение особенностей пролиферации эмбриональных клеток японских ускорению стареющих мышей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Семенова, Ирина Валерьевна

• Семенова, Ирина Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Семенова, Ирина Валерьевна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Клеточный цикл 9 1.1 Состояние пролиферативного покоя I о

1.2. Факторы роста

1.3. Активация тирозннкиназных рецепторов факторами роста

2. Проблема концевой недореплихации

2.1. Пролиферация клеток in vitro. Ограничение пролиферативного 17 потенциала клеток многоклеточных организмов

2.2. "Теломерная теория старения, или теория маргинотомии" А. Оловникова

2.3. Экспериментальные подтверждения теории A.M. Оловникова

3. Теломеры

3.1. Теломерный повтор

3.2. Функции теломер

4. Теломераза

4.1. РНК - компонент теломеразы

4.2. Теломеразные белки

4.3. Работа теломеразы

4.4. Механизм образования 3' - одноцепочечного фрагмента

4.5. Экзонуклеазная активность теломераз

4.6. Альтернативные механизмы поддержания длины теломер

4.7. Ингибиторы обратных транскриптаз нуклеотидной природы

5. Пролиферация клеток различных видов в культуре 36 5.1. Морфологические стадии старения фибробластов в культуре 36 5 .2. Фибробласты человека в культуре

5.3. Старение, или Ml

5.4. Состояние "кризиса", или М

5.5. Клетки мыши в культуре

6. Ускоренно стареющие мыши линий SAMP и SAMR

1- Смп мюиу старением Итон ■ штат* И организма W«старением

КОЯЯМШ" потенциала ктокс 8ИД010Й продолжительностью жизни

72 iHT" «Р—о л„т,И1шма фи6^ласто, от атраста J

73 ~ фибробластоа „р„ наследств* 48 болезнях преждевременного старенн, ■ лрогери.х '

4. Данные об ограниченности потенциала клеточных делений in vivo

Материалы и методы

1- "Сметные лют* SAMP-1, SAMR-1, СВА

2 Получение живот» с ^^

3 Получение эмбрнонадышх фнбробласгоа мыши

• Услоам культивированы клеток

5 3>М0Рв*инан*е клеточных культур

6 Ра«°Р«ивание клеточных культур 51 J Культивирование «легок а присутствии перекиси водорода '' « Выяление активности эндогенной Р-галактозидазы (рН-6 0) * Пролифератнвный „око. и стимул,™, рос™^ „„^

IU. Ралиоантпгпафкц

11 Исследование фосфорилирования тирозина

12. Определение теломеразной активности (ТАК)

13 Ингибиторы обратных транскриптаз

14. Изучение теломер

15. Гибридизация m situ

16. Приготовление хромосомных препаратов

Результаты

1 Рост эмбриональных фибробластов мышей в культуре

2- «°~НЫе параметры роста и старения культур эмбриональных фибробластов мышей линий SAMP-1, SAMR-l и СВА

3. Пролиферативный потенциал ЭФМ линий SAMP-1. SAMR-1 „ СВА

4- Время переживания клеток в неделящемся состоянии

5- Выявление аггивности эндогенной (3-галактозидазы (рН=6 0)

6. Пролифераггивный ответ эмбриональных фнбробластов мышей на стимуляцию 68 факторами роста

7. Уровень фосфорилироваиия белков по тирозиновым остаткам

8. Спонтанная трансформация

9. Теломеразная активность (ТАК)

10. Подавление функции теломеразы с помощью ингибиторов обратных 74 траискриптаз

11. Изучение теломер и кариотипа эмбриональных фнбробластов мышей линий 76 SAMP-1 и SAMR

Обсуждение

1. Морфологически старение клеток SAM неотличимо от старения нормальных 81 мышиных фнбробластов

2. Повышенная активность эндогенной 0-галактозидазы (рНа6,0) отражает 81 ускоренное старение эмбриональных фнбробластов мышей SAM

3. Снижение пролиферативного ответа на стимуляцию факторами роста в 81 процессе старения эмбриональных фнбробластов мышей в культуре

4. Вызывается ли спонтанная трансформация эмбриональных фнбробластов 83 мышей в культуре повышением (появлением) ТАК?

5. Существует два пути спонтанной трансформации

6. Связь длины теломер у мышей и пролиферативного потенциала их клеток в 85 культуре

7. Объяснение того, как относительно длинные теломеры мыши могут 86 индуцировать пролиферативное старение

8. Тройственная корреляция между продолжительностью жизни мышей, 88 пролиферативным потенциалом их эмбриональных фибробластов и временем переживания состарившихся фибробластов в неделяшемся состоянии

9. Повышенная нестабильность ДНК в клетках SAM может объяснить все 91 наблюдаемые в наших экспериментах явления

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение особенностей пролиферации эмбриональных клеток японских ускорению стареющих мышей»

Ежегодно ■ мире тратятся огромные средства на борьбу со старением. Считается, что половина всех средств, затрачиваемых на медицинское обслуживание, расходуется на поддержание последнего года жизни человека. Многие болезни (такие как болезнь Паркиисона, сердечно - сосудистые заболевания и т.п.), ранее считавшиеся болезнями пожилых людей, заметно "помолодели", что наносит значительный вред мировой экономике. Ухудшение экологической обстановки привело к резкому возрастанию количества онкологических заболеваний в промышленно - развитых странах. Все это делает необходимым изучение процессов, лежащих в основе естественного старения и канцерогенеза.

Процесс естественного старения организмов - одна из самых сложных в изучении проблем. Факторы, влияющие на этот процесс, многочисленны и разнообразны: от условий жизни и рациона питания, до сложных генетических и молекулярных механизмов.

Еще в конце XIX века Август Вейсман высказал предположение о том, что старение организмов связано со старением их клеток. В 1961 году Хэйфлик на основании результатов многолетней работы предположил, что старение клеток в культуре отражает те же самые процессы, которые обуславливают старение организма в целом Изучение культур клеток, взятых от больных различными формами прогерий (болезни преждевременного старения), подтвердили правоту предположения, сделанного Хэйфликом.

Изучение старения человека ограничено этическими причинами и большой длительностью процесса естественного старения. Поэтому для интенсивных исследований в этой области необходимо создание подходящих животных моделей. Из множества животных моделей сейчас наиболее перспективной, на наш взгляд, являются японские ускоренно стареющие мыши SAM и культуры их клеток.

Наиболее часто в литературе в качестве главной характеристики старения клеток в культуре приводится максимальное число удвоений популяции, которое могут проделать клетки in vitro (так называемый пролиферативный потенциал клеток) Поэтому одной из целей нашей работы было измерение и сравнение пролнферативных потенциалов эмбриональных фнбробластов мышей всех трех линийПоскольку любой многоклеточный организм состоит из делящихся и неделящихся клеток, то, теоретически, на продолжительность жизни организма должны влиять, по меньшей мере, два фактора, пролиферативный потенциал делящихся и время переживания неделящихся клеток. Исходя из этого, представлялось целесообразным изучить на одних и тех же культурах не только пролиферативные потенциалы эмбриональных фибробластов мышей указанных линий, но и время их переживания в неделяшемся состоянии после прекращения делений.

Из литературы известно, что пролиферативный ответ клеток на стимуляцию различными факторами роста снижен у старых клеток по сравнению с молодыми В связи с этим мы решили исследовать пролиферативный ответ эмбриональных фибробластов мышей линий SAMP-l, SAMR-1 и СВА, находящихся на различных стадиях пролиферации в культуре, на стимуляцию несколькими факторами роста и сывороткойПоказано, что эмбриональные фибробласты мыши обладают выраженной способностью к спонтанной трансформации, поэтому мы посчитали необходимым исследовать этот процесс на наших объектахПоскольку большинство полученных нами клонов спонтанных трансформантов обладало теломеразной активностью, нами были проведены эксперименты по блокированию функции теломеразы с помошью ингибиторов обратных транскриптаз с цетью выяснения роли активации теломеразы при спонтанной трансформации Следует отметить, что изучение активации теломеразы представляет интерес не только для фундаментальной науки, но иимеет большое прикладное значение, так как активация этого фермента связана с процессами иммортапиэащш к большинством случаев раковых заболеваний.

В соответствии с теломермой теорией A.M. Оловиикова клетка стареет из - за потери последовательностей ДНК на концах хромосом вследствие нх неполной репликации. Следовательно, теломеры могут играть ключевую роль в преждевременном старении мышей SAM. Для проверки этого предположения нам было необходимо измерить и сравнить между собой теломеры мышей линий SAMP-1, SAMR-1 и СВА.

Принимая во внимание все вышесказанное, мы посчитали, что мыши SAM и культуры их эмбриональных фибробластов представляются удобной моделью для изучения взаимосвязи старения на организменном и клеточном уровнях.Ototp лггсратуры.

Совокупность гюсюеаггшлышх событий, происходим* от момент» обркюамм ШКМ а имам— т ШИ-|ШМ п Tmrmn Mf> ш ш(тпогачаспм) тпслом. Обычно клеточный цикл у эукармотттшш отрока: ит» (М), пркиитепгиская (01), ситттмми (S) ■ тсптитчтят (02) фт (ряс. 1 А).

А - Кдвточимй ваш. Точа иотроля" Состоят покоя. В - Остановка юточюго2000).<82-лои*G2 Z1Повреждения ДНК, дефицит мукпяотмдм. разруиимм тмрогрувочм. появление ммроямр/ •V ^® ОО^пошоЛ (Б)Известно, что общая продолжительность, как всего клеточного цикла, так и отдельныхего фаз значительно варьируют ие только у разных организмов, но и у клеток разных органов■ тканей, а также в клеточных популяциях идентичных клеток. Наиболее подвержена изменениям Gl-фаза.

Предполагается, то простейший клеточный цикл может состоять только из двух фаз -S и М (Murray, Kinchner, 1919). Такой гипотетический клеточный цикл имеет место во время Р-шего эмбриогенеза у организмов с большими яйцеклетками, например, у Хепорш и Drosophila. В этих яйпеклетках все компоненты, необходимые для многочисленных делений, преснитеэировмы во время оогеиеза и сохраняйся в цитоплазме. Поэтому после оплодотворения деления происходит чрезвычайно быстро, и фазы G1 н 02 отсутствуют.t. 1. Состояние пролиферативного покоа.

Клетки, которые вышли из митотического цикла на неопределенное время, сохраняя жизнеспособность и пролиферативный потенциал, называют покоящимися клетками (Епифанова и др., 1983). Такие клетки, находящиеся вне митотического цикла ("вышедшие из цикла"), содержат, как правило, пресинтетическое количество ДНК. В отличие от фаз цикла их состояние обозначается как GO-фаза, или состояние пролиферативного покоя. Но поскольку было показано, что в редких случаях, особенно в условиях организма. клетки могут переходить в состояние покоя после завершения синтеза ДНК и содержать соответственно удвоенное постсинтетическое количество ДНК. было предложено определять состояния покоя как 00 - покой и 02 - покой, в зависимости от того, из какой фазы клеточного цикла (G1 или G2) клетки вышли в состояние покоя (рис 1А) (Никольский. 1984). Клетки в культуре можно ввести в состояние пролиферативного покоя за счет снижения содержания сыворотки в культуральной среде, те. пониженным содержанием факторов роста - так называемое "сывороточное голодание" Выход клеток из покоя вызывается добавлением в среду сыворотки. Переход клеток в состояние покоя также наблюдается при высокой плотности культуры даже в присутствии факторов роста. Следует отметить, что у многоклеточных организмов клетки многих типов переходят в состояние покоя в результате окончательной дифференцировки и теряют способность делиться независимо от внешних стимулов.

В клеточном цикле постулировано существование так называемых "точек контроля" (checkpoints) (рис 1А), прохождение которых возможно лишь в случае нормального завершения предыдущих этапов и отсутствия поломок Выделяют, по меньшей мере, четыре такие точки, в Gl, S, G2 фазах и "точку контроля сборки веретена деления" в митозе (рис 1 А) (Sherr, 1996; Murray, 1995, Elledge, 1996) Остановка клеточного цикла в этих точках происходит при различных повреждениях ДНК. изменениях числа хромосом, образовании микроядер, разрушении микротрубочек, дефиците нуклеотидов и т д (Копнин. 2000)Универсальная теория клеточного цикла предполагает что клетка как целое в течение клеточного цикла проходит через ряд состояний (Hartwell, 1995) В каждом состоянии критические регуляторные белки претерпевают фосфорилирование или дефосфорилирование, определяющее переход этих белков в активное или неактивное состояние, их взаимосвязи и/или клеточную локализацию В настоящее время признано, что изменения состояния клетки в определенных точках цикла определяются особымикомплексами циклинзааксимых протеинкииаз (Cyclin - dependent kinases - Cdk) с белками • цнклииами (рис. 2)(Мос®яп, 1997).

Рак. 2: Регуляция клеточного цикла комплексами циклниэааисимых кииаэ и циклиноа (согласно Копиин, 2000).

Циклин ВCdc2(Cdkl)Циклин В CdK2Циклин А Cdk2Циклин ЕCdk2Циклины D1 D3 Cdk4 6В клетках млекопитающих существует, по меньшей мере, шесть различных Cdk Cdkl-6. Cdkl ассоциируется с циклинами А и В и участвует в переходе G2 М Cdk2 может связываться с циклинами А, В, Е. D2 и D3 (но не с Dl) (Sherr. 1995) и является одной из основных киназ, регулирующих переход Gl S и прохождение через S-фазу (Fang, Newport, 1991; Paris et al., 1991). Cdk3 экспрессируется в большинстве клеток на незначительном уровне, и ее функция пока не выяснена, хотя предпола1аегся. что она. по юбш ( dk2 участвует в переходе Gl - S (Van den Heuvell. Harlow. 1994) Данные о роли Cdk5 и о взаимодействующих с ней циклинах противоречивы Cdk4 и С dk6 связываются с циклинами типа D и отвечают за прохождение Gl-фазы и переход в S-фазч (Sherr. 1994)Каждый тип циклинов, обозначенных от А до Н. имеет гомологичный участок -150 аминокислотных остатков, называемый "циклиновым боксом" (Hunt, 1991) )тот участок отвечает за связывание с Cdk (Kobayashi et. al. 1992. Lees. Harlow, 1993)л гдеследовательность после "циклинового бокса", которая повышает их стабильность Благодаря этому они сохраняются в интерфазе, но подвергаются протеолизу в митозе убиквитин - зависимым путем (Glotzer et. al., 1991).

Основными белками, контролирующими скорость прохождения Gl-фазы в клетках высших эукариотов. являются циклины типа D Существует три типа циклина D Dl. D2 и 03, которые не являются взаимозаменяемыми.

Каждая Cdk представляет собой каталитическую субьезиницу (серии - треониновую киназу) голоферментного комплекса, для активности которой требуется присутствие активаторной субьединицы - циклина (Morgan. 1995) Регуляция активности Cdk осуществляется за счет изменения уровня определенных циклинов в определенные фазы клеточного цикла. Кроме того, активность Cdk регулируется изменениями фосфорилироаання их определенных аминокислотных остатков, а также с помощью ингибиторов Cdk. В активной форме комплексы циклин - Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие протекание данной фазы. Например, основным субстратом комплексов циклин D-Cdk4 и циклин D-Cdk6 являются белок Rb и Rb-подобные белки р105 и р130. PRb и его гомологи дефосфорилированы в неделящихся клетках, находящихся в ранней Gl-фазе (Mittnacht, 1998). В таком состоянии они связывают и блокируют комплексы транскрипционных факторов E2F-DP (E2F-1. -2, -3. -4. -5 и DP-1. -2. -3). регулирующие активность ряда генов, продукты которых необходимы для начала и прохождения S-фазы Связывание белков семейства E2F с pRb ингибирует их транскрипционную активность При митогенных сигналах, вызываемых ростовыми факторами. pRb в середине Gl-фазы фосфорилируется комплексами циклин D-Cdk4 или циклин D-Cdk6 что вызывает высвобождение транскрипционных факторов E2F-DP из комплекса с pRb и их активацию (Mittnacht, 1998). Одним из следствий этого является стимуляция транскрипции гена циклина Е, в результате чего активируются комплексы циклин E-Cdk2. также фосфорилирующие pRb Таким образом, возникает регуляторная петля. поддерживающая активность транскрипционных факторов E2F-DP и контролируемых ими генов, обеспечивающих репликацию ДНК После завершения S-фазы pRb переходит в дефосфорилированное состояние, в котором он блокирует активность E2F-DP и вход в следующую S-фазу Следовательно, pRb играет ключевую роль в регуляции вхождения клетки в S-фазуВообще, сигнальный путь Cdk-pRb-E2F контролируется не только pRb но и многими другими супрессорными белками. Некоторые из них являются ингибиторными субъединицами Cdk CKIs - Cdk Inhibitors), опосредующими остановку клеточного цикла в ответ на различные внеклеточные и внутриклеточные сигналы (Morgan, 1997)Идентифицированы дм семейства CKIs: Ink4 и Cip/Kip. Первое включает четыре представителя, в том числе опухолевые супрессоры pISINk4b и pl6INk4a Белки Ink4 обладают достаточно узкой специфичностью: связывая Cdk4 и Cdk6. они препятствуют образованиюих комплексов с циклинами D (Morgan, 1997; Sherr, 1996). Семейство Cip/Kip состоит из ipe\ членов: p21WAFI/CIP1. р27МР1 и р57К1|>2 Эти белки связывают и ингибируют уже полностью сформированные комплексы циклин D-Cdk4,6, циклин E-Cdk2 и циклин A-Cdk2 Кроме того, р21WAFt/Cfp' способен блокировать и комплекс циклин B-Cdkl. ответственный за продвижение по 02-фазе и вход в митоз (Morgan. 1997; Sherr, 1996).

Ген р53 является центральным компонентом механизма, обеспечивающего удаление из организма поврежденных клеток. На нем сходятся многочисленные сигналы, отслеживающие состояние клетки и ее окружения. Р53 способен изменять свои свойства за счет разного рода модификаций молекулы посредством фосфорилирования, ацетчлирования и связывания с другими молекулами, регулирующими его активность. Р53 представляет собой полифункциональный белок, основная функция которого осуществляется в ядре. Ген р53 постоянно транскрибируется, однако образующийся белок быстро подвергается убиквнтин - зависимой деградации в протеосомах (Chowdary et al. 1994, Ichihara. Tanaka. 1995). Поэтому в клетках большинства тканей уровни белка чрезвычайно низки и могут находиться на пороге детекции. Активация белка р53 в ответ на разнообразные стрессы и повреждения происходит, главным образом, на посттрансляционном уровне за счет замедления его деградации, а также за счет конформационной перестройки молекулы, приводящей к повышению функциональной активности Р53 приписывается целый ряд функций и активностей, однако основной его функцией является способность служить транскрипционным фактором (Raycroft et al, 1990) Р53 является ключевым компонентом некоторых "точек контроля" Р53 активируется в ответ на повреждения ДНК, недостаток нуклеотидов, разрушение микротрубочек, образование микроядер, гипоксию, потерю контактов клетки с субстратом и тд. (рис 1Б) (Копнин, 2000) При этом сенсорами повреждений ДНК, по всей видимости, являются большая субъединица ДНК- зависимой протеинкиназы и/или белок ATM (Ataxia-Teleangioectasia Vlutated) обладающие способностью, с одной стороны, распознавать свободные концы ДНК, а с другой, фосфорилировать р53 по Ser-15, препятствуя тем самым его связыванию с белком Mdm2, последующему транспорту из ядра и деградации (Prives 1998,Giaccia. Kastan. 1998) Кроме того, имеются сообщения о способности С-концевого домена белка р53 непосредственно связываться с участками одноцепочечной ДНК (Bakaikin et al, 1994, Jayaraman, Prives, 1995),участками неспарениых оснований (Lee et aL 1995) и однонитевых разрывов (Reed et al. 199$), что указывает на возможное прямое участие р53 в узнавании повреждений ДНК.

Одним из следствий активации р53 является изменение экспрессии регулируемых им генов, таких как ВАХ. BCL2 и других, контролирующих апоптоз. и p21WAFI. GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage-induced), экспрессия которых приводит к остановке клеточного цикла (Agarwal et al. 1998; Amundson et al. 1998; Ко. Prives. 19%) В результате клетка, в которой уже произошли или только могут произойти генетические изменения, либо гибнет в результате индукции апоптоза, либо останавливается в G1- или G2-. а иногда в S-фазе клеточного цикла (рис. 1 Б).

1.2. Факторы роста.

К ростовым факторам (митогенам) относят вещества, как правило, пептидной природы, обладающие способностью стимулировать синтез ДНК (пролиферацию клеток) непосредственно или в совокупности с другими факторами. Наибольшее количество факторов роста обнаружено в сыворотке крови. Концентрация факторов роста в сыворотке очень мала - порядка Ю"10М.

Факторы роста многочисленны и разнообразны. В настоящее время выделяют семейство инсулиноподобных факторов роста, FGF, PDGF и EGF семейства, семейство трансформирующего фактора (3 (TGFP) и некоторые другие Кроме того, существуют факторы роста, пока не отнесенные к какому - либо семейству Следует отметить, что одни факторы роста специфичны по отношению к клеткам-мишеням, другие - менее избирательны и действуют на несколько типов клеток. Фактор роста высокомитогенный для одного типа клеток может действовать как ингибитор пролиферации для другого типа клеток.

В процессе пролиферативного старения изменяется способность клеток отвечать на стимуляцию факторами роста. Имеются данные о потере чувствительности к ряду митогенов диплоидными фибробластами, полученными из эмбриональных источников и or взрослых доноров, после их серийного пассирования в культуре (Cristofalo et. al., 1989. Ohno. 1979, Plisco, Gilchrest, 1983, Phillips et. al., 1984). Культуры клеток, полученные из тканей, взятых у пациентов, имеющих синдромы преждевременного старения, такие как прогерия и синдром Вернера, дают значительно более низкий ответ на стимуляцию инсулином, FGF, PDGF и сывороткой, чем клетки здоровых людей (Harley et. al., 1981, Bauer et. al., 1986). Показано также, что белок Rb не фосфорилируется в "старых" фибробластах человека после стимуляции сывороткой, хотя фосфорилируется в "молодых" клетках (Stein et al. 1990).

Таким образом, по мере старения клеток наблюдается снижение их чувствительности к факторам роста.

Среди митогеииых биологических добавок, используемых для культивирования клеток, наибольшее распространение получила сыворотка крови. Сыворотка является сложной смесью множества биологических молекул с различными физиологическими активностями. К основным компонентам сыворотки, необходимым для выживания и роста клеток млекопитающих в культуре относятся: белки плазмы (альбумины, фибронектин. а2-макроглобулии, фетуин, трансферрин); полипептидные факторы роста (инсулин, ннсулиноподобные факторы роста I и II (IGF), PDGF, EGF); глютатион; непептидные гормоны (кортизол (гидрокортизон), эстрогены, андрогены. тиреоидные гормоны (ТЗ. Т4)): липиды (линоевая кислота, холестерин, лизофосфатидная кислота, простагландины), метаболиты (аминокислоты, а-кетокислоты (пируват), полиамины), минеральные вещества (Fe2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, SeOj2", Co2+, V03", МотОзЛ) (Maurer, 1986).

1.3. Активация тнрозннкииазных рецепторов факторами роста.

Связывание полипептидных факторов роста со специфическими рецепторами, расположенными на плазматической мембране, индуцирует тирозинкиназную активность последних, которая, в свою очередь, приводит к активации сигнального каскада, ведущего к изменению транскрипции генов. Упрощенная последовательность событий при активации тирозинкиназных рецепторов факторами роста представлена на рис. 3Тирозинкиназные рецепторы состоят из трех доменов- внеклеточного (лигандсвязываюшего), сигнальной трансмембранной а-петли и цитозольного домена, обладающего тирозинкиназной активностью Связывание лигандов с рецепторами (1) индуцирует автофосфорилирование специфических тирозиновых остатков в цитозольном домене (2), что приводит к активации белков Grb2 и Sos (3), которые, в свою очередь, активируют белок Ras. В результате этого белок Ras переходит в GTP-связанную активированную форму - Ras-GTP (4) (Egan, Weinberg, 1993) Активированный Ras-GTP связывает N-концевой регуляторный домен цитоплазматического белка Raf (МАРККК -MAP kinase kinase kinase), приводя к его локализации в плазматической мембране и активации этого белка (5). Raf (МАРККК) фосфорилирует и активирует МАРКК (MAP kinase kinase) (6) - двуспецифичную киназу, способную фосфорилировать как серин/треониновые, так и тирозиновые остэтки, которая, в свою очередь, фосфорилирует МАРК (mitogen -activated protein kinase) и активирует ее (7).

Фосфорилнромнне транскрипционных факторов приводит к увеличению транскрипции генов, вовлеченных в пролиферативный ответ (например, c-jun. c-fos) (9). Одним из генов, чья экспрессия увеличивается в ответ на стимуляцию факторами роста, является ген МКР-1 (представитель семейства генов МАРК фосфатаз) (10). Продукт этого гена дефосфорилируст МАРК по остаткам тирозина и треонина, тем самым, инактивируя МАРК (11).

При стимуляции клеток из состояния пролиферативного покоя индуцируется транскрипция генов, относящихся к двум классам: генам раннего ответа и генам позднего (задержанного) ответа. Транскрипция генов раннего ответа индуцируется в течение нескольких минут после добавления в среду факторов роста через сигнальный каскад, активирующий факторы транскрипции. Индукция генов раннего ответа не блокируется ингибиторами белкового синтеза, потому что отвечающие за нее транскрипционные факторы присутствуют в покоящихся клетках и активируются путем посттрансляционных модификаций, таких как фосфорнлирование. Многие гены раннего ответа, в свою очередь, кодируют транскрипционные факторы. Например, продукты генов c-fos и c-jun входят в состав транскрипционного фактора АР-1, одного из основных регуляторов пролиферации и дифференцировки. Белки, кодируемые генами раннего ответа, стимулируют экспрессию дополнительных транскрипционных факторов, таких как E2F-1, которые, в свою очередь, индуцируют транскрипцию генов позднего (задержанного) ответа. К генам позднего ответа относятся, в частности, гены, кодирующие циклины D-типа, циклин Е, CDK2 и CDK4 Результатом действия факторов роста является вступление клеток в S-фазу клеточного цикла.

2. Проблема концевой недорепликации.

2.1. Пролиферация клеток in vitro. Ограничение пролиферативного потенциала клеток многоклеточных организмов.

В настоящее время многие типы клеток успешно культивируются in vitro, но большинство из них пролиферируют не бесконечно Какие причины обуславливают ограниченный пролиферативный потенциал или бессмертие клеточных культур9Еще в 1891 году великий немецкий биолог Август Вейсман предположил, что соматические клетки высших животных должны иметь ограниченный потенциал делений Хотя он не представил никаких экспериментальных доказательств этого положения. Вейсман писал, что ". смерть обусловлена тем, что изношенные клетки не могут самообновляться, а их способность к росту путем деления не вечна, но ограничена" (Weismann, 1891)Первые экспериментальные подтверждения ограниченности клеточных делений были опубликованы Свимом. Проанализировав результаты 336 публикаций, включая и результаты своих собственных экспериментов по длительному культивированию 23 штаммов фибробластов, взятых из нормальных тканей эмбрионов кролика и цыпленка (Haft', Swim. I9S6), а также 51 штамма фибробластов человека, полученных из крайней плоти, плаценты, яичек, матки и эмбриональных тканей (Swim. Parker, 1957). Свим пришел к выводу о том. что нормальные клетки в культуре смертны и что прекращение размножения клеток не зависит от условий культивирования. п < Наиболее известной работой, подтверждающей ограниченность клеточных делений in vitro, является работа Хейфлика и Мурхеда (Hayflick, Moorhead. 1961). Эти исследователи показали, что в популяции эмбриональных диплоидных фибробластов человека (ЭФЧ) линии WI-1 и других линий удвоение общей численности клеток происходит конечное число раз -50 ± 10, после чего клетки дегенерируют.

Жизнь клеток в культуре была разделена Хейфликом на три фазы (рис 4) фаза I представляет собой становление популяции in vitro, фаза II - период последовательных пассажей и экспоненциального роста числа клеток, фаза III - фаза истощения пролиферативного потенциала. Длительность фазы I - это время, необходимое для образования первого сомкнутого монослоя, т е. до первого субкультивирования. Продолжительность фазы II, в течение которой клетки стабильно делятся, определяется не временем, которое клетки провели в культуре, а числом произведенных удвоений популяции (УП). Для клеток человека, как было указано выше, это число составляет 50 + 10 УП. Максимальное число УП, которое большинство соматических клеток может проделать в культуре, было названо "пределом Хэйфлика" Важно иметь в виду, что приведенная цифра 50 ± 10 относится не к максимальному числу делений клетки в культуре, а к числу УП культивируемых клеток. Это число обычно определяют следующим простым, но далеко не точным способом: после того как клетки образуют ианослой на дне ^льтурального флакона, их рассаживают в два таких же флакона; когда ihq этих флаконов заполнится, проводят следующий пересев также с уменьшением плотности клеток вдвое и т д (Михельсон, 1984) Таким образом, между каждыми двумя пересевами (пассажами) число клеток удваивается, т.е. в среднем каждая клетка делится при $том один раз Между тем известно, что часть клеток гибнет при каждом пересеве; кроме того, не все клетки, пережившие пересев, делятся при каждом субкультивировании.Nb 4: Графическое изображеиие фаз пропнфераики ЭФЧ • культуре (согласно Hayflick, MoortMid, 1961).

Ллселжи0 то го за 4о so1-I-I 1-1 fp IВ конце фазы II время, необходимое для образования сомкнутого монослоя после каждого субкультивирования, постепенно увеличивается, митозов становится меньше, в клетках начинаются дегенеративные процессы.

Главным критерием вступления культуры клеток в фазу III является исчезновение митозов. Кроме того, наступление фазы П1 сопровождается накоплением цитоплазматических включений, укрупнением клеток и увеличением степени их распластывания. Следует отметить, что уменьшение числа митозов и вышеназванные дегенеративные изменения клеток в культуре происходят не вдруг, а нарастают постепенно с течением времени. После прекращения делений клетки еще некоторое время остаются метаболически активными, после чего не делящиеся клетки спонтанно дегенерируют, переживая в стационарных культурах длительное время (Matsumura et. al., (979). Все попытки набежать фазы П1 путем изменения состава культуральиой среды или условий культивирования не увенчались успехом.

В работе Хейфлика и Мурхеда (Hayflick. Moorhead. 1961) было высказано предположение о том, что ограниченность пролиферативного потенциала является внутренним свойством самих клеток и эта ограниченность связана со старением на клеточном уровне.

2.2. "Теломераая теории старения, или теория маргииотомии" А. Оловиикоаа.

Данные, полученные Леонардом Хейфликом об ограниченности пролиферативного потенциала нормальных человеческих клеток (Hayflick. Moorhead. 1961). о том. что замороженные в жидком азоте человеческие клетки "помнят" при каком числе удвоений они были положены на хранение и после размораживания они проделывают 50 удвоений минус число удвоений, выполненных ими до замораживания (Hayflick, 1965), наводят на мысль о существовании внутриклеточного механизма, который "считает" число делений клетки.

Первые экспериментальные попытки определения положения этого механизма в клетке были сделаны в работах по переносу ядра из старой или молодой культивируемой клетки в цитопласты, т.е. энуклеированные клетки, противоположного (молодые или старые соответственно) возраста. Эти опыты показали, что искомый механизм находится в ядре (Muggleton-Harris, Hayflick, 1976).

В 1971 году Алексей Оловников, исходя из теоретических предпосылок, сформулировал свою "теорию маргииотомии", объясняющую наличие "предела Хэйфлика" у клеток с линейными хромосомами. В соответствии с ней клетка может стареть в связи с потерей последовательностей ДНК на концах хромосом из-за их недорепликации (Оловников, 1971). На возможность существования процесса недорепликации указывал также Уотсон (Watson, 1972).

Согласно Оловникову, проблема концевой недорепликации состоит в том, что ДНК-полимераза способна осуществлять синтез только в направлении от 5-конца ДНК к ?'-концу, причем копирование матрицы не может начаться на первом нуклеотиде Таким образом, реплика получается короче матрицы Следовательно, с каждым актом клеточного деления хромосомы должны укорачиваться с концов (Оловников. 1971. Olovmkov. 1973) Поэтому укорочение хромосом с концов может служить "молекулярными часами" клетки, отсчитывающими число пройденных делений. Как только элиминируются жизненно важные гены, клетки перестают делиться. Теория предусматривает существование особого биологического механизма, предотвращающего этот эффект Этот механизм должен действовать в половых, а также в раковых клетках и в клетках организмов, размножающихсяeywii,и ие должен действом» • большинстве других случаев, • частности во «•«юл» соматичасках клетках (Оловиниоа, 1971).

К кастошяму аременн проблема концевой недорепликации изучена более дтпыюКакизвестио, отстающее то ДНК синтезируется » яде фрагментов Окюаки: сначала ДНКтлт* создт РНК-прЯЫеры, которые достр—ДНК-полшер«я, зит. иуюя«ш***** РНК-оряЫеры, а ДНК-л«я сияиг ДНК. Даже если реплнпщ» отстяоя*теш яшщцу^^.vi т гоипе хромосомы, то удаление РНК-праймера приводит к"««"о*»!») З'-нереплицироваиного учягтка. Схема концевой недореплипции ДНК |фиетамвмнврк.5.

5: Схема юнияов недорешшкации ДНК (согласно Егоровi,2001).

У 53' 5'23. Экеперимеи i альиые подперяаепи теория А.М. Оловникова.

1. Анализ теломер показал, что при каждом клеточном делении хромосомы соматических клеток теряют от 50 до 200 п.н. теломерного повтора (Harley et. al., 1990, Allsopp et. al., 1995).

2. Было показано, что соматические клетки лишены теломеразной активности (Harley et. al., 1990, Harley, 1991).

3. В противоположность "смертным" соматическим клеткам, обладающим ограниченной способностью к размножению in vitro, имморгальиые клетки (клетки21полового ряд», большинство опухолевых клеток, а также стволовые клетки), способные к ■ бесконечной пролиферации, содержат специальный фермент - теломеразу, удлиняющую теломеры (Kim et. al., 1994). Теломераэа была открыта в 1985 году Грейдер и Блэкборн (Greider, Blackburn, 1983) и это было первым экспериментальным подтверждением теории Оловиикоаа.

4. В половых клетках теломеры остаются длинными при общем старении организма (Harieyetal, 1992).

3. Теломеры.

Цитологи называют теломерами концевые участки хромосом, видимые в световом микроскопе Это очень большие структуры, охватывающие районы в миллионы пар оснований ДНК. Молекулярные биологи имеют дело со значительно меньшими концевыми районами хромосом, перекрывающими тысячи нуклеотидных пар. Именно этими теломерами оперирует теломериая теория.

3.1. Теломерный повтор.

На концах хромосом большинства эукариот расположены специальные структуры -теломеры. Это ДНК - белковые комплексы. Теломериая ДНК представлена простой тандемно повторяющейся последовательностью, длиной 5-8 оснований, G-богатой в той цепи, которая идет к 3'-концу хромосомы (G-цепь), и С-богатой в комплиментарной 5'-цепи (С-цепь) У всех позвоночных животных теломерный повтор G-цепи представлен последовательностью TTAGGG, повторенной сотни и тысячи раз (Meyne et al, 1989). которая является высоко консервативной в эволюции она встречается от примитивных организмов, таких как трипаносомы и слизевики до высших многоклеточных включая человека (Moyzis et al, 1988, Meyne et al, 1989, Cross et al, 1989) Особый интерес в структуре теломер представляет их самая дистальная часть Двойная спираль ДНК не доходит до самого конца, 5'-цепь обрывается, и остается одноцепочечный G-богатый участок Это свойственно всем теломерам, содержащим теломерные повторы, начиная от простейших и заканчивая человеком. Длина одноцепочечного 3'-конца варьирует от 10-16 нуклеотидов у простейших (Oka et. al., 1980, Klobutcher et. al., 1981, Henderson, Blackburn, 1989) до нескольких сотен нуклеотидов у человека (Makarov et al, 1997) Следует отметить, что свободный 3'-конец имеется как в члетках с функционирующей теломеразой, так и без нее (Brown et. al., 1990). Поэтому его наличие невозможно объяснить деятельностью теломеразыВ литератур* не закончен спор о том, имеется ли одноцепочечный 3 -конец на каждой теломере или же только у полоаииы теломер (Makarov et. al. 1997. Wright et. al. 1997. Huffman et. at., 2000, Riha et. al., 2000). Если следовать теории недорепликации, то свободный 3'-конец должен образовываться в каждом клеточном цикле только на одной из двух теломер - на теломере, образованной на отстающей цепи репликативиой вилки. Недавно показано, что теломеры в клетках фибросаркомы человека после репликации подвергаются процассиигу, в результате которого каждая теломера приобретает 3'-конец (Bailey et al. 2001). Процессииг теломеры, образованной на лидирующей цепи, заключается в деградации С-богатой цепи теломеры; теломеры, образованной на отстающей цепи не подвергаются процессингу. Кроме того, известно, что длина одноиепочечного участка коррелирует со скоростью недорепликации (Huffman et. al., 2000), что свидетельствует в пользу того, что деградация 5'-конца не вносит заметного вклада в укорачивание теломер.

Конформация одноцепочечиого 3'-конца привлекает внимание исследователей исходя из термодинамических особенностей последовательности, содержащей повторяющиеся кластеры GGG. Расчеты показывают, что такая последовательность может легко образовывать неканонические структуры (триплексы, квадруплексы). Реальным подтверждением возможности существования такой структуры явились опыты де Ланж и сотр. (Griffith et al, 1999). На основании анализа вероятности появления ковалентных сшивок между нитями ДНК была создана модель теломерных петель (рис. 6). По этой модели свободный 3'-конец в комплексе с белками вступает во взаимодействие с двойной спиралью теломерной ДНК и вытесняет одну из цепей (образуется тройной комплекс цепей ДНК). Вытесненная цепь образует D-loop (вытесненную петлю (D-displace)). а сама теломера при этом образует теломерную петлю (t-loop). По данным авторов, длина теломерной петли коррелирует с длиной теломер, измеренной независимыми методами. Модель оставляет необъясненным, каким образом D-loop образуется именно в начале теломерной последовательности.

Одноцепочечиая G-богатая теломериая последовательность способна образовывать внутрицепочечные и межмолекулярные квадруплексы, и другие неканонические структуры. До сих пор нет прямых свидетельств существования этих структур in vivo, однако разнообразные соединения, взаимодействующие с квадруплексами, подавляют теломеразную активность (Mergny et. al., 1999, Kerwin, 2000, Han, Hurley. 2000, Hurley et. al., 2000), в том числе и в клетках (Izbicka et. al. 1999). В образовании таких неканонических структур важную роль играют белки.

Таломеросананиоииш белки даляггся м дм класса: I) те, которые связываются с тушштшт учмпшна таломар - эхо Raplp у дрожжей (Krauakopf, Blackburn, 1996, de Laap, 1996, Shot*, 1997) a TRF1 у млекопитающих и ппш (Van Steenael, de Lange, 1997, de Uil|t, 1996);Pee. 6s Молкла петлевого строения теломер (согласно Griffith et al., 1999). Структура те номера! образуется ара аиангимйгтвии ДНК с балками, прежде всего TRFII н TRJFI.

Ояиоиепочечный З'-коисц ДНК -3"-5'i Избыток TKFl w TRF2TRF22) те, которые взаимодействуют с 3 -однонитевыми участками теломер: одни - специфично, км XTEF у Xenopus (de Lange, 1996), другие - не специфично - л амины А, В, С, внментнн и иуклеолии у млекопитающих a MF3 у птиц (de Lange, 1996).

Поманю собственно теломерных концевых повторов концы эукарнотических хромосом представлены мозаикой высоковариабельных повторяющихся последовательностей, расположенных в субтеломерных районах хромосом. Эти последовательности включают в себя как открытые рамки считывания, так и некодирующяе последовательности. Субтеломерные районы хорошо изучены на дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Сравнение концевых последовательностей хромосом человека и дрожжей продемонстрировало консерватизм структуры в целом (Flint et al, 1997).

У многих видов теломераые последовательности встречаются не только на концах хромосом, но могут ten расположены я во внутренних областях хромосомы. Например, у китайского хомячка (Cricetuhia griseus) в геноме имеется 18 районов теломерных повтороввнутри хромосом. Они расположены перицентромерно. по длине значительно превосходя теломерные повторы на концах хромосом (Slijpcevic, Hande. 1999) Хотя обычно внутренние теломерные повторы локализованы в перицентромерных областях (Slijpcevic. Hande. 1*99. Meyne et. al. 1990, de la Sena et at., 1995), в некоторых случаях они локализуются в областях ядрышкового организатора или около него (Meyne et. al. 1990. Salvadori et. al. 1995. Abuin et. at., 1996, Liu, Fredga. 1999). Происхождение и функции внутренних повторов неясны. Наиболее распространено мнение, что их появление связано с хромосомными перестройками и поэтому отражает эволюцию кариотипа (Ijdo et. al. 1991. Vermeesch et. al. 1996)Длина теломер широко варьирует у различных организмов. У человека она составляет 10-15 т.п.о. (de Lange et al, 1990), у мышей длина теломер различна у разных видов у вида Mus musculus она примерно равна 50 т.п.о., в то время как у вида Mus spretus - около 5 т п о (de Lange, 1996).

ДНК теломерногс повтора ассоциирована с ядерным матриксом (de Lange, 1992, Balajee et al, 1996). Теломерный хроматин гетерохроматизирован, а его ДНК является позднореплицируюшейся (Raghuraman et al, 1997).

Теломеры иного строения имеет Drosophila melanogaster - они не имеют коротких тандемных повторов, а состоят из нескольких тандемно организованных элементов двух типов (ретротранспозонов, относящихся к типу LINE) TART (Telomere Associated Retrotransposon) и HeT - A (Levis et al, 1993).

3.2. Функции теломер.

Теломеры играют важную роль в жизнедеятельности клетки1) Теломеры выполняют защитную функцию они кэпируют концы линейных эукариотических хромосом и стабилизируют их Когда хромосома разорвана или лишена полноценной теломеры безтеломерные концы хромосом претерпевают тибо слияние, либо деградацию (McChntock. 1941) Клетки реагируют на разорванные хромосомы или на укороченные теломеры как на поврежденную ДНК (McEachem, Blackburn. 1996. ^.adell. Zakian, 1993). Таким образом, теломеры защищают концы хромосом от деградации, слияния и рекомбинационных процессов (McClintock, 1941, Zakian, 1989. Counter et al, 1992)2) Теломеры участвуют в процессе старения, связанном с проблемой недорепликации У большинства прокариотических организмов не существует проблемы недорепликации, т к их хромосомы кольцевые. Эукариоты выработали новое решение проблемы концевой недорепликации, при котором специализированные концевые структуры хромосом -теломеры - содержат повторы, некоторые из которых теряются при каждом циклерепликации. Потеря этих последовательностей, а которых нет информации, содержащейся в генах, расположенных ниже, работает как буфер, защищающий эти гены от потери при каждой репликации ДНК.

В соответствии с теломерной теорией старения остановка клеточного цикла происходит, когда одна или несколько теломер становятся короче критического размера (Оловников, 1971, Harley, 1991, Harley et al., 1992). Это индуцирует процесс клеточного старения. Таким образом, длина теломер может служить мерой пролиферативного потенциала, т.е. теломеры могут играть роль "молекулярных часов" клетки (Оловников. 1971, Allsopp et al, 1992, Harley, 1991). Справедливость этого подтверждается следующими данными.

Харли и др. (Harley et al. 1990) обнаружили, что средняя длина теломер снижается в ходе пассирований клонов нормальных диплоидных фибробластов человека. Это снижение достигает в среднем 50 пар оснований на каждое УП (Levy et al. 1992).

Оллсопп с соавт. (Allsopp et al, 1992) проанализировали культуры нормальных фибробластов человека (от 31 донора в возрасте 0-93 лет) и выявили корреляцию между пролиферативной способностью клеток и начальной длиной теломер во всем диапазоне возрастов. Так, клеточные штаммы с более короткими теломерами выполняли гораздо меньше удвоений популяции по сравнению со штаммами, имевшими более длинные теломеры. Фибробласты больных прогерией Хатчинсона - Гилфорда имеют короткие теломеры, что соответствует их сниженному потенциалу делений in vitroУкорочение теломер наблюдаемое при старении нормальных фибробластов человека, также происходит in vivo в клетках эпидермиса кожи (Lindsey et ai, 1991). лейкоцитах периферической крови и в эпителии слизистой оболочки толстой кишки (Allsopp et al, 1992) Было также установлено, что теломеры в клетках половой линии остаются стабильными при старении донора (Harley et al, 1992)Предложено несколько гипотетических моделей, объясняющих каким образом клетка "определяет" длину своих теломер и в определенный момент запускает механизм блока пролиферацииСогласно одной модели, определяется общее количество TTAGGG повторов благодаря учету специфически связывающегося с ними белка (Kilian et al. 1995)В двух других моделях, предложенных Райтом и Шеем (Wright. Shay. 1992а). главная роль отводится гетерохроматину Первая модель исходит из того, что длинные теломеры молодых клеток находятся в области гетерохроматина Предполагается, что ген, супрессирующий программу клеточного старения, локализован в субтеломерном районе ПоijJmaimpwl ДНК.Own'—in в эту область ни lу пресса pa пр-лаг к сто иаакп—ам ■ яру мала»«ал кие пиши» старима (Wrifht, Shy, 1992а) (рас. 7А).района, а нгирм мщрка гм - mi—nip кмгочного старении, напрямую тмлслт от р—pa на—щ в мм—я клетках теломеры дяаниые я гаи - м i—юр рапрапг арп— По вш «мммлм телом» область гаателомеваого гяиюмюмиш умеаыааетса и гаи — BBiHMinp лачииит работать и запускает клеточное старание (Wright, Shay, 1992а) (рас. 7Б).

Рае. 7: Дм модем эапусм клеточного иареиия при утрачивании теломер: А - модель, яра—мгавм— иаяичне а субтеломераом районе гена - супрессора клеточного старенна; В - модель, предволагакхим наличие в субтеломерном районе гена - акшмюра клеточного аареина (согласно Wright, Shay, 1992а).

3) Наличием теломер обусловлен теломерный эффект положения, который описан у дрожжей вида S. cerevisiae и у человека. В искусственных хромосомах дрожжей, где генетический маркер расположен в непосредственной близости от теломерных последовательностей и фланкирован сайленсерами, наблюдается геломерный эффект положения, который выражается в транскрипционной репрессии маркерного гена (Gottachling et al, 1990, Apwicio et al, 1991).

До исяавнего времени теломерный эффект положения не был известен для клеток человека. В 2001 году появилась работа Баура с соавт. (Ваш- et al., 2001), в которойрепортерный геи люциферазы был введен в человеческие клетки линии HeLa в непосредственной близости от вновь синтезированного теломерного повтора. В таких клетках наблюдалось десятикратное уменьшение экспрессии люииферазного гена по сравнению с контрольными клетками, в которых геи люциферазы встроился случайным образом. При экспериментальном удлинении теломер экспрессия люциферазы дополнительно снижалась в 10 раз. Репортерные гены, расположенные внутри хромосомы, при этом не меняли своей активности.

4. Теломераэа.(ДНК - нуклеотидилэкзотрансфераза, КФ 2.7.7.31)Молекулярная основа репликации теломер прояснилась в 1985 году, когда Грейдер и Блэкберн открыли фермент - терминальную дезоксинуклеотидилэкзотрансферазу или теломеразу в клетках Tetrahymena thermophila (Greider, Blackburn, 1985). Было обнаружено, что in vitro в присутствии dNTP клеточный экстракт Т. thermophila способен удлинять олигонуклеотид d(TTGGGG)4, использованный в качестве аналога G - богатой цепи теломеры. Таким образом, теломераза - это фермент, достраивающий свободные 3'-концы хромосом короткими повторяющимися последовательностями (Morin. 1989).

Было показано, что теломераза является рибонуклеопротеиновым ферментом, состоящим из РНК и белка (Greider, Blackburn, 1987, 1989). По механизму своего действия теломераза представляет собой обратную транскриптазу, т.к. использует РНК-матрицу для синтеза ДНК (Greider. Blackburn, 1989).

Теломеразы обнаружены в большинстве исследованных видов эукариот, имеющих линейные хромосомы. В 1997 году были клонированы гены РНК - компонента теломеразы (Feng et al, 1995) и ген каталитической белковой субъединицы теломеразы человека (Nakamura et al, 1997, Meyerson et al, 1997). В конце этого же года удалось реконструировать теломеразную активность в лизате клеток. Оказалось, что для этого достаточно присутствия двух компонентов: каталитического компонента теломеразы (hTERT) и РНК-компонента (hTR) (Weinrich et. al., 1997).

В соответствии с теорией Оловникова теломеразная активность (ТАК) должна присутствовать в клетках половой линии и в раковых клетках. Действительно, теломераза активна в половых и стволовых клетках, но неактивна в большинстве соматических клеток (Harley, 1991, Harley et. al., 1990). На определенной стадии развития, приходящейся на ранний эмбриогенез, происходит выключение гена теломеразы в подавляющем большинствесоматических клеток челоаека. Выключение теломеразного гена есть этап онтогенеза, совершающийся в определенный момент жизни организма и не во всех типах клеток. В большинстве соматических клеток человека ТАК не детектируется. Можно считать установленным, что репрессия теломеразы ответственна за старение нормальных соматических клеток в культуре ("предел Хейфлика"). ТАК была обнаружена в некоторых соматических клетках, например в нормальных стволовых клетках костного мозга, лейкоцитах периферической крови, в Т - и В - лимфоцитах (Zhang et al. 1996. Weng et al. 1996, Igarashi, Sakaguchi. 1996). в семенниках, эпидермисе кожи и эпидермисе шейки матки (Pao et al, 1997, Kyo et al, 1997), в клетках нижней части крипт толстой кишки (Kuniyasu et al. 1997), клетках эндометрия матки (Kyo et al, 1997, Saito et al. 1997). Все эти ткани имеют высокие темпы обновления. Важно отметить, что ТАК в пересчете на одну клетку в этих нормальных популяциях существенно ниже, чем в популяциях раковых клеток (Wright et al. 1996а). Теломеразная активность детектируется у многих иммортальных клеточных культур (например, ТАК была обнаружена в экстрактах опухолевых иммортальных клеток человека линии HeLa (Morin, 1989)) и в других культурах опухолевых клеток - ТАК есть в 85% опухолевых клеток (Kim et. al., 1994). Кроме того, оказалось, что в большинстве раковых клеток теломеры довольно короткие, а уровень ТАК достаточно высок (Harley et al, 1990, Harley, 1991, Counter et al, 1992, Vaziri et al, 1994). Выяснено, что длина теломерных последовательностей в опухолевых клетках обычно меньше той. которая имеет место в клетках тех тканей, из которых они возникли (Counter et. al., 1992, Shay. Wright, 1996, Hastie et al, 1990).

4.1. РНК - компонент теломеразы.

К настоящему времени клонировано порядка 40 генов теломеразных РНК из инфузорий (McCormick - Graham, Romero, 1995), дрожжей S. cerevisiae (Singer. Gottschling, 1994). мыши (Blasco et al, 1995), человека (Feng et al, 1995) и других позвоночных (Chen et al, 2000) Известно, что РНК - компонент теломеразы экспрессируется в большинстве клеток человека независимо о- - теломеразной активности (Feng et.al., 1995, Avilion et. al, 1996).

РНК-компонент теломераз содержит короткий район (матрицу), комплиментарный теломерной последовательности G-богатой цепи ДНК (Blasco et. al., 1995) Матричный район теломеразной РНК диктует последовательность теломерных нуклеотидов (Singer. Gottschling, 1994, Yu et al, 1990). Интересно заметить, что матричный участок в мышиной РНК составляет 8 нуклеотидов, а в РНК человека - 11 нуклеотидов. несмотря на то. что обе РНКиодируют одну ■ ту же последовательность. Таким образом, матрица длиннее, чем ода теломерный помор (BImoo el. aL, 1995).

РНК из равных организмов довольно сильно различаются как по первичной структуре, так и оо дянне. Даже у таких эоолюционно близких видов как мышь и человек гомологияаыоока на уровне вторичной структуры (Romero, Blackburn, 1991). Хорошо изучены вторичные структуры тежиееризных РНК простейших (в основном, тетрахнмен) и позвоночных (Romero, Blackburn, 1991; Chen et aL, 2000). На основе сравнительногомоделирования укладки жыпнуклеотндной цепи этих теямцмяш РНК была предложена модель втричиой структуры теломеразной РНК и построена схема их эволюции (Chen et aL, 2000) (рис. 8). Основными элементами этой структуры являются несколько шпилек и довольно протяженный одноцепочечный участок, содержащий матрицу для синтеза теломсрной ДНК. Специфичные для позвоночных элементы вторичной структуры заштрихованы на ряс. 8. Мутации в матричной части теломеразных РНК приводят к синтезу соответственно измененных последовательностей теломерных повторов in vivo (Yu et al, 1990, McEachem, Blackburn, 1995).

Рис. 8: Сравнение вторичной структуры теломеразных РНК простейших и позвоночных. Возможные пути эволюции теломеразных РНК (согласно Chen et aL, 2000).(фшюгаитнчвеюго)иуклеотндных последовательностей н компьютерного4.2. Твломсразиые белки.

Первой была исследована теломераза Tetrahymena thcrmophila. В ее состав входят РНК, белок р80 и белок р95 в соотношении 1:1:1 (Collins et al. 1995). Белок р95 взаимодействует с теломерным праймером, т.к. имеет уникальный "якорный" сайт. Белок р80 ассоциирован с РНК-матрицей и, возможно, является каталитически активным (Collins et al, 1995).

Основным способом обнаружения теломеразных белков является поиск гомологии с известным белковым компонентом теломеразы из другого организма. Так были найдены гены млекопитающих (это гены каталитических субъединиц млекопитающих - TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) (Ишикава, 1997) и обнаружены теломеразные белки крысы TLP1 (Telomerase Protein 1) (Nakayama et al, 1997), человека и мыши ТР1 (Harrington et ai,1997), причем у мыши продукт гена ТР1 связан с матричной РНК теломеразы.

Введение каталитического компонента теломеразы (TERT) в клетки человека стало важным этапом в изучении теломеразы. Уже давно было известно, что РНК-компонент теломеразы экспрессируется в большинстве клеток человека независимо от наличия теломеразной активности (Feng et. al., 1995, Avilion et. al., 1996). После трансфекции клеток человека геном TERT в них появлялась теломеразная активность (Bodnar et. al., 1998, Vaziri, Benchimol, 1998). Эктопическая теломеразная активность обладала способностью поддерживать длину теломер, и как следствие этого, пролиферация первичных клеток человека перестала угасать со временем, и клетки стали иммортальными. Опыты, проведенные другими группами ученых, подтвердили эти результаты (Nakayama et. al.

1998). Следует отметить, что в результате введения гена каталитического компонента теломеразы клетки не приобретают никаких признаков злокачественной трансформации (независимость роста от прикрепления к субстрату, от наличия сыворотки, от клеточной плотности, способности к росту в полужидком агаре), а кариотип клеток остается стабильным, как и в обычных культурах диплоидных фибробластов человека (Jiang et. al., 1999, Morales et. al., 1999).

Теломераза способна не только поддерживать размер предсуществующего теломерного повтора, но и синтезировать теломеры de novo. Три примера, подтверждающие этоУ простейшего Euplotes crassus во время реорганизации генома образуется 107 линейных молекул ДНК, фланкированных теломерными последовательностями. При этом теломераза Euplotes crassus соединяется с дополнительной субъединицей, которая обеспечизает процессивность работы фермента на любых праймерах (Bednenko et. al., 1997). В других фазах роста теломераза Euplotes неспособна эффективно удлинять нетеломерные праймеры.

Днминуция хроматина у нематоды Ascaris suum сопровождается образованием теломер de novo. При этом теломераза наращивает теломеры на 3'-концах, имеющих ограниченную гомологию с теломерным повтором: для образования новой теломеры достаточно совпадения трех последних нуклеотидов (Magnenat et. al. 1999).

Описано появление нормально функционирующих теломер de novo у человека. В ряде случаев а-талассемии происходит разрыв а-глобинового гена, расположенного на конце малого плеча хромосомы 16. При этом последовательность гена а-глобина непосредственно переходит в теломерную последовательность без образования каких-то промежуточных субтеломерных последовательностей. Для образования такой теломеры требуется ограниченная гомология на З'-коние в области разрыва (3-4 нуклеотида) (Flint et. al. 1994).

4 J. Работа теломеразы.

Механизм работы теломеразы - это повторное копирование матрицы, включающее этап связывания фермента с теломерной ДНК. этап элонгации, когда дезоксирибонуклеотиды последовательно добавляются к 3'-концу G-богатой цепи теломеры и этапа транслокации фермента на конец новообразованной цепи (рис. 9) (Harley et. al., 1994).

В начале происходит связывание 3' - одноцепочечного конца хромосомы с теломеразой, при этом 3' - конец располагается вдоль РНК - матрицы теломеразы, в то время как лежащая ниже последовательность праймера связывается с "якорным" сайтом фермента, затем осуществляется РНК - зависимый синтез ДНК. после чего происходит транслокация, т.е. перемещение ДНК, удлиненной на один повтор, относительно фермента. Связывание праймера с "якорным" сайтом фермента предотвращает диссоциацию в процессе транслокации и позволяет провести следующий цикл полимеризации (Greider, Blackburn, 1996). Впоследствии комплиментарная С - цепь образуется с помощью ДНК -ро1а/праймазы, которая образует РНК - затравку, удлиняемую ДНК - pola (Sancar, 1996. Wood, 1996) (рис. 9).

9t Маивниия япм тмомср позвоночных (согласно Harky et. al., 1994).

Связывание теломеры (а)Хромосома■GGGTTAGТеломеразнаяAUCCCAAUC —^РНКЭлонгация (О)-GGGTTAGOGTTAG5' AUCCCAAUCТранслокация (в)• GGGTTAG <?GTTA<? 5 ,---AUCCCAAUC4.4. Меганита образования 3* - одвоценочсчного фрагмента.

Предложено два механизма образования 3' - конца: первый из них обусловлен недорешшкацией отстающей цепи ДНК и возможной достройкой при помощи теломеразы (последнее происходит только в клетках, обладающих теломеразной активностью); второй предполагает наличие активности экзонуклеазы, удаляющей часть ДНК с 5'-конца С-цепн теломеры, образованной на лидирующей цепи ДНК (Прайс, 1997; Bailey et al., 2001).

4.5. Экзонуклеазная активность тсломераз.

Для некоторых теломераз показана экзонуклеазная активность, которая позволяет теломеразам пцролиэовять как праймеры, так и продукты ферментативного синтеза. Впервые экзонуклеазная активность была продемонстрирована in vitro для теломеразы Tetrahymena thermophila (Collins, Greider, 1993), которая удаляла 3' - концевой луклеотидиый остаток праймера. Экзонуклеазная активность показана также для теломеразы дрожжей S. cerevisiae, которая может удалять с 3' - конца праймера до 8 и.о. (Cohn, Blackburn, 1995). Внастоящее время не известно, обладают ли теломеразы высших эукариот экзонуклеазной активностью.

4.6. Альтернативные механизмы поддержании длины теломер.

Некоторые линии клеток человека, иммортализованные in vitro, а также около 15% опухолей человека, не имеют ТАК (Rogan et ai. 1995, Mumane et al. 1994). В таких клетках работают альтернативные механизмы поддержания длины теломер. так называемые ALT (Alternative Mechanisms for Lengthening of Telomeres) (Bryan et al. 1995). Характерными признаками наличия ALT считаются:Во-первых, гетерогенность по длине теломер: встречаются как очень короткие, так и очень длинные теломеры (до 50 т.п.о.) (Bryan et al, 1995). В одной из работ (Murnane et. al., 1994) удалось проследить за изменениями длины отдельной теломеры. При трансфекции иммортальных клеток человека плазмида случайно встроилась очень близко к теломерному повтору, что позволило использовать длину рестрикционного фрагмента, содержащего плазмиду, как меру длины теломерного повтора. При дальнейшем культивировании этих клеток, которые не обладали ТАК, наряду с постепенными изменениями длины теломеры, которые соответствовали процессу недорепликации а различных клеточных субклонах наблюдали более редкие события, когда длина теломеры одномоментно менялась на несколько тысяч пар оснований. Полагают, что эти изменения могут возникать вследствие нереципроктной рекомбинации (Mumane et. al., 1994, Wang, Zakian, 1990).

Во-вторых, наличие специализированных ядерных структур, называемых PML тельцами (PML bodies) (Yeager et al., 1999), которые состоят из теломерной ДНК, теломерсвязывающих белков, белков, вовлеченных в рекомбинацию и репликацию, а также PML белка (Marciniak et al., 2001; Reddel et al., 2001). Следует отметить, что PML телец нет в нормальных клетках и в иммортальных клетках с активной теломеразой (Reddel et al. 2001).

На сегодняшний день предложено два основных механизма ALT рекомбинация и ретротранспозиция, но вероятно есть и другие.

Рекомбинации. В отсутствие теломеразы теломеры могут удлиняться посредством;1) рекомбинации укороченной теломеры с экстрахромосомной кольцевой теломерной ДНК при помощи генной конверсии по принципу катящегося кольца и дальнейшим переносом удлиненной теломеры на концы других хромосом также при помощи генной конверсии. Такой тип рекомбинации наблюдается у дрожжей К. lactis (McEachern et al. 2001).

2) межтеломерной гомологичной рекомбинации. С помощью этого типа рекомбинации удлиняют саон теломеры дрожжи S. cerevisiae и клетки человека (Reddel et al. 2001; Naylor et al. 2001: Louis et al. 2001; Marciniak et al. 2001).

3) внутрителомерной рекомбинации с образованием теломерной петли (t-loop) (см. рис 6). когда рекомбинация происходит либо с внутренними участками теломерной ДНК (если теломера достаточно длинная), либо с участками прителомерной ДНК (если теломера короткая). Такой способ найден у дрожжей S. cerevisiae и клеток человека (Reddel et al. 2001; Varley et al. 2001).

Ретротраиспозиция. Ретротраиспоэониое удлинение теломер найдено у Drosophila melanogaster и родственных двукрылых насекомых (теломеры достраиваются двумя ретротранспозонами. НеТ - А и TART) (Mason, Biessmann, 1995. Pardue et al, 19%), у двух представителей рода Chironomus (Kamnert et al., 1998), у лука (Allium сера) и некоторых лилейных (Pich, Schubert, 1998), а также у Aloe.

4.7. Ингибиторы обратных траискриптаз нуклеотидной природы.

Ингибиторы обратных траискриптаз, такие как З'-азидо.З'-дезокситимидин (AZT), карбовир и 2', 3' -дидезоксицитидин (ddC) - химически синтезированные аналоги природных нуклеозидов тимидина, гуанозина и цитидина (рис. 10). Известно, что AZT. карбовир и ddC превращаются в клетках млекопитающих и человека в соответствующие 5'-трифосфаты и терминируют синтез нуклеиновых кислот, который осуществляют полимеразы, т.к. они вступают в конкуренцию с нормальными нуклеотидами (Краевский. 1992, 1994). Из-за отсутствия ОН-группы в 3'-положении у этих ингибиторов синтез ДНК после присоединения терминирующих нуклеотидов не может продолжиться.

Рис. 10: 3'-азидо,3'-дезокситимидин (AZT), карбовир и 2'.3'-дидезоксицитидин (ddC)AZTN.

НОcarbovtrddCS. Пролиферация клеток различных аилоа в культуре.

5.1. Морфологические стадии старении фибробластов в культуре.

В культурах кожных фибробластов человека наблюдаются возрастные изменения частот встречаемости различных типов фибробластов: в культурах, полученных из кожи доноров в возрасте 7 и 37 лет, присутствует 80-90% митотических и 10-20% постмитотических фибробластов. У доноров старших возрастов соотношение митотических и постмитотических фибробластов следующее: 57 лет - 70-90% и 10-30%, 87 лет - 40% и 60%, 95 лет - 14% и 86% соответственно (Bayreuther et al, 1988)Wm lit Мврфвмщ'иит стадии стярниш фиброб—став чаломка в культуре (согласно Поймам* 4 1991)/# ♦• щI MFIIMFIII1PMFIV —PMFVPMFVIАналогичные результаты были получены для культур кожных и легочных фибробластов крыс BN различного возраста (Mollenhauer, Bayreuther, 1986) Эти данные показывают, что у обоих видов (человек и крыса) частоты встречаемости способных к обновлению митотически делящихся фибробластов, значительно снижаются с возрастом доноров, но полного истощения популяции этих клеток не происходит Таким образом,■ним мпнпммнва оашмяшш i—и» Мм&шм шляются #упшмс1 возраста шпрХВаупмИнг «I al, 19M).

Имея», «по клепш чаяоаааа чремичайао редко претерпевают спонтанную траасформвнаю а культуре. Следовательно, в ш должны существовать надежные мепинпмы яожршм клеточной яролнферамм. В фнбробластвх чеяонака обавруимаы дмОармрами на цу га кнмап|намм|ан Первое из этих состояний ТОП - собственно старение, которое было шуап Хэвфлшюм (позднее это состояние было паивал Ml - Mortality State 1) (WriglH et al, 1909, Slay et. aL, 1993). Пеноторые нсямнне исследования показала, что полни утрата фунищш р53 н pRb позаолает временно избежать старения и проделать дооолшгелыю ограниченное число УП (для фибробластов человека - около 30-40 УП) до вступлении клеток в оостоанне кризиса (позднее это состояние было названо М2 - Mortality Stafe 2) (Wright et al, 1919, Shay et. aL, 1993). Выход нз этого состояния всегда связан с активацией механизмов поддержания длины теломер (Дункан, Реддел, 1997) (Рис. 12).

Рве. 12: Дм оостоаини ТОП в клетках человека и связанные с ними изменения длины теломер и состояния теломеразы.

М1—длинателомер старениес.«««.«.*.«.«.«нормальный рост клеток5.3. Старшим, или Ml.

Старение фибробластов человека в культуре было подробно описано Хейфлнком и Мурхедом (Haytlick. Moorhead. 1961). Один из возможных механизмов запуска процессов старения - это путь, опосредованный белком р53 Активация транскрипции белка р53 н увеличение его ДНК - связывающей активности происходят в ответ на повреждение ДНК Существует гипотеза, согласно которой короткие теломеры могут восприниматься клеткой как поврежденная ДНК (Levy et. ai. 1992). Механизм Ml запускается когда длина теломер достигает определенного минимума, но задолго до полного физического исчерпания теломер (длина теломер при этом составляет несколько тысяч нуклеотидов (Shay et. al, 1993). Р53, в свою очередь, индуцирует экспрессию белка p2iSDII/WAFI/c,pl (El-Deiry et al. 1993). P21 связывается с различными комплексами циклинзависимых киназ (Cdk) с циклинами и тормозит их активность, препятствуя реакциям фосфорилирования (в том числе фосфорнлироваиия pRb), необходимым для нормального хода клеточного цикла (Harper et al, 1993). Р21 может блокировать клетки на стадии G1 В клетках потерявших функцию р53, продолжается укорочение теломер, и клетки дополнительно проходят определенное число УП (порядка 30).

В остановке клеточной пролиферации участвуют также белки pRb и pl6INk4 PRb участвует в регуляции клеточного цикла на протяжении всей жизни нормальных клеток. Во время фазы G1 клеточного цикла pRb недофосфорилирован. В этом состоянии он связывается с представителями семейства транскрипционных факторов E2F/DP и предотвращает экспрессию генов белков, необходимых в S - фазе (Lodish et al, 1995) Фосфорилирование pRb осуществляется комплексами циклин D-Cdk4 или циклин D-Cdk6 по мере приближения клеток к границе G1/S В результате этого фосфорилирования pRb диссоциирует от E2F/DP и разрешает прохождение через S - фазу (рис 13) (Nevtns, 1992, Dyson, 1994) В пролиферируюших клетках млекопитающих pRb дефосфорилируется в конце митоза и фосфорилируется в поздней G1 -фазеИнгибитор клеточного цикла pl6INM. экспрессия которого повышена в стареющих клетках (Нага et al, 1996, Reznikoff et al, 1996), связывается с Cdk4 и Cdk6 в конкуренции с циклином D, тем самым подавляя киназную активность этих Cdk. а значит и фосфорилирование pRb (Serrano et al, 1993, Tam et al, 1994)Другой возможный механизм запуска Ml связан с изменением экспрессии регуляторных генов, расположенных в субтеломерном гетерохроматине, при укорочении теломер (Wright, Shay, 1992а)Яш. lit Рои» фщфмрняированив^ифпгфпряяиривиииа белка Rb • регуляши пареном Ol-SПос^е потери функций р53 и/или pRb клетки продолжают делиться, и следовательно, терять теломерные повторы, но это продолжается не бесконечно. Клетки приходят к состоянию "кризиса", которьЛ выражается в массовой гибели клеток, хотя клетки продолжают делиться.

Состояние "кризиса" было описано в 1965 году в результате исследований эффектов обезьяньего пруса 40 (SV40) на фибробласты человека (Girardi et al, 1965). Нормальные клетки человеческого организма редко претерпевают (или никогда не претерпевают) спонтанную иммортализашпо in vitro. Однако иммортализацию клеток человека можно надежно, хотя и с очень низкой частотой, вызвать онкогенными ДНК-вирусами, например SV40, вирусом папилломы человека типа 16, а также аденовирусом типа 5 (Wright, Shay, 1992b). Имморталнзация клеток человека под действием SV40 протекает в две стадии. Первая стадия - временное удлинение пролиферации: после введения в клетки сегмента ДНК, кодирующего ранит белки вируса SV40 (в том числе большой Т-аитигеи, который связывает р53 и pRb), нормальные клетки человека претерпевают морфологическую трансформацию и продолжительность их пролнферативной жизни повышается примерно на 20 - 40 УЛ. Затем зги клетки обычно приходят к состоянию "кризиса", при котором не происходит общего роста популяции. Вторая стадия - достижение неограниченного пролнферагтивиого потенциала: некоторые клетки могут выйти их состояния "кризиса" и стать имморталиэованными. Иммортшшзация - редкое событие, частота которого составляет3x10'7 - 5x10"* для клеток неломка, трансформированных SV40 (Wright and Shay, 1992b, Klein et.al. 1990). Полагают, что кризис вызывается чрезмерным укорачимнием теломер. приводящим к их физическому исчезновению (Shay et. al., 1993. Wright. Shay. 1996b). Клегки пережившие "кризис" и ставшие иммортализоаанными, всегда активируют механизмы поддержания длины теломер: в большинстве случаев происходит активация теломеразы, в меньшинстве - активируются ALT - механизмы.

5.5. Клетки мыии в культуре.

Фибробласты челомка и мыши обладают существенными различиями, как в пролиферативиом потенциале, так и в способности к спонтанной трансформации.

В 1963 году Тодаро и Грин (Todaro, Green, 1963) опубликовали работу, в которой подробно описали образование клеточных линий из нормальных эмбриональных фибробластов мышей линии Swiss. В течение трех месяцев с момента инициации из 11 культур было получено 9 линий, что свидетельствует о высокой частоте трансформации клеток мышей. События в клеточной культуре развивались следующим образом. Вначале клетки интенсивно делились, хотя скорость роста культуры постепенно снижалась по мере пролиферации. Через 15-30 клеточных поколений (45 - 75 дней с момента инициации культур) скорость роста вновь возрастала - либо до изначального уровня, либо превосходила последний (рис. 14), после чего в течение 2-3 пересевов резко возрастала доля тетраплоидных и гетероплоидных клеток, а позднее появлялись клетки с метацентрическими хромосомами.

Существует дм группы линий мышей SAM: SAMP - Accelerated-Senescence Prone Mice- мыши, склоишк к ускоренному старению, и SAMR - Accelerated-Senescence Resistant Mice- мыши, резистентные к ускоренному старению. Группа линий SAMP включает в себя 9 линий (SAMP-1, 2, 3, б, 7, 8, 9, 10, И), а группа линий SAMR - 3 линии (SAMR-1, 4, 5) (TakedtetaJ, 1981,1991,1994, 1997а) (рис. 15).

Рас. 15: Получение линий SAM яа базе линии AKR/J (согласно Takeda et al, 1997).

1MIAKR/J—Скрмяшаа Р-3иисмп меткой Р-4линией (ями) Р-5\ R-1\ R-2

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Семенова, Ирина Валерьевна

Выводы.

1. Пролиферативный потенциал эмбриональных фибробластов японских ускоренно стареющих мышей линии SAMP-1 меньше такового эмбриональных фибробластов линии SAMR-1. который, в свою очередь, несколько меньше пролиферативного потенциала эмбриональных фибробластов линии СВА. Существует корреляция между пролиферативным потенциалом эмбриональных фибробластов мышей в культуре и средней продолжительностью жизни мышей соответствующих линии

2. Время переживания эмбриональных фибробластов мышей линий SAM в неделяшемся состоянии снижено по сравнению с таковым эмбриональных фибробластов мышей линии СВА и тис же, как и их пролиферативный потенциал, коррелирует со средней продолжительностью жизни животных соответствующих линий.

3. Старение эмбриональных фибробластов японских ускоренно стареющих мышей сопровождается ранним появлением в клетках активности эндогенной (З-галактозидазы (рН»6,0), параллельным снижением пролиферативного ответа на отдельные факторы роста и сыворотку и уменьшением уровня фосфорилирования тирозина.

4. Спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мыши в большинстве случаев сопровождается увеличением (появлением) теломеразной активности и приводит к появлению иммортальных клеток.

5. Спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мышей линии СВА в присутствии ингибиторов обратных транскриптаз ведет к появлению клонов спонтанных трансформантов, лишенных теломеразной активности Эти клетки обладают ограниченным пролиферативным потенциалом.

6. Средняя длина теломер в клетках мышей SAM больше, чем в клетках мышеи В \ Теломеры эмбриональных фибробластов SAMP-1 более гетерогенны по л^с ^м теломеры эмбриональных фибробластов SAMR-1 имеются как более коротки более длинные.

7. Предложен тест по изучению времени переживания состарившихся неделяшихся клеток. Этот тест, в особенности в сочетании с окислительным стрессом, может быть полезным при изучении механизмов старения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Семенова, Ирина Валерьевна, 2002 год

1. Abuin М., Martinez P., Sanchez L. Localization of repetitive telomeric sequence (TTAGGG)n in four salmonid species. 1996, Genome, v. 39. p. 1035-1038

2. Agarwai M.L., Taylor W.R., Chernov M.V. Chernova O.B. Stark G.R. The p53 network 1998, J. Biol. Chem., v. 273. p. 1-4.

3. Allsopp R.C., Chang E., Kashefi-Aazam M„ Rogaev E.I., Piatyszek M.A., Shay J.W., Harley

4. C.B. Telomere shortening is associated with cell division in vitro and in vivo. 1995, Exp. Cell Res., v. 220, p. 194-200.

5. Allsopp R.C., Vaziri H., Patterson C„ Goldstein S„ Youngla, E.V. Futcher A.B., Greider

6. C.W., Harley C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 89, p. 10114-10118.

7. Amundson S.A., Myers Т.О. Forn*e A.J., Jr. Roles for p53 m growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress. 1998, Oncogene, v. 17, p. 3287-3299

8. Aparicio O.M., Billington B.L., Gottschling D.E. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae 1991, Cell, v 66, p. 1279-141

9. Avilion A.A., Piatyszek M.A., Gupta J., Shay J.W. Bacchett, S. Greider С W Humantelomerase RNA and telomerase activity ,n immortal cell lines and tumor tissues. 1996, Cancer Res., v 56, p. 645-650.

10. Bailey S.M., Cornforth M.N., Kunmasa A., Chen D.J. Goodwin E.H. Strand specific postreplicative processing of mammalian telomeres. 2001, Science, v 293, p. 2462-2465.

11. Bakalkin G„ Yakovieva Т., Selivanova G„ Magnusson K.P., Szekely L„ Kiseleva E„ Klein G Terenius L„ Wiman K.G. p53 binds single stranded DNA ends and catalyzes DNA renaturation and strand transfer. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v 91. p 413-417

12. Balajee A.S. Dominguez I., Bohr V.A., Natarajan A.T Immunofluorescent analys.s of the organization of telomeric DNA sequences and their .revolvement m chromosomal aberrations m hamster cells. 1996, Mutat. Res., v. 372, p 163-172

13. Bauer E.A., Silverman N. Busiek D.F., Kronberger A., Deuel T.F Diminished response of

14. Werner's syndrome fibroblasts to growth factors PDGF and FGF. 1986. Science v 234 p 1240-.1243.

15. Baur J.A., Zou Y„ Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect ,n human cells. 2001, Science, v. 292, p. 2075-2077.

16. Bayreuther К., Rodemann H.P. Hommel R„ Dittmann K. Albiez M. Francz P I. Human skin fibroblasts in vitro differentiation along a terminal cell lineage 1988. Proc Nad Acad Sci (USA), v. 85, p. 5112-5116.

17. Bednenko J. Melek M. Greene E.C. Shippen D.E. Developmental!) regulated m.tiution of

18. DNA synthesis by telomerase: evidence for factor-ass.sted de novo telomere formation. 1997 The EMBO Journal, v. 16. p. 2507-2518.

19. Blasco M.A. Funk W. Villeponteau В., Greider C.W Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA. 1995. Science, v 269. p. 1267-1270

20. Blasco M.A Lee H.W, Hande MP, Samper E., Lansdorp P M. uePinho R.A. Greider C.W.

21. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA 1997 Cell v. 91, p. 25-34.

22. Bodnar A.G., Ouellette M., Frolkis M„ Holt S.E. Chiu C P . Morin G.B., Harley C.B., Shay

23. J.W., Lichtsteiner S„ Wright W. E. Extension of life-span by mtroduction of telomerase into normal human cells. 1998, Science, v. 279, p. 349-352.

24. Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 1976, Anal. Biochem., v 72. p 248-254

25. Brown W.R.A., Mackinnon P J., ViUasante A., Spun- N. Buckle V J . Dobson M.J. Structure and polymorphism of human telomere associated DNA. 1990, Cell, v 63. p 119-132

26. Bryan TM., Englezou A., Gupta V, Bacchem S. Reddel R.R. Telomere elongation mimmortal human cells without detectable telomerase activity 1995. The EMBO Journal. V 14 p. 4240-4248.

27. Busk F.L. The Hutchinson-Gilford progeria syndrome. 1972, Pediatrics, v 80, p 697-724.

28. Carrel A. Artificial activation of the growth in v.tro of connective nssue 1913. J Exp. Medcine, v 17, p 14.19

29. Chen J L„ Blasco M.A. Greider С W Secondary structure of vertebrate telomerase RNA 2000. Cell, v. 100, p. 503-514.

30. Chernov D.N., Yegorov Y E„ Akimov S.S. Telomerase actmty of mouse cells as a result of spontaneous transformation. 1996, Doklady B.ochemisrtry. v 349. p 55- 57

31. Chowdary D.R., Dermody J.J., Jha K.K., Ozer H.L Accumulation of p53 .n a mutant ceil line defective in the ubiquitin pathway. 1994, Mol. Cell. Biol., v 14, p. 1997-2003

32. Cohn M„ Blackburn E.H. Telomerase in yeast. 1995, Science, v 269. p 396-400

33. Cristofalo V.J., Allen R.G., Pignolo R.J., Martin B.G. Beck J.C. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: A revaluation. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 95, p. 10614-10619.

34. Cristofalo V.J., Phillips P D. Sorger T, Gerhard G Alterations m the responsiveness of senescent cells to growth factors. 1989, J. Gerootol., v. 44, p. 55-62.

35. Cross S.H., AUshire R.C., McKay S.J., McGill N.I., Cooke H.J Cloning of human telomeres by complementation in yeast. 1989, Nature, v. 338, p 771-774

36. Curatolo L., Erba F., Morasca L. Culture conditions induce the appearance of immortalized C3H mouse cell tines. 1984, In Vitro, v 20, p. 597- 601

37. Dimri G.P., Campisi J Molecular and cell biology of replicative senescence 1994, Cold Spring Symp. Quant. Biol., v LIX, p 67-73

38. Dyson N. PRb, p 107 and the regulation of the E2F transcription factor 1994. J Cell Sci Suppl., v. 18, p. 81-87п. Egan S. Е., Weinberg R.A. The pathway to signal achievement. 1993. Nature v 365 n 7», 713, P '*

39. El-Dairy W.S. Tok.no Т. Veiculescu V.E., Levy D.B. Parsons R. Trent J.M. Lin D Merser W.E., Kinzler K.W. Vogelstein B. WAF1. a potential mediator of p53 tumor suppression1993, Cell, v. 75, p. 817-825.

40. Elledge S.T. Cell cycle checkpoints: preventing an identity cnsis. 1996. Sc.ence v ^74 B 1664-1672. ~ ' P

41. Fang F., Newport J.W. Evidence that the Gl-S and G2-M transitions are controlled by different cdc2 proteins in higher eukaryotes. 1991, Cell. v. 66, p. 731 -742

42. Feng J., Funk W.D., Wang S.S., Weinrich S.L., Avilion A.A., Chiu C.P., Adams R.R Chang E-, Allsopp R.S., Yu J., Le S„ West M.D., Harley C.B. Andreews W.H., Greider C.W

43. Villeponteau B. The RNA component of human telomerase. 1995, Sc.ence v 269 p 1236 1241.

44. Flint J., Bates G.P., Clark K. Dorman A., Willengham D . Roe B.A. Micktan G . Higgs D R.1.uis E.J. Sequence companson of human and yeast telomeres identifies structurally distinct subtelomeric domains. 1997, Hum. Mol. Genet., v 6, p 1305-1313

45. Flint J., Craddock C.F., Villegas A., Bentley D R., Williams H.J , Galanello R„ Cao A., Wood

46. W.G., Ayub H„ Higgs D.R. Healing of broken human chromosomes by the addition of telomeric repeats. 1994, Amer. J. Hum. Genetics, v 55. p 505-512

47. Giaccia A.J. Kastan M.B. The complexity of P53 modulation: emerging patterns from divergent signals. 1998, Genes. Dev .v. 12, p 2973-2983

48. Girardi A.J. Prevention of SV40 virus oncogenesis ,n hamsters. 1. Tumor resistance induced by human cells transformed by SV40. 1965, Proc Natl Acad Sc. (USA), v 54. p 445-451

49. Glotzer M., Murray A.W., Kirschner M.W. Cyclin is degraded b> the ub.quitin pathway 1991, Nature, v. 349, p. 132-138.

50. Goldstein S. Lifespan of cultured cells in progeria. 1969, Lanset. v 1, p 424

51. Gottschling D.E., Арапсю O.M., Billington B.L., Zakian V A. Position effect at S. cerevisne telomeres: Reversible repression of Pol II transcription. 1990, Cell, v 63, p. 751-762.

52. H. Greider C.W., Blackburn E.H. A telomeric sequence in RNA of Tetrahymena telomera.se required for telomere repeat synthesis. 1989, Nature, v. 337, p. 331 -337

53. HaffR.F., Swim H.E. Serial propagation of 3 strains of rabbit fibroblasts, their susceptibility to infection with Vaccinia virus. 1956, Proc Soc. Exp. Biol. Med., v. 93. p. 200-204.

54. Hamilton W.D. The moulding of senescence by natural selection. 1966, J. Theor. Biol., v. 12, p. 12-45.

55. Han H., Hurley L.H. G-quadruplex DNA: a potential target for anti-cancer drug design. 2000. TiPS, v. 21, p. 136-142.

56. Hande P., Slijepcevic P., Silver A., Bouffler S., van Buul P . Bryant P . Lansdorp P Elongated telomeres in scid mice. 1999, Genomics, v 56, p 221-223

57. Нага E., Smith R. Parry D„ Tahara H., Stone S. Peters G Regulation of pl6CDK2 expression and its implications for cell immortalization and senescence 1996. Viol Cell Biol. v 16, p. 859-867.

58. Harley C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb0 1991. Mutat. Res., v 256, p. 271-282.

59. Harley C.B., Futcher A.B., Greider C.W Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. 1990. Nature, v 345, p. 458-460.

60. Harley C.B., Goldstein S., Posner B.I., Guyda H Decreased sensitivity of old and progenic human fibroblasts to a preparation of factors with insulin actiuty 1981 J Clin Invest. \ 68. p. 988-994.

61. Harley C.B., Vaziri H., Counter C.M., Allsopp R.C The telomere hypothesis of cellular aging. 1992, Exp. Gerontol., v. 27, p. 375-382.

62. Harper J.W., Adami G.R., Wei N. Keyomersi K., El ledge S.J. The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of Gl cyclin-dependent kinases. 1993. Cell, v 75. p. 805-816.

63. Harrington L., McPhail Т. Mar V., Zhou W„ Oulton R. Bass M B. Arruda I. Robinson M.O. A mammalian telomerase-associated protein. 1997. Science, v 275. p. 973-977

64. Hartwell L. Introduction to cell cycle controls. 1995. In: Cell cycle control. Ed By Hutchison L., Glover D.M., Oxford University Press, p. 1-15.

65. Hastie N.D., Dempster M. Dunlop M.G. Thompson A.M. Green D.K. Allshire R.C. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. 1990. Nature, v 346. p. 866-868

66. Hayflick L. The limited in vitro life time of human diploid cell strains. 1965, Exp. Cell. Res., v. 37, p. 614-636.

67. Hayflick L., Moorhead P S. The serial cultivation of human diploid cell strains. 1961, Exp. Cell Res., v. 25, p. 585-621.

68. He P., Yasumoto K. Dietary butylated hydroxytoluene counteracts with paraquat to reduse the rate of hepatic DNA single strand breaks in senescence accelerated mice. 1994, Mech. Aging Dev., v 76, p. 43-48.

69. Henderson E.R., Blackburn E.H. An overhanging 3' terminus is a conserved feature ot telomeres. 1989, Mol. Cell. Biol., v. 9, p. 345-348

70. Higuchi K. Genetic characterization of senescence-accelerated mouse (SAM). 1997. Exp. Gerontol., v 32, p. 129-138.

71. Hosokawa M., Fujisawa H., Zhu B.H., Jujo H., Higuchi K. In vitro study of the mechanisms of senescence acceleration. 1997b. Exp Gerontol. v 32. p 197-203

72. Huffman K.E. Levene S.D . Tesmer V M., Shay J № . Wright W E Telomere shortening is proportional to the size of the G-nch telomeric 3'-overhang 2000. J Biol Chem . v 275. p 19719-19722.

73. Hunt T Cyclins and their partners: from a single idea to complicated reality 1991. Serin. Cell Biol., v 2, p. 213-222.

74. Hurley L.H., Wheelhouse R.T., Sun D , Kerwin S.M., Salazar M , Fedoroff О Y , Han F X., Han H., Izbicka E., Von Hoff D.D. G-quadruplexs as target for drug design. 2000, Pharmacol. Therapeut., v. 85, p. 141-158.

75. Ijdo J.W. Baldini A., Ward D C. Reeders S T. Wells R.A Origin of human chromosome 2: an ancestral telomere-telomere fusion. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v. 88. p. 90519055.

76. Jayaraman J., Prives C. Activation of p53 sequence specific DNA binding by short single strands of DNA requires the p53 С - terminus. 1995, Cell. v. 81, p. 1021-1029.

77. Johnson Т.Е., Genetic influences on aging. 1997. Exp. Gerontol., v. 32. p. 11-22.

78. Kamnert I., Nielsen L., Edstrom J.E. A concertedly evolving region in Chironomus. unique within the telomere. 1998, J. Mol. Evol., v. 46, p. 562-570

79. Kerwin S.M. G-quadruplex DNA as a target for drug design. 2000. Current Pharmaceutical Design, v. 6, p. 441-471.

80. Kilian A., Stiff C., Kleinhofs A. Barley telomeres shorten during differentiation but grow in callus culture. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v 92. p. 9555-9559

81. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley С В. West M.D. Ho P L.C. Coviello G.M. Wright W.E., Wewrich S.L., Shay J.W Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. 1994, Science, v. 266, p. 2011-2014

82. Kipling D., Cooke H.J. Hypervariable ultra-long telomeres in mice. 1990. Nature, v 347. p. 400-402.

83. Klein В., Pastink A., Odijk H., Westerveld A., van der Eb A.J. Transformation and immortalization of diploid Xeroderma pigmentosum fibroblasts. 1990, Exp. Cell Res., v. 191, p. 256-262.

84. Kuniyasu H., Domen Т., Hamamoto Т., Yokozaki H., Yasui W. Tahara H., Tahara E. Expression of human telomerase RNA in an early event of stomach carcinogenesis. 1997. Jpn. J. Cancer Res., v. 88, p. 103-107.

85. Kuroki Т., Huh N.H. Why are human cells resistant to malignant cell transformation in vitro? 1993, Jpn. J. Cancer Res., V. 84, p. 1091-1100.

86. Kyo S., Takakura M., Ishikawa H., Sasagawa T , Satake S . Tateno M . Inoue M Application of telomerase assay for the screening of cervical lesions. 1997. Cancer Res., v 57. p 18631867.

87. Lee S., Elenbaas В., Levine A. Griffith J. p53 and its 14 kDa С terminal domain recognize primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches. 1995. Cell, v 81. p. 10131020.

88. Lees E.M., Harlow E. Sequences within the conserved cvchn box of human cyclm A are sufficient for binding to and activation of cdc2 kinase 1993 Mol Cell Biol \ П p 11941201.

89. Levis R.W , Ganesan R, Houtchens К , Tolar L.A., Sheen F Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere. 1993, Cell, v 75, p. 1083-1093

90. Levy M.A., Allsopp R.C., Futcher А.В., Greider С W , Hartev С В Telomere end-replication problem and cell aging. 1992, J Mol. Biol., v 225, p. 951-960

91. Lindsey J., McGill N.I., Lindsey L.A., Green D.K., Cooke H.J In vivo loss of telomeric repeats with age in humans. 1991, Mutat. Res., v. 256, p. 45-48.

92. Liu W.S., Fredga K. Telomeric (TTAOOO)n sequences are associated with nucleous organizer regions (NORs) in the wood lemming. 1999, Chromosome Res., v. 7. p. 235-240.

93. Lodish H , Baltimore D . Berk A. Zipursky S.L. Matsudaira P. Darnell Z. Molecular cell biology. 199$, Scientific American Books Ink. New York.

94. Louis E.J., Maddison R.L., Pryde F.E., Hickson I.D Yeast telomeres without telomerase. 2001. In Telomeres A telomerase. Cold Spring Harbor Laboratory Press. N. Y. p. 185

95. Magnenat L., Tobler H., Muller F. Developmentally regulated telomerase activity is correlated with chromosomal healing during chromatin diminution in Ascaris suum. 1999. Mol Cell Biol., v. 19, p. 3457-3465.

96. Makarov V.L., Hirose Y., Langmore J.P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest а С strand degradation mechanism for telomere shortening. 1997. Cell, v 88, p. 657666.

97. Marciniak R.A., Johnson F.B., Guarente L. Type I ALT telomere maintenance in a human cell line. 2001, in Telomeres & telomerase. Cold Spring Harbor Laboratory Press. N Y . p 188

98. Martin G., Sprague C., Epstein C. Replicative life-span of cultivated human cells; effects of donor age, tissue and genotype. 1970, Lab. Invest., v 23, p. 86-92

99. Martin G.M. Genetic syndromes in man with potential relevance to the pathology of aging. 1978, Birth. Defects: Orig. Artie. Ser., v 14, p. 5-39

100. Mason J M., Biessmann H. The unusual telomers of Drosophila. 1995. Trends in Genetics, v. 11, p. 58-62.

101. Matsumura T, Zeyudo Z. Hayflick L Senescent human diploid cells m culture survival. DNA dynthesis and morphology 1979. J Gerontol, v 34, p 328-334

102. Maurer H.R. Towards chemically-defined, serum-free media for mammalian cells culture 1986, In: Animal cell culture. A practical approach. Ed. By Freshnev R I. IRL Press Limited, p. 13-31

103. McClintock В The stability of broken ends in zea mays 1941. Genetics, v 26, p 234-282

104. McCormick-Graham M., Romero D.P Ciliate telomerase RNA structural features 1995. Nucleic Acids Research, v 23, p. 1091 -1097

105. McEachem M.J., Blackburn H. Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. 1995, Nature, v 376, p. 403-409

106. McEachem M.J, Natarajan S, Iyer S DNA circles serve as effective templates for recombinational telomere elongation in K. Lactis. 2001, in Telomeres & telomerase. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N Y , p. 187

107. McEachern M.L., Blackburn E.H. Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase. 1996, Genes Dev. v. 10, p. 1822-1834.

108. Medawar P.B. The definition and measurement of senescence. 1955. In. Wolstenholme GEW. Cameron M.P., eds. Ciba Foundation cotloquia on aging. I. General aspects. London: Churchill, 4-15.

109. Mergny J.L., Mailliet P., Lavelle F, Riou J F. Laoui A. Helene С The development oftelomerase inhibitors: the G-quartet. 1999. Anti-Cancer Drug Design. \ 14. p 327-339

110. Meyne J., Ratliff R.L., Moyzis R.K. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v 36, p 7049-7053

111. Mittnacht S. Control of pRb phosphorylation. 1998. Curr Opm Genet Dev , v 8. p 21-27

112. Mollenhauer J., Batreuther K. Donor-age-related changes in the morphology growth potential and collagen biosynthesis in rat fibroblast subpopulations in vuro 1986. Differentiation, v 32 p. 165-172

113. Morales C.P , Holt S.E., Ouellette M„ Kaur K.J . Yan Y . Wilson К S . White M A , Wright WE., Shay J W Absence of cancer associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase. 1999, Nature Genet., v 21, p 115-118

114. Morgan DO Cyclin-dependent kinases, engines, clocks, and microprocessors 1997. Annu Rev Cell. Dev Biol., v 13, p. 261-291

115. Morgan D. О Principles of CDK regulation. 1995, Nature, v 374. p 131-134

116. Mori S., Kawano M., Kanzaki T , Monsaki N , Saito Y . Yoshida S Decreased expression of the platelet-derived growth factor beta-receptor in fibroblasts from a patient with Werner's syndrome. 1993, Eur J Clin Invest., v 23. p 161-165

117. Muggleton-Harris A.L., Hayflick L. Cellular aging studied by the reconstruction of replicating cells from nuclei and cytoplasms isolated from normal human diploid cells 1976. Exp Celt Res., v. 103. p. 321-330.

118. Mumane J.P. Sabatier L., Marder B.A. Morgan W F Telomere dynamics in an immortal human cell tine. 1994, The EMBO Journal, v. 13. p. 4953-4962.

119. Murray A.W. The genetics of cell cycle checkpoints. 1995. Curr. Opin. Genet. Dev . v 5. p. 511

120. Murray A.W., Kirschner M.W Dominoes and clock: the union of two views of cell cycle regulation. 1989, Science, v. 246, p. 614-621

121. Nakamura T.M. Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews WH. Lingner J., Harley C.B., Cech T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. 1997, Science, v. 277, p. 955-959.

122. Nakayama J., Tahara H, Tahara E., Saito M. to fC., Nakamura H . Nakanishi T. Ide T. Ishikawa F Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. 1998, Nature Genet., v 18, p. 65-68.

123. Nakayama J.I., Saito M., Nakamura H., Matsuura A. Ishikawa F TLP1 \ gene encoding a proteincomponent of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family 1997. Cell, v 88, p. 875-884

124. Naylor M.L., Malkova A., Signon L . Ira G . Haber J Break-induced replication m yeast correlation with ALT repair in mammalian cells. 2001, in Telomeres & telomerase. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N Y , p. 184

125. Nevms J.R. Transcriptional regulation. A closer look at E2F 1992. Nature, v 358. p 375-376

126. Niida H., Matsumoto T, Satoh H., Shiwa M., Tokutake Y . Furuichi Y . Shinkai Y Severe growth defect in mouse cells lacking the telomerase RNA component 1998. Nature Genet v 19, p 203-206

127. Nisitani S., Hosokawa M„ Sasaki M.S et. al Acceleration of chromosome aberrations in senescence-accelerated strains of mice. 1990, Mutat Res., v 237, p 221-228

128. Odagin Y , Uchida H. Hosokawa M., Takemoto К . Morlev A A Taleda T Accelerated accumulation of somatic mutations in the senescence accelerated mouse 1998. Nature Genet., v. 19, p. 116-117.

129. Ohno T. Strict relationship between dialysed serum concentration and cellular lifespan in vitro 1979, Meeh. Ageing Dev., v. 11. p. 179-183.

130. Oka Y . Shiota S., Nakai S., Nishida Y , Okubo S. Inverted terminal repeat sequence in the macronuctcar DNA of stylonychia pustulate. 1980, Gene, v. Ю. p. 301-306.

131. Otovnikov A.M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. 1973. .1 Theor. Biol., v. 41. p. 181-190.

132. Olovnikov A.M. Senescence is the result of shortening of "differotene" in telomere because of undeneplication and underrepair of DNA. 1992. Izvestia AN SSSR Seria Biologicheskaya. v. 4, p. 641-643

133. Pao C.C., Tseng C.J., Lin C.Y. Yang F.P., Hor J.J., Yao D.S. Hsueh S Differential expression of telomerase activity in human cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia lesion. 1997, J. Clin. Oncol., v .5, p. 1932-1937.

134. Pardue M.L., Danilevskaya O.N., Lowenhaupt K., Slot F. Traverse K.L. Drosophila telomeres: new views on chromosome evolution. 1996, Trends in Genetics, v. 12. p. 48-52.

135. Paris J., LeGuellec R„ Couturier A., LeGuellec K., Omilli F . Camonis J. MacNeill S. Philppe M. Cloning by differential screening of a Xenopus cDNA coding for a protein higly homologous to cdc2. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v 88. p. 1039-10ч3.

136. Petersen S., Saretzki G„ von Zglinicki T. Preferential accumulation of single-stranded regions in telomeres of human fibroblasts. 1998. Exp. Cell. Res., v 239. p. 152-160

137. Phillips P.D., Kaji K., Cristofalo V.J. Progressive loss of the proliferative response of senescing WI-38 cells to PDGF. EGF, insulin, transferrin and DEX 1984. J Gerontol, v 39. p. 11-17

138. Phillips P.D., Kuhnle E„ Cristofalo V J. EGF binding ability is stable throughout the replicative life-span of WI-38 cells. 1983, J. Cell Physiol., v 114. p 311-316.

139. Pich U., Schubert I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium сера. 1998, Chrom. Res., v 6, p. 315-321

140. Plisco A., Gilchrest B.A. Growth factor responsiveness of cultured human fibroblasts declines with age. 1983, J Gerontol., v 38, p 513-518

141. Prives C. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit 1998. Cell, v 95. p 5-8

142. Prudovsky I.A., Yegorov Y.E., Zelenin A.V DNA synthesis in the heterokanons of nondividing differentiated cells and culture cells with various proliferative potentials 1985, Cell Differentiation, v 17, p. 239- 246.

143. Raghuraman M.K., Brewer B.J., Fangman W L. Cell cycle-dependent establishment of a late replication program. 1997, Science, v. 276, p. 806-809

144. Raycrott L., Wu H.Y., Lozano G. Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants of the p53 anti-oncogene. 1990. Science, v. 249. p. 1049-1051

145. Reddel R.R. Dunham M.A. Fasching C.L. Neumann A.A. Yeager I R. Telomenc recombination in telomerase-negative immortalized human cells. 2001. in Telomeres & telomerase. Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. p. 189

146. Reed ML. Woelker В., Wang P., Wang Y„ Anderson M.E. Tegtmeyer P The С terminal domain of p53 recognizes DNA damaged by ionizing radiation. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 92, p. 9455-9459.

147. Riha K., McKnight T.D., Fajkus J., Vyskot В., Shippen D E. Analysis of the G-overhang structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. 2000. Plant Journal, v. 23, p. 633-641.

148. Rodeman H.P., Peterson H.P. Schwenke K., von Wangenheim K.H. Terminal differentiation of human fibroblasts is induced by radiation. 1991, Scanning Microscopy, v 5. p. 1135-1143

149. Romero D.P , Blackburn E.H. A conserved secondary structure for telomerase RNA 1991. Cell, v. 67, p. 343-353.

150. Rosen R.S., Cimini R. Coblentz D Werner's syndrome 1970. Brit J Radiol v 43. p 193199.

151. Salvadori S., Deiana A.M., Elisabetta C., Floridia G . Rossi E. Zuffardi О Colocahzation of (TTAGGG)n telomeric sequences and ribosomal genes in Atlantic eels. 1995. Chromosome Res., v 3, p. 54-58.

152. Sancar A. DNA excision repair. 1996, Ann. Rev Biochem., v 65, p 43-81

153. Schwartz D C., Cantor C R. Separation of yeast chromosome sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. 1984, Cell, v. 37, p. 67-75

154. Serakinci N„ Koch J. Detection and sizing of teiomeric repeat DNA ш situ. A performance comparison of PRINS and PNA assays. 1999. Nature Biotechnology, v 17. p. 200-201.

155. Serrano M. Hannon G.J. Beach D A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. 1993, Nature, v. 366, p. 704-707

156. Shay J.W., Wright W.E. The reactivation of telomerase activity in cancer progression. 1996, Trends in Genetics, v. 12, p. 129.

157. Shay J.W., Wright W.E., Brasiskyte D. Van Der Haegen B.A. E6 of human papillomavirus type 16 can overcome the Ml stage of immortalization in human mammary epithelial cells but not in human fibroblasts. 1993, Oncogene, v. 8, p. 1407-1413

158. Sherr C.J. Cancer cell cycles. 1996, Science, v. 274, p. 1672-1677

159. Sherr C.J. D-type cyclins. 1995, Trends Biochem. Sci. v 20. p 187-1901M. Sherr C.J. G1 phase progression. Cycling on cue. 1994, Cell, v 79. p 551-555

160. Shimada Y., Kaji K., Ito H., Noda K., Matsuo M. Growth-inhibiting effect of tumor necrosis factor on human umbilical vein endothelial cells is enhanced with advancing age in vitro. 1990, J. Cell Physiol., V 142, p. 31-38

161. Shoie D Different means to common ends. 1997. Nature, v 385. p 676-677

162. Singer M.S., Gottscling D.E. TLC1 Template RNA component of Saccharomyces cerevisiae telomerase. 1994, Science, v 266, p. 404-409

163. Slijpcevic P, Hande M.P Chinese hamster telomeres are comparable in size to mouse telomeres. 1999, Cytogenet. Cell. Genet., v. 85, p. 196-199

164. Stein G.H., Beeson M., Gordon L. Failure phosphorylate the retinoblastoma gene product in senescent human fibroblasts. 1990, Science, v 294. p 666-669

165. Sun H., Tonks K. The coordinated action of protein tyrosine phosphatases and kinases in cell signaling. 1994, Trends Biochem. Sci., v 19, p 480-485

166. Swim H.E., Parker R.F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially 1957, Amer. J. Hyg., v. 66, p. 235-243

167. Takeda Т., Hosokawa M, Takeshita S., Irino M. Huguchi K. Matsuhita T. Tomita Y. Yasuhira K„ Hamamoto H., Shimizu K., Ishii M., Yamamuro T A new murine model of accelerated senescence. 1981, Mech. Aging Dev , v 17, p. 183-194

168. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi К. Senescence accelerated mouse (SAM). A novel murine model of aging. 1994, in: The SAM model of senescence, ed. Takeda Т., Excerpta Medica, Elsevier Science B.V., Amsterdam, p. 15-22.

169. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence accelerated mouse: a novel murine model of senescence. 1997a. Exp. Gerontol., v. 32, p. 105-109.

170. Todaro G.J., Green H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. 1963. J Cell Biology, v 17. p 299-313

171. Van den Heuvel S., Harlow E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. 1994, Science, v. 262, p. 2050-2054.

172. Van Steensel В. de Lange T. Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1 1997. Nature, v 385. p. 740-743

173. Vazin H., Benchimol S. Reconstitution of telomerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span. 1998. Current Biology, v 8. p. 279282.

174. Vaziri H., Dragowska W., Allsopp R.C., Thomas Т.Е., Harley C.B. Lansdorp P M. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v. 91, p. 9857-9860

175. Venkatesan R.N. Price C. Telomerase expression in chickens: constitutive activity in somatic tissues and down-regulation in culture. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v. 95. p. 1476314768.

176. Vos Dolmans M. Self-renewal of colony forming units (CFU) in serial bone marrow transplantation experiments. 1972, Cell Tissue Kinet., v 5, p. 371-385

177. Wang S.S., Zakian V.A. Telomere-telomere recombination provides an expiess pathway for telomere acquisition. 1990, Nature, v 345, p. 456-458

178. Watson J. D. Origin of concatemeric T7 DNA. 1972, Nature, v 239, p 197-201

179. Weismann A. Essays upon heredity and kindred biological problems 1891. v 1, Clarendon Press, Oxford.

180. Weng N.P., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation. 1996, J Exp Med , v 183, p 2471-2479

181. Williams G C Pleiotrophy, natural selection and the evolution of senescence. 1957, Evolution, v 11, p. 398-411

182. Winkles J.A., O'Connor M.L., Friesel R. Altered regulation of platelet-derived growth factor A-chain and c-fos gene expression in senescent progeria fibroblasts 1990, J Cell Physiol, v 144, p. 313-325.

183. Wood R.D. DNA repair in eukaryotes. 1996, Ann. Rev Biochem., v 65, p. 135-167

184. Wright W.E., Pereira-Smith O.M., Shay J.W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. 1989. Mol. Cell. Biol., v 9, p. 30683092.

185. Wright W.E., Piatyszek M.A. Rainey W.E., Byrd W. Shay J W Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. 1996a. Dev. Genet., v 18, p. 173-179

186. Wright W.E., Shay J.W. Mechanism of escaping senescence in human diploid cells. 1996b. in Cellular Aging and Cell Death. Wiley-Liss, Inc. p. 153-166.

187. Wright W.E., Shay J.W. Telomere positional effects and the regulation of cellular senescence. 1992a, Trends Genet., v. 8, p. 193-197.

188. Wright W.E., Shay J.W. The two-stage mechanism controlling cellular senescence and immortalization. 1992b, Exp. Gerontol., v. 27, p. 383-389.

189. Wright W.E. Tesmer VM. Huffman K.E. Levene SD. Sha\ JW Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. 1997, Genes & Development, v. 11, p. 2801-2809.

190. Xia C„ Higuchi K„ Shimizu M., Matsushita Т., Kogishi K., Wang J , Chiba T, Festing M.F., Hosokawa M. Genetic typing of the senescence accelerated mouse (SAM) strains with micro satellite markers. 1999, Mamm. Genome, v 10, p. 235-238.

191. Yeager T.R., Neumann A.A., Englezou A., Huschtscha L.I., Noble J R., Reddel R.R. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. 1999, Cancer Res., v 59, p 4175-4179

192. Yegorov Y E., Akimov S S , Akhmalisheva А.К . Semenova 1 V . Smirnova Y В . fCraevsky A.A., Zelemn A V Blockade of telomerase function in various cells 1999, Anti-Cancer Drug Design, v 14, p 305-316.

193. Yegorov Y E., Akimov S S , Hass R., Zelemn A V , Prudovsky I A Endogenous (3-galactosidase activity in continuously nonproliferatmg cells 1998, Exp Cell Res., v 243, p. 207-211

194. Yegorov Y E , Chernov D N , Akimov S S , Akhmalisheva А К , Smirnova Y В . Schinkarev D.B., Semenova I.V , Yegorova I.N., Zelemn A V Blockade of telomerase function by nucleoside analogs. 1997, Biochemistry (Moscow), v 62, p. 1296-1305

195. Yu G.L., Bradley J.D., Attardi L.D., Blackburn E H In vivo alteration of telomere sequ^ces, and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs 1990, Nature, v 344, p. 126-132.

196. Zaitseva V. E., Dyatkina N.B., Krayevsky A.A. Skaptsova N V . Tunna О V . Gnuchev N V . Gottikh B P., Azhaev A.V. Aminonucleosides and their derivatives. Synthesis of 3' amino-2',

197. З'-dideoxynucleoside 5'-triphosphates. 1984. Bioorganic Chemistry (Moscow), v. 10. p. 670 -680.

198. Zakian V.A. Structure and function of telomeres. 1989. Annual Review of Genetics, v. 23, p. 579-604.

199. Zhan X. Ни X., Friesei R. Maciag T. Long term growth factor exposure and differential tyrosine phosphorylation are required for DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells. 1993, J. Biol. Chem., v. 268, p. 9611-9620.

200. Zhu L„ Hathcock K.S., Hande P. Lansdorp P.M., Seldin M F . Hodes R.J. Telomere length regulation in mice is linked to a novel chromosome locus. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v. 95, p. 8648-8653.

201. Адаме P. Методы культуры клеток для биохимиков. 1983, М.: Мир. с. 69-70.

202. Акимов С.С., Масиаг Т., Зеленин А.В., Капник Е.М. Попов К В., Прудовский И.А. Взаимозаменяемость факторов роста в раннем G0-G1 периоде клеточного цикла. 1998, Доклады Академии Наук, т. 359, с. 557-560.

203. Байрейтер К., Франц П.И., Родеман Х.П. Фибробласты при нормальной и патологической терминальной дифференцировке. старении, апоптозе и трансформации. 1995, Онтогенез, т. 26, с. 22-37

204. Дункан Э Л., Реддел Р Р. Генетические изменения, связанные с иммортализацией. 1997, Биохимия, т 62, с. 1477-1490

205. Егоров Е.Е. Вокруг теломеразы. 1999, Молекулярная биология, т 33, с. 385-392. ~

206. Егоров Е.Е. Теломеры, теломериая ДНК, хромосомы. 2001, Биологические мембраны, т 18, с. 249-256.

207. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Ахмалишева А.Х., Смирнова Ю.Б., Шинкарев Д.Б., Семенова И.В., Егорова И.Н., Зеленин А.В. Подавление функции теломеразы аналогами нуклеозидов. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1516-1527

208. Епифанова О.И., Терских ВВ., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. 1983. М. с. 176.

209. Ишикава Ф. Механизмы регуляции теломеразы млекопитающих. 1997, Биохимия, т 62. с. 1558-1565.

210. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. 2000. Биохимия, т 65, с. 5-33

211. КрмаскиЙ А.А. Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, подавляющие репродукцию ВИЧ: анализ ситуации и вероятная перспектива. 1992. Молекулярная Биология, т. 26, с. 725-744.

212. Кроевский А.А. Пути поиска ингибиторов репродукции HIV среди нуклеотидов. 1994, Молекулярная Биология, т. 28, с. 1245-1257

213. Михелкон В.М. Старение клеточных культур. 1984, Ленинград. Издательство "Наука". Книга "Биология клетки в культуре" под редакцией Трошина А.С., с. 236-237

214. Никольский Н.Н. Пролиферация клеток в культуре. Состояние покоя и стимуляция пролиферации. 1984, Ленинград, Издательство "Наука", Книга "биология клетки в культуре" под редакцией Трошина А.С.

215. Оловников A.M. Принцип маргннотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. 1971, Доклады АН СССР, с. 1496-1499.

216. Пономарева Е.Д., Сагайдачных Н.А. К клинике прогерий. 1965. Терапевт Арх. т. 27. с. 77-80.

217. Прайс К.М. Синтез теломерной С-цепи. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1423-1431.

218. Соколов Д.Д. О прогерии. 1955, Пробл. Эндокринологии и Геронтологии, т. 1, с. 11-118.

219. Урываева И.В., Маршак Т.Л., Захидов С Т., Семенова М.Л., Делоне Г.В. Накопление с возрастом микроядерных аберраций в клетках печени ускоренно стареющих мышей линий SAM. 1999, Доклады Академии Наук, т 38. с 703-705

220. Хейфлик Л. Смертность и бессмертие на клеточном уровне. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1380-1393

221. Чернов Д.Н., Егоров Е.Е., Акимов С.С. Теломеразная активность клеток мыши при спонтанной трансформации. 1996, Доклады Академии Наук, т 349. с. 121 -123