Изучение роли теломеразы в реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Казимирчук, Екатерина Валерьевна

• Казимирчук, Екатерина Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Казимирчук, Екатерина Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Теломеры и теломераза

1. Структура теломер.

1.1. Теломерная ДНК.

1.2. Белки, связанные с теломерной ДНК.

1.3. Структура теломер.

2. Функции теломер.

2.1. Защита от хромосомных слияний

2.2. Эффект положения.

2.3. Структурная функция.

3. Недорепликация, недорепарация.

3.1. Концевая недорепликация.

3.2. Подтверждение укорачивания теломер.

3.3. Проблемы репарации.

4. Компенсация не д open л икации.

4.1. Открытие теломеразы, реконструкция теломеразной активности 17 в соматических клетках.

4.2. Структура теломеразы и механизм действия. 18 4.3 Регуляция теломеразной активности в соматических клетках млекопитающих.

4.4. Альтернативное удлинение теломер.

5. Иммортализация клеток. 23 5.1. Иммортализация клеток человека, М1-М2 гипотеза. 23 5.2 Особенности иммортализации клеток мыши.

6. Подавление теломеразной активности в опухолевых клетках.

6.1. Использование антисмысловых олигонуклеотидов.

6.2. Использование терминирующих аналогов нуклеозидов.

6.3. Стабилизация G-квадруплексов.

6.4. Исследование низкомолекулярных ингибиторов теломеразы.

6.5. Введение в клетки мутантных форм hTERT и hTR.

6.6. Подавление теломеразы как метод лечения опухолей.

II. Регуляция синтеза ДНК в гетерокарионах.

1. Ранние исследования гетерокарионов.

2. Негативная регуляция синтеза ДНК в гетерокарионах.

3. Гетерокарионы различных делящихся клеток с макрофагами.

III. Регуляция клеточного цикла. 41 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Клетки

2. Условия культивирования клеток.

3. Макрофаги.

4. Получение гетерокарионов.

5. Идентификация продуктов слияния.

6. Приготовление радиоавтографических препаратов.

7. Математическая обработка.

8. Подавление функции теломеразы в гетерокарионах.

9. Трансфекция 2'-0-метил-РНК олигонуклеотидов в гетерокарионы.

10. Изучение длин теломер. 56 РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Синтез ДНК в гетерокарионах "макрофаг + ЗТЗ Swiss" в присутствии азидотимидина.

2. Синтез ДНК в гетерокарионах «макрофаг + ДФЧ».

3. Изучение пролиферативного потенциала миобластов человека, 63 экспрессирующих ген hTERT.

4. Синтез ДНК в гетерокарионах «макрофаг + миобласт человека».

5. Синтез ДНК в гетерокарионах «макрофаг + клетка 1608 tel 7», 66 трансфицированных антисмысловым олигонуклеотидом к hTR.

6. Синтез ДНК в гетерокарионах «макрофаг + клетка ЗТЗ Swiss», 68 трансфицированных антисмысловым олигонуклеотидом к hTR.

7. Изучение влияния ингибиторов теломеразы нового типа на синтез 69 ДНК в гетерокарионах «макрофаг + ЗТЗ Swiss».

8. Синтез ДНК в гетерокарионах со стимулированными 74 макрофагами мыши.

9. Влияние трипсиновой обработки макрофагов на синтез ДНК в гетерокарионах «макрофаг + клетка ЗТЗ Swiss». 10. Сравнительный анализ длин теломер макрофагов и эмбриональных фибробластов мышей СВА.

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Наличие теломеразной активности в бессмертных клетках обусловливает реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов.

1.1 Блокирование теломеразы в гетерокарионах с помощью AZT.

1.2 Теломеризованные клетки человека реактивируют синтез ДНК в 82 макрофагах мыши в гетерокарионах «макрофаг + ДФЧ|||ЕКТ» и «макрофаг + миобластЬТЕКТ».

1.3. Введение антисмысловых олигонуклеотидов к hTR снижает индекс реактивации макрофагов в гетерокарионах.

2. Взаимосвязь между неделящимся состоянием макрофагов и репрессией 85 теломеразы в них.

3. Гетерокарионы с макрофагами как тест-система для изучения ингибиторов 88 теломеразы.

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение роли теломеразы в реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов»

Более 15 лет назад в результате исследований резидентных макрофагов из невоспаленной перитонеальной полости мыши было показано, что макрофаги обладают уникальной способностью быстро распознавать иммортальные клетки. Оказалось, что реактивация синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов происходит только в том случае, если для слияния с макрофагами использовали бессмертные клетки (Егоров и др., 1984). Причем, в отличие от макрофагов, для реактивации синтеза ДНК в ядрах других терминально дифференцированных клеток (ядерных эритроцитов курицы, нейтрофилов периферической крови мыши) в составе гетерокарионов, иммортальность пролиферирующей клетки-партнера по слиянию не была необходима. В 80-е годы было известно, что в бессмертных клетках происходит экспрессия онкогенов бессмертия (к этой группе генов относят гены туе и 2Е1А). Свойство макрофагов возобновлять репликацию ДНК в составе гетерокарионов с иммортальными клетками в то время объясняли экспрессией онкогенов бессмертия.

Несколько лет спустя после этих исследований был открыт фермент, теломераза, который предотвращает укорачивание теломер в стволовых и половых клетках, а также в раковых клетках. Оказалось, что бессмертие и теломеразная активность коррелируют. Продолжением исследований, проводившихся в 80-х годах, является данная работа, в которой изучается роль теломеразы в реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов с иммортальными клетками. Эти исследования могут также углубить теоретические представления о роли репрессии теломеразы в поддержании дифференцированного состояния макрофагов.

С момента открытия теломеразы и до настоящего времени в лабораториях всего мира ведутся интенсивные исследования теломеразы. Столь большой научный интерес можно объяснить тем, что с одной стороны, в соматических клетках, где теломераза репрессирована, наблюдают процессы клеточного старения. С другой стороны, было показано, что высокую теломеразную активность обнаруживают в 85 % раковых клеток. Ежегодно по всему миру от рака умирают сотни тысяч людей. В США в национальном институте здоровья была получена следующая статистика для США за 2001 год: злокачественное изменение клеток было диагностировано у 1.268.000 человек, умерло от рака в США только за 2001 год 553.400 человек. Проблема лечения рака уже давно является одной из самых насущных проблем медицины. Происходит постоянный поиск методов эффективного лечения опухолей. Традиционно в терапии рака используют хирургическое удаление опухолей, облучение и химиотерапию. Одним из направлений терапии рака является подавление функции теломеразы в раковых клетках. Этот подход, возможно в комплексе с другими методами, имеет хорошие перспективы, так как теломераза необходима для бесконечной пролиферации раковых клеток, и подавление теломеразной активности должно вызывать остановку пролиферации раковых клеток. Ингибиторы теломеразы могут быть использованы в качестве химиотерапевтических препаратов. Продолжается поиск новых специфичных и эффективных ингибиторов теломеразы. Для анализа свойств ингибиторов теломеразы необходимо наличие адекватных модельных систем. Используемый в настоящее время метод анализа ингибиторов теломеразы, когда клетки с теломеразной активностью инкубируют в присутствии ингибитора, контролируя длину теломер и выживаемость клеток, имеет несколько недостатков: требуется много времени для получения результатов, а также необходимы большие количества ингибиторов, что не всегда доступно. Актуальным направлением является разработка других модельных систем для анализа ингибиторов теломеразы. В данной работе проведено исследование влияния подавления функции теломеразы на реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в гетерокарионах. В том случае, если реактивация синтеза ДНК в ядрах макрофагов происходит в ответ на появление теломеразной активности в гетерокарионах, и подавление теломеразной активности ведет к снижению доли гетерокарионов, в которых произошла реактивация, гетерокарионы с макрофагами можно рассматривать в качестве модели для проверки ингибиторов теломеразы. В диссертационной работе изучается возможность использования гетерокарионов с макрофагами в качестве тест-системы для анализа новых ингибиторов теломеразы.

Следует заметить, что поскольку теломераза является обратной транскриптазой, тест-система с макрофагами может быть использована для исследования ингибиторов обратных транскриптаз некоторых вирусов, например, вируса иммунодефицита человека. Ранее было показано, что азидотимидин, являясь ингибитором обратной транскриптазы вируса HIV, также подавляет и теломеразную активность.

Обзор литературы

I. Теломеры и теломераза 1. Структура теломер.

1.1. Теломерная ДНК.

Теломеры - это особые структуры, локализованные на концах всех эукариотических хромосом и важные для генетической стабильности (Muller, 1938; McClintock, 1941; .Lundblad and Szostak, 1989; Sandell and Zakian, 1993). Теломеры являются комплексом теломерной ДНК и связанных с теломерной ДНК белков (Blackburn, 1991; Greider, 1996). Теломерная ДНК состоит из коротких тандемно повторяющихся последовательностей длиной 5-8 оснований. Теломерная последовательность ДНК всех позвоночных животных - (TTAGGG)n, повторенная сотни и тысячи раз (Meyne et al., 1989). Теломерный повтор оказался очень консервативным в эволюции. Так, у организмов, относящихся к разным классам, теломерные повторы могут быть одинаковым или отличаться незначительно (табл. 1). В клетках различных организмов длина теломерного повтора варьирует в широком диапазоне: от 10-15 т.п.о у человека (de Lange et al, 1990) до 50 т.п.о. у мышей вида Mus musculus (Broccoli et al., 1996).

Экспериментально длину теломер определяют с помощью гибридизации по Саузерну. Этот метод позволяет определить длину концевых фрагментов рестрикции (TRF от англ. terminal restriction fragments). TRF кроме консервативного теломерного повтора также включают в себя теломероподобные последовательности, характеризующиеся высокой вариабельностью (Allshire et al., 1989; de Lange et al., 1990). Таким образом, длина TRF, определяемая с помощью гибридизации по Саузерну, оказывается несколько больше реальной длины теломер.

Так как одна цепь ДНК теломерного повтора содержит примерно 50% остатков гуанозина, а другая соответственно, примерно 50% остатков цитозина, то когда говорят о теломерах, различают G-богатую цепь ДНК и комплементарную ей С-богатую цепь ДНК.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Казимирчук, Екатерина Валерьевна

Выводы.

1. С помощью различных подходов показано, что теломераза необходима для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов: а) В результате блокирования функции теломеразы в гетерокарионах «макрофаг + клетка ЗТЗ Swiss» с помощью различных ингибиторов теломеразы (азидотимидин, олигонуклеотид, комплементарный матричному району hTR, модифицированные динуклеозидтетрафосфонаты) происходит подавление реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов без влияния на синтез ДНК в ядрах клеток ЗТЗ. б) Диплоидные фибробласты кожи человека, трансформированные геном hTERT, и обладающие теломеразной активностью, вызывают реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов «макрофаг + ДФЧЬТЕКТ». Диплоидные фибробласты человека без теломеразной активности не обладают такой способностью. в) Миобласты кожи человека, трансформированные геном hTERT, и обладающие теломеразной активностью, вызывают реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов «макрофаг + миобластЬТЕКТ». Миобласты без теломеразной активности не обладают такой способностью.

2. Миобласты кожи человека с введенным геном hTERT, обладающие теломеразной активностью, имеют такой же пролиферативный потенциал, как и исходные миобласты, при этом они обладают способностью реактивировать синтез ДНК в ядрах макрофагов в гетерокарионах. Таким образом, для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов необходимо именно наличие теломеразной активности в пролиферирующей клетке (а не ее иммортальность).

3. Теломеры резидентных макрофагов, видимо, изменены таким образом, что для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов необходимо наличие теломеразной активности у клетки, входящей в состав гетерокариона с макрофагом.

4. Впервые создана система, позволяющая относительно быстро и с минимальными затратами изучать ингибиторы теломеразы на клеточном уровне.

Благодарности

Автор выражает сердечную благодарность своим научным руководителям, доктору биологических наук, профессору А.В. Зеленину и кандидату биологических наук, Е.Е. Егорову за предложенную интересную тему, помощь в работе и ценные советы.

Автор также выражает искреннюю признательность д.б.н. И.А. Прудовскому и к.б.н. С.С. Акимову за обучение основам культивирования клеток. Автор благодарит асп. В.В. Андрееву, Э.Б. Дашинимаева и к.б.н. И.В. Семенову за помощь, оказанную при выполнении экспериментальной части диссертации. Автор выражает особую признательность с.н.с., д. Физ.-мат.н. А.И. Полетаеву и н.с. К.В. Попову за помощь в оформлении диссертационной работы.

Автор благодарит всех сотрудников Лаборатории Функциональной морфологии хромосом за проявленный интерес к работе, за моральную поддержку во время работы, и за отзывчивость в обсуждении результатов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Казимирчук, Екатерина Валерьевна, 2002 год

1. Егоров Е.Е. Регуляция репликации в гибридах и цибридах иеделящихся дифференцированных и пролиферирующих клеток: Автореферат на соискание уч. ст. к.б.н. М.: ИМБ АН СССР, 1985.

2. Егоров Е.Е. Вокруг теломеразы. 1999, Молекулярная биология, т. 33, с. 385-392.

3. Егоров Е.Е., Гуменюк P.P., Прудовский И.А., Зеленин А. В. Синтез ДНК в гибридах макрофагов и различных клеток культур с ограниченной способностью к пролиферации. 1987, Биополимеры и клетка, т. 3, с. 313-317.

4. Егоров Е.Е., Казимирчук Е.В., Терехов С.М., Караченцев Д.Н., Вишнякова Х.С., Мещерякова Ю.А., Зеленин А.В. Иммортализация клеток человека и индукция синтеза ДНК в гетерокарионах. 2002, Молекулярная биология, т. 36, с. 1-2.

5. Егоров Е.Е., Прудовский И.А., Зеленин А.В. Синтез ДНК в гибридах макрофагов и клеток культур с различной пролиферативной активностью. 1984, ДАН, т. 276, с. 961965.

6. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Ахмалишева А. X., Смирнова Ю.Б., Шинкарев Д.Б., Семенова И.В., Егорова И.Н., Зеленин А.В. Подавление функции теломеразы аналогами нуклеозидов. 1997а, Биохимия, т. 62, с. 1296-1305.

7. Егоров Е.Е. Теломераза, старение, рак. 1997, Молекулярная биология, т. 31, с. 16-25

8. Егоров Е.Е. Теломераза, старение, рак. 1997, Молекулярная биология, т. 31, с. 16-25

9. Епифанова О.И. «Москва». 1997, Лекции о клеточном цикле.

10. Зеленин А.В., Прудовский И.А. Регуляция репликации ДНК в гетерокарионах и ее возможная связь с работой онкогенов. 1985, Успехи современной биологии, т. 100, с. 340-356.

11. Капник Е.М., Федоров Ю.В, Барбул А.И., Прудовский И.А., Зеленин А.В. Исследование блока пролиферации в ядерных эритроцитах методом клеточной гибридизации. 1989, ДАН, т. 308, с. 982-986.

12. Кущ А.А., Новаковская М.М. Отсутствие иигибирующего влияния лимфоцитов на вступление в синтез ДНК ядер клеток культуры, находящихся в гетерокарионах. 1984, ДАН, т. 279, с. 990-993.

13. Неверова М.Е., Полуновский В.А., Хрущов Н.Г. Морфологическое и авторадиографическое исследования реактивации ядер клеток перитонеального экссудата в гетерокарионах. 1976, Онтогенез, т. 7, с.475-483.

14. Оловников A.M. О возможности использования клетками эффекта концевой недорепарации ДНК в контроле за правильной последовательностью событий в индивидуальном развитии. 1995в, Онтогенез, т. 26, с. 254-256.

15. Оловников A.M. О роли неполной репарации конца хромосомной ДНК в старении нейронов и постмитотических организмов. 19956 Известия РАН. Серия биол., №4, с. 504-507.

16. Оловников A.M. Об эффекте концевой недорепликации, или неполной репарации конца линейной двуспиральной молекулы ДНК. 1995а, Известия РАН. Серия биол., №4, с. 501-503.

17. Оловников A.M. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. 1971, Докл. Акад. Наук, т. 201, с. 1496-1499.

18. Оловников A.M. Старение есть результат укорочения "дифферотены" в теломере из-за концевой недорепликации и недорепарации ДНК. 1992, Известия АН СССР. Серия биол., №4, с. 641-643.

19. Allshire R.C., Dempster М., Hastie N.D. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeats distributed nonrandomly. 1989, Nucl. Acids Res., v. 17, p. 4611-4627.

20. Allsopp R.C., Vaziri H., Patterson C., Goldstein S., Younglai E.V., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 89, p. 10114-10118.

21. Allsopp R.C., Vaziri H., Patterson C., Goldstein S., Younglai E.V., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 89, p. 10114-10118.

22. Aparicio O.M., Billington B.L., Gottschling D.E. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae. 1991, Cell, v. 66, p. 12791287.

23. Avilion A.A., Piatyszek M.A., Gupta J., Shay J.W., Bacchetti S., Greider C.W. Human telomerase RNA and telomerase activity in immortal cell lines and tumor tissues. 1996, Cancer Res., v. 56, p. 645-650.25.