Кодирующая некодирующая теломеразная РНК человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Нарайкина Юлия Валерьевна

• Нарайкина Юлия Валерьевна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Нарайкина Юлия Валерьевна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1.1.Теломер ы

1.2.Теломераз а

1.2.1. Общие сведения

1.2.2. Каталитический цикл теломеразы

1.2.3. Основные компоненты теломеразного комплекса

1.2.3.1. Обратная транскриптаза

1.2.3.2. Вспомогательные белки

1.2.3.3. Теломеразная РНК

1.2.3.4. Пространственная структура теломеразы

1.2.3.5. Процессинг ИТЯ и сборка теломеразного комплекса человека

1.3. Альтернативные функции компонентов теломеразы

1.4.1. Нуклеазная активность теломеразы

1.4.2. Трансферазная активность теломеразы

1.4.3. Теломераза и метаболизм

1.4.4. Обратная транскриптаза

1.4.4.1. ТБЯТ и митохондрии

1.4.4.2. ТБЯТ и регуляция экспрессии генов

1.4.4.3. ТБЯТ и повреждения ДНК

1.4.4.4. ТБЯТ и апоптоз

1.4.5. Теломеразная РНК

1.4.5.1. ИТЯ и повреждения ДНК

1.4.5.2. ИТЯ и апоптоз

1.4.5.3. ИТЯ как длинная некодирующая РНК

1.5. Заключение по обзору литературы

Результаты и их обсуждение

1. Постановка задачи

2. Биоинформатический анализ первичной структуры продукта трансляции теломеразной РНК человека

3. Исследование локализации теломеразной РНК человека в клетках

4. Идентификация ^ШЯР в клетках человека

4.1. Получение первичных поликлональных антител к белку ^ШЯР

4.2. Иммунофлуоресцентный анализ белка ^ШЯР в клетках

4.3. Идентификация белка ^ШЯР в клетках методом иммуноблоттинга

4.4. Идентификация белка ^ШЯР в клетках с помощью масс-спектрометрии

5. Исследование биологической роли белка ^ШЯР

5.1. Изучение роли ^ШЯР в апоптозе с помощью подхода «gam-of-fimctюn»

5.2. Изучение роли ^ГОЯР с помощью подхода «loss-of-function»

5.3. Исследование биологической роли белка ^ШЯР с помощью поиска

клеточных партнеров

Заключение

Выводы

Материалы и методы

1. Используемые реактивы и биоматериалы

2. Методики, использованные в работе

2.1. ПЦР

2.2. Приготовление вектора и вставки

2.3. Лигирование

2.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле

2.5. Приготовление компетентных клеток Е.свИ

2.6. Трансформация компетентных клеток Е.свИ плазмидной ДНК

2.7. Выделение плазмидной ДНК

2.8. Рестриктный анализ плазмидной ДНК

2.9. Секвенирование плазмид и ПЦР-продуктов

2.10. Создание конструкций, содержащих мутации в гене теломеразной РНК человека

2.11. Создание конструкций для выключения экспрессии гена теломеразной РНК человека

2.12. Культивирование эукариотических клеток

2.13. Тест на токсичность MTT

2.14. Ингибирование аутофагии

2.15. Приготовление экстрактов культуральных клеток

2.16. Выделение суммарной РНК

2.17. Проведение ПЦР в реальном времени

2.18. Определение относительной активности теломеразы

2.19. Трансфекция клеток кальций-фосфатным методом

2.20. Инфекция клеток

2.21. Электропорация

2.22. Иммуноцитохимия

2.23. Белковый электрофорез в ПААГ-ДСН

2.24. Окраска ПААГ серебром

2.25. Вестерн-блоттинг

2.26. Коиммунопреципитация с помощью наборов Pierce Direct IP Kit и

Dynabeads Co-Immunoprecipitation Kit

Приложение

Приложение

Благодарности

Список литературы

CRISPR

HEPES

hTR

LB

lncPHK

mTR

Ni-NTA

OD

PMSF

TER, TR, TERC

TERT

Tris

а.о.

БСА

Да, кДа

ДМСО

ДНК

ДСН

ДТТ

ИПТГ

МАЛДИ

мРНК

мяРНК

мяоРНК

н.о.

нт

Список сокращений

clustered regularly interspaced short palindromic repeats -короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами

К-2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота

теломеразная РНК человека

богатая среда Lysogeny broth

длинные некодирующие РНК

теломеразная РНК мыши

нитрилацетат никеля

оптическая плотность

фенилметилсульфонилфторид

теломеразная РНК

теломеразная обратная транскриптаза

трис(гидроксиметил)аминометан

аминокислотный остаток

бычий сывороточный альбумин

дальтон, килодальтон

диметилсульфоксид

дезоксирибонуклеиновая кислота

додецилсульфат натрия

1,4-дитио-DL-треитол

изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид

матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

матричная РНК

малая ядерная РНК

малая ядрышковая РНК

нуклеотидные основания

нуклеотид

ОРС открытая рамка считывания

ПААГ полиакриламидный гель

п.о. пара оснований

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кодирующая некодирующая теломеразная РНК человека»

Актуальность проблемы

Теломеры, защищая линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживают стабильность генома. Теломерная ДНК состоит из коротких повторяющихся участков и связана со специфичными белками [Collins, 2010].

При каждом клеточном делении в результате недорепликации концы хромосом укорачиваются. Когда их длина достигает критического предела (так называемого предела Хейфлика), клетка перестает делиться.

У большинства организмов ключевым этапом механизма поддержания длины теломер является достраивание повторов теломерной ДНК теломеразой. Теломераза - ферментативный комплекс, состоящий из двух основных компонентов - теломеразной РНК (TR) и обратной транскриптазы (TERT) [Collins, 2010]. В процессе работы фермента обратная транскриптаза синтезирует ДНК, используя в качестве матрицы собственную РНК. Теломераза активна в клетках простейших, дрожжей, а также в стволовых и зародышевых клетках позвоночных, в том числе и человека [Greider, 1996]. В соматических клетках человека теломераза неактивна, поэтому люди подвержены так называемому репликативному старению, связанному с достижением клетками предела Хейфлика. В клетках, преодолевших этот предел, как правило, происходит активация теломеразы и стабилизация теломер. Известно, что для 90% опухолевых клеток именно теломераза обеспечивает неограниченный пролиферативный потенциал за счет поддержания длины теломер [Shay, 1997].

Активность теломеразы обычно обусловлена наличием в клетках обратной транскриптазы теломеразы. Экспрессия гена обратной транскриптазы теломеразы инактивируется в процессе дифференцировки и активируется в процессе онкогенеза [Shay, 2005]. Теломеразная РНК

синтезируется и ее количество поддерживается на определенном уровне постоянно на протяжении всего существования клетки [Yashima, 1998]. Помимо этого, накоплены данные о выполнении теломеразной РНК функций, не связанных с удлинением теломер [Cheng, 2018; Gazzaniga, 2014; Sancar, 2004], детальное изучение которых является важной и актуальной задачей. Данная работа посвящена исследованию альтернативной роли теломеразной РНК человека (hTR) в качестве матрицы для синтеза белка.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось доказательство трансляции теломеразной РНК человека.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Доказать наличие продукта трансляции теломеразной РНК человека в клетке методами иммунофлуоресцентного анализа, иммуноблоттинга и масс-спектрометрии.

2. Изучить биологическую роль белка (hTERP), образующегося в результате трансляции hTR, с помощью подходов «gain-of-function», «loss-of-function» и поиска клеточных партнеров.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые проведено исследование возможности трансляции теломеразной РНК человека. Результаты экспериментов, полученные при использовании нескольких разных методов, свидетельствуют о существовании белка, кодируемого hTR.

В представленной работе показано, что исследуемый белок может быть вовлечён в регуляцию апоптоза и макроаутофагии. Результаты данного исследования способствуют пониманию молекулярных механизмов влияния компонентов теломеразы на процессы онкогенеза, клеточной пролиферации и гибели.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих

научных мероприятиях и конференциях: Keystone Symposium «Long Noncoding RNAs: Marching toward Mechanism», Санта-Фе, США, 27.02.04.03.2014; 3rd Meeting of the CNRS LIA NUCPROT «Biogenesis, structure and reactivity of nucleic acids protein assemblies important for health and disease», Страсбург, Франция 16.10.-19.10.2014; The 4th International Conference on Science and Applied Research «Post-Genome Methods of Analysis in Biology and Laboratory and Clinical Medicine», Казань, Россия 29.10.-01.11.2014; Keystone Symposium "Long Noncoding RNAs: From Evolution to Function", Колорадо, США 15.03.-21.03.2015; Международная конференция, посвященная 90-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, Россия, 24.07.-28.07.2016; V Съезд Биохимиков России, Сочи, Россия 4.10.-9.10.2016; Конференция Skoltech-MIT «Shaping the future», Москва, Россия 25.04.-26.04.2017; Конференция «Telomeres and Telomerase», Cold Spring Harbor Laboratory, США, 02.05.06.06.2017; The 42nd FEBS Congress, Иерусалим, Израиль 07.09.-10.09.2017; Международная научная конференция «XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды», Москва, Россия 18.09.-22.09.2017; The Gen-Y Conference «Coding non-coding human telomerase RNA», Сочи, Россия 29.09.-01.10.2017; «Telomere biology in health and human disease», Троя, Португалия, 1.05.-6.05.2018.

Публикация работы

1) Rubtsova M.1, Naraykina Y. 1, Vasilkova D., Meerson M., Zvereva M., Prassolov V., Lazarev V., Manuvera V., Kovalchuk S., Anikanov N., Butenko I., Pobeguts O., Govorun V., Dontsova O. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research, 2018, 46 (17), 8966-8977. (1 -равный вклад авторов). IF 11,561.

2) Рубцова М.П., Василькова Д.П., Нарайкина Ю.В., Донцова О.А. Особенности процессинга теломеразных РНК дрожжей и человека. Acta Naturae (англоязычная версия), 2016, 8(4), с. 78-86. IF 1,667.

3) Vasilkova D.V., Azhibek D.M., Zatsepin T.S., Naraikina Y.V., Prassolov V.S., Prokofjeva M.M., Rubtsova M.P. Dynamics of human telomerase RNA structure revealed by antisense oligonucleotide technique. Biochimie, 2013, 95 (12), 2423-2428. IF 3,112.

4) Рубцова М.П., Василькова Д.П., Малявко А.Н., Нарайкина Ю.В., Зверева М.Э., Донцова О.А. Функции теломеразы: удлинение теломер и не только. Acta Naturae (англоязычная версия), 2012, 4(2), с. 44-61. IF 1,667.

Личный вклад автора

Личный вклад автора в проведенное исследование заключался в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, планировании и проведении экспериментальных процедур, анализе и оформлении полученных результатов, в представлении результатов на научных мероприятиях.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов диссертационного исследования подтверждается воспроизводимостью экспериментов и статистической обработкой данных. В работе использовали современные методы исследований, соответствующие поставленным целям и задачам. Результаты получены на современном научном оборудовании и с использованием реактивов, произведенных ведущими мировыми компаниями.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: оглавление, список сокращений, введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, приложение 1 и 2, заключение, выводы, благодарности и список литературы. Материал иллюстрирован 57 рисунками и 3 таблицами. Список литературы включает 222 процитированные работы.

Положения, выносимые на защиту 1. Теломеразная РНК человека является матрицей для синтеза белка

hTERP.

2. Продукт трансляции ^ГЯ детектируется в ядре и цитоплазме клеток HEK293T c помощью антител к рекомбинантному белку ^ГЕЯР.

3. Выявление протеотипического пептида белка ^ГЕЯР в ходе масс-спектрометрического анализа подтверждает существование продукта трансляции теломеразной РНК человека в клетках НЕК293Т.

4. Уменьшение количества функционального ^ГЕЯР приводит к снижению выживаемости клеток в условиях индуцированного апоптоза.

5. Мутации белка ^ГЕЯР приводят к нарушениям в процессинге белка ЬС3 -- регулятора макроаутофагии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Теломеры

В эукариотических клетках ДНК находится в ядре в виде линейных хромосом, на концах которых расположены особые структуры - теломеры. Теломеры — это сложные нуклеопротеиновые комплексы, состоящие из длинных повторяющихся последовательностей и набора специальных теломерных белков, которые с ними взаимодействуют. Теломерные белки организуют ДНК в пространстве особым образом, образуя нуклеопротеидный комплекс - теломерный гетерохроматин [Lu, 2013].

Существование специальных структур на концах хромосом было независимо постулировано лауреатами Нобелевской премии Барбарой Мак-Клинток и Германом Мёллером. Сравнение фрагментов хромосом, полученных под действием рентгеновского облучения, с целыми хромосомами кукурузы и дрозофилы выявило внутрихромосомные перестройки и деградацию ДНК [McClintock, 1931]. Интактными оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам. Лишенные концевых последовательностей хромосомы начинают сливаться с большей частотой, что ведет к различным генетическим аномалиям. Ученые сделали вывод о том, что естественные концы линейных хромосом защищены специальными структурами. В 1938 году Г. Мёллер предложил называть их теломерами (от греч. телос - конец и мерос - часть) [Blackburn, 2006; Bogdanov, 1998].

Теломеры выполняют три наиболее важные функции. Во-первых, они предотвращают деградацию и слияние хромосом [Sullivan, 2010]. Во-вторых, теломеры играют важную роль в создании внутренней упорядоченности клеточного ядра, так как ответственны за прикрепление хромосом к ядерному матриксу [Lange, 1992]. И в-третьих, наличие на концах хромосом теломерной

ДНК позволяет решить проблему концевой недорепликации ДНК [Bogdanov, 1998]

Первыми объектами исследования были одноклеточные простейшие (ресничная инфузория Tetrahymena thermophila, в частности), обладающие особым строением ядерного аппарата: они содержат несколько десятков тысяч коротких хромосом с теломерами на конце. Позднее была определена теломерная последовательность и для других организмов [Blackburn, 2006].

Теломерный повтор содержит шесть-восемь нуклеотидных остатков. У Tetrahymena thermophila, к примеру, последовательность теломерного повтора - TTGGGG. У некоторых видов дрожжей теломерные повторы длиннее, чем у простейших, и часто не такие регулярные [Somanathan, 2018].

Теломеры человека состоят из многократных повторов последовательности TTAGGG, связанных со специализированными белками. Из таких же блоков построена теломерная ДНК (G-богатые цепи) всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб. Похожая последовательность характерна для теломерных ДНК-повторов растений (TTTAGGG) [Bogdanov, 1998].

Теломерная ДНК не является полностью двухцепочечной, часть её состоит из одной G-богатой цепи, выступающей с З'-конца, длиной 150-200 нуклеотидов (рис.1А). В структуре теломер можно выделить три части. Во-первых, субтеломерные последовательности, которые также представляют из себя повторы. Основная часть теломеры является двухцепочечной ДНК, а третья часть содержит так называемую кэп-концевую структуру, которая ответственна за контроль удлинения теломер и защиту концов хромосом от деградации и системы репарации двухцепочечных разрывов [Riethman, 2005; Рубцова, 2012].

Методом электронной микроскопии показано, что теломеры организованы в большую структуру типа «лассо» - t-петлю. Предполагается, что выступающий одноцепочечный участок G-цепи переплетается с

двухцепочечным участком теломеры, формируя t-петлю. В области комплементарного взаимодействия выступающего 3'-конца с двухцепочечным участком образуется D-петля [Lange De, 2002; Palm, 200S] (рис.1Б). Наличие подобных структур в клетках напрямую не доказано, поэтому формирование описанной структуры теломеры является одной из гипотез.

Cогласно другим исследованиям, в теломерных областях хромосом четыре теломерных повтора способны образовывать так называемые G-квадруплексные структуры, которые ингибируют теломеразную активность [Oganesian, 200V]. C использованием специфичных к G-квадруплексам антител in vivo показано существование таких структур в клетках многих организмов, в том числе человека [Lin, 201V; Oganesian, 200V; Rhodes, 2015]. При стабилизации G-квадруплексов путем их связывания с лигандами происходит укорочение теломер и нарушается взаимодействие теломерных белков с ДНК. По-видимому, теломеры не способны постоянно поддерживать G-квадруплексы, и формирование подобных структур в разных конформациях возможно в переходных состояниях [Oganesian, 200V].

Функции теломер непосредственно связаны с длиной теломерных повторов, но также зависят от активности ассоциированных с ними белков. Теломерная ДНК взаимодействует с несколькими белками, комплекс которых в совокупности называется шелтерином. Он состоит из шести белков: TRF1, TRF2, POT1, TIN2, TPP1 и RAP1 [Palm, 200S]. Среди них TRF1 и TRF2 (Telomeric Repeat binding Factor 1 и 2) - гомодимеры, которые связываются с двухцепочечными участками теломер. Белок POT1 взаимодействует с 3'-выступающим одноцепочечным участком G-цепи и формирует гетеродимер с TPP1 [Loayza, 2003; Rice, 201V]. TIN2 (TRF1-Interacting Protein 2) одновременно взаимодействует c TRF1, TRF2 и POT1/TPP1, опосредуя сборку всего шелтеринового комплекса (рис.^). RAP1 (Repressor/Activator Protein 1) привлекается на теломеры за счет образования комплекса с белком TRF2.

Предполагается, что RAP1 контролирует длину теломер и препятствует рекомбинации на теломерных участках [Martinez, 2010]. Мутации или удаление отдельных белков шелтеринового комплекса приводят к нестабильности теломер, что вызывает активацию системы ответа на повреждения ДНК [Panero, Santos Dos, Slavutsky, 2017].

Рисунок 1. Схематическое изображение структуры теломеры.

А- изображение комплекса теломерной ДНК, белков шелтеринового комплекса и теломеразы. Б-изображение комплекса теломерной ДНК в конформации t-петли и шелтеринового комплекса [Рубцова и др., 2012].

Некоторые исследования свидетельствуют о том, что теломерная ДНК может транскрибироваться с образованием теломерной РНК, содержащей повторы (TERRA) [Arora, 2012]. С помощью ЯМР и рентгеноструктурного анализа показано, что теломерная РНК также может формировать G-квадруплексы, в которых четыре гуанина располагаются в одной плоскости [Xu, 2008]. Более того установлено, что TERRA РНК способна взаимодействовать с теломерной ДНК и выступать в роли естественного ингибитора теломеразы [Redon, 2010]. В состоянии такого гетеродуплекса ДНК-РНК дуплекс может образовывать G-квадруплексные структуры. Предположительно, такие структуры могут защищать концы хромосом от

слияния с соседними хромосомами [Xu, 2012].

Укорочение теломер неизбежно из-за так называемой «проблемы недорепликации» концов линейных эукариотических хромосом. Данную проблему независимо сформулировали А.М. Оловников и Дж.Уотсон в 1970-х гг. Известно, что ДНК-полимеразы движутся по матричной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу, в противоположном направлении синтез цепи не может быть катализирован этим ферментом. Одна из цепей, которая расплетается хеликазой с 3'-конца, называется лидирующей, и по ней ДНК-полимераза может осуществлять беспрепятственное движение. Однако у противоположной цепи (отстающей) первым освобождается 5'-конец, и ферменту необходимо двигаться в другом направлении, достраивая дочернюю ДНК. ДНК-полимераза нуждается в затравке для начала синтеза новой цепи, т.к. нуклеотид может присоединиться только к свободной ОН-группе. В процессе репликации ДНК используются короткие РНК-затравки, комплементарные участку материнской цепи ДНК. В результате на отстающей цепи формируются так называемые фрагменты Оказаки - участки новосинтезированной ДНК, разделенные РНК-праймерами. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, образовавшиеся пропуски заполняет ДНК-полимераза I, а затем фосфодиэфирные связи между нуклеотидами восстанавливает ДНК-лигаза. Однако на З'-конце хромосомы этот пропуск не может быть заполнен. Он остается одноцепочечным, а соответствующий 5'-конец недореплицированным и подвергается действию экзонуклеаз, которые еще больше его укорачивают. Следовательно, каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению. Очевидно, что, прежде всего, сокращается длина теломер (рис.2) [Olovnikov, 1973; Watson, 1972].

Рисунок 2. Схема, иллюстрирующая укорочение концов хромосом в клетке

[Bogdanov, 1998].

А.М. Оловников в 1971 году высказал гипотезу, согласно которой потеря концевых последовательностей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки. Считалось, что процесс укорочения теломер и есть тот часовой механизм, который определяет репликативный потенциал клетки [Bogdanov, 1998]. Когда длина теломер достигает критического значения, этот механизм останавливает последующее деление клетки. А.М. Оловников высказал гипотезу, что в зародышевых, стволовых, и других нестареющих клетках должна присутствовать специализированная ферментативная система, которая поддерживает длину теломер. И в 1985 году Э. Блэкбёрн и К. Грейдер выделили фермент, который синтезирует теломерную ДНК. Этот фермент был назван теломеразой [Greider, 1985].

1.2. Теломераза 1.2.1. Общие сведения

Главным регулятором длины теломер является фермент теломераза [Greider, 1985]. Теломераза -- это рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из теломеразной РНК (TER, TR - telomerase RNA), обратной транскриптазы (TERT - telomerase reverse transcriptase) и вспомогательных белков, которые стабилизируют РНК и обеспечивают сборку активного фермента.

Ферменты, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, используют ретровирусы для синтеза ДНК-копий геномов, представленых в виде РНК. В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах [Xiong, 1990].

Уникальность теломеразы заключается в том, что на сегодня это единственная известная РНК-содержащая обратная транскриптаза. Субстратами теломеразы в реакции являются дезоксинуклеотид-5'-трифосфаты и З'-конец теломеры. При этом теломераза использует теломеразную РНК в качестве матрицы для удлинения теломер. Теломеразная РНК взаимодействует с теломерой не только на матричном участке, но и дополнительно в так называемом «якорном сайте» [Зверева, 2010].

Сборка теломеразы, ее процессинг и взаимодействие с теломерами имеют сходства и отличия у эволюционно далеких организмов. Общие свойства обнаружены у всех компонентов теломеразы. Однако только обратная транскриптаза является высококонсервативным элементом теломеразы. Исходя из противоречивых данных о компонентах теломеразы, можно сделать вывод о том, что клетки содержат отличные по составу теломеразные комплексы [Cohen, 2007].

Теломераза способна добавлять несколько теломерных повторов за один акт присоединения к олигонуклеотидному субстрату. Для определения

активности фермента часто применяют метод TRAP (протокол амплификации теломерных повторов) [Ilgen, 2015]. Дополнительным показателем эффективности работы теломеразы является количество теломерных повторов на концах теломер или длина теломер [3].

В большинстве соматических клеток человека теломераза либо вовсе неактивна, либо имеет невысокую активность (в фибробластах, ткани молочной железы, в клетках печени) [Shay, 2017]. Невысокий уровень её активности обнаружен в клетках кожи, лимфоцитах. Активность теломеразы в этих клетках меняется в процессе развития организма [Lindsey, 1991].

К примеру, в эмбриональных клеточных линиях теломераза активна, и длина теломер в них остается постоянной. Высокая теломеразная активность наблюдается в половых клетках человека в течение всей его жизни. Соответственно, их теломеры состоят из наибольшего числа ДНК-повторов и содержат все необходимые белки для нормальной пролиферации клеток.

Стволовым клеткам необходима теломераза для поддержания длины теломер на протяжении всего жизненного цикла [Belair, 1998]. С недостаточной активностью теломеразы стволовых клеток связан ряд врожденных патологий. Приблизительно 80-90% раковых клеток имеют короткие теломеры и высокий уровень теломеразной активности. Теломераза может служить чувствительным биомаркером для диагностики, раннего обнаружения и прогнозирования рака [Wright, 2002] (рис.4).

Длина теломер (т.п.н.)

Зародышевые клетки

-15

Теломеразная активность присутствует

-5-7

-2-4

" Теломеразная активность отсутствует

Раковые клетки

Теломеразная активность присутствует

'Лимит" Кризис Хей флика

Число клеточных делений

Рисунок 4. Схема, иллюстрирующая связь длины теломерной ДНК и активности теломеразы с особенностями клеточного деления различных

Сравнительно небольшая длина теломер у большинства раковых клеток может свидетельствовать о том, что они происходят из нормальных клеток, достигших предкризисного состояния, которое характеризуется нарушением регуляции многих биохимических реакций [Skvortsov, 2006]. В таких клетках происходят многочисленные хромосомные перестройки, которые в том числе ведут и к злокачественной трансформации. Длина теломер в раковых клетках, которые не содержат активной теломеразы, поддерживается на должном уровне, по-видимому, с помощью не теломеразного, а альтернативного рекомбинационного механизма удлинения теломерной ДНК [Blasco, 2003].

1.2.2. Каталитический цикл теломеразы

Основная особенность теломеразы - способность к процессивному добавлению теломерных повторов. Цикл реакции теломеразы как фермента включает в себя: 1) узнавание субстрата; 2) элонгацию; 3) транслокацию; 4) диссоциацию (рис. 5). При переходе фермента последовательно по стадиям (1)-(2)-(3)-(4) теломераза добавляет к субстрату один теломерный повтор

типов клеток [Bogdanov, 1998].

[Autexier, 2006; Зверева, 2010].

Согласно общепринятой схеме механизма синтеза теломерных повторов, на первой стадии теломераза находит 3'-конец теломерной ДНК, с которым часть матричного участка теломеразной РНК образует комплементарный комплекс. В первичном связывании З'-конца хромосомной ДНК также принимают участие якорные участки в TERT и TR. Далее РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность теломеразы способствует присоединению нуклеотидов к праймеру. После синтеза повтора происходит транслокация, при которой матрица и белковые субъединицы фермента перемещаются на вновь синтезированный конец теломерной ДНК, и все стадии цикла могут повториться снова (рис.5).

Работу теломеразы можно охарактеризовать двумя типами процессивности. Процессивность I свойственна всем полимеразам и заключается в добавлении нуклеотида, уникальная процессивность II определяет способность теломеразы копировать матричный участок теломеразной РНК много раз, удлиняя при этом одну молекулу праймера [Lue, 2004]. После добавления теломерного повтора реакция останавливается или замедляется, то есть транслокация и отжиг матрицы лимитируют скорость работы фермента [Greider, 1996].

Рисунок 5. Основные этапы синтеза одного теломерного ДНК-повтора теломеразой [Зверева, 2010].

В клетках человека полуконсервативная репликация ДНК происходит на протяжении всей S-фазы [Hagen, 1990; Wright, 1999]. Прямого доказательства, что теломеразная активность ограничена только этой фазой клеточного цикла, нет. Но исследования, основанные на гибридизации теломер с олигонуклеотидами, показывают, что теломеры наиболее доступны в поздней S-фазе [Jady, 2006].

Методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization) выявлено, что теломеразная РНК человека в интерфазе находится в тельцах Кахаля - структурах, участвующих в биогенезе небольших рибонуклеопротеидов (РНП). TERT человека (hTERT) в то же время находится в нуклеоплазме. В ранней S-фазе тельца Кахаля вместе с теломеразной РНК человека (hTR) находятся на периферии ядра, а hTERT-внутри ядрышка. В течение S-фазы и обратная транскриптаза, и РНК локализованы рядом с тельцами Кахаля, при этом часть их ассоциирована с теломерами [Schmidt, 2015].

1.2.3. Основные компоненты теломеразного комплекса 1.2.3.1. Обратная транскриптаза

Как уже отмечалось, теломераза - это особая обратная транскриптаза, которая в комплексе со специальной теломеразной РНК и дополнительными факторами осуществляет реакцию матричного удлинения теломер.

Каталитическая субъединица теломеразы (TERT) содержит три консервативных домена: РНК-связывающий домен (TRBD), центральный домен, содержащий активный центр фермента и короткий С-концевой домен, аналогичный «большому пальцу» ДНК-полимеразы (рис.6) [Autexier, 2006] .

Рисунок 6. Доменная организация TERTразных организмов и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (HIV) [Рубцова, 2012].

Обратные транскриптазы некоторых организмов также содержат N-концевой домен TEN, который принимает участие в связывании праймера, стабилизируя РНК-ДНК дуплекс в активном сайте, и обеспечивает процессивность фермента при добавлении теломерных повторов [Akiyama, 2013; Nguyen, 2018; Wu, 2018]. На сегодняшний день опубликованы две структуры высокого разрешения TEN домена TERT - TEN простейшего Tetrahymena thermophila [Jacobs, 2006] и дрожжей Hansenula polymorpha [Petrova, 2018]. Следствием удаления TEN домена в T.thermophila является

полная потеря теломеразной активности [Jacobs, 2005]. TEN H.polymorpha, по-видимому, ограничивает размер гетеродуплекса между матричным участком теломеразной РНК и теломерной ДНК при синтезе теломерного повтора [Petrova, 2018]. hTEN обеспечивает процессивность фермента и участвует в привлечении теломеразного комплекса на теломеры, взаимодейстуя с теломерными белками POT1-TPP1 [Wang, 2007; Zaug, 2010].

Альтернативный сплайсинг первичного транскрипта гена обратной транскриптазы человека (hTERT) приводит к образованию 13 разных типов мРНК. а- и Р-формы мРНК hTERT являются наиболее распространенными и достаточно хорошо изученными. Сплайсинг может проходить в разных сайтах независимо друг от друга, поэтому в клетках часто сосуществуют разные формы мРНК hTERT. Предполагается, что регуляторные функции, выполняемые продуктами альтернативного сплайсинга hTERT, зависят от типа клеток. На ранних стадиях эмбрионального развития человека все ткани содержат полноразмерную мРНК hTERT, а в процессе дифференцировки набор вариантов этой мРНК меняется в разных тканях [Hisatomi, 1998].

Важную роль в регуляции работы теломеразы играет обратимое фосфорилирование TERT. Биоинформатический анализ первичной структуры hTERT свидетельствует о наличии неспецифических участков фосфорилирования. Однако только для нескольких из них показана модификация, которая влияет на активность фермента [Wojtyla, 2011].

1.2.3.2. Вспомогательные белки

Помимо обратной транскриптазы теломеразный комплекс всегда содержит несколько вспомогательных белков, взаимодействующих как с TERT, так и с теломеразной РНК. Роль большинства вспомогательных белков

заключается в формировании активного теломеразного комплекса или процессинге теломеразной РНК. Функции некоторых белков до сих пор не ясны. Набор дополнительных факторов теломеразного комплекса у эукариот различается, что связано с принципиальными отличиями биогенеза теломеразной РНК у этих организмов [Witkin, 2004].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Нарайкина Юлия Валерьевна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ahmed S. и др. Telomerase does not counteract telomere shortening but protects mitochondrial function under oxidative stress // J. Cell Sci. 2008. Т. 121. С. 10461053.

2. Akiyama B.M., Gomez A., Stone M.D. A conserved motif in tetrahymena thermophila telomerase reverse transcriptase is proximal to the RNA template and is essential for boundary definition // J. Biol. Chem. 2013. Т. 288. № 30. С. 2214122149.

3. Ali M. и др. Telomerase reverse transcriptase induces basal and amino acid starvation-induced autophagy through mTORC1 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2016. Т. 478. № 3. С. 1198-1204.

4. Arora R., Brun C.M., Azzalin C.M. Transcription regulates telomere dynamics in human cancer cells // RNA. 2012. Т. 18. С. 684-693.

5. Autexier C., Lue N.F. The Structure and Function of Telomerase Reverse Transcriptase // Annu. Rev. Biochem. 2006. Т. 75. № 1. С. 493-517.

6. Belair C.D. и др. Telomerase activity: A biomarker of cell proliferation, not malignant transformation // J. Urol. 1998. Т. 160. № 2. С. 620-621.

7. Blackburn E.H., Greider C.W., Szostak J.W. Telomeres and telomerase: The path from maize, Tetrahymena and yeast to human cancer and aging // Nat. Med. 2006. Т. 12. № 10. С. 1133-1138.

8. Blasco M.A. Telomeres and cancer: A tale with many endings // Curr. Opin. Genet. Dev. 2003. Т. 13. № 1. С. 70-76.

9. Bogdanov A.A. Теломеры и теломераза // Соровский образовательный журнал. 1998. № 12. С. 12-18.

10. Bollmann F.M. The many faces of telomerase : emerging extratelomeric effects

// BioEssays. 2008. T. 30. C. 728-732.

11. Bosoy D., Lue N.F. Yeast telomerase is capable of limited repeat addition processivity // Nucleic Acids Res. 2004. T. 32. № 1. C. 93-101.

12. Box J.A. h gp. Spliceosomal cleavage generates the 3 9 end of telomerase RNA // Nature. 2008. T. 456. № 7224. C. 910-914.

13. Brachner A. h gp. Telomerase- and alternative telomere lengthening-independent telomere stabilization in a metastasis-derived human non-small cell lung cancer cell line: Effect of ectopic hTERT // Cancer Res. 2006. T. 66. № 7. C. 3584-3592.

14. Bryan T.M. h gp. The telomere lengthening mechanism in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit // Hum. Mol. Genet. 1997. T. 6. № 6. C. 921-926.

15. Buchan J.R. h gp. Eukaryotic stress granules are cleared by autophagy and Cdc48/VCP function // Cell. 2013. T. 153. № 7. C. 1461-1474.

16. Bufalo D. Del h gp. Involvement of hTERT in apoptosis induced by interference with Bcl-2 expression and function // Cell Death Differ. 2005. T. 12. C. 1429-1438.

17. Canela A. h gp. Constitutive expression of tert in thymocytes leads to increased incidence and dissemination of T-cell lymphoma in Lck-Tert mice. // Mol. Cell. Biol. 2004. T. 24. № 10. C. 4275-93.

18. Cao Y. h gp. TERT regulates cell survival independent of telomerase enzymatic activity // Oncogene. 2002. T. 21. № 20. C. 3130-3138.

19. Chapon C., Cech T.R., Zaug A.J. Polyadenylation of telomerase RNA in budding yeast // RNA. 1997. T. 3. C. 1337-1351.

20. Chen J.L., Blasco M.A., Greider C.W. Secondary structure of vertebrate telomerase RNA // Cell. 2000. T. 100. № 5. C. 503-514.

21. Cheng H. h gp. Telomerase deficiency delays renal recovery in mice after

ischemia-reperfusion injury by impairing autophagy // Kidney Int. 2015. T. 88. № 1. C. 85-94.

22. Cheng Y. h gp. Mitochondrial Trafficking and Processing of Telomerase RNA // CellReports. 2018. T. 24. № 10. C. 2589-2595.

23. Chiodi I., Mondello C. Telomere-independent functions of telomerase in nuclei, cytoplasm, and mitochondria // Front. Oncol. 2012. T. 2. № September. C. 1-7.

24. Chugunova A. h gp. Mining for Small Translated ORFs // J. Proteome Res. 2018. T. 17. № 1. C. 1-11.

25. Cohen S.B. h gp. Active Human Telomerase from Immortal Cells Protein Composition of Catalytically // Science. 2007. T. 315. № 5820. C. 1850-1853.

26. Collins K. Mammalian telomeres and telomerase // Curr. Opin. Cell Biol. 2000. T. 12. C. 378-383.

27. Collins K. The biogenesis and regulation of telomerase holoenzymes // Nat Rev Mol Cell Biol. 2010. T. 7. № 7. C. 484-494.

28. Collins K., Greider C.W. Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation // Genes Dev. 1993. T. 7. C. 1364-1376.

29. Cong Y., Wright W.E., Shay J.W. Human Telomerase and Its Regulation Human Telomerase and Its Regulation // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. T. 66. № 3. C. 407.

30. Coy S. h gp. The Sm Complex Is Required for the Processing of Non- Coding RNAs by the Exosome // PLoS One. 2013. T. 8. № 6. C. e65606.

31. Ding D. h gp. Human telomerase reverse transcriptase regulates MMP expression independently of telomerase activity via NF-KB-dependent transcription // FASEB J. 2013. T. 27. № 11. C. 4375-4383.

32. Dragon F., Pogacic V., Filipowicz W. In vitro assembly of human H/ACA small nucleolar RNPs reveals unique features of U17 and telomerase RNAs. // Mol. Cell.

Biol. 2000. T. 20. № 9. C. 3037-48.

33. Dudognon C. h gp. Death receptor signaling regulatory function for telomerase: hTERT abolishes TRAIL-induced apoptosis, independently of telomere maintenance // Oncogene. 2004. T. 23. № 45. C. 7469-7474.

34. Dyson H.J., Wright P.E. Intrinsically unstructured proteins and their functions // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. T. 6. № 3. C. 197-208.

35. Egan E.D., Collins K. Specificity and Stoichiometry of Subunit Interactions in the Human Telomerase Holoenzyme Assembled In Vivo // Mol. Cell. Biol. 2010. T. 30. № 11. C. 2775-2786.

36. Egan E.D., Collins K. An Enhanced H/ACA RNP Assembly Mechanism for Human Telomerase RNA // Mol. Cell. Biol. 2012a. T. 32. № 13. C. 2428-2439.

37. Egan E.D., Collins K. Biogenesis of telomerase ribonucleoproteins // RNA. 2012b. T. 18. № 10. C. 1747-1759.

38. Errington T.M. h gp. Disease-Associated Human Telomerase RNA Variants Show Loss of Function for Telomere Synthesis without Dominant-Negative Interference // Mol. Cell. Biol. 2008. T. 28. № 20. C. 6510-6520.

39. Feng J. h gp. The RNA component of human telomerase. // Science. 1995. T. 269. № 5228. C. 1236-1241.

40. Feng Y. h gp. The machinery of macroautophagy // Nat. Publ. Gr. 2013. T. 24. № 1. C. 24-41.

41. Fiset S., Chabot B. hnRNP A1 may interact simultaneously with telomeric DNA and the human telomerase RNA in vitro. // Nucleic Acids Res. 2001. T. 29. № 11. C. 2268-2275.

42. Ford L.P. h gp. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1 and C2 associate with the RNA component of human telomerase. // Mol. Cell. Biol. 2000. T. 20. № 23. C. 9084-9091.

43. Ford L.P., Shay J.W., Wright W.E. The La antigen associates with the human telomerase ribonucleoprotein and influences telomere length in vivo // RNA. 2001. T. 7. № 8. C. 1068-1075.

44. Forman-Kay J.D. M.T. From Sequence and Forces to Structure, Function and Evolution of Intrinsically Disordered Proteins Julie // Structure. 2015. T. 18. № 3. C. 386-392.

45. Forsythe H.L. h gp. Stable Association of hsp90 and p23, but Not hsp70, with Active Human Telomerase // J. Biol. Chem. 2001. T. 276. № 19. C. 15571-15574.

46. Gallardo F., Chartrand P. Telomerase biogenesis: The long road before getting to the end // RNA Biol. 2008. T. 5. № 4. C. 212-215.

47. Gazzaniga F.S., Blackburn E.H. An antiapoptotic role for telomerase RNA in human immune cells independent of telomere integrity or telomerase enzymatic activity // Blood. 2014. T. 124. № 25. C. 3675-3684.

48. Ghosh A. h gp. Telomerase directly regulates NF-B-dependent transcription // Nat. Cell Biol. 2012. T. 14. № 12. C. 1270-1281.

49. Gillis A.J., Schuller A.P., Skordalakes E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT // Nature. 2008. T. 455. № 7213. C. 633-637.

50. Glick D., Barth S., Macleod K.F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms // J Pathol. 2010. T. 221. № 1. C. 3-12.

51. Goldfarb K.C., Cech T.R. 3' terminal diversity of MRP RNA and other human noncoding RNAs revealed by deep sequencing // BMC Mol. Biol. 2013. T. 14. № 1. C. 1.

52. Greider C.W. Telomere Length Regulation // Annu. Rev. Biochem. 1996. T. 65. № 1. C. 337-365.

53. Greider C.W., Blackburn E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in tetrahymena extracts // Cell. 1985. T. 43. № 2 PART 1. C. 405-413.

54. Guttman M., Russell P., Ingolia N.T., Weissman J.S. L. Ribosome profiling provides evidence that large non-coding RNAs do not encode proteins // Cell. 2014. T. 154. № 1. C. 240-251.

55. Haendeler J. h gp. Hydrogen Peroxide Triggers Nuclear Export of Telomerase Reverse Transcriptase via Src Kinase Family-Dependent Phosphorylation of Tyrosine 707 // 2003. T. 23. № 13. C. 4598-4610.

56. Haendeler J. h gp. Antioxidants Inhibit Nuclear Export of Telomerase Reverse Transcriptase and Delay Replicative Senescence of // 2004. C. 768-775.

57. Haendeler J. h gp. Mitochondrial Telomerase Reverse Transcriptase Binds to and Protects Mitochondrial DNA and Function From Damage // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009. T. 29. C. 929-935.

58. Hagen K.G. Ten h gp. Replication timing of DNA sequences associated with human centromeres and telomeres. // Mol. Cell. Biol. 1990. T. 10. № 12. C. 63486355.

59. Hamma T., Ferre-D'Amare A.R. The box H/ACA ribonucleoprotem complex: Interplay of RNA and protein structures in post-transcriptional RNA modification // J. Biol. Chem. 2010. T. 285. № 2. C. 805-809.

60. Harrington L. h gp. A Mammalian Telornerase-Associated Protein // Science. 1997. T. 275. C. 973-977.

61. Harrington L. h gp. Polymerization defects within human telomerase are distinct from telomerase RNA and TEP1 binding. // Mol. Biol. Cell. 2000. T. 11. № 10. C. 3329-40.

62. Heesch S. Van h gp. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes // Genome Biol. 2014. T. 15. № 1. C. 1-12.

63. Hisatomi H., Ohyashiki K. Expression profile of a gamma-deletion variant of the human telomerase reverse transcriptase gene // Neoplasia. 2003. T. 5. № 3. C.

193-197.

64. Hoffmeyer K. h gp. Wnt/p-catenin signaling regulates telomerase in stem cells and cancer cells // Science. 2012. T. 336. № 6088. C. 1549-1554.

65. Holt S.E. h gp. Functional requirement of p23 and Hsp90 in telomerase complexes // Genes Dev. 1999. T. 13. № 7. C. 817-826.

66. Huang Y. h gp. Non-coding RNAs and diseases // Mol. Biol. 2013. T. 47. № 4. C. 465-475.

67. Huard S. h gp. Human telomerase catalyzes nucleolytic primer cleavage // Nucleic Acids Res. 2004. T. 32. № 7. C. 2171-2180.

68. Hultqvist G. h gp. Emergence and evolution of an interaction between intrinsically disordered proteins // Elife. 2017. T. 6. C. 1-25.

69. Ilgen Mender S.J.W. Telomerase Repeated Amplification Protocol (TRAP) // Bio Protoc. 2015. T. 25. № 4. C. 368-379.

70. Ingolia N.T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale // Nat. Rev. Genet. 2014. T. 15. № 3. C. 205-213.

71. Ito-Harashima S. h gp. Translation of the poly(A) tail plays crucial roles in nonstop mRNA surveillance via translation repression and protein destabilization by proteasome in yeast // Genes Dev. 2007. T. 21. № 5. C. 519-524.

72. Jacobs S.A. h gp. Soluble domains of telomerase reverse transcriptase identified by high-throughput screening // Protein Sci. 2005. T. 14. C. 2051-2058.

73. Jacobs S.A., Podell E.R., Cech T.R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase // Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. T. 13. № 3. C. 218-225.

74. Jady B.E., Bertrand E., Kiss T. Human telomerase RNA and box H/ACA scaRNAs share a common Cajal body - specific localization signal // J. Cell Biol. 2004. T. 164. № 5. C. 647-652.

75. Jady B.E., Richard Patricia, Bertrand Edouard K.T. Cell Cycle-dependent Recruitment of Telomerase RNA and Cajal Bodies to Human Telomeres // Mol. Biol. Cell. 2006. T. 17. № 2. C. 944-954.

76. Jaiswal R.K., Kumar P., Yadava P.K. Telomerase and its extracurricular activities // Cell. Mol. Biol. Lett. 2013. T. 18. № 4. C. 538-554.

77. Jiang J. h gp. The architecture of Tetrahymena telomerase holoenzyme // Nature. 2013. T. 496. № 7444. C. 187-192.

78. Jiang J. h gp. Structure of Telomerase with Telomeric DNA // Cell. 2018. T. 173. № 5. C. 1179-1190.e13.

79. Joung I., Strominger J.L., Shin J. Molecular cloning of a phosphotyrosine-independent ligand of the p56lck SH2 domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. T. 93. № 12. C. 5991-5995.

80. Kabeya Y. h gp. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing // EMBO J. 2000. T. 19. № 21. C. 5720-5728.

81. Karlseder J. h gp. The telomeric protein TRF2 binds the ATM Kinase and Can Inhibit the ATM-dependent DNA damage response // PLoS Biol. 2004. T. 2. № 8.

82. Kedde M. h gp. Telomerase-independent regulation of ATR by human telomerase RNA // J. Biol. Chem. 2006. T. 281. № 52. C. 40503-40514.

83. Kiss T., Fayet-Lebaron E., Jady B.E. Box H/ACA Small Ribonucleoproteins // Mol. Cell. 2010. T. 37. № 5. C. 597-606.

84. Koh C.M. h gp. Telomerase regulates MYC-driven oncogenesis independent of its reverse transcriptase activity // J. Clin. Invest. 2015. T. 125. № 5. C. 2109-2122.

85. Koukourakis M.I. h gp. Autophagosome Proteins LC3A , LC3B and LC3C Have Distinct Subcellular Distribution Kinetics and Expression in Cancer Cell Lines // PLoS One. 2015. T. 10. № 9. C. 1-13.

86. Kovalenko N.A., Zhdanov D.D., Kovalenko T.F. Possibilities and Effects of Telomerase Activation // Mol. Bio. 2013. T. 47. № 4. C. 476-487.

87. Kozak M. Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic // Nucleic Acids Res. 1984. T. 12. № 2. C. 857-872.

88. Kuhlow D. h gp. Telomerase deficiency impairs glucose metabolism and insulin secretion // Aging (Albany. NY). 2010. T. 2. № 10. C. 650-658.

89. Lange T. De. Human telomeres // EMBO J. 1992. T. 1. № 2. C. 717-724.

90. Lange T. De. Protection of mammalian telomeres // Oncogene. 2002. T. 21. № 4 REV. ISS. 1. C. 532-540.

91. Le S., Sternglanz R., Greider C.W. Identification of Two RNA-binding Proteins Associated with Human Telomerase RNA // Mol. Biol. Cell. 2000. T. 11. № March. C. 999-1010.

92. Lee J.-A. Autophagy manages disease-associated stress granules // Oncotarget. 2015. T. 6. № 31. C. 30421-30422.

93. Lee J. h gp. TERT promotes cellular and organismal survival independently of telomerase activity // Oncogene. 2008. T. 27. № 26. C. 3754-3760.

94. Legassie J.D., Jarstfer M.B. The Unmasking of Telomerase // Structure. 2006. T. 14. № 11. C. 1603-1609.

95. Li S. h gp. Rapid Inhibition of Cancer Cell Growth Induced by Lentiviral Delivery and Expression of Mutant-Template Telomerase RNA and Anti-telomerase Short-Interfering RNA // 2004. C. 4833-4840.

96. Li X. h gp. Proteomic analyses reveal distinct chromatin-associated and soluble transcription factor complexes // Mol. Syst. Biol. 2015. T. 11. № 1. C. 775-775.

97. Li X. h gp. Defining the Protein-Protein Interaction Network of the Human Protein Tyrosine Phosphatase Family // Mol. Cell. Proteomics. 2016. T. 15. № 9. C. 3030-3044.

98. Lin C., Yang D. Telomeres and Telomerase // Methods Mol. Biol. 2017. T. 1587. C. 171-196.

99. Lindsey J. h gp. In vivo loss of telomeric repeats with age in humans // Mutat. Res. 1991. T. 256. № 1. C. 45-48.

100. Loayza D., Lange T. De. POT1 as a terminal transducer of TRF1 telomere length control // Nature. 2003. T. 423. № 6943. C. 1013-1018.

101. Lu W. h gp. Telomeres-structure, function, and regulation // Exp. Cell Res. 2013. T. 319. № 2. C. 133-141.

102. Lue N.F. Characterization of the Interaction between the Nuclease and Reverse Transcriptase Activity of the Yeast Telomerase Complex // Mol. Cell. Biol. 2000. T. 20. № 18. C. 6806-6815.

103. Lue N.F. Adding to the ends: What makes telomerase processive and how important is it? // BioEssays. 2004. T. 26. № 9. C. 955-962.

104. Lue N.F. h gp. Telomerase can act as a template- and RNA-independent terminal transferase // 2005. № Track II.

105. Maenner S., Müller M., Becker P.B. Roles of long, non-coding RNA in chromosome-wide transcription regulation: Lessons from two dosage compensation systems // Biochimie. 2012. T. 94. № 7. C. 1490-1498.

106. Mahboubi H. h gp. Identification of Novel Stress Granule Components That Are Involved in Nuclear Transport // PLoS One. 2013. T. 8. № 6.

107. Maida Y. h gp. An RNA dependent RNA polymerase formed by hTERT and the RNase MRP RNA // Nature. 2009. T. 461. № 7261. C. 230-235.

108. Majerska J., Sykorova E., Fajkus J. Non-telomeric activities of telomerase // Mol. Biosyst. 2011. T. 7. № 4. C. 1013-1023.

109. Makino N. h gp. Calorie restriction increases telomerase activity, enhances autophagy, and improves diastolic dysfunction in diabetic rat hearts // Mol. Cell.

Biochem. 2015. T. 403. № 1-2.

110. Mammucari C. h gp. Article FoxO3 Controls Autophagy in Skeletal Muscle In Vivo // Cell Metab. 2007. № 6. C. 458-471.

111. Marino G., Niso-Santano M., Baehrecke E.H. K.G. Self-consumption: the interplay of autophagy and apoptosis Guillermo // Nat Rev Mol Cell Biol. 2014. T. 15. № 2. C. 81-94.

112. Markmiller S. h gp. Context-Dependent and Disease-Specific Diversity in Protein Interactions within Stress Granules // Cell. 2018. T. 172. № 3. C. 590-604.e13.

113. Martinez P. h gp. Mammalian Rap1 controls telomere function and gene expression through binding to telomeric and extratelomeric sites // Nat. Cell Biol. 2010. T. 12. № 8. C. 768-780.

114. Masutomi K. h gp. The telomerase reverse transcriptase regulates chromatin state and DNA damage responses. // Proc. Natl. Acad. Sci. {U.S.A.}. 2005. T. 102. № 23. C. 8222-8227.

115. Matera A.G., Terns R.M., Terns M.P. Non-coding RNAs: Lessons from the small nuclear and small nucleolar RNAs // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. T. 8. № 3. C. 209-220.

116. Mattson M.P., Fu W., Zhang P. Emerging roles for telomerase in regulating cell differentiation and survival: a neuroscientist ' s perspective // 2001. T. 122. C. 659671.

117. McClintock B., Hill H.E. The Cytological Identification of the Chromosome Associated with the R-G Linkage Group in ZEA MAYS. // Genetics. 1931. T. 16. № 2. C. 175-90.

118. Mercer T.R., Dinger M.E., Mattick J.S. Long non-coding RNAs: Insights into functions // Nat. Rev. Genet. 2009. T. 10. № 3. C. 155-159.

119. Michel A.M. h gp. GWIPS-viz: Development of a ribo-seq genome browser //

Nucleic Acids Res. 2014. T. 42. № D1. C. 859-864.

120. Miller M.C., Collins K. Telomerase recognizes its template by using an adjacent RNA motif // Proc. Natl. Acad. Sci. 2002. T. 99. № 10. C. 6585-6590.

121. Mitchell J.R., Cheng J., Collins K. A Box H/ACA Small Nucleolar RNA-Like Domain at the Human Telomerase RNA 3' End // Mol. Cell. Biol. 1999. T. 19. № 1. C. 567-576.

122. Mitchell J.R., Collins K. Human telomerase activation requires two independent interactions between telomerase RNA and telomerase reverse transcriptase // Mol. Cell. 2000. T. 6. № 2. C. 361-371.

123. Mitchell J.R., Wood E., Collins K. A telomerase component is defective in the human disease dyskeratosis congenita // Nat. let. 1999. T. 3. C. 551-555.

124. Muers M. RNA: Genome-wide views of long non-coding RNAs // Nat. Rev. Genet. 2011. T. 12. № 11. C. 742-743.

125. Nagano T., Fraser P. Emerging similarities in epigenetic gene silencing by long noncoding RNAs // Mamm. Genome. 2009. T. 20. № 9-10. C. 557-562.

126. Ngounou Wetie A.G. h gp. Protein-protein interactions: Switch from classical methods to proteomics and bioinformatics-based approaches // Cell. Mol. Life Sci. 2014. T. 71. № 2. C. 205-228.

127. Nguyen D. h gp. A Polyadenylation-Dependent 3' End Maturation Pathway Is Required for the Synthesis of the Human Telomerase RNA // Cell Rep. 2015. T. 13. № 10. C. 2244-2257.

128. Nguyen T.H.D. h gp. Cryo-EM structure of substrate-bound human telomerase holoenzyme // Nature. 2018. T. 557. № 7704. C. 190-195.

129. Oganesian L., Bryan T.M. Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target // BioEssays. 2007. T. 29. № 2. C. 155-165.

130. Oh H. h gp. Telomerase reverse transcriptase promotes cardiac muscle cell

proliferation , hypertrophy , and survival // PNAS. 2001. T. 98. № 18. C. 1030810313.

131. Ollis D.L. h gp. Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with dTMP // Nature. 1985. T. 313. № 6005. C. 762-766.

132. Olovnikov A.M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon // J. Theor. Biol. 1973. T. 41. № 1. C. 181-190.

133. Oulton R., Harrington L. A Human Telomerase-associated Nuclease // Mol. Biol. Cell. 2004. T. 15. C. 3244-3256.

134. Palm W., Lange T. de. How Shelterin Protects Mammalian Telomeres // Annu. Rev. Genet. 2008. T. 42. № 1. C. 301-334.

135. Panero J., Santos P. Dos, Slavutsky I. Telomere protein complexes and their role in lymphoid malignancies // Front. Biosci. - Sch. 2017. T. 9. № 1. C. 17-30.

136. Pankiv S. h gp. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy*[S] // J. Biol. Chem. 2007. T. 282. № 33. C. 24131-24145.

137. Park O.K., Schaefer T.S., Nathans D. In vitro activation of Stat3 by epidermal growth factor receptor kinase. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. T. 93. № 24. C. 13704-13708.

138. Park Y.P. h gp. Human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT): A target molecule for the treatment of cisplatin-resistant tumors // Korean J. Lab. Med. 2008. T. 28. № 6. C. 430-437.

139. Perrault S.D., Hornsby P.J., Betts D.H. Global gene expression response to telomerase in bovine adrenocortical cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. T. 335. C. 925-936.

140. Petrova O.A. h gp. Structure and function of the N-terminal domain of the yeast telomerase reverse transcriptase // Nucleic Acids Res. 2018. T. 46. № 3. C. 1525-

141. Podlevsky J.D. h gp. The Telomerase Database // Nucleic Acids Res. 2008. T. 36. № SUPPL. 1. C. 339-343.

142. Podlevsky J.D. C.J.J.-L. It all comes together at the ends: Telomerase structure, function, and biogenesis Joshua // Mutat Res. 2012. T. 1. C. 1-19.

143. Pogacic V., Dragon F., Filipowicz W. Human H/ACA small nucleolar RNPs and telomerase share evolutionarily conserved proteins NHP2 and N0P10. // Mol. Cell. Biol. 2000. T. 20. № 23. C. 9028-9040.

144. Qi X. h gp. The common ancestral core of vertebrate and fungal telomerase RNAs // Nucleic Acids Res. 2013. T. 41. № 1. C. 450-462.

145. Qi X. h gp. Prevalent and distinct spliceosomal 3'-end processing mechanisms for fungal telomerase RNA Xiaodong // Nat. Commun. 2015. T. 2. C. 1-8.

146. Rahman R., Latonen L., Wiman K.G. hTERT antagonizes p53-induced apoptosis independently of telomerase activity // Oncogene. 2005. T. 24. № 8. C. 1320-1327.

147. Redon S., Reichenbach P., Lingner J. The non-coding RNA TERRA is a natural ligand and direct inhibitor of human telomerase // Nucleic Acids Res. 2010. T. 38. № 17. C. 5797-5806.

148. Rhodes D., Lipps H.J. Survey and summary G-quadruplexes and their regulatory roles in biology // Nucleic Acids Res. 2015. T. 43. № 18. C. 8627-8637.

149. Rice C. h gp. Structural and functional analysis of the human P0T1-TPP1 telomeric complex // Nat. Commun. 2017. T. 8. C. 1-13.

150. Riethman H., Ambrosini A., Paul S. Human subtelomere structure and variation // Chromosom. Res. 2005. T. 13. № 5. C. 505-515.

151. Roberts D.J., Miyamoto S. Hexokinase II integrates energy metabolism and cellular protection: Akting on mitochondria and TORCing to autophagy // Cell

Death Differ. 2015. T. 22. № 2. C. 248- 257.

152. Roh J. Il h gp. Hexokinase 2 is a molecular bridge linking telomerase and autophagy // PLoS One. 2018. T. 13. № 2. C. 1-14.

153. Rosner M., Schipany K., Hengstschläger M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle // Nat. Protoc. 2013. T. 8. № 3. C. 602-626.

154. Rotblat B., Leprivier G., Sorensen P.H.B. A possible role for long non-coding RNA in modulating signaling pathways // Med. Hypotheses. 2011. T. 77. № 6. C. 962-965.

155. Saksela K., Permi P. SH3 domain ligand binding: What's the cons ensus and where's the specificity? // FEBS Lett. 2012. T. 586. № 17. C. 2609-2614.

156. Sancar A. h gp. Molecular Mechanisms of Mammalian DNA Repair and the DNA Damage Checkpoints // Annu. Rev. Biochem. 2004. T. 73. № 1. C. 39-85.

157. Santos J.H., Meyer J.N., Houten B. Van. Mitochondrial localization of telomerase as a determinant for hydrogen peroxide-induced mitochondrial DNA damage and apoptosis // Hum. Mol. Genet. 2006. T. 15. № 11. C. 1757-1768.

158. Sarin K.Y. et al. Conditional telomerase induction causes proliferation of hair follicle stem cells // Nature. 2005. T. 436. C. 1048-1052.

159. Sauerwald A. h gp. Structure of Active, Dimeric Human Telomerase // Nat. Struct. Mol. Biol. 2013. T. 20. № 4. C. 454-460.

160. Schmidt J.C., Cech T.R. Human telomerase: biogenesis , trafficking , recruitment , and activation // Genes Dev. 2015. T. 29. C. 1095-1105.

161. Seimiya H. h gp. Involvement of 14-3-3 proteins in nuclear localization of telomerase. // EMBO J. 2000. T. 19. № 11. C. 2652-61.

162. Sharma G.G. h gp. hTERT associates with human telomeres and enhances

genomic stability and DNA repair // Oncogene. 2003. T. 22. № 1. C. 131146.

163. Sharma N.K. h gp. Human telomerase acts as a hTR-independent reverse transcriptase in mitochondria // Nucleic Acids Res. 2012. T. 40. № 2. C. 712-725.

164. Shay J.W. Role of Telomeres and Telomerase in Aging and Cancer Jerry // Cancer Discov. 2017. T. 6. № 6. C. 584-593.

165. Shay J.W., Bacchetti S. A Survey of Telomerase Activity in Human Cancer // Eur. J. Cancer. 1997. T. 33. № 5. C. 787-791.

166. Shay J.W., Wright W.E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase // Carcinogenesis. 2005. T. 26. № 5. C. 867-874.

167. Shin K.H. h gp. Introduction of human telomerase reverse transcriptase to normal human fibroblasts enhances DNA repair capacity // Clin Cancer Res. 2004. T. 10. № 7. C. 2551-60.

168. Shukla S. h gp. Inhibition of telomerase RNA decay rescues telomerase deficiency caused by dyskerin or PARN defects // Nat. Struct. Mol. Biol. 2016. T. 23. № 4. C. 286-292.

169. Simonsen J.L. h gp. Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the osteogenic potential of human bone marrow stromal cells // Nat. Biotechnol. 2002. T. 20. № June.

170. Skvortsov D.A. h gp. Telomerase as a potential marker for early diagnosing cervical carcinoma // Dokl Biochem Biophys. 2006. T. 408. № June. C. 158-160.

171. Smekalova E.M. h gp. Specific features of telomerase RNA from Hansenula polymorpha // RNA. 2013. C. 1563-1574.

172. Smith L.L., Coller H.A., Roberts J.M. Telomerase modulates expression of growth-controlling genes and enhances cell proliferation // Nat. Cell Biol. 2003. T. 5. C. 474-479.

173. Somanathan, Indira B.C. A bioinformatics approach to identifytelomere sequences // Biotechniques. 2018. T. 65. № 1. C. 20-25.

174. Sullivan R.J.O., Karlseder J. Telomeres : protecting chromosomes against genome instability // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. T. 11. № 3. C. 171-181.

175. Teixeira M.T. h gp. Intracellular trafficking of yeast telomerase components // EMBO Rep. 2002. T. 3. № 7. C. 652-659.

176. Theimer C.A. h gp. Structural and Functional Characterization of Human Telomerase RNA Processing and Cajal Body Localization Signals // Mol. Cell. 2007. T. 27. № 6. C. 869-881.

177. Theimer C.A., Feigon J. Structure and function of telomerase RNA // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. T. 16. № 3. C. 307-318.

178. Tompa P. The interplay between structure and function in intrinsically unstructured proteins // FEBS Lett. 2005. T. 579. № 15. C. 3346-3354.

179. Tseng C.K. h gp. Human Telomerase RNA Processing and Quality Control // Cell Rep. 2015. T. 13. № 10. C. 2232-2243.

180. Tzfati Y. h gp. Template Boundary in a Yeast Telomerase Specified by RNA Structure // Science. 2000. T. 288. № 5467. C. 863-867.

181. Ulaner G. a h gp. Telomerase Activity in Human Development Is Regulated by Human Telomerase Reverse Transcriptase ( hTERT ) Transcription and by Alternate Splicing of hTERT Transcripts Telomerase Activity in Human Development Is Regulated by Human Telomerase Reverse Transc // Cancer Res. 1998. T. 58. № 31. C. 4168-4172.

182. Vasilkova D. V. h gp. Dynamics of human telomerase RNA structure revealed by antisense oligonucleotide technique // Biochimie. 2013. T. 95. № 12. C. 24232428.

183. Venteicher A.S. h gp. A human telomerase holoenzyme protein required for Cajal body localization and telomere synthesis // Science. 2009. T. 323. № 5914. C.

644-648.

184. Vizcaino J.A. h gp. 2016 update of the PRIDE database and its related tools // Nucleic Acids Res. 2016. T. 44. № D1. C. D447-D456.

185. Vogan J.M., Collins K. Dynamics of human telomerase holoenzyme assembly and subunit exchange across the cell cycle // J. Biol. Chem. 2015. T. 290. № 35. C. 21320-21335.

186. Volinsky N., Kholodenko B.N. Complexity of Receptor Tyrosine Kinase Signal Processing // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013. № 5. C. 1-16.

187. Wang C., Meier U.T. Architecture and assembly of mammalian H/ACA small nucleolar and telomerase ribonucleoproteins // EMBO J. 2004. T. 23. №2 8. C. 18571867.

188. Wang F. h gp. The POT1 - TPP1 telomere complex is a telomerase processivity factor // Nature. 2007. T. 445. № February. C. 506-510.

189. Wang P., Ren Z., Sun P. Overexpression of the long non-coding RNA MEG3 impairs in vitro glioma cell proliferation // J. Cell. Biochem. 2012. T. 113. № 6. C. 1868-1874.

190. Wang Y. h gp. Structural conservation in the template/pseudoknot domain of vertebrate telomerase RNA from teleost fish to human // Proc. Natl. Acad. Sci. 2016. T. 113. № 35. C. E5125-E5134.

191. Watson J.D. Origin of concatemeric T7 DNA // Nat. New Biol. 1972. T. 239. № 94. C. 197-201.

192. Weber K. h gp. A multicolor panel of novel lentiviral «gene ontology» (LeGO) vectors for functional gene analysis // Mol. Ther. 2008. T. 16. № 4. C. 698-706.

193. Wenz C. h gp. Human telomerase contains two cooperating telomerase RNA molecules // EMBO J. 2001. T. 20. № 13. C. 3526-3534.

194. Wilkins M.R. h gp. Protein Identification and Analysis Tools in the ExPASy

Server // Methods Mol. Biol. 2005. T. 112. C. 531-552.

195. Wilson M.I. h gp. PB1 Domain-Mediated Heterodimerization in NADPH Oxidase and Signaling Complexes of Atypical Protein Kinase C with Par6 and p62 // Mol. Cell. 2003. T. 12. C. 39-50.

196. Wilusz J.E., Sunwoo H., Spector D.L. Long noncoding RNAs: Functional surprises from the RNA world // Genes Dev. 2009. T. 23. № 13. C. 1494-1504.

197. Witkin K.L., Collins K. Holoenzyme proteins required for the physiological assembly and activity of telomerase // Genes Dev. 2004. T. 18. № 10. C. 1107-1118.

198. Wojtyla A., Gladych M., Rubis B. Human telomerase activity regulation // Mol. Biol. Rep. 2011. T. 38. № 5. C. 3339-3349.

199. Wright W.E. h gp. Normal human telomeres are not late replicating // Exp. Cell Res. 1999. T. 251. № 2. C. 492-499.

200. Wright W.E., Shay J.W. Historical claims and current interpretations of replicative aging // Nat. Biotechnol. 2002. T. 20. № 7. C. 682-688.

201. Wu R.A. h gp. Single-molecule imaging of telomerase reverse transcriptase in human telomerase holoenzyme and minimal RNP complexes // Elife. 2015. T. 4. C. 1-26.

202. Wu R.A. h gp. Telomerase Mechanism of Telomere Synthesis R. // Annu. Rev. Biochem. 2018. № 3. C. 439-460.

203. Xi L. h gp. Inhibition of telomerase enhances apoptosis induced by sodium butyrate via mitochondrial pathway // Apoptosis. 2006. T. 11. № 5. C. 789-798.

204. Xiong Y., Eickbush T.H. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences // EMBO J. 1990. T. 9. № 10. C. 3353-62.

205. Xu S. h gp. Proteomic Analysis of the Human CDK Family Reveals a Novel CDK5 Complex Involved in Cell Growth and Migration // Mol. Cell. Proteomics. 2014. T. 66. C. 713-745.

206. Xu Y., Kaminaga K., Komiyama M. G-Quadruplex Formation by Human Telomeric Repeats-Containing RNA in Na Solution G-Quadruplex Formation by Human Telomeric Repeats-Containing RNA in Na + Solution // J. Am. Chem. Soc. 2008. T. 130. № 33. C. 11179-11184.

207. Xu Y., Komiyama M. Structure, function and targeting of human telomere RNA // Methods. 2012. T. 57. № 1. C. 100-105.

208. Yang C. h gp. A Key Role for Telomerase Reverse Transcriptase Unit in Modulating Human Embryonic Stem Cell Proliferation, Cell Cycle Dynamics, and In Vitro Differentiation // Stem Cells. 2008. T. 26. № 4. C. 850-863.

209. Yashima K. h gp. Expression of the RNA component of telomerase during human development and differentiation. // Cell Growth Differ. 1998. T. 9. № 9. C. 805-813.

210. Yi X. h gp. Both Transcriptional and Posttranscriptional Mechanisms Regulate Human Telomerase Template RNA Levels // Mol. Cell. Biol. 1999. T. 19. № 6. C. 3989-3997.

211. Yoshii S.R., Mizushima N. Monitoring and measuring autophagy // Int. J. Mol. Sci. 2017. T. 18. № 9. C. 1-13.

212. Young J.I., Sedivy J.M., Smith J.R. Telomerase Expression in Normal Human Fibroblasts Stabilizes DNA 5-Methylcytosine Transferase I * // J. Biol. Chem. 2003. T. 278. № 22. C. 19904-19908.

213. Yu Guo-Liang, Bradley John D., Attardi Laura D. B.E.H. In vivo alteration of telomere sequences and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs // Nature. 1990. T. 344. № 2. C. 126-132.

214. Zaratiegui M., Irvine D. V., Martienssen R.A. Noncoding RNAs and Gene Silencing // Cell. 2007. T. 128. № 4. C. 763-776.

215. Zaug A.J. h gp. Functional interaction between telomere protein TPP1 and telomerase // Genes Dev. 2010. T. 24. C. 613-622.

216. Zhang Q., Kim N.-K., Feigon J. Architecture of human telomerase RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Т. 108. № 51. С. 20325-20332.

217. Zhou J. и др. Telomerase reverse transcriptase in the regulation of gene expression // BMB rep. 2014. Т. 47. № 1. С. 8-14.

218. Zhu H., Fu W., Mattson M.P. The catalytic subunit of telomerase protects neurons against amyloid beta-peptide-induced apoptosis. // J. Neurochem. 2000. Т. 75. № 1. С. 117-24.

219. Zirkel A. и др. Maturation of mammalian H / ACA box snoRNAs : PAPD5-dependent adenylation and PARN-dependent trimming // RNA. 2012. С. 958-972.

220. Зверева М.Э., Щербакова Д.М., Донцова О.А. ТЕЛОМЕРАЗА: СТРУКТУРА , ФУНКЦИИ // Успехи биологической химии. 2010. Т. 50. С. 155-202.

221. Рубцова М.П. и др. Функции теломеразы : удлинение теломер и не только // Acta Naturae. 2012. Т. 2. № 13. С. 44-61.

222. Рубцова М.П. и др. Особенности процессинга теломеразных РНК дрожжей и человека // Acta Naturae. 2016. Т. 8. № 31. С. 16-25.