Эндоэкологические особенности влияния ингибитора теломеразы aITEL1296 на теломеразную активность в опухолевых клетках и развитие ксенографтной опухоли тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.08, кандидат биологических наук Жданов, Дмитрий Дмитриевич

• Жданов, Дмитрий Дмитриевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Жданов, Дмитрий Дмитриевич

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Структурно-функциональная организация и регуляция функций теломер и теломеразы

1.2 Эндоэкологические особенности теломеразы при минимизации воздействия патогенных факторов окружающей среды

1.3 Роль теломеразы при канцерогенезе и других заболеваниях

1.4 Способы определения теломеразной активности

1.5 Ингибирование ТА 29 Глава 2. Материалы и методы

2.1 Поиск и получение действующего вещества

2.2 Ингибирование ТА в лизатах опухолевых клеток

2.3 Исследование связи ТА с экспрессией ТВ гена НБРЯОа и

гена кТЕЯТ

2.4 Влияние аГГЕЬ1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса

2.5 Ингибирование аГГЕЫ296 вирусной ОТ и компьютерное моделирование взаимодействия а1ТЕЬ 1296 с ИТЕЯТ 5

2.6 Определение действия а1ТЕЕ1296 на культивируемые клетки

2.7 Определение апоптотических клеток и анализ

клеточного цикла

2.8 Исследование противоопухолевой активности аГГЕЬ 1296 59 Глава 3. Результаты и их обсуждение 62 3.1 Поиск и получение а1ТЕЬ 1296

3.2 Ингибирование ТА в лизатах опухолевых клеток

3.3 Исследование связи ТА с экспрессией ТВ гена HSP90a

и гена hTERT

3.4 Влияние aITEL1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса

3.5 Ингибирование aITEL1296 вирусной ОТ и компьютерное моделирование взаимодействия alTEL 1296 с hTERT

3.6 Определение действия ингибитора ТА на

культивируемые клетки

3.7 Изучение совместного действия aITEL1296 и противоопухолевых препаратов на рост опухолевых клеток

3.8 Определение влияния alTEL 1296 на клеточный цикл и

апоптоз в культивируемых клетках

3.9 Изучение противоопухолевой активности alTEL 1296 101 Заключение 208 Выводы ид Литература Ш Благодарности

Список сокращений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат

дТТФ - дезокситимидинтрифосфат

дГТФ - дезоксигуанидинтрифосфат

кДНК - комплементарная ДНК

ОТ - обратная транскрипция

РМЖ - рак молочной железы

ПААГ - полиакриламидный гель

П.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТА - теломеразная активность

ТВ - транскрипционный вариант

ТРО - торможение роста опухоли

HSP - heat shock protein, белок теплового шока

hTR - human telomerase RNA, теломеразная РНК человека

hTERT - human telomerase reverse transcriptase, теломеразная обратная транскриптаза человека

TRAP - telomeric repeat amplification protocol, метод амплификации теломерных повторов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эндоэкологические особенности влияния ингибитора теломеразы aITEL1296 на теломеразную активность в опухолевых клетках и развитие ксенографтной опухоли»

Введение

Актуальность работы

Современное состояние окружающей среды характеризуют как экологический кризис, одной из отличительных черт которого является загрязнение биосферы. Химические, физические и биологические ксенобиотические агенты, воздействуя на организм, вызывают развитие множества патологических состояний, снижающих продолжительность и качество жизни людей. Продолжительность жизни населения является одним из основных параметров, определяющих экологическое благополучие страны. Увеличение продолжительности жизни возможно при минимизации воздействия патогенных факторов окружающей среды на организм, а также при своевременном нивелировании эффектов (терапии заболеваний), вызванных этими факторами. Многие из ксенобиотиков при длительном воздействии на организм человека вызывают появление генетических мутаций, приводящих к злокачественной трансформации клеток и способствующих развитию опухолевого процесса.

Одной из важных задач современной экологии, фармакологии и медицины является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остается открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм, а именно, обеспечивать необходимый набор эндоэкологических составляющих. Главными мишенями действия таких лекарственных средств должны являться специфические компоненты раковых клеток, необходимые для их существования и размножения. В нормальных

соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления. Раковые клетки обладают способностью обходить этот механизм и становятся бессмертными (обладают неограниченным репликативным потенциалом). Иммортализация клеток опухолей напрямую связана с активацией теломеразы, компенсирующей укорочение теломер, происходящее при каждом делении клетки.

Теломераза - рибонуклеопротеиновый комплекс, обладающий обратно транскриптазной активностью, катализирующий синтез теломерных повторов на концах хромосом у эукариот. Реактивация теломеразы является одним из ключевых событий при злокачественной трансформации клеток и развитии опухолевого процесса [56].

Теломеразная активность (ТА) обнаруживается почти во всех типах злокачественных опухолей человека независимо от вида и степени дифференциации [120], в то время как в большинстве нормальных тканей она практически не детектируется. Активная теломераза поддерживает длину теломер в опухолевых клетках, что позволяет им делиться неограниченное количество раз. Ингибирование теломеразы в активно делящихся опухолевых клетках ведет к укорочению и нарушению структуры и функций теломер, что вызывает активацию системы ответа на повреждение ДНК и, в конечном итоге, апоптоз опухолевых клеток. Именно поэтому теломераза рассматривается как уникальный маркер опухолевого роста, а также как перспективная мишень для действия лекарственных препаратов.

Поиску ингибиторов ТА в опухолевых клетках посвящено большое количество исследований. Найденные ингибиторы принадлежат к

различным группам химических веществ и ингибируют ТА по различным механизмам. Однако не все ингибиторы ввиду высокой токсичности, плохой растворимости и проницаемости через клеточные мембраны, быстрому разрушению в организме и пр. являются перспективными для терапевтических целей.

Перспективным направлением работ по поиску противоопухолевых препаратов является выявление природных и создание синтетических ингибиторов ТА и их исследование. Такие соединения, как правило, различной химической природы, должны обладать высокой способностью проникновения в клетки, иметь высокую специфичность ингибирующего действия и, следовательно, малое количество побочных эффектов. Однако обнаружено и синтезировано всего несколько соединений, обладающих описанными выше свойствами [64].

Этими обстоятельствами, а также возможностью использования ингибиторов теломеразы в терапии злокачественных заболеваний (для нивелирования отрицательных эндоэкологических факторов) объясняется необходимость поиска новых ингибиторов ТА и изучения их действия, что делает важным и актуальным настоящее исследование.

Целью работы явился поиск и исследование эндоэкологических особенностей биологического действия нового природного ненуклеозидного ингибитора ТА аГГЕЫ296.

В связи с поставленной целью основные задачи исследования были сформулированы следующим образом.

1. Выявление связи определенного транскрипционного варианта (ТВ) белка теплового шока HSP90a с экспрессией гена каталитической субъединицы теломеразы и ТА.

2. Изучение механизма действия обнаруженного соединения aITEL1296 на активность теломеразы.

3. Определение влияния aITEL1296 на экспрессию генов белков теломеразного комплекса.

4. Определение ингибирования ТА внутри клеток в условиях in vitro.

5. Изучение действия aITEL1296 на рост опухолевых и нормальных клеток в условиях in vitro и его совместного действия с другими терапевтическими агентами.

6. Исследование противоопухолевой активности aITEL1296, а также его действия на ТА опухолевых клеток в условиях in vivo на модели с ксенографтной опухолью.

Научная новизна работы

Впервые проведено исследование экологических особенностей способности нового природного соединения aITEL1296 ингибировать теломеразу в клеточных лизатах и внутриклеточную ТА, а также его способности активировать процесс апоптоза в опухолевых клетках. Выявлена связь транскрипционного варианта 1 белка теплового шока HSP90a с экспрессией каталитической субъединицы теломеразы и ТА. Изучено влияние aITEL1296 на транскрипцию генов основных субъединиц теломеразного комплекса. Проведено компьютерное моделирование взаимодействия aITEL1296 с hTERT. Также проведено исследование

способности aITEL1296 ингибировать ТА в клетках опухолей и противоопухолевой активности aITEL1296 в условиях in vivo на модели штамма ксенографтной опухоли. Полученные данные позволяют более полно изучать влияние ксенобиотических агентов окружающей среды на организм животных и человека.

Практическая значимость работы

Полученные данные о связи TBI HSP90a с экспрессией гена каталитической субъединицы теломеразы и ТА могут использоваться в качестве дополнительной информации при создании специфических к HSP90a ингибиторов теломеразы. На основании результатов исследования биологического действия aITEL1296, нового ингибитора ТА, можно считать, что данное соединение при дальнейшем изучении может служить основой для создания нового высокоспецифичного противоопухолевого терапевтического препарата и изучения влияния факторов окружающей среды на организм. aITEL1296 может также использоваться для фундаментальных медико-экологических исследований в области биологии теломер и теломеразы.

Апробация работы и публикации по теме исследования

Результаты исследований доложены на конференциях: XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия, 2009), «Experimental Biology - 2010» (Anahaim, USA); 5-ой международной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnology for Medicine» (GPBNM-2010, St.Petersburg-Kizhi-Mandrogy-Valaam-Kovenets- St.Petersburg, Russia); 1-ой

международной научно-практической конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, Россия, 2010); 22nd International Congress on Anti-Cancer Treatment, (Paris, France, 2011). По материалам диссертации опубликовано 4 печатных статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре экологического факультета Российского университета дружбы народов 17 октября 2011 года

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 126 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 145 источников. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 6 таблицами.

Работа выполнена на базе кафедры прикладной экологии экологического факультета Российского университета дружбы народов, а также на базе лаборатории биотехнологии Первого московского государственного медицинского университета им. И. М. Сеченова.

Заключение диссертации по теме «Экология (по отраслям)», Жданов, Дмитрий Дмитриевич

Выводы

1. Обнаружено новое природное соединение aITEL1296, котрое эффективно ингибирует ТА в клеточных лизатах (1С5о - 8,4 ± 1,2 нМ), вероятно, взаимодействуя с доменом обратной транскрипции каталитической субъединицы теломеразного комплекса по механизму смешанного неконкурентного взаимодействия.

2. Показано, что TBI HSP90a участвует в формировании теломеразного комплекса.

3. aITEL1296 не влияет на экспрессию генов белков теломеразного комплекса.

4. В условиях in vitro aITEL1296 эффективно ингибирует ТА внутри опухолевых клеток, что вызывает их переход в состояние репликативного старения и активацию процессов апоптоза. В дозах критичных для опухолевых клеток aITEL1296 не оказывает действия на пролиферацию нормальных клеток.

5. aITEL1296 ингибирует ТА в условиях in vivo и обладает противоопухолевым действием на модели с ксенографтной опухолью РМЖ.

6. aITEL1296 усиливает действие других противоопухолевых агентов и при дальнейшем исследовании может служить основой для создания высокоспецифичного препарата для терапии злокачественных опухолей.

Заключение

Современные подходы к терапии злокачественных заболеваний заключаются в воздействии на специфические для опухолевых клеток молекулы-мишени т.е. развивается т.н. таргетная терапия как один из важных эндоэкологических критериев современной биологии и медицины. Теломераза активна в большинстве опухолей человека и является одной из таких молекул. Воздействие на теломеразу специфическими ингибиторами вызывает в пролиферирующих клетках уменьшение длины теломер, нарушение их структуры и потерю функций. Эти процессы приводят к активации апоптоза и вызывают гибель опухолевых клеток.

В данной работе показано, что обнаруженное нами новое природное соединение ненуклеозидного ряда а1ТЕЬ1296 обладает способностью ингибировать ТА в клеточных лизатах. Изучение кинетических характеристик процесса ингибирования позволило сделать вывод о смешанном неконкурентном (по отношению к субстратам) характере взаимодействия а1ТЕЫ296 с теломеразным комплексом.

Изучение связи ТВ белка ШР90а с ТА и экспрессией гена ИТЕЯТ и ТА дало возможность сделать предположение о наиболее вероятном участии ТВ1 ШР90а в формировании теломеразного комплекса. Исследование количества мРНК белков теломеразного комплекса в клетках, инкубированных с а1ТЕЕ1296, указывает на отсутствие влияния ингибитора на экспрессию данных генов. Исследование уровня экспрессии гена /3-Оа1 в этих клетках доказало их пребывание в состоянии репликативного старения.

На основании данных, полученных из экспериментов по ингибированию действия вирусной обратной транскриптазы и анализа степени ее гомологии с субъединицами теломеразного комплекса, удалось выявить участки гомологии лишь в молекуле hTERT. Эти данные были использованы для построения компьютерной модели взаимодействия aITEL1296 с молекулой hTERT. Наиболее вероятным представляется взаимодействие aITEL1296 с участком домена обратной транскрипции молекулы каталитической субъединицы теломеразы, что вызывает нарушение образования комплексов теломеразы с теломерной ДНК и ингибирование ТА. aITEL1296 легко проникает через клеточные мембраны и вызывает устойчивое ингибирование ТА внутри опухолевых клеток. Ингибирование ТА aITEL1296 вызывает активацию процессов апоптоза и гибель опухолевых клеток. В дозах, критичных для опухолевых клеток, aITEL1296 не оказывает действия на пролиферацию нормальных фибробластов человека, что указывает на избирательность его действия. aITEL1296 вызывает усиление действия других противоопухолевых терапевтических препаратов.

Исследование противоопухолевого действия aITEL1296 в условиях in vivo на модели ксенографтной опухоли РМЖ показало способность данного соединения ингибировать ТА внутри клеток опухоли и подавлять рост опухоли.

Данная работа является фундаментальным эндоэкологическим исследованием биологического действия нового ингибитора ТА, который обладает хорошей проницаемостью через клеточные мембраны, высокой специфичностью действия и низкой токсичностью. На основании данного ингибитора, при условии дальнейшего исследования, возможно создание нового высокоспецифичного противоопухолевого терапевтического препарата. aITEL1296 также может быть использован в исследованиях в области биологии теломер и теломеразы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Жданов, Дмитрий Дмитриевич, 2012 год

Литература

1. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л. - Медгиз. - 1961. - 152 с.

2. Глухое А. И., Зимник О. В., Гордеев С.А. и др. Разработка амплификационных тест-систем для анализа теломеразы // Аллергия, астма и клин, иммунол. - 1999. — N 9 . - С. 173 - 175.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика (пер. с англ.), Практика, М. - 1998.

4. Корман Д. Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. - М.: Практическая медицина - 2006. - 512 с.

5. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. М., «Наука», 1974 г.

6. Малашенко А. М. Межлинейные различия в чувствительности мужских половых клеток у мышей к индукции доминантных леталей тиофосфамидом. // Генетика. - 1980. - Т. XVI - № 9. - с. 1577 - 1583.

7. Росс У. Биологические алкилирующие вещества. - М.: Медицина. -1964.-259 с.

8. Трещалин И. Д. Советский противоопухолевый препарат платин. Токсикология, фармакокинетика и снятие нефротоксичности (экспериментальное исследование). Дисс. канд. мед. наук. - М. -1983.- 131 с.

9. Трещалина Е. М., Жукова О. С., Герасимова Г. К. и др. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ. — В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2-е изд./ Под ред. Р. У. Хабриева. — М.: Медицина. - 2005. - С. 637 - 651.

10. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма, пер. с англ., М., 1966 г.

11.Химиотерапия злокачественных новообразований. Под ред. Э. Чу и В. ДеВиты -младшего. - М.: Практика. - 2009. - 455 с.

12.Электронный ресурс http://msds.chem.ox.ac.uk

13. A be N., Watanabe Т., Nakashima М. et al. Quantitative analysis of telomerase activity: a potential diagnostic tool for colorectal carcinoma // Hepatogastroenterology. - 2001. -Vol. 48. - P. 692 - 695.

14.Ahmed S., Passos J. F., Birket M. J. et al. Telomerase does not counteract telomere shortening but protects mitochondrial function under oxidative stress//J. Cell Sci. - 2008.-Vol. 121.-P. 1046- 1053.

15.Aldous W. K., Grabill N. R. A fluorescent method for detection of telomerase activity // Diagn. Mol. Pathol. - 1997. - V. 6. - P. 102 - 110.

16.American Society of Hospital Pharmacists. ASHP technical assistance bulletin on handling cytotoxic and hazardous drugs // Am. J. Hosp. Pharm. - 1990. - Vol. 47. - P. 1033 - 1049.

n.Asai A., Oshima Y., Yamamoto Y. et al. A novel telomerase template antagonist (GRN163) as a potential anticancer agent // Cancer Res. -2003.-V. 63.-P. 3931 -3939.

18.Azzalin С. M., Reichenbach P., Khoriauli L. et al. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends // Science - 2007. - V. 318. - P. 798 - 801.

19.Berg K., Selbo P. K., Prasmickaite L. et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol // Cancer Res. - 1999.-V. 59.-P. 1180- 1183.

20.Bias со M. A. Mammalian telomeres and telomerase: why they matter for cancer and aging // Eur. J. Cell Biol. - 2003. - Vol. 82. - P. 441 - 446.

21 .Budach W., Budach V., Stuschke M. et al. Efficacy of ifosfamide, dacarbazine, doxorubicin and cisplatin in human sarcoma xenografts // Br. J. Cancer. - 1994. - Vol. 70. - P. 29 - 34.

22.Chabner B. A., Longo D. L. Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice. — 3rd ed., Philadelphia: Lippincott-Raven. -2001.-P. 678-699.

23.Chen B., Liang J., Tian X. et al. G-quadruplex structure: a target for anticancer therapy and a probe for detection of potassium // Biochemistry (Mosc). - 2008. - V. 73. - P. 853 - 861.

24.Chen Y. J., Sheng W. Y, Huang P. R. et al. Potent inhibition of human telomerase by U-73122 // J Biomed Sci. - 2006. - V. 13. - P. 667 - 674.

25.Chen Z., Koeneman K. S., Corey D. R. Consequences of telomerase inhibition and combination treatments for the proliferation of cancer cells // Cancer Res. - 2003. - V. 63. - P. 5917 - 5925.

26. Chomezynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem -1987.-V. 162.-P. 156- 159.

27.Colangelo D., GhigliaA., Ghezzi A. et al. Water-soluble benzoheterocycle triosmium clusters as potential inhibitors of telomerase enzyme // J. Inorg. Biochem. - 2005. - V. 99. - P. 505 - 512.

28.Counter C. M., Botelho F. M., Wang P. et al. Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes // J. Virol. - 1994. - V. 68. -P. 3410-3414.

29.Crabbe L., Jauch A., Naeger C. M. et al. Telomere dysfunction as a cause of genomic instability in Werner syndrome // Proc .Natl. Acad. Sci. U S A. - 2007. - V. 104.- P. 2205 - 2210.

30.Damm K., Hemmann U., Garin-Chesa P. et al. A highly selective telomerase inhibitor limiting human cancer cell proliferation // EMBO J. -2001. - V. 20. - P. 6958 - 6968.

3 l.De Boeck G., Forsyth R. G., Praet M. et al. Telomere-associated proteins: cross-talk between telomere maintenance and telomere-lengthening mechanisms // J. Pathol. - 2009. - Vol. - 217. - P. 327 - 344.

32.De Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres // Genes Dev. - 2005. - V. 19. - P. 2100 - 2110.

33 .Delany M. E., Daniels L. M. The chicken telomerase reverse transcriptase (chTERT): molecular and cytogenetic characterization with a comparative analysis // Gene. - 2004. - V. 339. - P. 61 - 69.

34.Dudognon C., Pendino F., Hillion J. et al. Death receptor signaling regulatory function for telomerase: hTERT abolishes TRAIL-induced apoptosis, independently of telomere maintenance // Oncogene. - 2004. -Vol. 23.-P. 7469-7474.

35.Dunham M. A., Neumann A. A., Fasching C. L. et al. Telomere maintenance by recombination in human cells // Nat. Genet. - 2000. - V. 26.-P. 447-450.

36.Eitsuka T., Nakagawa K., Suzuki T. et al. Polyunsaturated fatty acids inhibit telomerase activity in DLD-1 human colorectal adenocarcinoma cells: a dual mechanism approach // Biochim. Biophys. Acta. - 2005. - V. 1737.-P. 1 - 10.

31 .Elayadi A. N., Demieville A., Wancewicz E. V. et al. Inhibition of telomerase by 2'-0-(2-methoxyethyl) RNA oligomers: effect of length, phosphorothioate substitution and time inside cells // Nucleic Acids Res. -2001.-V. 29.-P. 1683- 1689.

38.El-Daly H., Kull M., Zimmermann S. et al. Selective cytotoxicity and telomere damage in leukemia cells using the telomerase inhibitor BIBR1532//Blood.-2005.-V. 105.-P. 1742-1749.

39.Erba E., Bergamaschi D., Ronzoni S. et al. Mode of action of thiocoraline, a natural marine compound with anti-tumour activity // Br. J. Cancer. -1999.-V. 80.-P. 971 -980.

40.Ermens A. A., Schoester M., Spijkers L. J. et al. Toxicity of methotrexate in rats preexposed to nitrous oxide // Cancer Res. - 1989. - Vol. 49. - P. 6337-6341.

41 .Fajkus J. Detection of telomerase activity by the TRAP assay and its variants and alternatives // Clin. Chim. Acta. - 2006. - Vol. 371. - P. 25 -31.

42.Fajkus J., Fulneckova J., Hulanova M. et al. Plant cells express telomerase activity upon transfer to callus culture, without extensively

changing telomere lengths // Mol. Gen. Genet. - 1998. - V. 260. - P. 470 -474.

43.Feng J., Funk W. D., Wang S. S. et al. The RNA component of human telomerase//Science. - 1995.-V. 269.-P. 1236- 1241.

44.Folini M., Colella G., Villa R. et al. Inhibition of telomerase activity by a hammerhead ribozyme targeting the RNA component of telomerase in human melanoma cells // J. Invest. Dermatol. - 2000. - V. 114. - P. 259 -267.

45 .Folini M., Zaffaroni N. Targeting telomerase by antisense-based approaches: perspectives for new anti-cancer therapies // Curr. Pharm. Des.-2005.-V. 11.-P. 1105-1117.

4e.Fujimoto K., Takahashi M. Telomerase activity in human leukemic cell lines is inhibited by antisense pentadecadeoxynucleotides targeted against c-myc mRNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1997. - V. 241. - P. 775 -781.

47.Fuster J. J., Andrés V. Telomere biology and cardiovascular disease // Circ. Res. - 2006. - V. 99. - P. 1167 - 1180.

48.Georgiadis M. M., Jessen S. M, Ogata С. M. et al. Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase // Structure. - 1995. - V. 3. - P. 879 - 892.

49.Glukhov A. I., Zimnik О. V., Gordeev S. A. et al. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. -V. 248. - P. 368 - 371.

50.Gomez D., Lemarteleur T., Lacroix L. et al. Telomerase downregulation induced by the G-quadruplex ligand 12459 in A549 cells is mediated by hTERT RNA alternative splicing // Nucleic Acids Res. - 2004. - V. 32. -P. 371 -379.

51 .Gomez D. E., TejeraA. M., Olivero O. A. Irreversible telomere shortening by 3,-azido-2',3'-dideoxythymidine (AZT) treatment // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1998.-V. 246.-P. 107-110.

52.Goodsell D. S. The molecular perspective: 1-asparaginase // Stem Cells. -2005.-Vol. 23.-P. 710-711.

53.Graves A. P., Devleena M., Shivakumar S. E. et al. Rescoring Docking Hit Lists for Model Cavity Sites: Predictions and Experimental Testing // J. Mol. Biol. - 2008. - V. 377. - P. 914 - 934.

54.Griffith J. D., Comeau L., Rosenfield S. et al. Mammalian telomeres end in a large duplex loop // Cell. - 1999. - V. 97. - P. 503 - 514.

55.Hamilton S. E., Pitts A. E., Katipally R. R. et al. Identification of determinants for inhibitor binding within the RNA active site of human telomerase using PNA scanning // Biochemistry. - 1997. - V. 36. - P. 11873- 11880.

56.Hanahan D, Weinberg R. A. Hallmarks of cancer: the next generation // Cell. - 2011. - V. 144. - P. 646 - 674.

51 .Harrington L. Biochemical aspects of telomerase function // Cancer Lett. -2003 - V. 194.-P. 139-154.

58.Hayakawa N., Nozawa K, Ogawa A. et al. Isothiazolone derivatives selectively inhibit telomerase from human and rat cancer cells in vitro // Biochemistry. - 1999.-V. 38.-N35.-P. 11501 - 11507.

59.Hirose M., Abe-Hashimoto J., Ogura K. et al. A rapid, useful and quantitative method to measure telomerase activity by hybridization protection assay connected with a telomeric repeat amplification protocol // J. Cancer Res. Clin. Oncol. - 1997. - V. 123. - P. 337 - 344.

60.Holt S. E., Aisner D. L., Baur J. et al. Functional requirement of p23 and Hsp90 in telomerase complexes // Genes Dev. - 1999. - V. 13. - P. 817 — 826.

61 .Huang G. P., Pan Z. J., Huang J. P. et al. Proteomic analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells transduced with human telomerase reverse transcriptase gene during proliferation // Cell Prolif. - 2008. -Vol. 41.-P. 625-644.

62 .Huang P. R., Yeh Y. M., Wang T. C. Potent inhibition of human telomerase by helenalin // Cancer Lett. - 2005. - V. 227. - P. 169 - 174.

63.Itahana K. , Campisi J., Dimri G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay // Methods Mol. Biol. - 2007. -Vol. 371.-P. 21 -31.

64.Kelland L. R. Overcoming the immortality of tumour cells by telomere and telomerase based cancer therapeutics-current status and future prospects // Eur. J. Cancer. - 2005. Vol. 41. - P. 971 - 979.

65 .Kim J. H., Kim J. H., Lee G. E. et al. Identification of a quinoxaline derivative that is a potent telomerase inhibitor leading to cellular senescence of human cancer cells // Biochem J. - 2003. - V. 373. - P. 523 -529.

66.Kim N. W., Piatyszek M. A., Prowse K. R. et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer // Science. -1994.-V. 266.-P. 2011 -2015.

61.Kondo S., Kondo Y, Li G. et al. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA // Oncogene. - 1998. - V. 16. - P. 3323 - 3330.

68.Kosciolek B. A., Kalantidis K., Tabler M. et al. Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference // Mol. Cancer Ther. -2003.-V. 2.-P. 209-216.

69.Kraemer K., Fuessel S., Schmidt U. et al. Antisense-mediated hTERT inhibition specifically reduces the growth of human bladder cancer cells // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 9. - P. 3794 - 3800.

10.Krupp G., Kuhne K., Tamm S. et al. Molecular basis of artifacts in the detection of telomerase activity and a modified primer for a more robust 'TRAP' assay//Nucleic Acids Res. - 1997.-V. 25.-P. 919 - 921.

11.Li H., Zhao L. L., Funder J. W. et al. Protein phosphatase 2A inhibits nuclear telomerase activity in human breast cancer cells // J. Biol. Chem. - 1997. - V. 272. - P. 16729 - 16732.

12.Lin F. T. Preclinical pharmacologic evaluation of bleomycin A6. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. - 1989. - Vol. 11. - P. 257 - 259.

13.Liu J., Ge L., Zhang G. Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase expression in colorectal carcinoma. // World J. Gastroenterol. - 2006. - Vol. 12. - P. 465 - 567.

lA.Loayza D., De Lange T. POT1 as a terminal transducer of TRF1 telomere length control // Nature. - 2003. - V. 423. - P. 1013 - 1018.

15.Lu C., Fu W., Mattson M. P. Telomerase protects developing neurons against DNA damage-induced cell death // Brain Res. Dev. Brain. Res. -2001.-Vol. 131.-P. 167-171.

16.Ludwig A., Saretzki G., Holm P. S. et al. Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase// Cancer Res. -2001. -Vol. 61.-P. 3053-3061.

11.Luke B., Panza A., Redon S. et al. The Ratlp 50 to 30 exonuclease degrades telomeric repeat-containing RNA and promotes telomere elongation in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell. - 2008. - V. 32. - P. 465-477.

IS.Maesawa C., Inaba T., Sato H. et al. A rapid biosensor chip assay for measuring of telomerase activity using surface plasmon resonance // Nucleic Acids Res. - 2003. - V. 31. - P. E4.

19.Mata J. E., Joshi S. S., Palen B. et al. A hexameric phosphorothioate oligonucleotide telomerase inhibitor arrests growth of Burkitt's lymphoma cells in vitro and in vivo // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1997. - V. 144. -P. 189- 197.

SO.Masutomi K., Possemato R., Wong J. M. et al. The telomerase reverse transcriptase regulates chromatin state and DNA damage responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005. - Vol. 102. - P. 8222 - 8227.

81 .Mergny J., Riou J., Mailliet P. et al. Natural and pharmacological regulation of telomerase // Nucleic Acids Research. - 2002. - Vol. 30. -P. 839-865.

^2. Mikhail ov A., Sokolovskaya A., Yegutkin G. G. et al. CD73 participates in cellular multiresistance program and protects against TRAIL-induced apoptosis // J. Immunol. - 2008. - V. - 181. - P. 464 - 475.

.Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J. Immunol. Methods. - 1983. - V. 65. - 2. - P. 55 - 63.

84.Mitchell M., Gillis A., Futahashi M. et al. Structural evidence for RNA template and telomeric DNA binding by the catalytic subunit of telomerase, TERT // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2010. - Vol. 17. - P. 513 -518 .

85.Montaño S. P., Coté M. L., Roth M i et al. Crystal structures of oligonucleotides including the integrase processing site of the Moloney murine leukemia virus // Nucleic Acids Res. - 2006. - V. 34. - P. 5353 -5360.

&6.Naasani I., Oh-Hashi F., Oh-Hara T. et al. Blocking telomerase by dietary polyphenols is a major mechanism for limiting the growth of human cancer cells in vitro and in vivo // Cancer Res. - 2003. - V. 63. -P. 824-830.

87.Najmudin S., Coté M. L., Sun D. et al. Crystal structures of an N-terminal fragment from Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase complexed with nucleic acid: functional implications for template-primer binding to the fingers domain // J. Mol. Biol. - 2000. - V. 296. - P. 613 -632.

88 .Natar ajan S., Chen Z, Wancewicz E. V. et al. Telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA and telomerase RNA (hTR) as targets for downregulation of telomerase activity // Oligonucleotides. - 2004. - V. 14.-P. 263-273.

%9.Naumov G.N., Nilsson M.B., Cascone T. et al. Combined vascular endothelial growth factor receptor and epidermal growth factor receptor (EGFR) blockade inhibits tumor growth in xenograft models of EGFR inhibitor resistance // Clin. Cancer Res. - 2009. - V. 15. - P. 3484 - 3494.

90.Newlands E.S. Results with the EMA/CO (Etoposide, Methotrexate, Actinomycin D, Cyclophosphamide, Vincristine) Regimen in High Risk Gestational Trophoblastic Tumours, 1979 to 1989 // Br. J. Obstet. Gynaecol. - 1991. - Vol. 98. - P. 550 - 557.

91.Norton J. C., Piatyszek M. A., Wright W. E. et al. Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids // Nat. Biotechnol. - 1996. -V. 14. - P. 615-619.

92.Nowak J., Januszkiewicz D., Lewandowski K. et al. Activity and expression of human telomerase in normal and malignant cells in gastric and colon cancer patients // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. - 2003.- Vol. 15.-P. 75 -80.

93.Ohnuma T., Li F. L., Holland J. F. Inhibitory effects of telomere-mimic phosphorothioate oligonucleotides on various human tumor cells in vitro // Anticancer Res. - 1997. - V. 17. - P. 2455 - 2458.

94.Ohyashiki K., Ohyashiki J. H., Nishimaki J. et al. Cytological detection of telomerase activity using an in situ telomeric repeat amplification protocol assay // Cancer Res. - 1997. - V. 57. - P. 2100 - 2103.

95.Okamura K., Ohno M., Tsutsui T. Possible involvement of loss of imprinting in immortalization of human fibroblasts // Int. J. Oncol. -2011.-Vol. 38.-P. 903-910.

96.Park J. I., Venteicher A. S., Hong J. Y. et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin // Nature. - 2009. -Vol. 460.-P. 66-72.

97.Pascolo E., Wenz C., Lingner J. et al. Mechanism of human telomerase inhibition by BIBR1532, a synthetic, non-nucleosidic drug candidate // J. Biol. Chem. - 2002. -V. 277. - P. 15566 - 15572.

98.Pendino F., Tarkanyi I., Dudognon C. et al. // Telomeres and telomerase: Pharmacological targets for new anticancer strategies? // Curr. Cancer Drug Targets. - 2006. - Vol. - 6. - P. 147 - 180.

99.Perrault S. D., Hornsby P. J., Betts D. H. Global gene expression response to telomerase in bovine adrenocortical cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - Vol. 335 - P. 925 - 936.

100. Philips F. S., Sternberg S. S., Cronin A. P. et al. Cyclophosphamide and urinary bladder toxicity // Cancer Res. - 1961. - Vol. 21. - P. 1577 -1589.

101. Pieters R., Hunger S. P., Boos J. et al. L-asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia: a focus on Erwinia asparaginase // Cancer. -2011.-Vol. 117.-P. 238-249.

102. Pirollo K. F., Rait A., Sleer L. S. et al. Antisense therapeutics: from theory to clinical practice // Pharmacol Ther. - 2003. - V. 99. - P. 55 -77.

103. Pirzio L. M., Freulet-Marrière M. A., Bai Y. et al. Human fibroblasts expressing hTERT show remarkable karyotype stability even after exposure to ionizing radiation // Cytogenet. Genome Res. - 2004. -Vol. 104.-P. 87-94.

104. Plunkett F. J., Franzese O., Belaramani L. L. et al. The impact of telomere erosion on memory CD8+ T cells in patients with X-linked lymphoproliferative syndrome // Mech. Ageing Dev. - 2005. - V. 126.-P. 855 -865.

105. Podlevsky J. D., Bley C. J., Omana R. V. et al. The telomerase database // Nucleic Acids Res. - 2008. - V. 36 (Database issue). - D 339 -343.

106. Pruzan R., Pongracz K., Gietzen K. et al. Allosteric inhibitors of telomerase: oligonucleotide N3'~>P5' phosphoramidates // Nucleic Acids Res. - 2002. - V. 30. - P. 559 - 568.

107. Rahman R., Latonen L., Wiman K. G. hTERT antagonizes p53-induced apoptosis independently of telomerase activity // Oncogene. -2005. - Vol. 24. - P. 1320 - 1327.

108. Rizzo R. C., Aynechi T., Case D. A. et al. Estimation of Absolute Free Energies of Hydration Using Continuum Methods: Accuracy of Partial Charge Models and Optimization of Nonpolar Contributions // J. Chem. Theory Comput. - 2006. - V. 2. - P. 128 - 139.

109. Robart A. R., Collins K. Investigation of human telomerase holoenzyme assembly, activity, and processivity using disease-linked subunit variants // J. Biol. Chem. - 2010. - V. 285. - P. 4375 - 4386.

110. Rodrigues D. G., Maria D. A., Fernandes D. C. et al. Improvement of paclitaxel therapeutic index by derivatization and association to a

cholesterol-rich microemulsion: in vitro and in vivo studies // Cancer Chemother Pharmacol. - 2005. - Vol. 55. - P. 565 - 576.

111. Rubio M. A., Davalos A. R., Campisi J. Telomere length mediates the effects of telomerase on the cellular response to genotoxic stress // Exp. Cell Res. - 2004. - Vol. 298. - P. 17 - 27.

112. Rudolph R., Larson D. L. Etiology and Treatment of Chemotherapeutic Agent Extravasation Injuries: A Review // J. Clin. Oncol. - 1987.-Vol. 5.-P. 1116-1126.

113. Saeboe-Larssen S., Fossberg E., Gaudernack G. Characterization of novel alternative splicing sites in human telomerase reverse transcriptase (hTERT): analysis of expression and mutual correlation in mRNA isoforms from normal and tumour tissues // BMC Mol Biol. - 2006. -Vol. 29. - P. 7 - 26.

114. Saretzki G., Ludwig A., von Zglinicki T. et al. Ribozyme-mediated telomerase inhibition induces immediate cell loss but not telomere shortening in ovarian cancer cells // Cancer Gene Ther. - 2001. - V. 8. -P. 827-834.

115. Savoysky E., Akamatsu K., Tsuchiya M. et al. Detection of telomerase activity by combination of TRAP method and scintillation proximity assay (SPA) // Nucleic Acids Res. - 1996. - V. 24. — P. 1175 -1176.

116. Schindler A., Fiedler U., Meye A. et al. Human telomerase reverse transcriptase antisense treatment downregulates the viability of prostate cancer cells in vitro // Int. J. Oncol. - 2001. - V. 19. - P. 25 - 30.

117. Schmidt P. M., Matthes E., Scheller F. W. et al. Real-time determination of telomerase activity in cell extracts using an optical biosensor // Biol. Chem. - 2002. - V. 383. - P. 1659 - 1666.

118. Schoeftner S. Blasco M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II // Nat. Cell Biol. - 2008. - V. 10. - P. 228 - 236.

119. Shammas M. A., Simmons C. G., Corey D. R. et al. Telomerase inhibition by peptide nucleic acids reverses 'immortality' of transformed human cells // Oncogene. - 1999. - V. 18. - P. 6191 - 6200.

120. Shay J. W., Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer // Eur. J. Cancer. - 1997. - V. 33. - P. 787 - 791.

121. Shay J. W., Van Der Haegen B. A., Ying Y et al.The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SY40 large T-antigen // Exp. Cell Res. - 1993. - V. 209. -P. 45-52.

122. Smith L. L., Coller H. A., Roberts J. M. Telomerase modulates expression of growth-controlling genes and enhances cell proliferation // Nat Cell Biol. - 2003. - Vol. 5. - P. 474 - 479.

123. Smogorzewska A., van Steensel B., Bianchi A. et al. Control of human telomere length by TRF1 and TRF2 // Mol. Cell Biol. - 2000. - V. 20.-P. 1659- 1668.

124. Song J. S., Murase N., Demetris A. J. et al. Protection from acute cellular injury using Sleeping Beauty mediated telomerase gene transfer // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 363. - P. 253 - 256.

125. Strahl C., Blackburn E. H. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase activity in two immortalized human cell lines // Mol. Cell Biol. - 1996. - V. 16. - P. 53 - 65.

126. Stravopodis D. J., Margaritis L. H., Voutsinas G. E. Drug-mediated targeted disruption of multiple protein activities through functional inhibition of the Hsp90 chaperone complex // Curr. Med. Chem. - 2007. -V. 14.-P. 3122-3138.

127. Tatsumoto N., Hiyama E., Murakami Y et al. High telomerase activity is an independent prognostic indicator of poor outcome in colorectal cancer // Clin. Cancer Res. - 2000. -Vol. 6. - P. 2696 - 2701.

128. Teng L„ Specht M. C„ Barden C. B. et al. Antisense hTERT inhibits thyroid cancer cell growth // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2003. - V. 88. -P. 1362- 1366.

129. Ueno T., Takahashi H., Oda M. et al. Inhibition of human telomerase by rubromycins: implication of spiroketal system of the compounds as an active moiety // Biochemistry. ~ 2000. - V. 39. - P. 5995 - 6002.

130. Ulaner G., Hu J., Vu T. et al. Tissue-specific alternate splicing of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) influences telomere lengths during human development // Int. J. Cancer. - 2001. - Vol. 91. -P. 644 - 649.

131. Villa R., Folini M., Lualdi S. et al. Inhibition of telomerase activity by a cell-penetrating peptide nucleic acid construct in human melanoma cells // FEBS Lett. - 2000. - V. 473. - P. 241 - 248.

132. Von Zglinicki T. Oxidative stress shortens telomeres // Trends Biochem. Sci. - 2002. - Vol. 27 - P. 339 - 344.

133. Walker P. R., Kwast-Welfeld J., Gourdeau H. et al. Relationship between apoptosis and the cell cycle in lymphocytes: roles of protein kinase C, tyrosine phosphorylation, and API // Exp. Cell Res. - 1993. -V. 207. - P. 142-151. 11

134. Walsby E. J., Coles S. J., Knapper S. et al. The topoisomerase II inhibitor voreloxin causes cell cycle arrest and apoptosis in myeloid leukemia cells and acts in synergy with cytarabine. Haematologica. -2011.-Vol. 96.-P. 393 -399.

135. Ward R. J., Autexier C. Pharmacological telomerase inhibition can sensitize drug-resistant and drug-sensitive cells to chemotherapeutic treatment // Mol Pharmacol. - 2005. - V. 68. - P. 779 - 786.

136. Wege H., Chui M. S., Le H. T. et al. SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity // Nucleic Acids Res. - 2003. - V. 31. - P. E3.

137. Wong K. K., Chang S., Weiler S. R. et al. Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation // Nat. Genet. - 2000. - Vol. 26. - P. 85 - 88.

138. Wright W. E., Shay J. W., Piatyszek M. A. Modifications of a telomeric repeat amplification protocol (TRAP) result in increased

reliability, linearity and sensitivity // Nucleic Acids Res. - 1995. - V. 23. -P. 3794-3795.

139. Xu S. Q., He M., Yu H. P. et al. Bioluminescent method for detecting telomerase activity // Clin. Chem. - 2002. - V. 48. - P. 1016 -1020.

140. Yamakuchi M., Nakata M., Kawahara K. et al. New quinolones, ofloxacin and levofloxacin, inhibit telomerase activity in transitional cell carcinoma cell lines // Cancer Lett. - 1997. - V. 119. - P. 213 - 9.

141. Yang J., Chang E., Cherry A. M. et al. Human endothelial cell life extension by telomerase expression // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. -P. 26141-26148.

142. Yokoyama Y., Takahashi Y., Shinohara A. et al. Attenuation of telomerase activity by a hammerhead ribozyme targeting the template region of telomerase RNA in endometrial carcinoma cells // Cancer Res. -

1998.-V. 58.-P. 5406-5410.

143. Yokoyama Y., Takahashi Y., Shinohara A. et al. The 5'-end of hTERT mRNA is a good target for hammerhead ribozyme to suppress telomerase activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2000. - V. -273. -P. 316-321.

144. Yuan F., Chen M., Hornsby P. J. Fibroblasts from Werner syndrome patients: cancer cells derived by experimental introduction of oncogenes maintain malignant properties despite entering crisis // Oncol. Rep. - 2010. - Vol. 23. - P. 377 - 386.

145. Zhang X., Mar V., Zhou W. et al. Telomere shortening and apoptosis in telomerase-inhibited human tumor cells // Genes Dev. -

1999.-V. 13.-P. 2388-2399.

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю -доктору биологических наук, профессору Орловой Елене Владимировне за помощь и поддержку при выполнении данной работы, а также всему профессорско-преподавательскому составу Российского университета дружбы народов за полученные знания. Особо благодарю кандидата биологических наук, старшего научного сотрудника Первого Московского Еосударственного Медицинского Университета им. И. М. Сеченова Коваленко Наталию Аркадьевну за руководство и помощь при выполнении и написании данной работы. Выражаю глубокую признательность коллективу лаборатории медицинской биотехнологии Учреждения российской академии медицинских наук НИИ Биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН и лично доктору биологических наук, профессору Соколову Николаю Николаевичу за предоставление материально-технической базы для проведение экспериментов и полезные рекомендации, а также доктору биологических наук ОАО «ЕосНИИ Синтез-белок» Бибиковой Маргарите Васильевне и ее коллегам за предоставление а!ТЕЫ296.