Изучение нуклеазной активности фермента LbCas12a в условиях in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Чиринскайте Ангелина Валерьевна

• Чиринскайте Ангелина Валерьевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Чиринскайте Ангелина Валерьевна

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы. CRISPR/Cas-системы: от повторов в геноме до инструментов генной терапии наследственных заболеваний человека

1.1. CRISPR/Cas-системы адаптивного иммунитета прокариот

1.1.1. История открытия и изучения CRISPR/Cas систем

1.1.2. Механизм ответа системы CRISPR/Cas на проникновение чужеродных плазмид и бактериофагов в клетку

1.1.3. Классификация и эволюция CRISPR/Cas-систем

1.2. Нуклеазы семейства Cas12

1.2.1. Классификация и происхождение нуклеаз семейства Cas12

1.2.2. Особенности строения и активности нуклеаз Cas12

1.2.3. Использование нуклеаз Cas12a биотехнологии и медицине

1.3. Нуклеаза LbCas12a

1.3.1. Структура и состав рибонуклеопротеинового комплекса нуклеазы LbCas12a

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе

2.1.1. Штаммы Е.соМ, использованные в работе

2.1.2. Плазмида для получения рекомбинантного белка...............,

2.1.3. Конструирование плазмид для наработки ДНК-мишени нуклеазы LbCas12a

2.1.4. Конструирование плазмид для наработки ДНК-мишеней нуклеазы LbCas12a, несущих микроделеции

2.2. Среды и условия культивирования

2.3 Наработка и выделение рекомбинантного белка LbCas12a

2.4. Получение направляющих РНК

2.5. Анализ расщепления ДНК-мишени нуклеазой LbCas12a

2.6. Анализ коллатеральной активности LbCas12a

2.7. Генотипирование мышей, содержащих микроделеции в генах pde6b и grin3a

2.8. Статистическая обработка результатов

2.9. Исследование расщепления различных цепей ДНК методом фрагментного анализа

2.10. Анализ неспецифической экзонуклеазной активности фермента LbCas12a методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях

Глава 3. Результаты

3.1. Наработка фермента LbCas12a в бактериях Е.соИ

3.2. Анализ специфичности взаимодействия нуклеазы LbCas12a с целевой ДНК в присутствии канонической и новой последовательности РАМ

3.2.1. Анализ специфичности расщепления целевой ДНК-мишени в случае наличия делеций 2 нуклеотидов

3.2.2. Анализ специфичности расщепления целевой ДНК-мишени в случае наличия однонуклеотидных замен

3.3. Анализ влияния типа нуклеотидных замен на эффективность расщепления ДНК мишени в присутствии нового РАМ

3.4. Анализ неспецифической активности фермента LbCas12a

3.5. Система детекции микроделеций на базе нуклеазы LbCas12a

3.5.1. Анализ эффективности расщепления ферментом LbCas12a различных флуоресцентных зондов

3.5.2. Апробация системы детекции микроделеций на линиях мышей, несущих делеции 2 нуклеотидов

Глава 4. Обсуждение

Выводы

Заключение

Список литературы

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение нуклеазной активности фермента LbCas12a в условиях in vitro»

Введение

Актуальность темы. Системы редактирования генома CRISPR/Cas, обеспечивающие адаптивный иммунитет у прокариотических организмов, в настоящее время получают все большее распространение в качестве инструментов для осуществления направленного мутагенеза (Wang et al., 2020), создания систем диагностики инфекционных заболеваний (Chen et al., 2018; Gootenberg et al., 2018), а также как потенциальные системы для генной терапии наследственных заболеваний (Li et al., 2023). Наиболее часто используемыми в лабораторных условиях являются нуклеазы Cas9, Cas12 и Cas13. Нуклеазы группы Cas12 в комплексе с направляющей РНК способны направленно вносить двунитевые разрывы в ДНК-мишень аналогично Cas9, однако большое разнообразие ферментов, больший спектр целевых последовательностей ДНК и большая специфичность разрезания ДНК позволили именно ферментам семейства Cas12a стать одними из наиболее широко используемых в биотехнологии и медицине ферментов Cas на данный момент.

Степень разработанности темы. На сегодняшний день изучение систем геномного редактирования на базе систем CRISPR-Cas является одним из активно изучаемых направлений в генетике и молекулярной биологии. Активно происходит обнаружение новых систем CRISPR/Cas и их систематизация (Koonin and Makarova, 2017; Koonin and Makarova, 2019), в частности, систем CRISPR/Cas12 (Schunder et al., 2013; Shmakov et al., 2017; Liu et al., 2023). Получены кристаллические структуры ферментов семейства Cas12a (Yamano et al., 2016), ведется анализ их активности в условиях in vitro и in vivo, в частности для использования в качестве аналога белков Cas9 для геномного редактирования (Gier et al., 2020; Ha et al., 2020). Тем не менее, опубликованных работ по ферменту LbCas12a, посвященных специфичности данного фермента, а также его узнаванию различных последовательностей PAM (Protospacer adjacent motif), крайне мало.

Научная новизна работы. Несмотря на активное открытие новых ферментов семейства Cas12 и улучшение существующих методов диагностики и редактирования, основанных на нуклеазной активности белков Cas12a, фундаментальные исследования свойств ферментов данного семейства оставляют желать лучшего. Недостаточно освещаются вопросы субстратной специфичности ферментов, узнавания ферментами различных PAM и эффективности взаимодействия направляющей РНК с целевой ДНК в случае неточного совпадения их последовательностей. В данной работе мы впервые обнаружили новую последовательность PAM, узнаваемую нуклеазой LbCas12a, а также проанализировали специфичность расщепления

ДНК-мишени в случае наличия различных неспаренностей между направляющей РНК и ДНК-мишенью. Мы впервые показываем наличие экзонуклеазной активности у фермента LbCas12a. Также в данной работе проводился анализ коллатеральной активности фермента LbCas12a и сделано предположение о механизме инициации данной активности. Помимо этого, в работе предложена новая система детекции микроделеций в геномной ДНК с использованием фермента LbCas12a.

Цель работы: изучение нуклеазной активности фермента LbCas12a.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать специфичность взаимодействия эффекторного комплекса белка

LbCas12a c ДНК мишени в присутствии канонического PAM в условиях in vitro.

2. Проанализировать специфичность взаимодействия эффекторного комплекса белка

LbCas12a c ДНК мишени в присутствии нового PAM в условиях in vitro.

3. Проанализировать эффективность неспецифического расщепления ДНК ферментом

LbCas12a.

4. Разработать систему детекции микроделеций на основе нуклеазы LbCas12a.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в результате этого исследования данные об узнавании ферментом нового PAM, а также об изменении активности фермента вследствие такого нестандартного взаимодействия открывают новые возможности для использования данного фермента в диагностических целях, в частности, для идентификации в геноме микровставок или микроделеций, а потенциально и однонуклеотидных замен, что может быть удобно в медицинской практике. Данные о наличии неспецифической активности фермента могут помочь при создании диагностических систем на базе фермента LbCas12a. Узнавание нового PAM данным ферментом расширяет потенциальный круг мишеней для внесения с помощью данной нуклеазы направленных изменений в геном организмов in vivo, в частности, как двунитевых разрывов, так и точковых замен для потенциального использования фермента в качестве генной терапии наследственных заболеваний.

Методы исследования. Исследование проводили с использованием широкого круга методов генетики, молекулярной биологии и биохимии, включающих трансформацию бактерий E.coli плазмидной ДНК, наработку и выделение белка и плазмидной ДНК в бактериях, амплификацию ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), реакции синтеза РНК в условиях in vitro и других. Подробное описание методов, использованных в рамках исследования, представлено в главе 2 «Материалы и методы».

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследования, проведенного в рамках данной диссертации, были опубликованы в журналах, рецензируемых в базах данных RSCI, WoS и Scopus:

1. Misiurina M.A., Chirinskaite A.V., Fotina A.S., Zelinsky A.A., Sopova J.V., Leonova E.I. New PAM Improves the Single-Base Specificity of crRNA-Guided LbCas12a Nuclease // Life. 2022. Vol. 12. No11. P. 1927. doi: 10.3390/life12111927.

2. Chirinskaite A.V., Rotov A.Y., Ermolaeva M.E., Tkachenko L.A., Vaganova A.N., Danilov L.G., Fedoseeva K.N., Kostin N.A., Sopova J.V., Firsov M. L., Leonova E. I. Does Background Matter? A Comparative Characterization of Mouse Models of Autosomal Retinitis Pigmentosa rd1 and Pde6b-KO // International Journal of Molecular Sciences. 2023. Vol. 24. No24. P. 17180. doi: 10.3390/ijms242417180.

3. Reshetnikov V. V., Chirinskaite A. V., Sopova J.V., Ivanov R.A., Leonova E.I. Cas-Based Systems for RNA Editing in Gene Therapy of Monogenic Diseases: In Vitro and in Vivo Application and Translational Potential // Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2022. Vol. 10. doi: 10.3389/fcell.2022.903812.

4. Reshetnikov V.V., Chirinskaite A.V., Sopova J.V., Ivanov R.A., Leonova E.I. Translational potential of base-editing tools for gene therapy of monogenic diseases // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2022. Vol. 10. doi: 10.3389/fbioe.2022.942440.

5. Chirinskaite A.V., Zelinsky A.A., Sopova J.V., Leonova E.I. Development of the Cas12a-based microdeletion and microinsertion detection system // Ecological genetics. 2023. Vol. 21. P. 2021. doi: 10.17816/ecogen568454.

Кроме того, результаты исследования были представлены на ряде всероссийских и международных конференций: международной конференции «ГМО: история, достижения, социальные и экологические риски» (Санкт-Петербург, 3-5 октября 2023 г.), международном конгрессе «VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки и высшей школы» (Саратов, 14 - 19 июня 2024г.), втором международном конгрессе "CRISPR-2023" (Новосибирск, 11-13 сентября 2023 г.), а также на XXII Зимней молодежной школе ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии (Санкт-Петербург, 27 февраля - 4 марта 2023 г.).

Объем и структура работы. Полный объем диссертации составляет 85 страниц, включает 29 рисунков и 6 таблиц. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, 4 глав, выводов,

заключения, списка литературы и благодарностей. В список литературы включено 125 источников.

Основные научные результаты. В статье (Misiurina et а1., 2022) представлены результаты анализа взаимодействия фермента LbCas12a с целевой ДНК, содержащей впервые обнаруженный нами РАМ - ТТАА, а также результаты анализа специфичности расщепления нуклеазой ДНК-мишени в присутствии однонуклеотидных замен в направляющей РНК. Помимо этого, в публикации представлены результаты исследования зависимости эффективности расщепления ДНК от типа нуклеотидной замены в направляющей РНК (стр. 4-8).

Личный вклад: осуществляла экспериментальную работу, участвовала в подготовке текста публикации.

В статье (СЫпмкаке et а1., 2023 а) представлено исследование особенностей полученной в нашей лаборатории линии мышей Pde6b-KO, наличие микроделеции в геноме было также впервые подтверждено представленной в диссертацией системой для экспресс-генотипирования мышей (стр. 2-3).

Личный вклад: участвовала в экспериментальной работе по получению и генотипированию линии мышей Pde6b-KO, а также по подтверждению отсутствия продуктов экспрессии гена pde6b, участвовала в подготовке текста публикации.

В обзоре (Reshetnikov et а1., 2022а) рассматривается Cas-опосредованное редактирование РНК с целью повышения или понижения экспрессии генов как потенциальная терапия моногенных заболеваний, указаны ограничения доставки систем редактирования нуклеиновых кислот, а также недостаточность специфичности систем, что подчеркивает важность изучения различных Cas-белков для разработки систем редактирования РНК нового поколения, которые будут более безопасны, чем существующие (стр. 6-7).

Личный вклад: участие в написании текста статьи, а также подготовка иллюстрации.

В статье (Reshetnikov et а1., 2022Ь) рассматриваются перспективы применения модифицированной нуклеазы LbCas12a в качестве агента для направленного редактирования ДНК при генетической терапии наследственных заболеваний. Подчеркивается важность изучения РАМ-специфичности ферментов, а также их специфической и неспецифической активностей. Это необходимо для создания более эффективных систем редактирования и минимизации нежелательного воздействия нуклеаз на организм человека вызванного неспецифической активностью (стр 13-14).

Личный вклад: участие в написании текста статьи, а также подготовка иллюстрации.

В публикации (СЫп^каке et а1., 2023Ь) демонстрируется применение предложенной в диссертации системы экспресс-генотипирования для успешного определения мышей, нокаутных по гену grin3a (стр.20-21).

Личный вклад: проведение экспериментальной работ и подготовка текста публикации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Нуклеаза LbCas12a взаимодействует с новым РАМ последовательности 5'-ТТАА-3', при этом эффективность расщепления целевой ДНК-мишени ниже, чем в случае канонического РАМ.

2. При взаимодействии с РАМ ТТАА нуклеаза LbCas12a демонстрирует более высокую специфичность расщепления целевой ДНК по сравнению с каноническим РАМ.

3. Нуклеаза LbCas12a, помимо коллатеральной, демонстрирует экзонуклеазную активность, которая должна быть принята во внимание при использовании в системах детекции на основе LbCas12a.

4. Предложенная нами система для экспресс-генотипирования позволила детектировать наличие микроделеций в образцах ДНК нокаутных линий мышей Pde6b-KO и Grin3a-KO.

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Чиринскайте Ангелина Валерьевна

Заключение

Результаты, полученные в рамках данной работы, могут быть использованы для упрощения проведения научных исследований: выявление нового РАМ открывает новые возможности для направленного редактирования генома организмов, поскольку увеличивает количество потенциальных мишеней для редактирования. Кроме того, повышенная специфичность фермента при расщеплении ДНК, содержащей новый РАМ может стать важным критерием для выбора определенных мишеней в геноме. Информация о наличии неспецифической экзонуклеазной активности фермента может помочь в интерпретации результатов анализа расщепления флуоресцентных зондов и должна быть учтена при создании новых систем детекции на базе фермента LbCas12a. Предложенная нами система экспресс-генотипирования может значительно сократить временные затраты на потоковое генотипирование мышиных линий, несущих микроделеции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чиринскайте Ангелина Валерьевна, 2025 год

Список литературы

1. Zhang B., Ye Y., Ye W., Perculija V., Jiang H., Chen Y., Li Y., Chen J., Lin J., Wang S., Chen Q., Han Y.-S., Ouyang S. Two HEPN domains dictate CRISPR RNA maturation and target cleavage in Cas13d // Nat Commun. 2019. Vol. 10. No 1. P. 2544.

2. Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Konermann S., Joung J., Slaymaker I. M., Cox D. B. T., Shmakov S., Makarova K. S., Semenova E., Minakhin L., Severinov K., Regev A., Lander E. S., Koonin E. V., Zhang F. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector // Science. 2016. Vol. 353. No.6299. P. aaf5573.

3. Amitai G., Sorek R. CRISPR-Cas adaptation: insights into the mechanism of action // Nat Rev Microbiol. 2016. Vol. 14. No. 2. P. 67-76.

4. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D. A., Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science. 2007. Vol. 315. No. 5819. P. 1709-1712.

5. Bhattacharya S., Agarwal A., Muniyappa K. Deciphering the Substrate Specificity Reveals that CRISPR-Cas12a Is a Bifunctional Enzyme with Both Endo- and Exonuclease Activities // Journal of Molecular Biology. 2024. Vol. 436. No. 10. P. 168550.

6. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S. D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin // Microbiology. 2005. Vol. 151. No. 8. P. 2551-2561.

7. Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S., Du M., Rollins M. F., Hidalgo-Reyes Y., Wiedenheft B., Maxwell K. L., Davidson A. R. Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins // Nature. 2015. Vol. 526. No. 7571. P. 136-139.

8. Bondy-Denomy J., Pawluk A., Maxwell K. L., Davidson A. R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system // Nature. 2013. Vol. 493. No. 7432. P. 429.

9. Brouns S. J. J., Jore M. M., Lundgren M., Westra E. R., Slijkhuis R. J. H., Snijders A. P. L., Dickman M. J., Makarova K. S., Koonin E. V., Oost J. van der. Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes // Science. 2008. Vol. 321. No. 5891. P. 960-964.

10. Burmistrz M., Pyre K. CRISPR-Cas Systems in Prokaryotes // Pol J Microbiol. 2015. Vol. 64. No. 3. P. 193-202.

11. Charpentier E., Richter H., Oost J. van der, White M. F. Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity // FEMS Microbiol Rev. 2015. Vol. 39. No. 3. P. 428-441.

12. Chen J. S., Ma E., Harrington L. B., Da Costa M., Tian X., Palefsky J. M., Doudna J. A. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity // Science. 2018. Vol. 360. No. 6387. P. 436-439.

13. Chirinskaite A. V., Rotov A. Y., Ermolaeva M. E., Tkachenko L. A., Vaganova A. N., Danilov L. G., Fedoseeva K. N., Kostin N. A., Sopova J. V., Firsov M. L., Leonova E. I. Does Background Matter? A Comparative Characterization of Mouse Models of Autosomal Retinitis Pigmentosa rd1 and Pde6b-KO // International Journal of Molecular Sciences. 2023a. Vol. 24. No. 24. P. 17180.

14. Chirinskaite A. V., Zelinsky A. A., Sopova J. V., Leonova E. I. Development of the Cas12a-based microdeletion and microinsertion detection system // Ecological genetics. 2023b. Vol. 21. P. 20-21.

15. Choi E., Hwang H.-Y., Kwon E., Kim D., Koo T. Expanded targeting scope of LbCas12a variants allows editing of multiple oncogenic mutations // Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2022. Vol. 30. P. 131-142.

16. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C. M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M. R., Vogel J., Charpentier E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III // Nature. 2011. Vol. 471. No. 7340. P. 602-607.

17. Deveau H., Barrangou R., Garneau J. E., Labonté J., Fremaux C., Boyaval P., Romero D. A., Horvath P., Moineau S. Phage Response to CRISPR-Encoded Resistance in Streptococcus thermophilus // J Bacteriol. 2008. Vol. 190. No. 4. P. 1390-1400.

18. Dong D., Ren K., Qiu X., Zheng J., Guo M., Guan X., Liu H., Li N., Zhang B., Yang D., Ma C., Wang S., Wu D., Ma Y., Fan S., Wang J., Gao N., Huang Z. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA // Nature. 2016. Vol. 532. No. 7600. P. 522-526.

19. Dupuis M.-È., Villion M., Magadân A. H., Moineau S. CRISPR-Cas and restriction-modification systems are compatible and increase phage resistance // Nat Commun. 2013. Vol. 4. P. 2087.

20. Faure G., Shmakov S. A., Yan W. X., Cheng D. R., Scott D. A., Peters J. E., Makarova K. S., Koonin E. V. CRISPR-Cas in mobile genetic elements: counter-defence and beyond // Nat Rev Microbiol. 2019. Vol. 17. No. 8. P. 513-525.

21. Fonfara I., Richter H., Bratovic M., Le Rhun A., Charpentier E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA // Nature. 2016. Vol. 532. No. 7600. P. 517-521.

22. Garneau J. E., Dupuis M.-E., Villion M., Romero D. A., Barrangou R., Boyaval P., Fremaux C., Horvath P., Magadan A. H., Moineau S. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA // Nature. 2010. Vol. 468. No. 7320. P. 67-71.

23. Gasiunas G., Barrangou R., Horvath P., Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. Vol. 109. No. 39. P. E2579-E2586.

24. Gier R. A., Budinich K. A., Evitt N. H., Cao Z., Freilich E. S., Chen Q., Qi J., Lan Y., Kohli R. M., Shi J. High-performance CRISPR-Cas12a genome editing for combinatorial genetic screening // Nat Commun. 2020. Vol. 11. No. 1. P. 3455.

25. Godde J. S., Bickerton A. The repetitive DNA elements called CRISPRs and their associated genes: evidence of horizontal transfer among prokaryotes // J Mol Evol. 2006. Vol. 62. No. 6. P. 718-729.

26. Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Kellner M. J., Joung J., Collins J. J., Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6 // Science. 2018. Vol. 360. No. 6387. P. 439-444.

27. Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Lee J. W., Essletzbichler P., Dy A. J., Joung J., Verdine V., Donghia N., Daringer N. M., Freije C. A., Myhrvold C., Bhattacharyya R. P., Livny J., Regev A., Koonin E. V., Hung D. T., Sabeti P. C., Collins J. J., Zhang F. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas 13a/C2 c2 // Science. 2017. Vol. 356. No. 6336. P. 438-442.

28. Guk K., Yi S., Kim H., Bae Y., Yong D., Kim S., Lee K.-S., Lim E.-K., Kang T., Jung J. Hybrid CRISPR/Cas protein for one-pot detection of DNA and RNA // Biosensors and Bioelectronics. 2023. Vol. 219. P. 114819.

29. Ha D.-I., Lee J. M., Lee N.-E., Kim D., Ko J.-H., Kim Y.-S. Highly efficient and safe genome editing by CRISPR-Cas12a using CRISPR RNA with a ribosyl-2'-O-methylated

uridinylate-rich 3'-overhang in mouse zygotes // Exp Mol Med. 2020. Vol. 52. No. 11. P. 18231830.

30. Haft D. H., Selengut J., Mongodin E. F., Nelson K. E. A Guild of 45 CRISPR-Associated (Cas) Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes // PLoS Comput Biol. 2005. Vol. 1. No. 6. P. e60.

31. Hale C. R., Zhao P., Olson S., Duff M. O., Graveley B. R., Wells L., Terns R. M., Terns M. P. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex // Cell. 2009. Vol. 139. No. 5. P. 945-956.

32. Hanahan D., Jessee J., Bloom F. R. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria // Methods Enzymol. 1991. Vol. 204. P. 63-113.

33. Harrington L. B., Burstein D., Chen J. S., Paez-Espino D., Ma E., Witte I. P., Cofsky J. C., Kyrpides N. C., Banfield J. F., Doudna J. A. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes // Science. 2018. Vol. 362. No. 6416. P. 839-842.

34. Heidelberg J. F., Nelson W. C., Schoenfeld T., Bhaya D. Germ Warfare in a Microbial Mat Community: CRISPRs Provide Insights into the Co-Evolution of Host and Viral Genomes // PLoS One. 2009. Vol. 4. No. 1. P. e4169.

35. Hermans P. W., Soolingen D. van, Bik E. M., Haas P. E. de, Dale J. W., Embden J. D. van. Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains // Infect Immun. 1991. Vol. 59. No. 8. P. 2695-2705.

36. Ishino Y., Krupovic M., Forterre P. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology // Journal of Bacteriology. 2018. Vol. 200. No. 7. P. e00580-17.

37. Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M., Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product // J Bacteriol. 1987. Vol. 169. No. 12. P. 5429-5433.

38. Jansen R., Embden J. D. A. van, Gaastra W., Schouls L. M. Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes // OMICS. 2002a. Vol. 6. No. 1. P. 23-33.

39. Jansen Ruud., Embden Jan. D. A. van, Gaastra Wim., Schouls Leo. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes // Molecular Microbiology. 2002b. Vol. 43. No. 6. P. 1565-1575.

40. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. Vol. 337. No. 6096. P. 816-821.

41. Kapitonov V. V., Makarova K. S., Koonin E. V. ISC, a Novel Group of Bacterial and Archaeal DNA Transposons That Encode Cas9 Homologs // J Bacteriol. 2016. Vol. 198. No. 5. P. 797-807.

42. Kim D., Kim J., Hur J. K., Been K. W., Yoon S., Kim J.-S. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells // Nat Biotechnol. 2016a. Vol. 34. No. 8. P. 863-868.

43. Kim Y., Cheong S.-A., Lee J. G., Lee S.-W., Lee M. S., Baek I.-J., Sung Y. H. Generation of knockout mice by Cpf1-mediated gene targeting // Nat Biotechnol. 2016b. Vol. 34. No. 8. P. 808-810.

44. Kleinstiver B. P., Pattanayak V., Prew M. S., Tsai S. Q., Nguyen N. T., Zheng Z., Joung J. K. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects // Nature. 2016. Vol. 529. No. 7587. P. 490-495.

45. Koonin E. V., Makarova K. S. Mobile Genetic Elements and Evolution of CRISPR-Cas Systems: All the Way There and Back // Genome Biol Evol. 2017. Vol. 9. No. 10. P. 2812-2825.

46. Koonin E. V., Makarova K. S. Origins and evolution of CRISPR-Cas systems // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2019. Vol. 374. No. 1772. P. 20180087.

47. Krupovic M., Makarova K. S., Forterre P., Prangishvili D., Koonin E. V. Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity // BMC Biol. 2014. Vol. 12. P. 36.

48. Kunin V., Sorek R., Hugenholtz P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats // Genome Biol. 2007. Vol. 8. No. 4. P. R61.

49. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. No. 5259. P. 680-685.

50. Laible M., Boonrod K. Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids // J Vis Exp. 2009. No. 27. P. 1135.

51. Li J., Luo T., He Y., Liu H., Deng Z., Bu J., Long X., Zhong S., Yang Y. Discovery of the Rnase activity of CRISPR-Cas12a and its distinguishing cleavage efficiency on various substrates // Chem. Commun. 2022. Vol. 58. No. 15. P. 2540-2543.

52. Li S.-Y., Cheng Q.-X., Liu J.-K., Nie X.-Q., Zhao G.-P., Wang J. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA // Cell Res. 2018. Vol. 28. No. 4. P. 491-493.

53. Li T., Yang Y., Qi H., Cui W., Zhang L., Fu X., He X., Liu M., Li P., Yu T. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects // Sig Transduct Target Ther. 2023. Vol. 8. No. 1. P. 1-23.

54. Liu K., Petree C., Requena T., Varshney P., Varshney G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease // Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2019a. Vol. 7.

55. Liu L., Li X., Ma J., Li Z., You L., Wang J., Wang M., Zhang X., Wang Y. The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a // Cell. 2017. Vol. 170. No. 4. P. 714-726.e10.

56. Liu L., Yin M., Wang M., Wang Y. Phage AcrIIA2 DNA Mimicry: Structural Basis of the CRISPR and Anti-CRISPR Arms Race // Molecular Cell. 2019b. Vol. 73. No. 3. P. 611-620.e3.

57. Liu X., Qiu X., Han L., Yue Y., Xu S., Li F., Yao J., Sun L., Li Z. Three novel Cas12a orthologs with robust DNA cleavage activity suitable for nucleic acid detection // Gene. 2023. Vol. 852. P. 147055.

58. Makarova K. S., Wolf Y. I., Alkhnbashi O. S., Costa F., Shah S. A., Saunders S. J., Barrangou R., Brouns S. J. J., Charpentier E., Haft D. H., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J. M., Terns R. M., Terns M. P., White M. F., Yakunin A. F., Garrett R. A., Oost J. van der, Backofen R., Koonin E. V. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems // Nat Rev Microbiol. 2015. V. 13. No.11. P. 722-736.

59. Makarova K. S., Wolf Y. I., Iranzo J., Shmakov S. A., Alkhnbashi O. S., Brouns S. J. J., Charpentier E., Cheng D., Haft D. H., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J. M., Scott D., Shah S. A., Siksnys V., Terns M. P., Venclovas C., White M. F., Yakunin A. F., Yan W., Zhang F., Garrett R. A., Backofen R., Oost J. van der, Barrangou R., Koonin E. V. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants // Nat Rev Microbiol. 2020. V. 18. No.2. P. 67-83.

60. Makarova K. S., Aravind L., Grishin N. V., Rogozin I. B., Koonin E. V. A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30. No. 2. P. 482-496.

61. Makarova K. S., Grishin N. V., Shabalina S. A., Wolf Y. I., Koonin E. V. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action // Biol Direct. 2006. Vol. 1. P. 7.

62. Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns S. J. J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J. M., Wolf Y. I., Yakunin A. F., Oost J. van der, Koonin E. V. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems // Nat Rev Microbiol. 2011. Vol. 9. No. 6. P. 467477.

63. Mali P., Yang L., Esvelt K. M., Aach J., Guell M., DiCarlo J. E., Norville J. E., Church G. M. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 // Science. 2013. Vol. 339. No. 6121. P. 823-826.

64. Malzahn A. A., Tang X., Lee K., Ren Q., Sretenovic S., Zhang Y., Chen H., Kang M., Bao Y., Zheng X., Deng K., Zhang T., Salcedo V., Wang K., Zhang Y., Qi Y. Application of CRISPR-Cas12a temperature sensitivity for improved genome editing in rice, maize, and Arabidopsis // BMC Biology. 2019. Vol. 17. No. 1. P. 9.

65. Marino N. D., Zhang J. Y., Borges A. L., Sousa A. A., Leon L. M., Rauch B. J., Walton R. T., Berry J. D., Joung J. K., Kleinstiver B. P., Bondy-Denomy J. Discovery of widespread Type I and Type V CRISPR-Cas inhibitors // Science. 2018. Vol. 362. No. 6411. P. 240-242.

66. Marraffini L. A., Sontheimer E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA // Science. 2008. Vol. 322. No. 5909. P. 1843-1845.

67. Meliawati M., Schilling C., Schmid J. Recent advances of Cas12a applications in bacteria // Appl Microbiol Biotechnol. 2021. Vol. 105. No. 8. P. 2981-2990.

68. Ming M., Ren Q., Pan C., He Y., Zhang Y., Liu S., Zhong Z., Wang J., Malzahn A. A., Wu J., Zheng X., Zhang Y., Qi Y. CRISPR-Cas12b enables efficient plant genome engineering // Nat. Plants. 2020. Vol. 6. No. 3. P. 202-208.

69. Misiurina M. A., Chirinskaite A. V., Fotina A. S., Zelinsky A. A., Sopova J. V., Leonova E. I. New PAM Improves the Single-Base Specificity of crRNA-Guided LbCas12a Nuclease // Life. 2022. Vol. 12. No. 11. P. 1927.

70. Mojica F. J. M., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Almendros C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system // Microbiology (Reading). 2009. Vol. 155. No. Pt 3. P. 733-740.

71. Mojica F. J. M., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements // J Mol Evol. 2005. Vol. 60. No. 2. P. 174-182.

72. Mojica F. J. M., Díez-Villaseñor C., Soria E., Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria // Molecular Microbiology. 2000. Vol. 36. No. 1. P. 244-246.

73. Mojica F. j. m., Ferrer C., Juez G., Rodríguez-Valera F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning // Molecular Microbiology. 1995. Vol. 17. No. 1. P. 85-93.

74. Nakata A., Amemura M., Makino K. Unusual nucleotide arrangement with repeated sequences in the Escherichia coli K-12 chromosome. // J Bacteriol. 1989. Vol. 171. No. 6. P. 35533556.

75. Newsom S., Parameshwaran H. P., Martin L., Rajan R. The CRISPR-Cas Mechanism for Adaptive Immunity and Alternate Bacterial Functions Fuels Diverse Biotechnologies // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2021. Vol. 10.

76. Nguyen G. T., Schelling M. A., Buscher K. A., Sritharan A., Sashital D. G. CRISPR-Cas12a exhibits metal-dependent specificity switching // bioRxiv. 2024. P. 2023.11.29.569287.

77. Nishimasu H., Nureki O. Structures and mechanisms of CRISPR RNA-guided effector nucleases // Current Opinion in Structural Biology. 2017. Vol. 43. P. 68-78.

78. Nuñez J. K., Lee A. S. Y., Engelman A., Doudna J. A. Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nature. 2015. Vol. 519. No. 7542. P. 193198.

79. Palaz F., Kalkan A. K., Tozluyurt A., Ozsoz M. CRISPR-based tools: Alternative methods for the diagnosis of COVID-19 // Clinical Biochemistry. 2021. Vol. 89. P. 1-13.

80. Pausch P., Al-Shayeb B., Bisom-Rapp E., Tsuchida C. A., Li Z., Cress B. F., Knott G. J., Jacobsen S. E., Banfield J. F., Doudna J. A. CRISPR-Cas® from huge phages is a hypercompact genome editor // Science. 2020. Vol. 369. No. 6501. P. 333-337.

81. Pawluk A., Bondy-Denomy J., Cheung V. H. W., Maxwell K. L., Davidson A. R. A New Group of Phage Anti-CRISPR Genes Inhibits the Type I-E CRISPR-Cas System of Pseudomonas aeruginosa // mBio. 2014. Vol. 5. No. 2. P. e00896-14.

82. Pawluk A., Davidson A. R., Maxwell K. L. Anti-CRISPR: discovery, mechanism and function // Nat Rev Microbiol. 2018. Vol. 16. No. 1. P. 12-17.

83. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies // Microbiology (Reading). 2005. Vol. 151. No. Pt 3. P. 653-663.

84. Puig H. de, Lee R. A., Najjar D., Tan X., Soenksen L. R., Angenent-Mari N. M., Donghia N. M., Weckman N. E., Ory A., Ng C. F., Nguyen P. Q., Mao A. S., Ferrante T. C., Lansberry G., Sallum H., Niemi J., Collins J. J. Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants // Science Advances. 2021. Vol. 7. No. 32. P. eabh2944.

85. Rajan A., Shrivastava S., Janhawi, Kumar A., Singh A. K., Arora P. K. CRISPR-Cas system: from diagnostic tool to potential antiviral treatment // Appl Microbiol Biotechnol. 2022. Vol. 106. No. 18. P. 5863-5877.

86. Ran F. A., Hsu P. D., Wright J., Agarwala V., Scott D. A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nat Protoc. 2013. Vol. 8. No. 11. P. 2281-2308.

87. Reshetnikov V. V., Chirinskaite A. V., Sopova J. V., Ivanov R. A., Leonova E. I. Cas-Based Systems for RNA Editing in Gene Therapy of Monogenic Diseases: In Vitro and in Vivo Application and Translational Potential // Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2022a. Vol. 10.

88. Reshetnikov V. V., Chirinskaite A. V., Sopova J. V., Ivanov R. A., Leonova E. I. Translational potential of base-editing tools for gene therapy of monogenic diseases // Front Bioeng Biotechnol. 2022b. Vol. 10. P. 942440.

89. Rybarski J. R., Hu K., Hill A. M., Wilke C. O., Finkelstein I. J. Metagenomic discovery of CRISPR-associated transposons // Proc Natl Acad Sci U S A. 2021. Vol. 118. No. 49. P. e2112279118.

90. Safari F., Afarid M., Rastegari B., Borhani-Haghighi A., Barekati-Mowahed M., Behzad-Behbahani A. CRISPR systems: Novel approaches for detection and combating COVID-19 // Virus Res. 2021. Vol. 294. P. 198282.

91. Safari F., Zare K., Negahdaripour M., Barekati-Mowahed M., Ghasemi Y. CRISPR Cpf1 proteins: structure, function and implications for genome editing // Cell & Bioscience. 2019. Vol. 9. No. 1. P. 36.

92. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. // Molecular cloning: a laboratory manual. 1989. No. Ed. 2.

93. Sambrook J., Russell D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters // Cold Spring Harb Protoc. 2006. Vol. 2006. No. 1. P. pdb.prot4085.

94. Sambrook J., Russell D. W., Irwin C. A., Janssen K. A. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

95. Schindele P., Puchta H. Engineering CRISPR/LbCas12a for highly efficient, temperature-tolerant plant gene editing // Plant Biotechnol J. 2020. Vol. 18. No. 5. P. 1118-1120.

96. Schunder E., Rydzewski K., Grunow R., Heuner K. First indication for a functional CRISPR/Cas system in Francisella tularensis // Int J Med Microbiol. 2013. Vol. 303. No. 2. P. 5160.

97. She Q., Singh R. K., Confalonieri F., Zivanovic Y., Allard G., Awayez M. J., ChanWeiher C. C.-Y., Clausen I. G., Curtis B. A., De Moors A., Erauso G., Fletcher C., Gordon P. M. K., Heikamp-de Jong I., Jeffries A. C., Kozera C. J., Medina N., Peng X., Thi-Ngoc H. P., Redder P., Schenk M. E., Theriault C., Tolstrup N., Charlebois R. L., Doolittle W. F., Duguet M., Gaasterland T., Garrett R. A., Ragan M. A., Sensen C. W., Van der Oost J. The complete genome of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus P2 // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. V. 98. No.14. P. 7835-7840.

98. Shin U., Brondani V. Analysis of Wild Type LbCpf1 Protein, and PAM Recognition Variants, in a Cellular Context // Front Genet. 2021. Vol. 11. P. 571591.

99. Shmakov S., Smargon A., Scott D., Cox D., Pyzocha N., Yan W., Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Makarova K. S., Wolf Y. I., Severinov K., Zhang F., Koonin E. V. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems // Nat Rev Microbiol. 2017. Vol. 15. No. 3. P. 169-182.

100. Son H., Park J., Hwang I., Jung Y., Bae S., Lee S. Mg2+-dependent conformational rearrangements of CRISPR-Cas12a R-loop complex are mandatory for complete double-stranded DNA cleavage // Proc Natl Acad Sci U S A. 2021. Vol. 118. No. 49. P. e2113747118.

101. Stella S., Mesa P., Thomsen J., Paul B., Alcon P., Jensen S. B., Saligram B., Moses M. E., Hatzakis N. S., Montoya G. Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity // Cell. 2018. Vol. 175. No. 7. P. 1856- 1871.e21.

102. Strecker J., Ladha A., Gardner Z., Schmid-Burgk J. L., Makarova K. S., Koonin E. V., Zhang F. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases // Science. 2019. Vol. 365. No. 6448. P. 48-53.

103. Summer H., Grämer R., Dröge P. Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE) // J Vis Exp. 2009. No. 32. P. 1485.

104. Swarts D. C., Jinek M. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure-function comparisons and implications for genome editing // Wiley Interdiscip Rev RNA. 2018. Vol. 9. No. 5. P. e1481.

105. Swarts D. C., Jinek M. Mechanistic Insights into the cis- and trans-Acting DNase Activities of Cas12a // Molecular Cell. 2019. Vol. 73. No. 3. P. 589- 600.e4.

106. Takeda S. N., Nakagawa R., Okazaki S., Hirano H., Kobayashi K., Kusakizako T., Nishizawa T., Yamashita K., Nishimasu H., Nureki O. Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme // Mol Cell. 2021. Vol. 81. No. 3. P. 558- 570.e3.

107. Toth E., Varga E., Kulcsar P. I., Kocsis-Jutka V., Krausz S. L., Nyeste A., Welker Z., Huszar K., Ligeti Z., Talas A., Welker E. Improved LbCas12a variants with altered PAM specificities further broaden the genome targeting range of Cas12a nucleases // Nucleic Acids Res. 2020. Vol. 48. No. 7. P. 3722-3733.

108. Tran M. H., Park H., Nobles C. L., Karunadharma P., Pan L., Zhong G., Wang H., He W., Ou T., Crynen G., Sheptack K., Stiskin I., Mou H., Farzan M. A more efficient CRISPR-Cas12a variant derived from Lachnospiraceae bacterium MA2020 // Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2021. Vol. 24. P. 40-53.

109. Uribe R. V., Helm E. van der, Misiakou M.-A., Lee S.-W., Kol S., Sommer M. O. A. Discovery and Characterization of Cas9 Inhibitors Disseminated across Seven Bacterial Phyla // Cell Host & Microbe. 2019. Vol. 25. No. 2. P. 233- 241.e5.

110. Vestergaard G., Garrett R. A., Shah S. A. CRISPR adaptive immune systems of Archaea // RNA Biol. 2014. Vol. 11. No. 2. P. 156-167.

111. Wang J., Li J., Zhao H., Sheng G., Wang M., Yin M., Wang Y. Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems // Cell. 2015. Vol. 163. No. 4. P. 840-853.

112. Wang J., Zhang C., Feng B. The rapidly advancing Class 2 CRISPR-Cas technologies: A customizable toolbox for molecular manipulations // J Cell Mol Med. 2020. Vol. 24. No. 6. P. 3256-3270.

113. Wang Q., Liu X., Zhou J., Yang C., Wang G., Tan Y., Wu Y., Zhang S., Yi K., Kang C. The CRISPR-Cas13a Gene-Editing System Induces Collateral Cleavage of RNA in Glioma Cells // Advanced Science. 2019. Vol. 6. No. 20. P. 1901299.

114. Wang X., Ding C., Yu W., Wang Y., He S., Yang B., Xiong Y.-C., Wei J., Li J., Liang J., Lu Z., Zhu W., Wu J., Zhou Z., Huang X., Liu Z., Yang L., Chen J. Cas12a Base Editors Induce Efficient and Specific Editing with Low DNA Damage Response // Cell Rep. 2020a. Vol. 31. No. 9. P. 107723.

115. Wang Z., Wang Y., Wang S., Gorzalski A. J., McSwiggin H., Yu T., Castaneda-Garcia K., Prince B., Wang H., Zheng H., Yan W. Efficient genome editing by CRISPR-Mb3Cas12a in mice // J Cell Sci. 2020b. Vol. 133. No. 9. P. jcs240705.

116. Wu Q., Cui L., Liu Y., Li R., Dai M., Xia Z., Wu M. CRISPR-Cas systems target endogenous genes to impact bacterial physiology and alter mammalian immune responses // Mol Biomed. 2022. Vol. 3. P. 22.

117. Wu Z., Zhang Y., Yu H., Pan D., Wang Y., Wang Y., Li F., Liu C., Nan H., Chen W., Ji Q. Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease // Nat Chem Biol. 2021. Vol. 17. No. 11. P. 1132-1138.

118. Yamano T., Nishimasu H., Zetsche B., Hirano H., Slaymaker I. M., Li Y., Fedorova I., Nakane T., Makarova K. S., Koonin E. V., Ishitani R., Zhang F., Nureki O. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA // Cell. 2016. Vol. 165. No. 4. P. 949-962.

119. Yamano T., Zetsche B., Ishitani R., Zhang F., Nishimasu H., Nureki O. Structural Basis for the Canonical and Non-canonical PAM Recognition by CRISPR-Cpf1 // Molecular cell. 2017. Vol. 67. No. 4.

120. Yan W. X., Hunnewell P., Alfonse L. E., Carte J. M., Keston-Smith E., Sothiselvam S., Garrity A. J., Chong S., Makarova K. S., Koonin E. V., Cheng D. R., Scott D. A. Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems // Science. 2019. Vol. 363. No. 6422. P. 88-91.

121. Yang H., Gao P., Rajashankar K. R., Patel D. J. PAM-Dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2c1 CRISPR-Cas Endonuclease // Cell. 2016. Vol. 167. No. 7. P. 1814- 1828.e12.

122. Yang H., Patel D. J. Inhibition Mechanism of an Anti-CRISPR Suppressor AcrIIA4 Targeting SpyCas9 // Mol Cell. 2017. Vol. 67. No. 1. P. 117- 127.e5.

123. Yang Z., Edwards H., Xu P. CRISPR-Cas12a/Cpf1-assisted precise, efficient and multiplexed genome-editing in Yarrowia lipolytica // Metab Eng Commun. 2019. Vol. 10. P. e00112.

124. Zetsche B., Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Slaymaker I. M., Makarova K. S., Essletzbichler P., Volz S. E., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin E. V., Zhang F. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System // Cell. 2015. Vol. 163. No. 3. P. 759-771.

125. Zhang L., Li G., Zhang Y., Cheng Y., Roberts N., Glenn S. E., DeZwaan-McCabe D., Rube H. T., Manthey J., Coleman G., Vakulskas C. A., Qi Y. Boosting genome editing efficiency in human cells and plants with novel LbCas12a variants // Genome Biology. 2023. Vol. 24. No. 1. P. 102.