Разработка новых подходов к эрадикации ВИЧ-1 с помощью системы CRISPR/Cas9 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Масленникова Александра Констанция Юрьевна

• Масленникова Александра Констанция Юрьевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Масленникова Александра Констанция Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы и степень ее разработанности

Цели и задачи исследования

Научная новизна. Теоретическая и практическая ценность работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личный вклад автора

Структура и объем работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Вирус иммунодефицита человека

2.2. Система СШ8РЯ/Са8 как инструмент редактирования генома

2.2.1. Нуклеаза Cas9

2.2.2. Механизмы репарации двуцепочечных разрывов ДНК

2.2.2.1. Механизм ]]НЕа

2.2.2.2. Механизм ИБЯ

2.3. Современные стратегии использования системы СШ8РЯ/Са89 для лечения ВИЧ-1

2.3.1. Стратегии терапии ВИЧ, основанные на нокауте генов

2.3.1.1. Нокаут ССЯ5

2.3.1.2. Нокаут CXCR4 и двойной нокаут корецепторов

2.3.1.3. Инактивация и делеция провируса ВИЧ-1

2.3.2. Терапия ВИЧ на основе HDR

2.3.2.1. Направленное редактирование CXCR4

2.3.2.2. Редактирование TRIM5a

2.3.2.3. Нокин С-пептидов - ингибиторов слияния ВИЧ

2.3.2.4. Перепрограммирование В-лимфоцитов для получения антител с широким спектром нейтрализующей активности против ВИЧ

2.3.3. Борьба с ВИЧ путем регуляции экспрессии генов на основе СШ8РШСа89

2.3.3.1. Шокируй и убей

2.3.3.2. Блокируй-и-запирай

2.3.3.3. Активация рестрикционных факторов ВИЧ

2.4. Заключение

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.1.1. Клеточные культуры

3.1.2. Бактериальные культуры

3.1.3. Растворы

3.1.4. Антитела

3.1.5. Плазмиды

3.1.6. Реактивы для ПЦР

3.1.7. Другие реактивы

3.1.8. Наборы

3.2. Методы

3.2.1. Рестрикция и лигирование ДНК

3.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.2.3. Приготовление компетентных клеток Е.соН

3.2.4. Трансформация

3.2.5. ПЦР-амплификация фрагментов ДНК

3.2.6. Конструирование плазмид

3.2.6.1. Конструирование векторов для экспрессии С-пептидов

3.2.6.2. Конструирование вектора для экспрессии эндогенного ССЯ5

3.2.6.3. Конструирование штаммов NL4-3 ВИЧ-1 с мутациями в Епу

3.2.7. Анализ локализации антигенов и пептидов в липидных рафтах

3.2.8. Иммуноферментный анализ

3.2.9. Работа с эукариотическими клетками

3.2.9.1. Выделение и активация первичных клеток

3.2.9.2. Лентивирусная трансдукция

3.2.9.3. Проточная цитометрия и клеточная сортировка

3.2.9.4. Инфекционные тесты с выделенными вирусными частицами

3.2.9.5. Измерение межклеточной инфекции

3.2.9.6. Тест многоцикловой репликации ВИЧ-1

3.2.10. СШ8РЯ/Са89 редактирование

3.2.10.1. Подготовка Са89, гидовых РНК и донорных ДНК

3.2.10.2. Нокин

3.2.11. Анализ последовательностей ДНК

3.2.12. Генетический анализ целевых локусов

3.2.13. Статистическая обработка данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

4.1. Выбор СР1-заякоренных пептидов, наиболее эффективно ингибирующих проникновение ВИЧ-1 в клетку

4.1.1. Получение модельных клеточных линий, пермиссивных для инфекции ВИЧ-1

4.1.2. Создание генетических конструкций для экспрессии СР1-заякоренных С-пептидов

4.1.3. Отбор СР1-заякоренных пептидов, наиболее эффективно ингибирующих проникновение ВИЧ-1 в клетку

4.2. Оценка уровней экспрессии С-пептидов и вирусных рецептора/корецепторов на поверхности трансдуцированных клеток

4.3. Исследование антивирусной активности пептида МТ-С34, модифицированного для секреции, шеддинга или ассоциации с корецепторами ВИЧ-1

4.3.1. Модификация химерной конструкции CD52-MT-C34 для секреции, шеддинга или привлечения к корецепторам ВИЧ

4.3.2. Определение уровня защиты клеток, экспрессирующих модифицированные варианты пептида MT-C34

4.3.3. Определение ингибирующей активности синтетических С-пептидов

4.3.4. Определение уровня продукции растворимых форм пептидов модифицированными клетками

4.3.5. Определение антивирусной активности супернатантов модифицированных клеток

4.3.6. Роль модификации для шеддинга Я в экспрессии пептида MT-C34 и защите от ВИЧ инфекции

4.4. Создание СШ8РШСа89 платформы для борьбы с ВИЧ-1 путем нокина С-пептидов

4.4.1. Разработка стратегий нокина пептидов в гены рецептора/корецепторов ВИЧ

4.4.2. Выбор генетической мишени для нокина

4.4.3. Варианты нокина пептида МТ-С34 в провирус и ген СХСЯ4

4.4.4. Оценка эффективности экспрессии МТ-С34 и гена-мишени после нокина

4.4.5. Устойчивость клеток СЕМ/Я5 с нокином МТ-С34 к межклеточной инфекции ВИЧ-1 различной тропности

4.4.6. Клетки СЕМ/Я5 с нокином МТ-С34ор1 в локус СХСЯ4 полностью устойчивы к заражению репликационно-компетентным ВИЧ-1

4.4.7. Нокин пептида МТ-С34 в провирусную ДНК ВИЧ-1 эффективно блокирует продукцию вирусных частиц

4.5. Разработка биаллельного нокина двух разных пептидных ингибиторов слияния в локус СХСЯ4

4.5.1. Стратегия биаллельного нокина

4.5.2. Суммирующий эффект нокина двух С-пептидов на их противовирусную активность

4.5.3. Генетический анализ клеток с биаллельным К1 пептидов МТ-С34 и 2Р23

4.5.4. Изучение ассоциации С-пептидов с липидными рафтами в зависимости от дизайна нокина

4.5.5. Резистентность клеток СЕМ/К5 с нокином пептидов МТ-С34 и 2Р23 к заражению вариантами ВИЧ-1, мутантными по gp41

4.5.6. Выживание и размножение клеток СЕМ/К5 с нокином пептидов МТ-С34 и 2Р23 в присутствии реплицирующегося ВИЧ-1

4.6. Оптимизация нокина пептида МТ-С34 в геном первичных клеток человека

4.6.1. Оптимизация протоколов стимуляции и трансфекции первичных клеток

4.6.2. Повышение эффективности HDR

4.6.3. Сравнение эффективности нокина и нокаута при таргетировании гена СХСЯ4 в CD4-лимфоцитах

4.6.4. Оценка эффективности нокина MT-C34 в провирусный геном ВИЧ-1 и его

инактивации в CD4-лимфоцитах человека

4.6.5. Оптимизация нокина за счет улучшения доставки донорной ДНК в клеточное ядро

4.6.6. Увеличение нокина путем использования различных вариантов CRISPR/Cas9 с разным числом NLS

4.7. Характеристика CD4+ лимфоцитов человека, генетически-модифицированных пептидом MT-C34 посредством нокина или лентивирусной трансдукции

4.7.1. Дизайн экспериментов для оценки функциональности лимфоцитов и их защиты от ВИЧ-1

4.7.2. Сравнение эффективности доставки и экспрессии пептида MT-C34

4.7.3. Степень защиты модицифированных CD4+ лимфоцитов от заражения ВИЧ-1

4.7.4. Оценка жизнеспособности и функциональности CD4+ лимфоцитов после Ы и LV трансдукции

4.7.5. Выживаемость и пролиферация MT-C34+ СБ4+ лимфоцитов в условиях репликации ВИЧ-1 отличаются в зависимости от способа доставки трансгена

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

• 293Т — HEK 293T, клеточная линия эмбриональной почки человека

• A3B - цитидиновая дезаминаза APOBEC3B

• A3G - цитидиновая дезаминаза APOBEC3G

• Ab - антитело

• bNAb -- broadly neutralizing antibodies антитела с широким спектром

• CCR5 - C-C хемокиновый рецептор тип

• CEM - CCRF-CEM, CD4+ T-клеточная линия человека

• CHR - C-концевой гептадный повтор или, HR2

• CP - цитоплазматический домен

• CRISPR/Cas9 - clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9 (система геномного редактирования)

• CRISPRi - CRISPR интерференция

• crRNA - CRISPR РНК

• CXCR4 - C-X-C хемокиновый рецептор тип

• DAF - фактор, ускоряющий инактивацию комплемента

• dCas9 - дезактивированная Cas9

• DTS - сигнал транспорта ДНК из вируса SV40

• Env - оболочечный белок вируса

• FACS - fluorescence-activated single cell sorting

• FDA - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США

• FP - пептид слияния

• Gag - коровый белок ВИЧ

• GPI - гликозилфосфотидилинозитол

• HDR - гомологичное соединение концов ДНК

• HSF-1 - фактор теплового шока человека

• HSPC - гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки

• IFNy - интерферон гамма

• iPSC — индуцируемые плюрипотентные стволовые клетки

• KI - нокин гена

• KO - нокаут гена

• KRAB - Krüppel-ассоциированный домен

• LASER ART - противовирусная терапия длительного действия с медленным и эффективным высвобождением

• LD - лидерный пептид

• LLPC - долгоживущие плазматические клетки

• LNGFR - низкоафинный рецептор фактора роста нервов

• LTR - длинный концевой повтор (Long terminal repeat)

• LV - лентивирусный вектор

• MFI - mean fluorescence intensity, средняя интенсивность флюоресценции

• MOI - множественность инфекции

• NHEJ - негомологичное соединение концов ДНК

• NHR - N- концевой гептадный повтор, или HR1

• NLS - сигнала ядерной локализации

• ORF - открытая рамка считывания

• PAM - protospacer adjacent motif

• PBMC - мононуклеарные клетки периферической крови

• RNP - рибонуклеопротеиновый комплекс

• sg - протоспейсер

• shPHK - короткая шпилька РНК

• SIV - вирус иммунодефицита обезьян

• SLPC - короткоживущие плазмобласты

• SORTS - метод селекции редактированных клеток (Surface Oligonucleotide knock-in for Rapid Target Selection)

• ssODN - одноцепочечные дезоксирибоолигонуклеотиды

• TM - трансмембранный домен

• Т№а - фактор некроза опухоли альфа

• tracrRNA - трансактивирующая РНК

• VSVG - белок G из вируса везикулярного стоматита

• ZFN - нуклеаза «цинковые пальцы»

• АРТ - антиретровирусная терапия

• ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека, тип

• гРНК - гидовая (направляющая) РНК

• дцДНК - двуцепочечная ДНК

• ОЕЛ - относительные единицы люминесценции

• ПВ - псевдовирусные частицы ВИЧ-1

• ПЦР - полимеразная цепная реакция

• С-пептид - пептид из CHR, ингибитор слияния ВИЧ-1

• СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка новых подходов к эрадикации ВИЧ-1 с помощью системы CRISPR/Cas9»

1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы и степень ее разработанности

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является социально-значимым патогеном. По данным ВОЗ число ВИЧ-инфицированных в 2021 году составило более 38 миллионов человек (Global HIV Programme (who.int)). Выделяют два типа вируса: 1 и 2, при этом именно ВИЧ 1 типа является наиболее распространенным и патогенным.

Осложняет эпидемиологическую обстановку характерный для ВИЧ длительный инкубационный период и пожизненное персистирование вируса в организме. Без применения антиретровирусной терапии (АРТ) у пациентов развивается синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), обусловленный снижением числа CD4+ Т-лимфоцитов. СПИД характеризуется развитием оппортунистических инфекций, злокачественных опухолей и, в конечном итоге, приводит к летальному исходу заболевания.

На данный момент АРТ не позволяет добиться полной эрадикации вируса из организма, в связи с чем ее применение является пожизненным. При этом для ВИЧ-1 характерно развитие устойчивости к препаратам, в связи с чем пациенты вынуждены применять одновременно несколько лекарств, направленных на блокирование разных стадий жизненного цикла ВИЧ-1. Важным фактором успешности АРТ является приверженность пациента лечению, так как нерегулярность приема препаратов приводит к формированию мультирезистентных штаммов ВИЧ -1. В этом случае дальнейший подбор эффективной АРТ бывает затруднен.

На фоне описанных проблем активно развивается альтернативное направление терапии ВИЧ-инфекции, главной и конечной целью которого является полная эрадикация вируса из организма c формированием устойчивости к повторному заражению.

На данный момент зарегистрировано два случая излечения от ВИЧ-инфекции - «Берлинский» [1]-[3] и «Лондонский» [4], [5] пациенты. В обоих случаях эрадикации удалось добиться при помощи трансплантации костного

мозга от донора с врожденной мутацией гена CCR5, отвечающей за устойчивость к инфицированию ВИЧ-1, проведенной с целью терапии злокачественных заболеваний кроветворной системы. Эти случаи подтверждают принципиальную возможность полного выздоровления ВИЧ-инфицированных пациентов при условии репопуляции кроветворной системы клетками, резистентными к инфицированию вирусом. Устойчивость клеток-мишеней к ВИЧ можно обеспечить с помощью терапевтических генов, доставляемых различными способами, этот подход получил название генная терапия. Доставленные и стабильно экспрессируемые гены могут воздействовать на различные этапы вирусной репликации, однако наиболее эффективными способами ингибирования ВИЧ инфицирования признаны блокаторы самой ранней стадии инфекции - проникновения вируса в клетку.

Одним из наиболее эффективных способов генетической борьбы с ВИЧ инфекцией является система геномного редактирования CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9). С момента ее описания в качестве системы адаптивного иммунитета бактерий, способной вносить целевые разрезы в ДНК [6], было разработано множество стратегий генотерапии ВИЧ-1, в том числе удаление генома провируса ВИЧ-1 [7], [8] и/или его инактивация [9], [10], нокаут CCR5 и/или CXCR4 [11]—[13], которые, как было показано, эффективно снижали резервуар латентной инфекции и обеспечивали высокую устойчивость к заражению ВИЧ, соответственно. Однако внедрение этих методов в клиническую практику тормозится вследствие нескольких выявленных и нерешенных на данный момент проблем: появлением жизнеспособных мутантов и квазивидов ВИЧ-1, устойчивых к CRISPR терапии [9], [14], [15], нецелевой активностью Cas9 [16], [17] и низкой эффективностью направленного редактирования по механизму гомологичной рекомбинации (HDR) [18], [19].

Короткие пептиды из домена С-концевого гептадного повтора 2 (HR2 или CHR) вирусного белка gp41 (С-пептиды) ингибируют проникновение ВИЧ, взаимодействуя с областью N-концевого гептадного повтора 1 (HR1 или

NHR) gp41 и блокируя образование 6-спирального пучка gp41, необходимого для слияния мембран [20]. На сегодняшний день только два С-пептида были одобрены для клинического применения: энфувиртид (Т -20) Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) и сифувиртид в Китае. Исследования, проведенные в лаборатории Dorothee von Laer, показали, что пептиды T-20 и C46, экспрессируемые на поверхности клеток в контексте низкоаффинного рецептора фактора роста нервов (LNGFR) человека, являются мощными ингибиторами проникновения ВИЧ-1 [21], [22]. В 2016 году Liu L. с соавт. сообщали, что пептид C34, связанный с сигналом GPI-заякоревания от фактора, ускоряющего инактивацию комплемента (DAF), и экспрессируемый в липидных рафтах, придает клеткам высокую устойчивость к инфекции ВИЧ-1 [23]. Также было показано, что пептид третьего поколения 2P23, экспрессируемый аналогичным образом, полностью защищает клетки от инфекции ВИЧ -1, ВИЧ-2 и SIV [24]. Известно, что прямое слияние C34 с N-концом CXCR4 или CCR5 формирует клеточную устойчивость к ВИЧ-инфекции in vitro и in vivo [25]. В совокупности эти данные указывают на то, что экспонированные на цитоплазматической мембране С-пептиды способны эффективно блокировать проникновение ВИЧ-1 в клетку. Однако во всех опубликованных исследованиях пептиды доставлялись и экспрессировались с помощью ретро-или лентивирусных векторов.

В рамках представленного исследования была разработана технология создания Т-клеточной устойчивости к ВИЧ-1 на основе генетически -кодированных С-пептидов, доставляемых с помощью системы CRISPR/Cas9.

Цели и задачи исследования

Цель работы: разработать CRISPR/Cas9 платформу для борьбы с ВИЧ-1 инфекцией путем нокина пептидных ингибиторов слияния вируса с клеткой.

Были поставлены следующие задачи:

1. Создать генетические конструкции для экспрессии ОР1-заякоренных С-пептидов и отобрать варианты с наиболее высокой анти-ВИЧ-1 активностью.

2. Измерить уровень экспрессии С-пептидов, а также рецепторов/корецепторов ВИЧ-1 на поверхности пермиссивных клеток.

3. Модифицировать конструкцию с пептидом МТ-С34 для его секреции и оценить эффективность данной стратегии в защите клеток от ВИЧ -1 инфекции.

4. Разработать и протестировать различные варианты нокина С-пептидов в локусы СХСЯ4, ССЯ5, СЭ4 и провирусную ДНК.

5. Оценить эффективность биаллельного нокина двух разных С-пептидов в локус СХСЯ4.

6. Добиться увеличения уровня нокина пептида МТ-С34 не только в клеточных линиях, но и в первичных СБ4+ лимфоцитах человека.

7. Сравнить функциональные свойства и резистентность к ВИЧ-1 инфекции пептид-модифицированных СБ4+ лимфоцитов, полученных в результате нокина и лентивирусной трансдукции.

Научная новизна. Теоретическая и практическая ценность работы

Впервые была показана возможность применения СК18РК/СаБ9 нокина для доставки коротких С-пептидов на поверхность клетки и эффективной генотерапии ВИЧ-1. В отличие от предшествующих работ, где использовали отдельные ОР1-заякоренные С-пептиды, доставляемые лентивирусом, в нашей работе созданы конструкции для поверхностной экспрессии семи С-пептидов и их миметиков и отобраны три из них с пептидами МТ-С34, 2Р23, ИР23Ь, обладающими максимальным уровнем ингибирования ВИЧ-1 инфекции.

На базе полученных конструкций разработана мультимодальная СКТ8РК/Сав9 платформа, позволяющая осуществлять К1 различных С-

пептидов с различным влиянием на ген-мишень. Например, пептид и таргетная молекула CXCR4 могут экспрессироваться на мембране независимо друг от друга или в виде N-концевого дополнения к молекуле CXCR4, или сопровождаться нокаутом гена CXCR4, что потенцирует терапевтический эффект пептида. Два разных пептида могут быть интегрированы в оба аллеля CXCR4 и отобраны методом сортировки, при этом их противовирусная активность будет потенцироваться. Редактированные таким образом лимфоидные клетки полностью защищены от ВИЧ-1 инфекции любой тропности, а также любой модальности трансмиссии, т.е. как от инфекции выделенными вирусными частицами, так и от межклеточной трансмиссии вируса. Таким образом, представленные данные расширяют наши знания о противовирусной активности мембранно-связанных генетически-кодируемых С-пептидов.

Практическая значимость работы заключается в разработке технологии нокина пептидных ингибиторов слияния, которая в дальнейшем может быть использована для терапии ВИЧ-1. С этой целью были предприняты комплексные подходы для увеличения уровня KI в первичных лимфоцитах человека, которые могут быть адаптированы не только для терапии ВИЧ, но и для борьбы с другими заболеваниями человека, где требуется инженерия противоопухолевых CAR клеток или направленная коррекция генетических дефектов.

Методология и методы исследования

Основными объектами исследования являлись пептидные ингибиторы слияния из белка gp41, вирус ВИЧ-1, лимфоидные и нелимфоидные вирус-пермиссивные клеточные линии и первичные клетки человека. Для отбора наиболее эффективной генетической конструкции методами лентивирусной трансдукции, FACS сортировки и проточной цитометрии были получены и охарактеризованы клеточные линии, экспрессирующие на поверхности С-пептиды. Целевую доставку конструкций с С-пептидами в геном

осуществляли методом СК18РК/СаБ9-опосредованного нокина. Резистентность генетически-модифицированных клеток к ВИЧ -1 инфекции оценивали как с помощью псевдовирусных частиц и теста одноцикловой репликации, так и с использованием репликационно-компетентных штаммов вируса. Защиту клеток от двух типов трансмиссии ВИЧ-1 - межклеточной и классической с помощью изолированных вирусных частиц - определяли с помощью оригинального интрон-содержащего репортерного вектора тЬис, разработанного в лаборатории ранее. Исследование проводилось с применением современных молекулярно-биологических, генетических и вирусологических методов.

Положения, выносимые на защиту

1. Генетически-кодируемые GPI-заякоренные С-пептиды С34, МТ-С34 и, в меньшей степени, 2Р23 и HP23L эффективно защищают пермиссивные клетки от инфекции Х4- и R5-тропным ВИЧ-1.

2. Степень защиты клетки от ВИЧ-1 зависит от уровня поверхностной экспрессии С-пептида, а не от изменения уровня экспрессии вирусных рецептора или корецепторов.

3. В отличие от мембранно-заякоренной формы секреция пептида МТ-С34 неэффективна и не обеспечивает защиту клеток от инфекции ВИЧ-1.

4. Разработан дизайн нокина С-пептидов в провирусный геном ВИЧ-1 и локус СХСЯ4 с возможностью инактивации или сохранения экспрессии гена-мишени.

5. Биаллельный нокин двух различных пептидов МТ-С34 и 2Р23 в локус СХСЯ4 в клетках СEM/R5 суммирует их ингибирующую активность, обеспечивая устойчивость клеток в том числе к мутантным формам ВИЧ-1 и селективное размножение резистентных клеток.

6. В результате оптимизации протокола активации/трансфекции, удлинения плечей гомологии, клонирования донорной ДНК в плазмиду и ее модификации сигналами для ядерного импорта на порядок

повышены уровни нокина MT-C34 в клеточной линии CEM/R5 и в первичных CD4+ лимфоцитах человека.

7. Преимущество нокина перед лентивирусной доставкой пептида MT-C34 состоит в более высоком уровне экспрессии пептида, более эффективной защите CD4+ лимфоцитов от ВИЧ-1 инфекции и в отсутствии IFNy ответа. Степень достоверности и апробация результатов

По результатам диссертационной работы опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых изданиях. Получено 2 патента на изобретения. Материалы работы представлены на российских и международных научных конференциях.

Статьи в научных журналах:

1. Maslennikova A, Kruglova N, Kalinichenko S, Komkov D, Shepelev M, Golubev D, Siniavin A, Vzorov A, Filatov A, Mazurov D Engineering T-Cell Resistance to HIV-1 Infection via Knock-In of Peptides from the Heptad Repeat 2 Domain of gp41. mBio. 2022 Jan 25;13(1) doi: 10.1128/mbio.03589-21

2. Maslennikova A and Mazurov D Application of CRISPR/Cas Genomic Editing Tools for HIV Therapy: Toward Precise Modifications and Multilevel Protection. Front. Cell. Infect. Microbiol. 25 May 2022 12:880030. doi: 10.3389/fcimb.2022.880030

Патенты:

1. По заявке на изобретение 2020142800 от 24.12.2020 «Технология создания Т-клеточной устойчивости к ВИЧ -1 на основе генетически кодируемых GPI-заякоренных пептидов из gp41» Масленникова А., Круглова Н., Зотова А., Мазуров Д. получен патент на изобретение RU2769567C1 от 04.04.2022

2. По заявке на изобретение 2021131499 от 27.10.2021 «Способ усиления направленного редактирования гена CXCR4 в CD4-лимфоцитах человека в целях создания резистентности клеток к ВИЧ-1» Масленникова А., Круглова Н., Комков Д., Мазуров Д. получен патент на изобретение №RU2779300C1 от 05.09.2022.

Тезисы докладов на конференциях:

1. Масленникова А.Ю., Круглова Н.А., Комков Д.С., Мазуров Д.В. «Направленная интеграция пептидных ингибиторов слияния из gp41 в ген CXCR4 полностью защищает Т-клетки человека от инфекции ВИЧ-1» III объединенный научный форум физиологов, биохимиков и молекулярных биологов Россия Дагомыс, Сочи 3-8 октября 2021 Сборник тезисов ISBN: 978-5-00189-678-4 стр.204

2. A. Maslennikova, N. Kruglova, D. Mazurov «Knockin of fusion inhibitory peptides into CXCR4 gene confers a strong resistance of lymphocytes to HIV1» 45th FEBS Congress Lubljana, Slovenia, 3-8 July 2021 Опубликовано FEBS Open Bio 11/1, p.32.

3. D. Mazurov, A. Maslennikova «SORTS is a novel method for selection of geneedited cells: advantages and new areas of application» 45th FEBS Congress Lubljana, Slovenia, 3-8 July 2021 Опубликовано FEBS Open Bio 11/1, p.33.

4. Maslennikova, A.; Komkov, D.; Zotova, A.; Mazurov, D. «Cell Surface-Expressed GPI-Anchored Peptides from the CHR Domain of gp41 Are Potent Inhibitors of HIV-1 Fusion» Viruses 2020 - Novel Concepts in Virology, Barcelone, Spain, February 5-7. Опубликовано Proceedings MDPI 2020, 50/1, p.70.

5. Mazurov, D.; Maslennikova, A.; Komkov, D.; Zotova, A. «Application of SORTS, a Novel Gene-Edited Cell Selection Method for HIV Study and Therapy» Viruses 2020 - Novel Concepts in Virology, Barcelone, Spain, February 5-7. Опубликовано Proceedings, MDPI, 2020, 50/1, p.13.

6. Масленникова А.Ю., Зотова А.А., Мазуров Д.В. «Генотерапия ВИЧ-1 на основе GPI-заякоренных пептидов из GP41» VI съезд биохимиков России, Дагомыс, Сочи, 1-6 октября 2019 г. Сборник тезисов ISBN: 9785-00150-521-1, стр.33

7. Комков Д.С., Масленникова А.Ю., Зотова А.А., Мазуров Д.В. «Создание трансгенных лимфоидных клеток человека для изучения межклеточной трансмиссии ВИЧ-1» VI съезд биохимиков России, Дагомыс, Сочи, 1-6 октября 2019 г. Сборник тезисов ISBN: 978-5-00150521-1, стр.31

8. Мазуров Д.В., Масленникова А.Ю., Зотова А.А. «Конструирование ВИЧ-1-эффекторных и ВИЧ-1-резистентных Т клеток человека с помощью модифицированного метода SORTS» VI съезд биохимиков России, Дагомыс, Сочи, 1-6 октября 2019 г. Сборник тезисов ISBN: 9785-00150-521-1 стр.12

Личный вклад автора

Автор внес основной вклад в получение и анализ представленных в работе данных. Все эксперименты выполнены автором или при его участии. Автор принимал участие в подготовке публикаций и докладов на конференциях. Автором написан текст диссертации. Эксперименты в условиях BSL2+ проводили д.б.н. Взоров А.Н. и к.б.н. Синявин А.Э. в НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Комплексы RNP Cas9 подготовил к.б.н. Шепелев М.В. в ИБГ РАН. Имена соавторов указаны в публикациях.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав ("Обзор литературы", "Материалы и Методы", "Результаты и обсуждения", "Заключение") и выводов. Работа изложена на 146 страницах, содержит 50 рисунков, 4 таблицы. Список литературы включает 170 источников.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Вирус иммунодефицита человека

ВИЧ-1 принадлежит к семейству Retroviridae, роду ЬепйупиБ. ВИЧ инфицирует клетки, несущие на своей поверхности CD4 рецептор и один из корецепторов CCR5 или CXCR4, что определяет его тропность. Геном ВИЧ-1, который представлен в вирионе двумя молекулами односпиральной РНК, содержит 9 генов, кодирующих 15 белков [26]. Структура генома ВИЧ-1 представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Структура генома ВИЧ-1. Схематично показано положение генов в геноме ВИЧ. Геном содержит три открытые рамки считывания, кодирующих 9 вирусных генов. Изображение создано с помощью ВюЯепёег.

На 5'- и 3'-концах генома расположены длинные концевые повторы (LTR, Long terminal repeats). Структурные и регуляторные гены частично перекрываются. Известно три основных структурных гена — gag, pol и env. Gag кодирует белки нуклеокапсида и матрикса, pol - обратную транскриптазу, интегразу и протеазу, env - белки оболочки вируса. Остальные 6 генов: tat, rev, vif, vpr, vpu и nef кодируют белки, необходимые для инфицирования клеток и производства новых копий ВИЧ. Tat и rev кодируют регуляторные белки, запускающие транскрипцию с ДНК провируса и обеспечивают транспорт вирусной РНК из ядра в цитоплазму. Vif, vpr, vpu и nef кодируют вспомогательные белки, обеспечивающие репликацию в некоторых типах клеток и противодействующие клеточным защитным механизмам [27].

Вирион ВИЧ-1 имеет сферическую форму диаметром 100-120 нм. Вирус покрыт липидной оболочкой, в которую встроены гликопротеиновые

комплексы Env, состоящие из трансмембранного тримера gp41 и поверхностного тримера gp120. Под оболочкой расположен матрикс, выполняющий каркасную функцию. В центре расположен конусообразный капсид, состоящий из молекул р24. Внутри нуклеокапсида расположены молекулы геномной РНК и ферменты, необходимые для интеграции в геном клетки хозяина [28] (рисунок 2).

Рисунок 2. Строение вириона ВИЧ-1. Снаружи расположена двухслойная липидная оболочка, пронизанная бпу, состоящая из трансмембранного гликопротеина gp41 и поверхностного гликопротеина gp120. Капсид состоит из молекул р24 и имеет форму усеченного конуса. Внутри капсида находятся две нити РНК и вирусные белки. Изображение создано с помощью BioRender.

Жизненный цикл ВИЧ-1 включает в себя следующие стадии: проникновение в клетку, транспорт в ядро, обратная транскрипция, интеграция в геном, транскрипция, трансляция, сборка и отпочковывание вирусных частиц.

Для проникновения в клетку гликопротеин gp120 связывается с CD4 рецептором на поверхности клетки-мишени. В результате этого процесса gp120 меняет свою конформацию и связывается в зависимости от тропизма с корецептором CCR5 или CXCR4. После этого гликопротеин gp41 меняет свою конформацию, «выбрасывая» в мембрану пептид слияния (FP). Дальнейшие конформационные изменения gp41 приводят к сближению N и ^концевого гептадных повторов в этом белке и формированию шестиспирального пучка.

В результате этого процесса происходит слияние вирусной и клеточной мембран, после чего нуклеокапсид проникает в цитоплазму [29].

После транспортировки в ядро обратная транскриптаза ВИЧ-1 синтезирует на матрице вирусной РНК ее ДНК копию - процесс, называемый обратной транскрипцией [30]. С помощью вирусной интегразы ДНК ВИЧ-1 встраивается в геном инфицированной клетки. РНК-полимераза II осуществляет транскрипцию ДНК провируса. Выделяют несколько типов транскриптов ВИЧ-1: 1- несплайсированные молекулы РНК служат матрицей для трансляции продуктов генов gag-pol, а также геномной РНК, которая упаковывается в вирусные частицы; 2- частично и полностью сплайсированные молекулы РНК служат матрицей для синтеза белка оболочки Env, регуляторных белков Tat и Rev, а также вспомогательных белков Vpr, Vpu, Vif и Nef. Сборка и отпочковывание вирионов происходит в липидных рафтах. В процессе отпочковывания ВИЧ забирает часть клеточной мембраны в качестве своей липидной оболочки [31].

Для инфекции ВИЧ-1 характерен длительный инкубационный период и пожизненное персистирование вируса в организме. Без применения АРТ число CD4+ Т-лимфоцитов снижается и у пациентов развивается СПИД, что в свою очередь вызывает развитие оппортунистических инфекций, опухолей, и как следствие, летальный исход заболевания.

На данный момент АРТ не позволяет добиться полной эрадикации вируса из организма, в связи с чем ее применение является пожизненным. При этом для ВИЧ характерно развитие устойчивости к препаратам, в связи с чем пациенты вынуждены применять несколько лекарств, направленных на блокирование разных стадий жизненного цикла ВИЧ-1. Существенной проблемой является развитие токсических эффектов АРТ и высокая стоимость препаратов. Кроме того, важным фактором успешности терапии является приверженность пациента лечению, так как нерегулярность приема препаратов приводит к формированию мультирезистентных штаммов ВИЧ-1. Дальнейший подбор эффективной АРТ бывает сильно затруднен.

Описанные выше проблемы лечения ВИЧ инфекции способствовали бурному развитию генной терапии ВИЧ-1 в последние годы, конечной целью которой является полная эрадикация вируса из организма человека c формированием устойчивости к повторному заражению. Большим прорывом в этой области стало появление и совершенствование системы CRISPR/Cas9, которая значительно упростила и удешевила работу по редактированию генома.

2.2. Система CRISPR/Cas как инструмент редактирования генома

В 2012 году Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна впервые продемонстрировали, что направляемая с помощью CRISPR РНК бактериальная ДНК-нуклеаза Cas9 может быть запрограммирована для редактирования геномов эукариот [6]. В 2020 году за исследования системы CRISPR/Cas они получили Нобелевскую премию по химии.

У бактерий система CRISPR/Cas выполняет функцию адаптивного иммунного ответа на вирусную инвазию. Для этого система получает из вирусной ДНК спейсерные последовательности, которые интегрируются в бактериальную кассету CRISPR, а затем используются для защиты бактерий от повторного инфицирования тем же вирусом или фагом. Таким образом, этот процесс делится на три фазы, называемые адаптацией, экспрессией и интерференцией. Именно изучение фазы интерференции у бактерий легло в основу адаптации системы для геномного редактирования у млекопитающих и человека.

2.2.1. Нуклеаза Cas9

Бактериальная система CRISPR/Cas подразделяется на два класса и шесть типов [32]. Эффекторный комплекс системы CRISPR класса I состоит из нескольких субъединиц Cas, тогда как система класса II представлена одним эффекторным нуклеазным белком. Поскольку экспрессия одного белка

Cas значительно проще, чем нескольких, именно система CRISPR/Cas II класса была адаптирована для редактирования генома людей и других организмов.

Наиболее широко изученной и распространенной является эффекторная нуклеаза Cas9 из Streptococcus pyogenes. Она относится к классу II типу II CRISPR/Cas.

Cas9 состоит из двух долей: распознающей (REC) и нуклеазной (NUC). В доле REC выделяют три области: а-спираль, называемую спиралью моста, домены REC1 и REC2. Доля NUC состоит из доменов RuvC, HNH и домена, взаимодействующего с PAM [33] (рисунок 3 А). Без гРНК белок Cas9 остается неактивным. Для связывания с ДНК ему требуется CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующая РНК (tracrRNA). CrRNA Cas9 состоит из двадцатинуклеотидной спейсерной последовательности, которая распознает целевой участок двуцепочечной ДНК (дцДНК), который c 3'-конца должен иметь последовательность NGG, так называемый protospacer adjacent motif (PAM). Чтобы упростить нацеливание Cas9 на ДНК, crRNA и tracrRNA были объединены в одну гидовую РНК (гРНК), экспрессированную с U6 промотора [34].

Описанная гРНК связывается с белком Cas9, индуцируя конформационные изменения, превращающие неактивный белок в его активную форму. Активный комплекс сталкивается с ДНК случайным образом, в результате чего образуются слабые взаимодействия Cas9 с участками PAM, разбросанными по геному. РАМ-взаимодействующий домен Cas9 инициирует расплетание дуплекса ДНК на один нуклеотид. При наличии комплементарности гРНК стимулирует респлетение целевого участка ДНК, после чего происходит внесение одноцепочечных разрывов в цепь, содержащую протоспейсер (участок, соответствующий гРНК) и комплементарную цепь нуклеазными доменами RuvC и HNH соответственно, таким образом образуются целевые двуцепочечные разрывы ДНК [33] (рисунок 3 Б). Было показано, что комплекс гРНК-Cas9 эффективно и

специфично нацеливается на различные гены в разных типах клеток человека [34], [35]. А

Б

1—'—

ЙЕС1 ИЕС II

Активный комплексСэбЭ/гРНК

..........I..............

Целевая ДНК

Комплекс Са59/гРНК связывается с целевой ДНК

I

спеисе] протоспейсе]

Рисунок 3. Механизм внесения двуцепочечных разрывов Cas9. (А) Доменная структура и механизм активации комплекса Cas9. Белок Cas9 состоит из шести доменов: Rec I, Rec II, а-спираль (Bridge helix) - распознающая доля и RuvC, HNH и домен, взаимодействующий с РАМ (PAM Interacting) - NUC доля. Доменная структура изображена в виде схемы. Искусственная гРНК показана зеленым, красным выделена последовательность спейсера, комплементарная целевой ДНК. При взаимодействии с Cas9 образует с ней комплекс и переводит из неактивной формы в активную. (Б) Активированная Cas9 ищет целевую ДНК путем связывания с последовательностями, которые соответствуют последовательности PAM (выделено звездочками). Когда белок Cas9 находит потенциальную целевую последовательность белок расплетает ДНК и соединяется с комплементарной областью на направляющей РНК. Если комплементарная область и целевая область соединяются правильно, нуклеазные домены RuvC и HNH разрезают целевую ДНК. Cavanagh & Garrity, 2014 с изменениями [36].

2.2.2. Механизмы репарации двуцепочечных разрывов ДНК

Все клетки млекопитающих обладают двумя ферментативными путями, которые опосредуют репарацию DSB: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HDR).

2.2.2.1. Механизм NHEJ

Механизм NHEJ представляет собой лигазную реакцию, с помощью которой соединяются вместе тупые концы ДНК после их разрыва. NHEJ инициируется связыванием белкового гетеродимера Ku70/80 с обоими концами разорванной молекулы ДНК. Они создают механическую опору для работы остальных ферментов репарации. ДНК-Ки привлекает каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы, которая отвечает за формирование синаптического комплекса, который соединяет оба конца ДНК. После образования комплекса из ДНК, Ku и ДНК-зависимой протеинкиназы, некомплементарные концы ДНК обрабатываются для последующего лигирования. Было идентифицировано несколько ферментов, включая нуклеазы и полимеразы, которые способны либо удалять, либо заполнять

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Масленникова Александра Констанция Юрьевна, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

[1] G. Hutter et al., "Long-Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem-Cell Transplantation," New England Journal of Medicine, vol. 360, no. 7, pp. 692-698, Feb. 2009, doi: 10.1056/NEJMoa0802905.

[2] K. Allers et al., "Evidence for the cure of HIV infection by CCR5A32/A32 stem cell transplantation," Blood, vol. 117, no. 10, pp. 2791-2799, Mar. 2011, doi: 10.1182/blood-2010-09-309591.

[3] S. A. Yukl et al., "Challenges in Detecting HIV Persistence during Potentially Curative Interventions: A Study of the Berlin Patient," PLoS Pathog, vol. 9, no. 5, p. e1003347, May 2013, doi: 10.1371/journal.ppat.1003347.

[4] R. K. Gupta et al., "HIV-1 remission following CCR5A32/A32 haematopoietic stem-cell transplantation," Nature, vol. 568, no. 7751, p. 244—248, 2019, doi: 10.1038/s41586-019-1027-4.

[5] R. K. Gupta et al., "Evidence for HIV-1 cure after CCR5A32/A32 allogeneic haemopoietic stem-cell transplantation 30 months post analytical treatment interruption: a case report," Lancet HIV, vol. 7, no. 5, pp. e340-e347, May 2020, doi: 10.1016/S2352-3018(20)30069-2.

[6] M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, and E. Charpentier, "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity," Science (1979), vol. 337, no. 6096, pp. 816 LP - 821, Aug. 2012, doi: 10.1126/science.1225829.

[7] W. Hu et al., "RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 111, no. 31, pp. 11461 LP -11466, Aug. 2014, doi: 10.1073/pnas.1405186111.

[8] R. Kaminski et al., "Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing," Sci Rep, vol. 6, no. 1, p. 22555, 2016, doi: 10.1038/srep22555.

[9] G. Wang, N. Zhao, B. Berkhout, and A. T. Das, "CRISPR-Cas9 Can Inhibit HIV-1 Replication but NHEJ Repair Facilitates Virus Escape," Molecular Therapy, vol. 24, no. 3, pp. 522-526, 2016, doi: https://doi.org/10.1038/mt.2016.24.

[10] H.-K. Liao et al., "Use of the CRISPR/Cas9 system as an intracellular defense against HIV-1 infection in human cells," Nat Commun, vol. 6, no. 1, p. 6413, 2015, doi: 10.1038/ncomms7413.

[11] L. Ye et al., "Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5A32 mutation confers resistance to HIV infection," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 111, no. 26, pp. 9591 LP - 9596, Jul. 2014, doi: 10.1073/pnas.1407473111.

[12] S. Liu et al., "HIV-1 inhibition in cells with CXCR4 mutant genome created by CRISPR-Cas9 and piggyBac recombinant technologies," Sci Rep, vol. 8, no. 1, p. 8573, Dec. 2018, doi: 10.1038/s41598-018-26894-4.

[13] S. Yu et al., "Simultaneous Knockout of CXCR4 and CCR5 Genes in CD4+ T Cells via CRISPR/Cas9 Confers Resistance to Both X4- and R5-Tropic Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection," Hum Gene Ther, vol. 29, no. 1, pp. 51-67, Jun. 2017, doi: 10.1089/hum.2017.032.

[14] Z. Wang et al., "CRISPR/Cas9-Derived Mutations Both Inhibit HIV-1 Replication and Accelerate Viral Escape," Cell Rep, vol. 15, no. 3, pp. 481-489, 2016, doi: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.042.

[15] K. E. Yoder and R. Bundschuh, "Host Double Strand Break Repair Generates HIV-1 Strains Resistant to CRISPR/Cas9," Sci Rep, vol. 6, no. 1, p. 29530, 2016, doi: 10.1038/srep29530.

[16] Y. Fu et al., "High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells," Nat Biotechnol, vol. 31, no. 9, pp. 822-826, Sep. 2013, doi: 10.1038/nbt.2623.

[17] M. Kosicki, K. Tomberg, and A. Bradley, "Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements," Nat Biotechnol, vol. 36, no. 8, pp. 765771, Sep. 2018, doi: 10.1038/nbt.4192.

[18] Z. MAO, M. BOZZELLA, A. SELUANOV, and V. GORBUNOVA, "Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells," DNA Repair (Amst), vol. 7, no. 10, pp. 1765-1771, Oct. 2008, doi: 10.1016/j.dnarep.2008.06.018.

[19] Y. Miyaoka et al., "Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease, and cell type on genome-editing," Sci Rep, vol. 6, no. 1, p. 23549, Apr. 2016, doi: 10.1038/srep23549.

[20] C. de Feo and C. Weiss, "Escape from Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Entry Inhibitors," Viruses, vol. 4, no. 12, pp. 3859-3911, Dec. 2012, doi: 10.3390/v4123859.

[21] M. Egelhofer et al., "Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Entry in Cells Expressing gp41-Derived Peptides," J Virol, vol. 78, no. 2, pp. 568-575, Jan. 2004, doi: 10.1128/JVI.78.2.568-575.2004.

[22] M. Hildinger et al., "Membrane-Anchored Peptide Inhibits Human Immunodeficiency Virus Entry," J Virol, vol. 75, no. 6, pp. 3038-3042, Mar. 2001, doi: 10.1128/JVI.75.6.3038-3042.2001.

[23] L. Liu, M. Wen, Q. Zhu, J. T. Kimata, and P. Zhou, "Glycosyl Phosphatidylinositol-Anchored C34 Peptide Derived From Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gp41 Is a Potent Entry Inhibitor," Journal of Neuroimmune Pharmacology, vol. 11, no. 3, pp. 601-610, 2016, doi: 10.1007/s11481-016-9681-x.

[24] X. Tang et al., "A Membrane-Anchored Short-Peptide Fusion Inhibitor Fully Protects Target Cells from Infections of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), HIV-2, and Simian Immunodeficiency Virus," J Virol, vol. 93, no. 22, Nov. 2019, doi: 10.1128/JVI.01177-19.

[25] G. J. Leslie et al., "Potent and Broad Inhibition of HIV-1 by a Peptide from the gp41 Heptad Repeat-2 Domain Conjugated to the CXCR4 Amino Terminus," PLoS Pathog, vol. 12, no. 11, p. e1005983, Nov. 2016, doi: 10.1371/journal.ppat.1005983.

[26] G. Li and E. de Clercq, "HIV Genome-Wide Protein Associations: a Review of 30 Years of Research," Microbiology and Molecular Biology Reviews, vol. 80, no. 3, pp. 679-731, Sep. 2016, doi: 10.1128/MMBR.00065-15.

[27] A. Seelamgari, "Role of viral regulatory and accessory proteins in HIV-1 replication," Frontiers in Bioscience, vol. 9, no. 1-3, p. 2388, 2004, doi: 10.2741/1403.

[28] F. Barre-Sinoussi, "HIV as the cause of AIDS," The Lancet, vol. 348, no. 9019, pp. 31-35, Jul. 1996, doi: 10.1016/S0140-6736(96)09058-7.

[29] B. Chen, "Molecular Mechanism of HIV-1 Entry," Trends Microbiol, vol. 27, no. 10, pp. 878-891, 2019, doi: https://doi.org/10.1016/j.tim.2019.06.002.

[30] R. C. Burdick et al., "HIV-1 uncoats in the nucleus near sites of integration," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 117, no. 10, pp. 5486-5493, Mar. 2020, doi: 10.1073/pnas.1920631117.

[31] H. S. H. , V. H. E. Coffin J.M., "Principles of Particle Assembly," Retroviruses, 1997.

[32] C. Mosterd, G. M. Rousseau, and S. Moineau, "A short overview of the CRISPR-Cas adaptation stage," Can J Microbiol, vol. 67, no. 1, pp. 1-12, Jan. 2021, doi: 10.1139/cjm-2020-0212.

[33] H. Nishimasu et al., "Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA," Cell, vol. 156, no. 5, pp. 935-949, Feb. 2014, doi: 10.1016/j.cell.2014.02.001.

[34] L. Cong et al., "Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems," Science (1979), vol. 339, no. 6121, pp. 819-823, Feb. 2013, doi: 10.1126/science.1231143.

[35] P. Mali, K. M. Esvelt, and G. M. Church, "Cas9 as a versatile tool for engineering biology," Nat Methods, vol. 10, no. 10, pp. 957-963, 2013, doi: 10.1038/nmeth.2649.

[36] Cavanagh P. and Garrity A., "Cas9 Mechanism," CRISPR/Cas9, Tufts University, 2014.

[37] E. Weterings and D. J. Chen, "The endless tale of non-homologous end-joining," Cell Res, vol. 18, no. 1, pp. 114-124, Jan. 2008, doi: 10.1038/cr.2008.3.

[38] T. Liu and J. Huang, "Quality control of homologous recombination," Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 71, no. 19, pp. 3779-3797, Oct. 2014, doi: 10.1007/s00018-014-1649-5.

[39] D. Klatzmann et al., "T-lymphocyte T4 molecule behaves as the receptor for human retrovirus LAV," Nature, vol. 312, no. 5996, pp. 767-768, Dec. 1984, doi: 10.1038/312767a0.

[40] A. G. Dalgleish, P. C. L. Beverley, P. R. Clapham, D. H. Crawford, M. F. Greaves, and R. A. Weiss, "The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus," Nature, vol. 312, no. 5996, pp. 763-767, Dec. 1984, doi: 10.1038/312763a0.

[41] Y. Feng, C. C. Broder, P. E. Kennedy, and E. A. Berger, "HIV-1 Entry Cofactor: Functional cDNA Cloning of a Seven-Transmembrane, G Protein-Coupled Receptor," Science (1979), vol. 272, no. 5263, pp. 872-877, May 1996, doi: 10.1126/science.272.5263.872.

[42] H. Deng et al., "Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1," Nature, vol. 381, no. 6584, pp. 661-666, Jun. 1996, doi: 10.1038/381661a0.

[43] R. A. Weiss, "Thirty years on: HIV receptor gymnastics and the prevention of infection," BMC Biol, vol. 11, no. 1, p. 57, 2013, doi: 10.1186/1741-7007-11-57.

[44] R. I. Connor, K. E. Sheridan, D. Ceradini, S. Choe, and N. R. Landau, "Change in Coreceptor Use Correlates with Disease Progression in HIV-1-Infected Individuals," Journal of Experimental Medicine, vol. 185, no. 4, pp. 621-628, Feb. 1997, doi: 10.1084/jem.185.4.621.

[45] G. Scarlatti et al., "In vivo evolution of HIV-1 co-receptor usage and sensitivity to chemokine-mediated suppression," Nat Med, vol. 3, no. 11, pp. 1259-1265, 1997, doi: 10.1038/nm1197-1259.

[46] M. Samson et al., "Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene," Nature, vol. 382, no. 6593, pp. 722-725, 1996, doi: 10.1038/382722a0.

[47] P. Tebas et al., "Gene Editing of CCR5 in Autologous CD4 T Cells of Persons Infected with HIV," New England Journal of Medicine, vol. 370, no. 10, pp. 901-910, Mar. 2014, doi: 10.1056/NEJMoa1300662.

[48] C. Li et al., "Inhibition of HIV-1 infection of primary CD4+ T-cells by gene editing of CCR5 using adenovirus-delivered CRISPR/Cas9," Journal of General Virology, vol. 96, no. 8, pp. 2381-2393, Aug. 2015, doi: 10.1099/vir.0.000139.

[49] J. F. Hultquist et al., "A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIVHost Interactions in Primary Human T Cells," Cell Rep, vol. 17, no. 5, pp. 1438-1452, Oct. 2016, doi: 10.1016/j.celrep.2016.09.080.

[50] H. Kang, P. Minder, M. A. Park, W.-T. Mesquitta, B. E. Torbett, and I. I. Slukvin, "CCR5 Disruption in Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 Provides Selective Resistance of Immune Cells to CCR5-tropic HIV-1 Virus," Mol Ther Nucleic Acids, vol. 4, p. e268, 2015, doi: 10.1038/mtna.2015.42.

[51] D. Lin, S. H. Scheller, M. M. Robinson, R. Izadpanah, E. U. Alt, and S. E. Braun, "Increased Efficiency for Biallelic Mutations of the CCR5 Gene by CRISPR-Cas9 Using Multiple Guide RNAs As a Novel Therapeutic Option for Human Immunodeficiency Virus," CRISPR J, vol. 4, no. 1, pp. 92103, Feb. 2021, doi: 10.1089/crispr.2020.0019.

[52] P. K. Mandal et al., "Efficient Ablation of Genes in Human Hematopoietic Stem and Effector Cells using CRISPR/Cas9," Cell Stem Cell, vol. 15, no. 5, pp. 643-652, 2014, doi: https://doi.org/10.1016/j.stem.2014.10.004.

[53] W. Wang, C. Ye, J. Liu, D. Zhang, J. T. Kimata, and P. Zhou, "CCR5 Gene Disruption via Lentiviral Vectors Expressing Cas9 and Single Guided RNA Renders Cells Resistant to HIV-1 Infection," PLoS One, vol. 9, no. 12, p. e115987, Dec. 2014, doi: 10.1371/journal.pone.0115987.

[54] N. Holt et al., "Human hematopoietic stem/progenitor cells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5 control HIV-1 in vivo," Nat Biotechnol, vol. 28, no. 8, pp. 839-847, Aug. 2010, doi: 10.1038/nbt.1663.

[55] L. Xu et al., "CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia," New England Journal of Medicine, vol. 381, no. 13, pp. 1240-1247, Sep. 2019, doi: 10.1056/NEJMoa1817426.

[56] S. R. Modarai, D. Man, P. Bialk, N. Rivera-Torres, K. Bloh, and E. B. Kmiec, "Efficient Delivery and Nuclear Uptake Is Not Sufficient to Detect Gene Editing in CD34+ Cells Directed by a Ribonucleoprotein Complex," Mol Ther Nucleic Acids, vol. 11, pp. 116-129, Jun. 2018, doi: 10.1016/j.omtn.2018.01.013.

[57] B. Davies, "The technical risks of human gene editing," Human Reproduction, vol. 34, no. 11, pp. 2104-2111, Nov. 2019, doi: 10.1093/humrep/dez162.

[58] L. Kordelas, J. Verheyen, and S. Esser, "Shift of HIV Tropism in Stem-Cell Transplantation with CCR5 Delta32 Mutation," New England Journal of Medicine, vol. 371, no. 9, pp. 880-882, Aug. 2014, doi: 10.1056/NEJMc1405805.

[59] M. Vergara-Mendoza et al., "Regulation of Cas9 by viral proteins Tat and Rev for HIV-1 inactivation," Antiviral Res, vol. 180, p. 104856, Aug. 2020, doi: 10.1016/j.antiviral.2020.104856.

[60] A. Dar, O. Kollet, and T. Lapidot, "Mutual, reciprocal SDF-1/CXCR4 interactions between hematopoietic and bone marrow stromal cells regulate human stem cell migration and development in NOD/SCID chimeric mice," Exp Hematol, vol. 34, no. 8, pp. 967-975, Aug. 2006, doi: 10.1016/j.exphem.2006.04.002.

[61] Y. Nie, Y.-C. Han, and Y.-R. Zou, "CXCR4 is required for the quiescence of primitive hematopoietic cells," Journal of Experimental Medicine, vol. 205, no. 4, pp. 777-783, Apr. 2008, doi: 10.1084/jem.20072513.

[62] S.-H. Chung et al., "CXC chemokine receptor 4 expressed in T cells plays an important role in the development of collagen-induced arthritis," Arthritis Res Ther, vol. 12, no. 5, p. R188, 2010, doi: 10.1186/ar3158.

[63] J. Yuan et al., "Zinc-finger Nuclease Editing of Human cxcr4 Promotes HIV-1 CD4+ T Cell Resistance and Enrichment," Molecular Therapy, vol. 20, no. 4, pp. 849-859, 2012, doi: https://doi.org/10.1038/mt.2011.310.

[64] P. Hou et al., "Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection," Sci Rep, vol. 5, no. 1, p. 15577, 2015, doi: 10.1038/srep15577.

[65] K. Schumann et al., "Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 112, no. 33, pp. 10437 LP - 10442, Aug. 2015, doi: 10.1073/pnas.1512503112.

[66] Z. Liu et al., "Genome editing of the HIV co-receptors CCR5 and CXCR4 by CRISPR-Cas9 protects CD4+ T cells from HIV-1 infection," Cell Biosci, vol. 7, no. 1, p. 47, 2017, doi: 10.1186/s13578-017-0174-2.

[67] J. N. Blankson, D. Persaud, and R. F. Siliciano, "The Challenge of Viral Reservoirs in HIV-1 Infection," Annu Rev Med, vol. 53, no. 1, pp. 557-593, Feb. 2002, doi: 10.1146/annurev.med.53.082901.104024.

[68] J. D. Siliciano et al., "Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells," Nat Med, vol. 9, no. 6, pp. 727-728, Jun. 2003, doi: 10.1038/nm880.

[69] H. Ebina, N. Misawa, Y. Kanemura, and Y. Koyanagi, "Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus," Sci Rep, vol. 3, no. 1, p. 2510, 2013, doi: 10.1038/srep02510.

[70] W. Zhu et al., "The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA," Retrovirology, vol. 12, no. 1, p. 22, 2015, doi: 10.1186/s12977-015-0150-z.

[71] G. Wang, N. Zhao, B. Berkhout, and A. T. Das, "CRISPR-Cas based antiviral strategies against HIV-1," Virus Res, vol. 244, pp. 321-332, 2018, doi: https://doi.org/10.1016/j~.virusres.2017.07.020.

[72] S. Ueda, H. Ebina, Y. Kanemura, N. Misawa, and Y. Koyanagi, "Anti-HIV-1 potency of the CRISPR/Cas9 system insufficient to fully inhibit viral replication," Microbiol Immunol, vol. 60, no. 7, pp. 483-496, Jul. 2016, doi: https://doi.org/10.1111/1348-0421.12395.

[73] Q. Wang et al., "Genome scale screening identification of SaCas9/gRNAs for targeting HIV-1 provirus and suppression of HIV-1 infection," Virus Res, vol. 250, pp. 21-30, 2018, doi: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2018.04.002.

[74] Y. Ophinni, S. Miki, Y. Hayashi, and M. Kameoka, "Multiplexed tat-Targeting CRISPR-Cas9 Protects T Cells from Acute HIV-1 Infection with Inhibition of Viral Escape," Viruses , vol. 12, no. 11. 2020. doi: 10.3390/v12111223.

[75] C. Yin et al., "Functional screening of guide RNAs targeting the regulatory and structural HIV-1 viral genome for a cure of AIDS," AIDS, vol. 30, no. 8, pp. 1163-1174, May 2016, doi: 10.1097/QAD.0000000000001079.

[76] C. Yin et al., "In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models," Molecular Therapy, vol. 25, no. 5, pp. 1168-1186, 2017, doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.012.

[77] G. Wang, N. Zhao, B. Berkhout, and A. T. Das, "A Combinatorial CRISPR-Cas9 Attack on HIV-1 DNA Extinguishes All Infectious Provirus in Infected T Cell Cultures," Cell Rep, vol. 17, no. 11, pp. 28192826, 2016, doi: https://doi.org/10.10167j.celrep.2016.11.057.

[78] G. Barillari and B. Ensoli, "Angiogenic Effects of Extracellular Human Immunodeficiency Virus Type 1 Tat Protein and Its Role in the Pathogenesis of AIDS-Associated Kaposi's Sarcoma," Clin Microbiol Rev, vol. 15, no. 2, pp. 310-326, Apr. 2002, doi: 10.1128/CMR.15.2.310-326.2002.

[79] W. Witkowski and B. Verhasselt, "Contributions of HIV-1 Nef to immune dysregulation in HIV-infected patients: a therapeutic target?," Expert Opin Ther Targets, vol. 17, no. 11, pp. 13451356, Nov. 2013, doi: 10.1517/14728222.2013.830712.

[80] S. Langer et al., "HIV-1 Vpu is a potent transcriptional suppressor of NF-KB-elicited antiviral immune responses," Elife, vol. 8, Feb. 2019, doi: 10.7554/eLife.41930.

[81] M. Isaguliants, E. Bayurova, D. Avdoshina, A. Kondrashova, F. Chiodi, and J. M. Palefsky, "Oncogenic Effects of HIV-1 Proteins, Mechanisms Behind," Cancers (Basel), vol. 13, no. 2, p. 305, Jan. 2021, doi: 10.3390/cancers13020305.

[82] M. C. Canver et al., "Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Nuclease System in Mammalian Cells*," Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 31, pp. 21312-21324, Aug. 2014, doi: 10.1074/jbc.M114.564625.

[83] D. Maddalo et al., "In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system," Nature, vol. 516, no. 7531, pp. 423-427, 2014, doi: 10.1038/nature13902.

[84] W. Dampier, M. R. Nonnemacher, N. T. Sullivan, J. M. Jacobson, and B. Wigdahl, "HIV E xcision Utilizing CRISPR/Cas9 Technology: Attacking the Proviral Quasispecies in Reservoirs to Achieve a Cure," MOJ Immunol, vol. 1, no. 4, p. 22, Oct. 2014, doi: 10.15406/moji.2014.01.00022.

[85] P. Roychoudhury et al., "Viral diversity is an obligate consideration in CRISPR/Cas9 designs for targeting the HIV reservoir," BMC Biol, vol. 16, no. 1, p. 75, 2018, doi: 10.1186/s12915-018-0544-1.

[86] L. A. Campbell, L. M. Coke, C. T. Richie, L. v Fortuno, A. Y. Park, and B. K. Harvey, "Gesicle -Mediated Delivery of CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Complex for Inactivating the HIV Provirus," Molecular Therapy, vol. 27, no. 1, pp. 151-163, 2019, doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2018.10.002.

[87] P. K. Dash et al., "Sequential LASER ART and CRISPR Treatments Eliminate HIV-1 in a Subset of Infected Humanized Mice," Nat Commun, vol. 10, no. 1, p. 2753, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-10366-y.

[88] Z. Gao, M. Fan, A. T. Das, E. Herrera-Carrillo, and B. Berkhout, "Extinction of all infectious HIV in cell culture by the CRISPR-Cas12a system with only a single crRNA," Nucleic Acids Res, vol. 48, no. 10, pp. 5527-5539, Jun. 2020, doi: 10.1093/nar/gkaa226.

[89] S. Tian et al., "Distinct Functional Sites for Human Immunodeficiency Virus Type 1 and Stromal Cell-Derived Factor 1a on CXCR4 Transmembrane Helical Domains," J Virol, vol. 79, no. 20, pp. 12667-12673, Oct. 2005, doi: 10.1128/JVI.79.20.12667-12673.2005.

[90] M. Chemudupati et al., "From APOBEC to ZAP: Diverse mechanisms used by cellular restriction factors to inhibit virus infections," Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, vol. 1866, no. 3, pp. 382-394, 2019, doi: https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2018.09.012.

[91] A. A. Zotova, A. A. Atemasova, A. v Filatov, and D. v Mazurov, "HIV Restriction Factors and Their Ambiguous Role during Infection," Mol Biol, vol. 53, no. 2, pp. 212-226, 2019, doi: 10.1134/S0026893319020171.

[92] M. Stremlau, C. M. Owens, M. J. Perron, M. Kiessling, P. Autissier, and J. Sodroski, "The cytoplasmic body component TRIM5a restricts HIV-1 infection in Old World monkeys," Nature, vol. 427, no. 6977, pp. 848-853, 2004, doi: 10.1038/nature02343.

[93] T. Hatziioannou, D. Perez-Caballero, A. Yang, S. Cowan, and P. D. Bieniasz, "Retrovirus resistance factors Ref1 and Lv1 are species-specific variants of TRIM5alpha," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 101, no. 29, pp. 10774-10779, Jul. 2004, doi: 10.1073/pnas.0402361101.

[94] M. J. Perron, M. Stremlau, M. Lee, H. Javanbakht, B. Song, and J. Sodroski, "The human TRIM5alpha restriction factor mediates accelerated uncoating of the N-tropic murine leukemia virus capsid," J Virol, vol. 81, no. 5, pp. 2138-2148, Mar. 2007, doi: 10.1128/JVI.02318-06.

[95] Q. T. Pham, A. Bouchard, M. G. Grutter, and L. Berthoux, "Generation of human TRIM5a mutants with high HIV-1 restriction activity," Gene Ther, vol. 17, no. 7, pp. 859-871, 2010, doi: 10.1038/gt.2010.40.

[96] J. Anderson and R. Akkina, "Human Immunodeficiency Virus Type 1 Restriction by Human-Rhesus Chimeric Tripartite Motif 5a (TRIM 5a) in CD34+ Cell-Derived Macrophages In Vitro and in T Cells In Vivo in Severe Combined Immunodeficient (SCID-hu) Mice Transplanted with Human Fetal Tissue," Hum Gene Ther, vol. 19, no. 3, pp. 217-228, Feb. 2008, doi: 10.1089/hum.2007.108.

[97] U. Jung et al., "Preclinical Assessment of Mutant Human TRIM5a as an Anti-HIV-1 Transgene," Hum Gene Ther, vol. 26, no. 10, pp. 664-679, Jun. 2015, doi: 10.1089/hum.2015.059.

[98] C. Dufour et al., "Editing of the human TRIM5 gene to introduce mutations with the potential to inhibit HIV-1," PLoS One, vol. 13, no. 1, p. e0191709, Jan. 2018, doi: 10.1371/journal.pone.0191709.

[99] K. Désaulniers et al., "Editing of the TRIM5 Gene Decreases the Permissiveness of Human T Lymphocytic Cells to HIV-1," Viruses , vol. 13, no. 1. 2021. doi: 10.3390/v13010024.

[100] S. Jiang, K. Lin, N. Strick, and A. R. Neurath, "HIV-1 inhibition by a peptide," Nature, vol. 365, no. 6442, p. 113, 1993, doi: 10.1038/365113a0.

[101] J. Pu, Q. Wang, W. Xu, L. Lu, and S. Jiang, "Development of Protein- and Peptide-Based HIV Entry Inhibitors Targeting gp120 or gp41," Viruses , vol. 11, no. 8. 2019. doi: 10.3390/v11080705.

[102] P. Ingallinella et al., "Addition of a cholesterol group to an HIV-1 peptide fusion inhibitor dramatically increases its antiviral potency," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 106, no. 14, pp. 5801-5806, Apr. 2009, doi: 10.1073/pnas.0901007106.

[103] M. T. Augusto, A. Hollmann, M. A. R. B. Castanho, M. Porotto, A. Pessi, and N. C. Santos, "Improvement of HIV fusion inhibitor C34 efficacy by membrane anchoring and enhanced exposure," Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 69, no. 5, pp. 1286-1297, May 2014, doi: 10.1093/jac/dkt529.

[104] H. Chong, X. Wu, Y. Su, and Y. He, "Development of potent and long-acting HIV-1 fusion inhibitors," AIDS, vol. 30, no. 8, pp. 1187-1196, May 2016, doi: 10.1097/QAD.0000000000001073.

[105] H. Chong et al., "A Lipopeptide HIV-1/2 Fusion Inhibitor with Highly Potent In Vitro , Ex Vivo , and In Vivo Antiviral Activity," J Virol, vol. 91, no. 11, Jun. 2017, doi: 10.1128/JVI.00288-17.

[106] A. Ashkenazi, M. Viard, L. Unger, R. Blumenthal, and Y. Shai, "Sphingopeptides: dihydrosphingosine-based fusion inhibitors against wild-type and enfuvirtide-resistant HIV-1," The FASEB Journal, vol. 26, no. 11, pp. 4628-4636, Nov. 2012, doi: 10.1096/fj.12-215111.

[107] J. van Lunzen et al., "Transfer of Autologous Gene-modified T Cells in HIV-infected Patients with Advanced Immunodeficiency and Drug-resistant Virus," Molecular Therapy, vol. 15, no. 5, pp. 1024-1033, May 2007, doi: 10.1038/mt.sj.6300124.

[108] M. Delville et al., "Safety of CD34+ Hematopoietic Stem Cells and CD4+ T Lymphocytes Transduced with LVsh5/C46 in HIV-1 Infected Patients with High-Risk Lymphoma," Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 13, pp. 303-309, Jun. 2019, doi: 10.1016/j.omtm.2019.02.006.

[109] K. Quinn et al., "A first-in-human study of the novel HIV-fusion inhibitor C34-PEG4-Chol," Sci Rep, vol. 7, no. 1, p. 9447, Dec. 2017, doi: 10.1038/s41598-017-09230-0.

[110] B. P. Burke et al., "Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector," Mol Ther Nucleic Acids, vol. 4, p. e236, 2015, doi: 10.1038/mtna.2015.10.

[111] C. W. Peterson et al., "Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS," Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 3, p. 16007, 2016, doi: 10.1038/mtm.2016.7.

[112] S. L. Nutt, P. D. Hodgkin, D. M. Tarlinton, and L. M. Corcoran, "The generation of antibody-secreting plasma cells," Nat Rev Immunol, vol. 15, no. 3, pp. 160-171, 2015, doi: 10.1038/nri3795.

[113] K. Kometani and T. Kurosaki, "Differentiation and maintenance of long-lived plasma cells," Curr Opin Immunol, vol. 33, pp. 64-69, 2015, doi: https://doi.org/10.1016/j~.coi.2015.01.017.

[114] H. Hartweger et al., "HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells," Journal of Experimental Medicine, vol. 216, no. 6, pp. 1301-1310, Nov. 2019, doi: 10.1084/jem.20190287.

[115] A. D. Nahmad et al., "Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion," Nat Commun, vol. 11, no. 1, p. 5851, 2020, doi: 10.1038/s41467-020-19649-1.

[116] S. G. Deeks, "Shock and kill," Nature, vol. 487, no. 7408, pp. 439-440, 2012, doi: 10.1038/487439a.

[117] G. Darcis, A. T. Das, and B. Berkhout, "Tackling HIV Persistence: Pharmacological versus CRISPR-Based Shock Strategies," Viruses , vol. 10, no. 4. 2018. doi: 10.3390/v10040157.

[118] P. Limsirichai, T. Gaj, and D. v Schaffer, "CRISPR-mediated Activation of Latent HIV-1 Expression," Molecular Therapy, vol. 24, no. 3, pp. 499-507, 2016, doi: https://doi.org/10.1038/mt.2015.213.

[119] S. M. Saayman et al., "Potent and Targeted Activation of Latent HIV-1 Using the CRISPR/dCas9 Activator Complex," Molecular Therapy, vol. 24, no. 3, pp. 488-498, 2016, doi: https://doi.org/10.1038/mt.2015.202.

[120] Y. Zhang et al., "CRISPR/gRNA-directed synergistic activation mediator (SAM) induces specific, persistent and robust reactivation of the HIV-1 latent reservoirs," Sci Rep, vol. 5, no. 1, p. 16277, 2015, doi: 10.1038/srep16277.

[121] J. K. Bialek et al., "Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR/Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems," PLoS One, vol. 11, no. 6, p. e0158294, Jun. 2016, doi: 10.1371/journal.pone.0158294.

[122] H. Ji et al., "Specific Reactivation of Latent HIV-1 by dCas9-SunTag-VP64-mediated Guide RNA Targeting the HIV-1 Promoter," Molecular Therapy, vol. 24, no. 3, pp. 508-521, 2016, doi: https://doi.org/10.1038/mt.2016.7.

[123] H. Zhou et al., "In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice," Nat Neurosci, vol. 21, no. 3, pp. 440-446, Mar. 2018, doi: 10.1038/s41593-017-0060-6.

[124] D. Qu et al., "The variances of Sp1 and NF-kB elements correlate with the greater capacity of Chinese HIV-1 B'-LTR for driving gene expression," Sci Rep, vol. 6, no. 1, p. 34532, 2016, doi: 10.1038/srep34532.

[125] A. Olson, B. Basukala, S. Lee, M. Gagne, W. W. Wong, and A. J. Henderson, "Targeted Chromatinization and Repression of HIV-1 Provirus Transcription with Repurposed CRISPR/Cas9," Viruses , vol. 12, no. 10. 2020. doi: 10.3390/v12101154.

[126] N. Alerasool, D. Segal, H. Lee, and M. Taipale, "An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells," Nat Methods, vol. 17, no. 11, pp. 1093-1096, Nov. 2020, doi: 10.1038/s41592-020-0966-x.

[127] A. Okada and Y. Iwatani, "APOBEC3G-Mediated G-to-A Hypermutation of the HIV-1 Genome: The Missing Link in Antiviral Molecular Mechanisms," Front Microbiol, vol. 07, Dec. 2016, doi: 10.3389/fmicb.2016.02027.

[128] E. W. Refsland, M. D. Stenglein, K. Shindo, J. S. Albin, W. L. Brown, and R. S. Harris, "Quantitative profiling of the full APOBEC3 mRNA repertoire in lymphocytes and tissues: implications for HIV-1 restriction," Nucleic Acids Res, vol. 38, no. 13, pp. 4274-4284, Jul. 2010, doi: 10.1093/nar/gkq174.

[129] H. P. Bogerd, A. V. R. Kornepati, J. B. Marshall, E. M. Kennedy, and B. R. Cullen, "Specific induction of endogenous viral restriction factors using CRISPR/Cas-derived transcriptional activators," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 112, no. 52, Dec. 2015, doi: 10.1073/pnas.1516305112.

[130] Y. Zhang et al., "CRISPR-mediated activation of endogenous BST-2/tetherin expression inhibits wild-type HIV-1 production," Sci Rep, vol. 9, no. 1, p. 3134, 2019, doi: 10.1038/s41598-019-40003-z.

[131] J. Zou, C. Wang, X. Ma, E. Wang, and G. Peng, "APOBEC3B, a molecular driver of mutagenesis in human cancers," Cell Biosci, vol. 7, no. 1, p. 29, Dec. 2017, doi: 10.1186/s13578-017-0156-4.

[132] W. D. Mahauad-Fernandez and C. M. Okeoma, "The role of BST-2/Tetherin in host protection and disease manifestation," Immun Inflamm Dis, vol. 4, no. 1, pp. 4-23, Mar. 2016, doi: https://doi.org/10.1002/iid3.92.

[133] A. Zotova, A. Atemasova, A. Pichugin, A. Filatov, and D. Mazurov, "Distinct Requirements for HIV-1 Accessory Proteins during Cell Coculture and Cell-Free Infection," Viruses, vol. 11, no. 5, p. 390, Apr. 2019, doi: 10.3390/v11050390.

[134] C. Jolly, N. J. Booth, and S. J. D. Neil, "Cell-Cell Spread of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Overcomes Tetherin/BST-2-Mediated Restriction in T cells," J Virol, vol. 84, no. 23, pp. 1218512199, Dec. 2010, doi: 10.1128/JVI.01447-10.

[135] O. Wolstein et al., "Preclinical safety and efficacy of an anti-HIV-1 lentiviral vector containing a short hairpin RNA to CCR5 and the C46 fusion inhibitor," Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 1, p. 11,

2014, doi: 10.1038/mtm.2013.11.

[136] A. Tarasevich, A. Filatov, A. Pichugin, and D. Mazurov, "Monoclonal antibody profiling of cell surface proteins associated with the viral biofilms on HTLV-1 transformed cells," Acta Virol, vol. 59, no. 03, pp. 247-256, 2015, doi: 10.4149/av_2015_03_247.

[137] T. Murakami and E. O. Freed, "The long cytoplasmic tail of gp41 is required in a cell type-dependent manner for HIV-1 envelope glycoprotein incorporation into virions," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 97, no. 1, pp. 343-348, Jan. 2000, doi: 10.1073/pnas.97.1.343.

[138] K. Sato et al., "Modulation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infectivity through Incorporation of Tetraspanin Proteins," J Virol, vol. 82, no. 2, pp. 1021-1033, Jan. 2008, doi: 10.1128/JVI.01044-07.

[139] A. Zotova et al., "Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags," Sci Rep, vol. 9, no. 1, p. 3132, 2019, doi: 10.1038/s41598-019-40219-z.

[140] A. v. Filatov, I. B. Shmigol, I. I. Kuzin, G. v. Sharonov, and A. v. Feofanov, "Resistance of cellular membrane antigens to solubilization with Triton X-100 as a marker of their association with lipid rafts—analysis by flow cytometry," J Immunol Methods, vol. 278, no. 1-2, pp. 211-219, Jul. 2003, doi: 10.1016/S0022-1759(03)00188-1.

[141] D. Mazurov, A. Ilinskaya, G. Heidecker, P. Lloyd, and D. Derse, "Quantitative Comparison of HTLV-1 and HIV-1 Cell-to-Cell Infection with New Replication Dependent Vectors," PLoS Pathog, vol. 6, no. 2, p. e1000788, Feb. 2010, doi: 10.1371/journal.ppat.1000788.

[142] A. Shunaeva et al., "Improvement of HIV-1 and Human T Cell Lymphotropic Virus Type 1 Replication-Dependent Vectors via Optimization of Reporter Gene Reconstitution and Modification with Intronic Short Hairpin RNA," J Virol, vol. 89, no. 20, pp. 10591-10601, Oct.

2015, doi: 10.1128/JVI.01940-15.

[143] J. Kimpton and M. Emerman, "Detection of replication-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated beta-galactosidase gene," J Virol, vol. 66, no. 4, pp. 2232-2239, Apr. 1992, doi: 10.1128/jvi.66.4.2232-2239.1992.

[144] Y. Zhu, X. Ding, D. Yu, H. Chong, and Y. He, "The Tryptophan-Rich Motif of HIV-1 gp41 Can Interact with the N-Terminal Deep Pocket Site: New Insights into the Structure and Function of gp41 and Its Inhibitors," J Virol, vol. 94, no. 1, Dec. 2019, doi: 10.1128/JVI.01358-19.

[145] H. Chong et al., "The M-T hook structure increases the potency of HIV-1 fusion inhibitor sifuvirtide and overcomes drug resistance," Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 69, no. 10, pp. 2759-2769, Oct. 2014, doi: 10.1093/jac/dku183.

[146] H. Chong et al., "The M-T Hook Structure Is Critical for Design of HIV-1 Fusion Inhibitors," Journal of Biological Chemistry, vol. 287, no. 41, pp. 34558-34568, Oct. 2012, doi: 10.1074/jbc.M112.390393.

[147] H. Chong, Y. Zhu, D. Yu, and Y. He, "Structural and Functional Characterization of Membrane Fusion Inhibitors with Extremely Potent Activity against Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), HIV-2, and Simian Immunodeficiency Virus," J Virol, vol. 92, no. 20, Oct. 2018, doi: 10.1128/JVI.01088-18.

[148] S. Su et al., "Creating an Artificial Tail Anchor as a Novel Strategy To Enhance the Potency of Peptide-Based HIV Fusion Inhibitors," J Virol, vol. 91, no. 1, Jan. 2017, doi: 10.1128/JVI.01445-16.

[149] H. Chong, Z. Qiu, Y. Su, L. Yang, and Y. He, "Design of a highly potent HIV-1 fusion inhibitor targeting the gp41 pocket," AIDS, vol. 29, no. 1, pp. 13-21, Jan. 2015, doi: 10.1097/QAD.0000000000000498.

[150] S. Xiong et al., "A Helical Short-Peptide Fusion Inhibitor with Highly Potent Activity against Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), HIV-2, and Simian Immunodeficiency Virus," J Virol, vol. 91, no. 1, Jan. 2017, doi: 10.1128/JVI.01839-16.

[151] Y. Liu, A. Nguyen, R. L. Wolfert, and S. Zhuo, "Enhancing the secretion of recombinant proteins by engineering N-glycosylation sites," Biotechnol Prog, vol. 25, no. 5, pp. 1468-1475, Sep. 2009, doi: 10.1002/btpr.241.

[152] L. Egerer et al., "Secreted Antiviral Entry Inhibitory (SAVE) Peptides for Gene Therapy of HIV Infection," Molecular Therapy, vol. 19, no. 7, pp. 1236-1244, Jul. 2011, doi: 10.1038/mt.2011.30.

[153] E. Matabaro, Z. He, Y.-S. Liu, H.-J. Zhang, X.-D. Gao, and M. Fujita, "Molecular switching system using glycosylphosphatidylinositol to select cells highly expressing recombinant proteins," Sci Rep, vol. 7, no. 1, p. 4033, Dec. 2017, doi: 10.1038/s41598-017-04330-3.

[154] O. Chertov et al., "Novel Peptides Based on HIV-1 gp120 Sequence with Homology to Chemokines Inhibit HIV Infection in Cell Culture," PLoS One, vol. 6, no. 1, p. e14474, Jan. 2011, doi: 10.1371/journal.pone.0014474.

[155] Y. Zhou et al., "Simultaneous Expression of Displayed and Secreted Antibodies for Antibody Screen," PLoS One, vol. 8, no. 11, p. e80005, Nov. 2013, doi: 10.1371/journal.pone.0080005.

[156] K. Jacobson and C. Dietrich, "Looking at lipid rafts?," Trends Cell Biol, vol. 9, no. 3, pp. 87-91, Mar. 1999, doi: 10.1016/S0962-8924(98)01495-0.

[157] Y. He et al., "Identification of a Critical Motif for the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) gp41 Core Structure: Implications for Designing Novel Anti-HIV Fusion Inhibitors," J Virol, vol. 82, no. 13, pp. 6349-6358, Jul. 2008, doi: 10.1128/JVI.00319-08.

[158] Y. Su, H. Chong, S. Xiong, Y. Qiao, Z. Qiu, and Y. He, "Genetic Pathway of HIV-1 Resistance to Novel Fusion Inhibitors Targeting the Gp41 Pocket," J Virol, vol. 89, no. 24, pp. 12467-12479, Dec. 2015, doi: 10.1128/JVI.01741-15.

[159] D. Yu et al., "Molecular mechanism of HIV-1 resistance to sifuvirtide, a clinical trial-approved membrane fusion inhibitor," Journal of Biological Chemistry, vol. 293, no. 33, pp. 12703-12718, Aug. 2018, doi: 10.1074/jbc.RA118.003538.

[160] N. T. Sullivan et al., "Designing Safer CRISPR/Cas9 Therapeutics for HIV: Defining Factors That Regulate and Technologies Used to Detect Off-Target Editing," Front Microbiol, vol. 11, p. 1872, Aug. 2020, doi: 10.3389/fmicb.2020.01872.

[161] T. Kurihara et al., "DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons," Biochem Biophys Res Commun, vol. 524, no. 3, pp. 621-628, 2020, doi: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.01.132.

[162] A. P. Lam and D. A. Dean, "Progress and prospects: nuclear import of nonviral vectors," Gene Ther, vol. 17, no. 4, pp. 439-447, Apr. 2010, doi: 10.1038/gt.2010.31.

[163] J.-P. Zhang et al., "Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage," Genome Biol, vol. 18, no. 1, p. 35, Dec. 2017, doi: 10.1186/s13059-017-1164-8.

[164] D. N. Nguyen et al., "Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency," Nat Biotechnol, vol. 38, no. 1, pp. 44-49, Jan. 2020, doi: 10.1038/s41587-019-0325-6.

[165] D. A. Dean, B. S. Dean, S. Muller, and L. C. Smith, "Sequence Requirements for Plasmid Nuclear Import," Exp Cell Res, vol. 253, no. 2, pp. 713-722, Dec. 1999, doi: 10.1006/excr.1999.4716.

[166] P. E. Mangeot et al., "Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins," Nat Commun, vol. 10, no. 1, p. 45, Dec. 2019, doi: 10.1038/s41467-018-07845-z.

[167] A. Gutierrez-Guerrero et al., "Baboon Envelope Pseudotyped 'Nanoblades' Carrying Cas9/gRNA Complexes Allow Efficient Genome Editing in Human T, B, and CD34+ Cells and Knock-in of AAV6-Encoded Donor DNA in CD34+ Cells," Front Genome Ed, vol. 3, Feb. 2021, doi: 10.3389/fgeed.2021.604371.

[168] P. Gee et al., "Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping," Nat Commun, vol. 11, no. 1, p. 1334, Dec. 2020, doi:

10.1038/s41467-020-14957-y.

[169] J. R. Hamilton et al., "Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering," Cell Rep, vol. 35, no. 9, p. 109207, Jun. 2021, doi: 10.1016/j.celrep.2021.109207.

[170] I. Indikova and S. Indik, "Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts," Nucleic Acids Res, vol. 48, no. 14, pp. 8178-8187, Aug. 2020, doi: 10.1093/nar/gkaa561.