Подходы к повышению эффективности гомологичной репарации при геномном редактировании тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Анучина Арина Артуровна

• Анучина Арина Артуровна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Анучина Арина Артуровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Методы редактирования генома

1.1.1 Первые программируемые искусственные нуклеазы

1.1.1.1 Мегануклеазы

1.1.1.2 Нуклеазы с доменом «цинковые пальцы»

1.1.1.3 Нуклеазы TALEN

1.1.2 Технология CRISPR-Cas

1.1.2.1 История открытия Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

1.1.2.2 Классификация систем CRISPR-Cas

1.2 Геномное редактирование с помощью системы CRISPR-Cas

в клетках человека

1.2.1 Способы интеграции системы в клетки человека

1.2.2 Перспективы использования системы CRISPR-Cas для лечения наследственных заболеваний

1.2.3 Ограничения и недостатки системы CRISPR-Cas

1.3 Пути повышения эффективности редактирования генома

1.3.1 Воздействие на пути репарации

1.3.1.1 Типы репарации двунитевых разрывов ДНК

1.3.1.2 Способы повышения эффективности НГР путем влияния на факторы репарации

1.3.1.3 Новые участники механизмов репарации как потенциальные мишени для модификации

1.3.2 Матрицы для репарации

1.3.3 Синхронизация работы Cas с клеточным циклом

1.4 Заключение по данным литературы

ГЛАВА2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Работа с эукариотическими клетками

2.1.1 Разморозка и рассадка клеток

2.1.2 Рассадка клеток в планшет

2.1.3 Трансфекция и снятие клеток

2.1.4 Окраска антителами

2.1.5 Проточная цитометрия и микроскопия

2.2 Выделение нуклеиновых кислот

2.3 Обратная транскрипция

2.4 Статистический анализ

2.5 Детекция уровня ГР

2.6 Дизайн миРНК

2.7 Полимеразная цепная реакция

2.8 Электрофорез

2.9 Рестрикция

2.10 Лигирование

2.11 Приготовление химически компетентных клеток

2.12 Химическая трансформация

2.13 Плазмиды, sgRNA и ssODN

2.13.1 Создание клеточной культуры с геном EGFPmut

2.13.2 Создание плазмидной конструкции для экспрессии кодирующей последовательности гена NUDT16L1

2.13.3Создание плазмидной конструкции для экспрессии кодирующей последовательности генов spCas9(1.1)-SCAI

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Дизайн исследования по редактированию

3.2 Редактирование с применением нокдауна генов

3.2.1. Проведение нокдауна гена MAD2L2/REV7

3.2.2. Редактирование локуса EGFPmut при нокдауне гена MAD2L2

3.2.3. Проведение нокдауна гена NUDT16L1

3.2.4. Редактирование EGFPmut при нокдауне гена NUDT16L1

3.3.Гиперэкспрессия NUDT16L1 в культуре клеток HEK-293T

3.3.1 Проверка работоспособности вектора pcDNA3.1+NUDT16L1

3.3.2 Редактирование EGFPmut при гиперэкспрессии гена NUDT16L1

3.4 Редактирование с применением белка Cas9-SCAI

3.4.1 Проверка работоспособности вектора со слитым

геном Cas9-SCAI

3.4.2 Редактирование EGFPmut с использованием слитого гена Cas9-SCAI

3.5 Изменение уровней спонтанной рекомбинации при применении методов повышении НГР

3.6.Редактирование плазмидного и геномного локусов

3.7.Изменение экспрессии NUDT16L1 в ответ на воздействие неспецифических миРНК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

3'-UTR - 3'-untranslated region 3'-UTR - 3'-untranslated region 53BP1 - p53-binding protein

5-FAM - карбоксифлуорофесцеин, 5 изомер - флуоресцентный краситель,

применяемый для проточной цитофлуориметрии

BRCA1 - Breast cancer type

Cas9 - CRISPR associated protein

CBA - chicken B-actin promoter

CMV - cytomegalovirus promoter

CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats dCas9 - dead Cas9

DPBS - Dulbecco's phosphate-buffered saline

dsODN - double-stranded oligodeoxynucleotide

EF1 - elongation factor alpha promoter

EGFP - enhanced green fluorescent protein

FISH - fluorescent in situ hybridization

HEK293 - Human Embryonic Kidney

MAD2L2 - Mitotic Arrest Deficient 2 Like

NUDT16L1 - Nudix Hydrolase 16 Like

OTEs - off-target effects

PDB - Protein Data Bank

RIF1 - Replication Timing Regulatory Factor

RVDs - repeat variable di-residues

SCAI - suppressor of cancer cell invasion

sgRNA - small guide RNA

SpCas9 - S. pyogenes Cas9

ssODN - single-stranded oligodeoxynucleotide

TALEN - Transcription activator-like effector nuclease

TIRR - Tudor-interacting repair regulator

TurboRFP-635 - turbo red fluorescent protein -635 ZFN - Zinc finger nuclease ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДНР - двунитевой разрыв

ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

миРНК - малая интерферирующая РНК

НГР - направленная гомологичная репарация

НГСК - негомологичное соединение концов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Подходы к повышению эффективности гомологичной репарации при геномном редактировании»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Возможности системы CRISPR-Cas9 и её производных вносить изменения в геном эукариот открыли широкие перспективы для терапии наследственных заболеваний. Несмотря на то, что соответствующие молекулярные инструменты часто называют геномными редакторами, по сути речь идёт об использовании нуклеаз, и непосредственно редактирование патогенных вариантов происходит в ходе естественной репарации двунитевых разрывов [Scully R., et al., 2019]. При этом для исправления патогенных изменений в ДНК в большинстве случаев необходима репарация путем направленной гомологичной рекомбинации (НГР). Одним из препятствий для успешного применения технологий геномного редактирования является низкая эффективность НГР на фоне преобладающего в клетке процесса негомологичного соединения концов ДНК (НГСК) [Liu M., et al., 2018, Shibata A., 2017].

Показано, что повысить эффективность точной коррекции мутаций можно с помощью ряда подходов. В их числе синхронизация работы системы с циклами S/G2, в которые активен путь НГР, использование малых молекул, различных типов матриц для репарации и т.д. [Gerlach M., et al., 2018, Lin S., et al., 2014, Shao S.M., et al., 2017, Yang D., et al., 2016, Zhang J.P., et al., 2017]. Среди данных подходов можно выделить воздействие непосредственно на механизмы репарации. Активация факторов НГР или ингибирование факторов НГСК позволяют, наряду с малыми молекулами, прямо воздействовать на пути репарации [Chu V.T., et al., 2015, Pinder J., et al., 2015, Robert F., et al., 2015, Smirnikhina S.A., et al., 2019, Song J., et al., 2016]. На сегодняшний день не существует единого метода для повышения эффективности НГР, а имеющиеся данные весьма разрознены. В среднем, влияние на факторы репарации способно повысить эффективность НГР в 2-6 раз, однако многие подходы демонстрируют противоречивые результаты. В связи с этим, поиск новых ключевых факторов НГР и НГСК, а также последующее воздействие на них, может внести значимый вклад в создание универсального способа

повышения эффективности коррекции генов, и приблизить мировые исследования к использованию CRISPR-Cas9 в терапии заболеваний.

Несмотря на то, что НГСК и НГР изучают давно и отдельные факторы и процессы изучены и описаны довольно подробно, до сих регулярно появляются сведения о новых факторах, играющих большую роль в этих процессах. Сведения о недавно описанных факторах TIRR, MAD2L2 и SCAI носят разрозненный и противоречивый характер, однако указывают на их важную роль в переключении репарации ДНК с BRCA1-опосредованного на 53BP1-опосредованный путь [Drane P., et al., 2017, Ghezraoui H., et al., 2018, Isobe S.Y., et al., 2017, Parnandi N., et al., 2021]. Понимание функционирования TIRR, MAD2L2 и SCAI и их роли в репарации двуцепочечных разрывов ДНК позволит не только расширить знания в области базовых процессов, происходящих в клетке, но и послужит основой для разработки более эффективных подходов к геномному редактированию мутаций для лечения наследственных и онкологических заболеваний.

Степень разработанности темы исследования Несмотря на то, что механизмы репарации ДНК достаточно изучены, общая схема путей репарации в последний годы претерпела ряд изменений. Нынешнее разделение подразумевает разветвление на 53ВР1-зависимый и BRCA1-зависимые пути репарации [Pannunzio N.R., et al., 2018]. Негомологичное соединение концов подразделяется на два типа - классическое (53BP1-зависимый путь) и альтернативное (относится к BRCA1-зависимым путям), что заставило пересмотреть участие комплекса MRN в репарации ДНК и отнести его к BRCA1-опосредованным механизмам репарации [Jachimowicz R.D., et al., 2019, Verma P. and Greenberg R.A., 2016]. Кроме того, несколько важных открытий совершено в области выбора путей репарации.

Один из важнейших комплексов репарации - Shieldin, в состав которого, помимо трех субъединиц SHLD1, SHLD2 и SHLD3, входит белок MAD2L2, открыли в 2018 году сразу несколько независимых исследовательских групп [Dev H., et al., 2018, Ghezraoui H., et al., 2018, Gupta R., et al., 2018, Mirman Z., et al., 2018, Noordermeer S.M., et al., 2018, Zlotorynski E., 2018]. Комплекс обеспечивает защиту

локуса ДНР от факторов НГР, доказано, что снижение экспрессии MAD2L2 способствует ингибированию НГСК и активации факторов гомологичной репарации, что вызвано, по всей вероятности, диссоциацией Shieldin от точки разрыва [Simonetta M., et а1., 2018]. Еще одним открытием стала роль супрессора инвазии опухолевых клеток ^СА1) в подавлении механизма НГСК. $СА1 способен связываться напрямую с 53ВР1 и ингибировать его взаимодействие с партнером МП и с комплексом Shieldin, способствуя, таким образом, запуску НГР [ЬоЬе S.Y., et а!., 2017]. Кроме того, открыли новый партнер 53ВР1 по связыванию - белок ТГО^ (кодируется геном ЫиОТ16Ь1). Установлено, что как его гиперэкспрессия, так и нокдаун, негативно влияют на прохождения НГСК и способствуют НГР [ВоШуап М.У., et а!., 2018, Бгапе Р., et а!., 2017].

Тем не менее, на сегодняшний день в мире не проводилось исследований, использующих воздействие на ЫЛ02Ь2, ЫиОТ16Ь1 или 8СЛ1 для оценки эффективности геномного редактирования.

Цель исследования: увеличить эффективность гомологичной рекомбинации при геномном редактировании с помощью CRISPR/Cas9 путем воздействия на факторы репарации MAD2L2, ТЖЯ и SCAI.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние нокдауна ЫЛ02Ь2 на эффективность направленной гомологичной репарации

2. Изучить влияние нокдауна и гиперэкспрессии ЫиОТ16Ь1 на эффективность направленной гомологичной репарации

3. Установить влияние SCAI в составе химерного белка с Cas9 на эффективность направленной гомологичной репарации

4. Изучить возможность комбинированного воздействия на эффективность направленной гомологичной репарации.

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертации являются исследования, посвященные подходам к повышению эффективности гомологичной репарации с

помощью различных методов, а также исследования, направленные на нокдаун генов с помощью малых интерферирующих РНК.

В работе использовались следующие методы: работа с бактериальными культурами, клонирование, культивирование и трансфекция клеточных линий, окраска клеток антителами, флуоресцентная микроскопия, проточная цитометрия, выделение нуклеиновых кислот, спектрофотометрия, полимеразная цепная реакция, гель-электрофорез нуклеиновых кислот, анализ экспрессии генов, секвенирование и анализ секвенограмм с помощью инструмента ТГОБЯ.

Положения, выносимые на защиту 1. Нокдаун гена ЫЛ02Ь2 повышает уровень направленной гомологичной репарации и при редактировании геномного локуса увеличивает долю GFP+ клеток в 10,2 раза, а доли исправленных аллелей в 3,7 раза; а при редактировании плазмидного локуса увеличивает долю GFP+ клеток в 2,6 раза.

2. Нокдаун гена ЫиОТ1бЬ1 повышает уровень направленной гомологичной репарации и при редактировании геномного локуса увеличивает долю GFP+ клеток в 2 раза, а долю исправленных аллелей в 3,6 раза; а при редактировании плазмидного локуса увеличивает долю GFP+ клеток в 6 раз, а долю исправленных аллелей в 1,8 раза.

3. Гиперэкспрессия ЫиОТ1бЬ1 уменьшает эффективность направленной гомологичной репарации и снижает долю GFP+ клеток в 2,53 раза в геномном локусе.

4. Химерный белок Cas9-SCAI уменьшает эффективность направленной гомологичной репарации и снижает долю GFP+ клеток в геномном локусе в 2,8 раз.

5. миРНК независимо от её специфичности вызывает увеличение экспрессии ЫиОТ1бЬ1 от 1,23 до 1,78 раз.

Научная новизна исследования

Впервые показано, что нокдаун ЫЛ02Ь2 приводит к повышению эффективности точной коррекции мутации с помощью системы СМ8РК-Сав9.

Впервые показано, что нокдаун ЫиОТ1бЬ1 приводит к повышению эффективности точной коррекции мутации с помощью системы СМ8РК-Сав9.

Проведен анализ способности SCAI в составе химерного белка с Cas9 влиять на эффективность направленной гомологичной репарации.

Показано, что воздействие неспецифических миРНК приводит к повышению уровня экспрессии ЫиБТ16Ь1.

Создана новая клеточная культура НЕК293Т-ЕОЕРтЫ, содержащая мутантный ген ЕОЕР в геноме, для тестирования методик геномного редактирования.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Получены новые данные о роли и MAD2L2 в контроле репарации

двуцепочечных разрывов ДНК. Это фундаментальные знания, которые позволяют глубже вникнуть в механизмы репарации в клетке и определить функциональную роль исследуемых белков.

Полученные данные также могут быть использованы для повышения эффективности гомологичной репарации в научно-практических целях.

Наконец, полученные результаты являются очень важными с точки зрения клинического аспекта применения системы СККРК-Сав9. Помимо разработки нового эффективного способа повышения НГР, который может быть использован исследователями наряду с уже имеющимися, данный способ направлен, прежде всего, на возможность использования в клетках человека при редактировании патогенных мутаций, что приближает систему к использованию в клинической практике.

Степень достоверности результатов

Высокая степень достоверности результатов достигнута благодаря использованию большого количества биологических и технических повторов в экспериментах. В работе использовались современные молекулярно-генетические и статистические методы. Непараметрический критерий и Манна-Уитни использовали для определения различий между двумя группами образцов. Метод ddCt использовался для подсчета нормализованных значений экспрессии генов. Для теоретического обоснования проанализировали многочисленные источники литературы. Полученные результаты подкреплены экспериментальными данными

и проиллюстрированы диаграммами, достоверность результатов оценена международным сообществом при публикации в научных журналах. Выводы полностью соответствуют поставленным задачам.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Диссертация соответствует формуле специальности 1.5.7. (03.02.07) -«Генетика (биологические науки)», разбирая процессы реализации генетической информации, процессы репарации ДНК (пункт 3 паспорта научной специальности), механизмы регуляции экспрессии генов (пункт 7 паспорта научной специальности), генетику человека и медицинскую генетику (пункт 17 паспорта научной специальности).

Апробация результатов исследования Материалы диссертации доложены на Международном конгрессе «CRISPR-2018», 2018 год; VII съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 100-летию кафедры генетики СПбГУ, 2019 год; XIV Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых и ассоциированных симпозиумах; 2019 год; Международной конференции «ESHG-2020.2-LIVE IN YOUR LIVING ROOM», 2020 год, XV Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, 2020 год; Международной научно-практической конференции «Геномное редактирование» в рамках IX Съезда Российского общества медицинских генетиков, 2021 год; Международной конференции «ESHG-2021», 2021 год.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета ФБГНУ «МГНЦ».

Личное участие автора в выполнении исследования Автор участвовал в составлении плана исследования, формулировании целей и задач, дизайне экспериментов. Автором проведен исчерпывающий анализ литературы по теме использования системы CRISPR/Cas9 для редактирования патогенных мутаций, а также о путях репарации двунитевых разрывов ДНК и участвующих в них факторов, составлено несколько схем взаимодействия факторов репарации в точке двунитевого разрыва. С учетом этого подобраны

теоретические модели конструкций, обеспечивающих воздействие на необходимые факторы репарации. Автор участвовал в проведении молекулярно-биологической части работы (выделение нуклеиновых кислот, обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция, анализ экспрессии генов с использованием ПЦР в реальном времени, очистка ДНК, рестрикционный анализ, гель-электрофорез, работа с про- и эукариотами и т.д.). Кроме того, автор принимал участие в работе с клеточными культурами, их трансфекции, окраске антителами, анализе с помощью микроскопии и проточной цитометрии.

Публикации

Результаты диссертационной работы представлены в 24 печатных работах, в том числе в 6 статьях в журналах (4 в SCOPUS и WoS), рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата биологических наук.

Объем и структура работы Структура диссертации включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, применение результатов и научных выводов, список цитируемой литературы. Работа представлена на 154 страницах, содержит 35 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает в себя 233 наименований, 232 из которых являются зарубежными источниками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ l.l. Методы редактирования генома l.l.l. Первые программируемые искусственные нуклеазы

История современного подхода к редактированию генома берет свое начало в 80-90х годах прошлого века. Первым шагом к разработке методики стало использование направленного разрыва двух цепей ДНК, что позволяло запустить механизм последующей гомологичной рекомбинации [Capecchi M.R., 19S9]. Именно этот подход «разрыв-рекомбинация» лег в основу дальнейших экспериментальных разработок. Существует четыре системы редактирования, в основе которых лежит использование эндонуклеаз разного типа: мегануклеаз, нуклеаз с доменом «цинковые пальцы», нуклеаз TALEN и CRISPR-ассоциированных нуклеаз.

l.l.l.l. Мегануклеазы

В 2003 году Epinat с соавторами предложили метод редактирования, основанный на использовании мегануклеаз [Epinat J.C., et al., 2003]. Мегануклеазами или «хоуминг»-нуклеазами называют высокоспецифичные эндонуклеазы, распознающие длинные последовательности ДНК: от 12 до 40 п.н [Silva G., et al., 2011]. Именно длинные сайты узнавания, а также низкая цитотоксичность в клетках млекопитающих сделали их привлекательным инструментом для геномного редактирования [Paques F. and Duchateau P., 2007]. Самыми распространенными в исследованиях являются мегануклеазы семейства LAGLIDADG, названных так из-за наличия в их аминокислотном составе соответствующего декапептидного мотива [Belfort M. and Roberts R. J., 1997].

Представители данного семейства являются первыми описанными интрон-кодируемыми белками. В состав LAGLIDADG входят самые распространенные сейчас мегануклеазы I-CreI (рис.1) и I-SceI [Chevalier B., et al., 2005] .

Несмотря на высокую специфичность, мегануклеазная система характеризуется ограниченным набором мишеней, а дизайн белков с новыми сайтами узнавания является трудоемкой процедурой вследствие сложности

разделения ДНК-связывающего и разрезающего доменов белка [Gao H.R., et al., 2010, Redondo P., et al., 2008].

Рисунок 1. Мегануклеаза I-CreI в комплексе с нитью ДНК (from Protein Data Bank).

Мегануклеаза имеет структуру гомодимера из двух частей, разделенных осью симметрии. Оранжевым и бирюзовым цветом изображены a-спирали каждого из двух мономеров. Черным цветом изображены ß-тяжи, образующие ДНК-связывающие участки.

1.1.1.2. Нуклеазы с доменом «цинковые пальцы» Проблема сепарации доменов решилась с развитием редактирования на основе нуклеаз с доменом «цинковые пальцы» (Cys2-His2 zing finger nucleases, ZFN)[Kim Y.G., et al., 1996]. Данный фермент является химерной нуклеазой, состоящей из ДНК-распознающей части, представленной непосредственно ZF-мотивом, и ДНК-разрезающей части, представленной доменом рестриктазы FokI [Li L., et al., 1992, Miller J, et al., 1985]. Следует отметить, что для правильного функционирования FokI требует димеризации, поэтому система представляет собой два набора цинковых пальцев, каждый из которых соединен с мономером FokI (рис.2) [Bitinaite J., et al., 1998]. Дизайн конструкции соответствует разделению двух сайтов узнавания для ZF-доменов участком в 5-7 пар нуклеотидов, в который и вносится двунитевой разрыв [Bibikova M., et al., 2001, Handel E.M., et al., 2009].

«Цинковый палец» имеет в своем составе примерно 30 аминокислот и связывает один атом цинка [Beerli R.R. and Barbas C.F., 2002]. Структура имеет ßßa-конфигурацию, причем за связывание с нуклеотидами цепи ДНК отвечает a-спиральный участок [Chandrasegaran S. and Carroll D., 2016, Pavletich N.P. and Pabo

С.О., 1991]. Установили, что основную роль в специфичности конструкции играют аминокислоты на позициях -1, +1, +2, +3, +5, +6; изменение этих аминокислот при сохранении остальных позволяет получать варианты с измененной специфичностью.

Рисунок 2. Схема взаимодействия ZF-нуклеазы с участком ДНК [Закиян С.М., Медведев С.П., Дементьева Е.В. et al, 2018].

В большинстве случаев один «цинковый палец» связывает 3 нуклеотида [Pavletich N.P. and Pabo C.O., 1991]. Однако присутствие аспарагиновой аминокислоты в позиции +2 альфа-спирали способствует образованию дополнительной связи с аденином или цитозином вне 3-нуклеотидного сайта узнавания, таким образом, изменяя его на 4-нуклеотидный. Как правило, в конструкции нуклеазы включают 3-6 цинковых пальцем, обеспечивая распознавание 9-18 нуклеотидов [Chandrasegaran S. and Carroll D., 2016].

1.1.1.3. Нуклеазы TALEN Несмотря на преимущества нуклеаз с цинковыми пальцами по сравнению с мегануклеазами, возможности дизайна нуклеаз такого типа ограничены вследствие нечеткого соответствия количества нуклеотидов и связующего домена [Liu Q., et al., 1997, Maeder M.L., et al., 2008]. Справиться с этой проблемой смогла еще одна платформа для редактирования, появившаяся в 2010 году и получившая название TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)[Christian M., et al., 2010].

Архитектура химерной нуклеазы TALEN во многом схожа с таковой у ZFN (рис.3). Разрезание ДНК также осуществляется двумя каталитическими доменами FokI. Однако структура ДНК-распознающего участка химерной нуклеазы здесь

представлена повторяющимся доменом TALE, впервые обнаруженным в составе растительных факторов вирулентности у бактерий рода Xanthomonas [Moscou M.J. and Bogdanove A.J., 2009]. Каждый повтор содержит 33-35 аминокислот и состоит из двух a-спиралей и петлевого участка, отвечающего за распознавание нуклеотидов. В этом районе располагаются высоко вариабельные аминокислоты позиций 12 и 13, которые получили название RVDs (repeat variable di-residues)[Deng D., et al., 2012].

внесение двуцепочечного разрыва

Рисунок 3. Схема взаимодействия нуклеазы TALEN с участком ДНК [NE, Sanjana, et al., 2012].

Каждый участок RVD обладает способностью связывать только один нуклеотид, а специфичность связывания определяется аминокислотными остатками. К примеру, аминокислотные остатки гистидин-аспартат распознают цитозин, аспарагин-аспарагин - гуанин или аденин, аспарагин-глицин или гистидин-глицин - тимин, а аспарагин-серин может связывать любой из четырех нуклеотидов [Boch J., et al., 2009]. В отличие от ZFN, в данной системе нет влияния на взаимную специфичность связывания соседних RVD [Christian M., et al., 2010].

Недостатками платформы TALEN являются, в первую очередь, крупный размер конструкции, который приблизительно в три раза больше ZFN, трудности вирусной доставки таких конструкций в клетки млекопитающих, а также высокая цена по сравнению с цинковыми пальцами [Nemudryi A.A., et al., 2014, Holkers M., et al., 2013]. Однако, учитывая вышеописанные преимущества, данная платформа могла бы составить полноценную конкуренцию системе ZFN, если бы не появление через два года четвертой платформы для редактирования генома - CRISPR-Cas9.

1.1.2. Технология CRISPR-Cas

1.1.2.1. История открытия Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats

Короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) или CRISPR - это система, называемая бактериальным аналогом иммунитета и предохраняющая клетки прокариот от проникновения чужеродной ДНК. Работа системы основана на способности бактериальной клетки «запоминать» инфицирующую ее вирусную частицу и оперативно реагировать при повторной попытке проникновения.

Впервые подобные повторяющиеся последовательности обнаружены Ishino с соавторами в 1987 году в геноме бактерии Escherichia coli [Ishino Y., et al., 1987]. Позднее наличие системы подтверждено у большого количества бактерий и архей [Mojica F.J., et al., 1995, Nelson K.E., et al., 1999, Hermans P.W., et al., 1991]. Принцип работы заключается, во-первых, в наличие в клеточном геноме специального участка, называемого CRISPR-локусом. Данный участок состоит из двух типов последовательностей: прямых повторов длиной 21-48 п.н. (являются видоспецифичными), разделенных неповторяющимися участками длиной 21 -72 п.н., называемыми спейсерами [Szczepankowska A., 2012]. Кроме того, в геноме имеются участки, кодирующие гены CRISPR-ассоциированных нуклеаз Cas (CRISPR-associated), которые могут располагаться слева или справа от CRISPR-локуса [Haft D.H., et al., 2005].

Различают три типа CRISPR-регионов, которые, несмотря на наличие сходных коровых генов Casl и Cas2, имеют специфические ключевые нуклеазы: Cas3 для типа I, Cas9 для типа II и Cas10 для типа III (встречается преимущественно у архей) [Makarova K.S., et al., 2011]. Механизм действия системы включает три фазы: иммунизацию, экспрессию и интерференцию.

В фазе иммунизации (или адаптации) происходит первичный контакт бактериофага с клеткой, в результате которого вирусная ДНК проникает через мембрану (рис.4). Группа Cas-белков осуществляет разрезание последовательности, при этом часть вирусного генома интегрируется в CRISPR-

локус в качестве нового спейсера [Deveau H., et al., 2010, Barrangou R., et al., 2007]. Следует отметить, что вырезание фрагмента интеграции из вирусной ДНК для систем типа I и II происходит только при условии наличия перед фрагментом специального мотива, смежного с протоспейсером. Этот участок получил название PAM (proto-spacer adjacent motif) и представляет собой последовательность длиной 2-6 нуклеотидов в зависимости от типа нуклеазы (NGG для нуклеазы Cas9) [Szczepankowska A., 2012].

Рисунок 4. Фаза иммунизации [Mali P., et al., 2013].

Следующей стадией является фаза экспрессии или транскрипции CRISPR-Cas9 локуса. Первоначально, все находящиеся в нем спейсеры и повторы транскрибируются в виде одной длинной мРНК (pre-crRNA)[Lillest0l R.K., et al., 2006]. Затем группа Cas-нуклеаз (вместе с РНКазой III - у систем II типа ) вносит разрезы в мРНК, и в дальнейшем образуются короткие РНК-фрагменты (cr-RNA)[Deveau H., et al., 2010]. Зрелая cr-RNA представляет собой спейсер, фланкированный с 5'-конца неполным прямым повтором - этот участок требуется для привлечения к РНК Cas-белков (в т.ч нуклеазы Cas9) и правильного его связывания с будущей мишенью [Kunin V., et al., 2007]. Кроме того, у систем II типа РНК-молекула является двуцепочечной за счет комплементарного присоединения к участку прямого повтора шпилечной РНК tracrRNA, которая находится за

пределами локуса спейсеров и служит для правильного связывания с молекулами Cas9 и РНКазы III.

Заключительный этап - фаза интерференции или устойчивости - отводит главную роль частицам Cas-crRNA, которые связываются с вирусной ДНК, участок которой совпадает со спейсером, и осуществляют ее деградацию [Най Б.Н., е1 а1., 2005](рис.5). Следует отметить, что для систем I и II типов узнавание на стадии интерференции также требует наличия РАМ-последовательности в геноме вируса [Наш^з Я.Б., е1 а1., 2010]. Во многом механизм действия CRISPR-Cas9 напоминает процесс РНК-интерференции у эукариот, при котором образуются схожие комплексы из коротких молекул РНК и белков-нуклеаз [Szczepankowska А., 2012].

Рисунок 5. Фаза экспрессии и интерференции [Mali P., et al., 2013].

В 2012 году статья под авторством Мартина Джинека (в соавт. С Дженнифер Дудной и Эммануэль Шарпентье) произвела революцию в методах редактирования человеческого генома. Статья описывает исследование системы CRISPR/Cas II типа и демонстрацию ее эффективности как программируемой против желаемой последовательности ДНК. В данной работе авторы объединили последовательность прямого повтора из локуса CRISPR и tracrRNA, создав вместо двух транскриптов единую химерную молекулу РНК (single guide RNA, sgRNA).

Установлено, что последовательность направляющей молекулы РНК может быть запрограммирована в зависимости от интересующего участка ДНК и наличия в нем PAM-последовательности [Jinek M., et al., 2012]. Таким образом, начиная с 2012 года инструмент CRISPR-Cas9 стал широко применяться в редактировании эукариотического (в т.ч. человеческого) генома.

1.1.2.2. Классификация систем CRISPR-Cas

Две главные составляющие системы CRISPR-Cas - это адаптивный модуль, который унифицирован у большинства видов и состоит из эндонуклеаз и структурных субъединиц Casi and Cas2 [Amitai G. and Sorek R., 2016]; а также эффекторный модуль, который отвечает за процессинг пре-crRNA, распознавание целевой последовательности и ее разрезание. Адаптивный модуль, в свою очередь, отвечает за приобретение спейсеров [Ahmad A., Khan S.H., Khan Z., 2021].

В настоящее время системы CRISPR-Cas подразделяются на два больших класса в зависимости от строения эффекторного модуля ^^^^Koonin E.V., et al., 2017].

Класс 1 включает типы I, III и IV и эффекторный комплекс состоит здесь из нескольких молекул. Представители класса 2 содержат в качестве эффектора единичную молекулу (например, Cas9); к этому классу относятся типы II, V, и VI [Koonin E.V., et al., 2017].

Основу эффекторного модуля у типов I и III представляют белки RAMPs (Repeat-Associated Mysterious Proteins), в числе которых находятся Cas7 и Cas5. Эти белки содержат РНК-распознающий мотив RRM, а также дополнительные большие и малые субъединицы [Hale C.R., et al., 2009, van der Oost J., et al., 2014, Jackson R.N., et al., 2014]. Cas5 взаимодействует с большими субъединицами, а также с 5'-концом crRNA, малые субъединицы, представленные в нескольких копиях, связываются с участком crRNA, взаимодействующим с Cas7. Для процессинга пре-crRNA система I типа использует Cas5 или Cas6, система III - только белок Cas6 [Charpentier E., et al., 2015, Khan S.H., 2019, Niewoehner O. and Jinek M., 2016].

Рисунок 6. Классификация систем CRISPR-Cas [Ahmad, Aftab, Khan, Sultan Habibullah, Khan, Zulqurnain, 2021].

Тип IV, встречающийся очень редко, включает упрощенный CRISPR-Cas локус без адаптивного модуля [EV, Koonin, et al., 2017].

Наиболее изученными среди различных типов класса 2 являются системы II типа, содержащие эффекторную молекулу Cas9 и широко используемые в редактировании генома. Именно система такого типа описана в п.1.1.2.1. В данном случае привлечение молекулы Cas к геномной ДНК регулируется crRNA, однако механизм процессинга ее 5'-конца остается не до конца изученным [ Ahmad A., Khan S.H., Khan Z., 2021]. В системах V типа эффекторной молекулой является Cas12 [Dong D., et al., 2016, Yang H., et al., 2016]. В последнее время этот тип тоже стали использовать для редактирования из-за малого размера Cas12, отсутствия жестких требований к tracrRNA и ассиметричных сайтов разрезания. Все белки типа VI содержат в своем составе домены HEPN (higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding) и предположительно, проявляют РНК-, а не ДНК-нуклеазную активность. В пользу этого говорит и тот факт, что активность белков системы

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Анучина Арина Артуровна, 2021 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bhat A., Wu Z., Maher VM., McCormick J.J. and Xiao W. Rev7/Mad2B plays a critical role in the assembly of a functional mitotic spindle. Cell cycle. — 2015. — Т. 14. — № 24. — C. 3929-3938.

2. Gasparics A., Kokeny G., Fintha A., Bencs R., Mozes M.M., Agoston E.I., Buday A., Ivics Z., Hamar P., Gyorffy B., Rosivall L. and Sebe A. Alterations in SCAI Expression during Cell Plasticity, Fibrosis and Cancer. Pathology oncology research : POR. — 2018. — Т. 24. — № 3. — C.641-651.

3. Hendel A., Bak R.O., Clark J.T., Kennedy A.B., Ryan D.E., Roy S., Steinfeld I., Lunstad B.D., Kaiser R.J., Wilkens A.B., Bacchetta R., Tsalenko A., Dellinger D., Bruhn L. and Porteus M.H. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. — 2015. — Т. 33. — № 9. — C. 985989.

4. Ikeda A., Fujii W., Sugiura K. and Naito K. High-fidelity endonuclease variant HypaCas9 facilitates accurate allele-specific gene modification in mouse zygotes. Communications biology. — 2019. — Т. 2. https://doi.org/10.1038/s42003-019-0627-8

5. Mehta A. and Haber J.E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor perspectives in biology. — 2014. — Т. 6. — № 9. — C. a016428.

6. Paix A., Folkmann A., Rasoloson D. and Seydoux G. High Efficiency, Homology-Directed Genome Editing in Caenorhabditis elegans Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoprotein Complexes. Genetics. — 2015. — Т. 201. — № 1. — C. 47-54.

7. Shibata A. Regulation of repair pathway choice at two-ended DNA double-strand breaks. Mutation research. — 2017. — Т. 803-805. — C. 51-55.

8. Szczepankowska A. Role of CRISPR/cas system in the development of bacteriophage resistance. Advances in virus research. — 2012. — Т. 82. — C. 289-338.

9. Zhang A., Peng B., Huang P., Chen J. and Gong Z. The p53-binding protein 1-Tudor-interacting repair regulator complex participates in the DNA damage response. The Journal of biological chemistry. — 2017. — Т. 292. — № 16. — C. 6461-6467.

10. Anuchina A.A., Lavrov A.V. and Smirnikhina S.A. TIRR: a potential front runner in HDR race-hypotheses and perspectives. Molecular biology reports. — 2020. — T. 47. — № 3. — C. 2371-2379.

11. Nemudryi A.A., Valetdinova K.R., Medvedev S.P. and Zakian S.M. TALEN and CRISPR/Cas Genome Editing Systems: Tools of Discovery. Acta naturae. — 2014.

— T. 6. — № 3. — C. 19-40.

12. Chadwick A.C., Evitt N.H., Lv W. and Musunuru K. Reduced Blood Lipid Levels With In Vivo CRISPR-Cas9 Base Editing of ANGPTL3. Circulation. — 2018. — T. 137. — № 9. — C. 975-977.

13. Komor A.C., Kim Y.B., Packer M.S., Zuris J.A. and Liu D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature.

— 2016. — T. 533. — № 7603. — C. 420-424.

14. Monteys A.M., Ebanks S.A., Keiser M.S. and Davidson B.L. CRISPR/Cas9 Editing of the Mutant Huntingtin Allele In Vitro and In Vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. — 2017. — T. 25. — № 1. — C. 1223.

15. Moreno A.M., Palmer N., Alemán F., Chen G., Pla A., Jiang N., Leong Chew W., Law M. and Mali P. Immune-orthogonal orthologues of AAV capsids and of Cas9 circumvent the immune response to the administration of gene therapy. Nature biomedical engineering. — 2019. — T. 3. — № 10. — C. 806-816.

16. Wadhwani A.R., Affaneh A., Van Gulden S. and Kessler J.A. Neuronal apolipoprotein E4 increases cell death and phosphorylated tau release in alzheimer disease. Annals of neurology. — 2019. — T. 85. — № 5. — C. 726-739.

17. Shen B., Zhang W., Zhang J., Zhou J., Wang J., Chen L., Wang L., Hodgkins A., Iyer V., Huang X. and Skarnes W.C. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature methods. — 2014. — T. 11. — № 4. — C. 399-402.

18. Beerli, R.R. and Barbas, C.F. Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors. Nat Biotechnol. — 2002. — T. 20. — № 2. — C. 135-141.

19. Belfort M. and Roberts R.J. Homing endonucleases: keeping the house in order. Nucleic Acids Res. — 1997. — T. 25. — № 17. — C. 3379-3388.

20. Bibikova M., Carroll D., Segal D.J., Trautman J.K., Smith J., Kim, Y.G. and Chandrasegaran S. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. — 2001. — T. 21. — № 1. — C. 289-297.

21. Bitinaite J., Wah D.A., Aggarwal A.K. and Schildkraut I. Fokl dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. — 1998. — T. 95. — № 18. — C. 10570-10575.

22. Botuyan M.V., Cui G., Drane P., Oliveira C., Detappe A., Brault M.E., Parnandi N., Chaubey S., Thompson J.R., Bragantini B., Zhao D., Chapman J.R., Chowdhury D. and Mer G. Mechanism of 53BP1 activity regulation by RNA-binding TIRR and a designer protein. Nat Struct Mol Biol. — 2018. — T. 25. — № 7. — C. 591600.

23. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q., Nguyen N.T., Topkar V.V., Zheng Z. and Joung J.K. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nat Biotechnol. — 2015. — T. 33. — №2 12. — C. 1293-1298.

24. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q., Topkar V.V., Nguyen N.T., Zheng Z., Gonzales A.P., Li Z., Peterson R.T., Yeh J.R., Aryee M.J. and Joung J.K. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. — 2015. — T. 523. — № 7561. — C. 481-485.

25. Kleinstiver B.P., Pattanayak V., Prew M.S., Tsai S.Q., Nguyen N.T., Zheng Z and Joung J.K. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. — 2016. — T. 529. — № 7587. — C. 490-495.

26. Shy B.R., MacDougall M.S., Clarke R. and Merrill B.J. Co-incident insertion enables high efficiency genome engineering in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. — 2016. — T. 44. — № 16. — C. 7997-8010.

27. Moses C., Nugent F., Waryah C.B., Garcia-Bloj B., Harvey A.R. and Blancafort P. Activating PTEN Tumor Suppressor Expression with the CRISPR/dCas9 System. Molecular therapy. Nucleic acids. — 2019. — T. 14. — C. 287-300.

28. Capecchi, M.R. Altering the genome by homologous recombination. Science. — 1989. — T. 244. — № 4910. — C. 1288-1292.

29. Richardson C.D., Ray G.J., DeWitt M.A., Curie G.L and Corn J.E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. — 2016. — T. 34. — № 3. — C. 339-344.

30. Lai C.F., Chen C.Y. and Au L.C. Comparison between the repression potency of siRNA targeting the coding region and the 3'-untranslated region of mRNA. BioMed research international. — 2013. — T. 2013. doi: 10.1155/2013/637850

31. Chandrasegaran S. and Carroll D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. J Mol Biol. — 2016. — T. 428. — № 5 Pt B. — C. 963-989.

32. Chu V.T., Weber T., Wefers B., Wurst W., Sander S., Rajewsky K. and Kuhn R. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. — 2015. — T. 33. — № 5. — C. 543-548.

33. Hale C.R., Zhao P., Olson S., Duff M.O., Graveley B.R., Wells L., Terns R.M. and Terns M.P. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell. — 2009. — T. 139. — № 5. — C. 945-956.

34. Charlesworth C.T., Deshpande P.S., Dever D.P., Camarena J., Lemgart V.T., Cromer M.K., Vakulskas C.A., Collingwood M.A., Zhang L., Bode N.M., Behlke M.A., Dejene B., Cieniewicz B., Romano R., Lesch B.J., Gomez-Ospina N., Mantri S., Pavel-Dinu M., Weinberg K.I. and Porteus M.H. Identification of preexisting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans. Nature medicine. — 2019. — T. 25. — № 2. — C. 249-254.

35. Deng D., Yan C., Pan X., Mahfouz M., Wang J., Zhu JK., Shi Y. and Yan N. Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors. Science. — 2012. — T. 335. — № 6069. — C. 720-723.

36. Dong D., Ren K., Qiu X., Zheng J., Guo M., Guan X., Liu H., Li N., Zhang B., Yang D., Ma C., Wang S., Wu D., Ma Y., Fan S., Wang J., Gao N. and Huang Z. The

crystal structure of Cpfl in complex with CRISPR RNA. Nature. — 2016. — T. 532. — № 7600. — C. 522-526.

37. Gleditzsch D., Pausch P., Müller-Esparza H., Özcan A., Guo X., Bange G. and Randau L. PAM identification by CRISPR-Cas effector complexes: diversified mechanisms and structures. RNA biology. — 2019. — T. 16. — № 4. — C. 504-517.

38. Paquet D., Kwart D., Chen A., Sproul A., Jacob S., Teo S., Olsen K.M., Gregg A., Noggle S. and Tessier-Lavigne M. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. — 2016. — T. 533. — № 7601. — C. 125-129.

39. Xu D., Gu M. and Liu H.L. MicroRNA-625-3p promotes cell migration of oral squamous cell carcinoma by regulating SCAI expression. European review for medical and pharmacological sciences. — 2019. — T. 23. — № 2. — C. 641-648.

40. Yang D., Scavuzzo M.A., Chmielowiec J., Sharp R., Bajic A. and Borowiak M. Enrichment of G2/M cell cycle phase in human pluripotent stem cells enhances HDR-mediated gene repair with customizable endonucleases. Scientific reports. — 2016. — T. 6. doi: 10.1038/srep21264.

41. Yang D., Sun Y., Chen J., Zhang Y., Fan S., Huang M., Xie X., Cai Y., Shang Y., Gui T., Sun L., Hu J., Dong J., Yeap LS., Wang X., Xiao W. and Meng F.L. REV7 is required for processing AID initiated DNA lesions in activated B cells. Nat Commun. — 2020. — T. 11. — № 1. doi: 10.1038/s41467-020-16632-8.

42. Luther D.C., Lee Y.W., Nagaraj H., Scaletti F. and Rotello V.M. Delivery approaches for CRISPR/Cas9 therapeutics in vivo: advances and challenges. Expert opinion on drug delivery. — 2018. — T. 15. — № 9. — C. 905-913.

43. Dev H., Chiang T.W., Lescale C., de Krijger I., Martin A.G., Pilger D., Coates J., Sczaniecka-Clift M., Wei W., Ostermaier M., Herzog M., Lam J., Shea A., Demir M., Wu Q., Yang F., Fu B., Lai Z., Balmus G., Belotserkovskaya R., Serra V., O'Connor M.J., Bruna A., Beli P., Pellegrini L., Caldas C., Deriano L., Jacobs J.J.L., Galanty Y. and Jackson S.P. Shieldin complex promotes DNA end-joining and counters homologous recombination in BRCA1-null cells. Nat Cell Biol. — 2018. — T. 20. — № 8. — C. 954-965.

44. Haft D.H., Selengut J., Mongodin E.F. and Nelson K.E. A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLoS computational biology. — 2005. — T. 1. — № 6. doi: 10.1371/journal.pcbi.0010060.

45. Drane P., BraultM.E., Cui G., Meghani K., Chaubey S., Detappe A., Parnandi N., He Y., Zheng X.F., Botuyan M.V., Kalousi A., Yewdell W.T., Munch C., Harper J.W., Chaudhuri J., Soutoglou E., Mer G. and Chowdhury D. TIRR regulates 53BP1 by masking its histone methyl-lysine binding function. Nature. — 2017. — T. 543. — № 7644. — C. 211-216.

46. Drane P. and Chowdhury, D. TIRR and 53BP1- partners in arms. Cell Cycle.

— 2017. — T. 16. — № 13. — C. 1235-1236.

47. Brandt D.T., Baarlink C., Kitzing T.M., Kremmer E., Ivaska J., Nollau P. and Grosse R. SCAI acts as a suppressor of cancer cell invasion through the transcriptional control of beta1-integrin. Nature cell biology. — 2009. — T. 11. — № 5.

— C. 557-568.

48. Charpentier E., Richter H., van der Oost J. and White M.F. Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity. FEMS microbiology reviews. — 2015. — T. 39. — № 3. — C. 428-41.

49. Kohne E. and Kleihauer E. Hemoglobinopathies: a longitudinal study over four decades. Deutsches Arzteblatt international. — 2010. — T. 107. — № 5. — C. 6571.

50. Kohne E. Hemoglobinopathies: clinical manifestations, diagnosis, and treatment. Deutsches Arzteblatt international. — 2011. — T. 108. — № 31-32. — C. 532540.

51. Kondrateva E., Demchenko A., Lavrov A. and Smirnikhina S. An overview of currently available molecular Cas-tools for precise genome modification. Gene. — 2021. — T. 769. doi: 10.1016/j.gene.2020.145225.

52. Semenova E., Jore M.M., Datsenko K.A., Semenova A., Westra E.R., Wanner B., van der Oost J., Brouns S.J. and Severinov K. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed

sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2011. — T. 108. — № 25. doi: 10.1073/pnas.1104144108.

53. Brinkman E.K., Kousholt A.N., Harmsen T., Leemans C., Chen T., Jonkers J. and van Steensel B. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. — 2018. — T. 46. — № 10. — C. e58.

54. Epinat J.C., Arnould S., Chames P., Rochaix P., Desfontaines D., Puzin C., Patin A., Zanghellini A., Paques F. and Lacroix E. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res. — 2003. — T. 31. — № 11. — C. 2952-2962.

55. Koonin E.V., Makarova K.S. and Zhang F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Current opinion in microbiology. — 2017. — T. 37.

— C. 67-78.

56. Denhez F., Wilcox-Adelman S.A., Baciu P.C., Saoncella S., Lee S., French

B., Neveu W. and Goetinck P.F. Syndesmos, a syndecan-4 cytoplasmic domain interactor, binds to the focal adhesion adaptor proteins paxillin and Hic-5. The Journal of biological chemistry. — 2002. — T. 277. — № 14. doi: 10.1074/jbc.M110291200

57. Heigwer F., Kerr G. and Boutros M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature methods. — 2014. — T. 11. — № 2. — C. 122-123.

58. Robert F., Barbeau M., Ethier S., Dostie J. and Pelletier J. Pharmacological inhibition of DNA-PK stimulates Cas9-mediated genome editing. Genome Med. — 2015.

— T. 7. — № 1. — C. 93

59. Zhang F., Wen Y, and Guo X. CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges. Human molecular genetics. — 2014. — T. 23. — №2 R1. —

C. 40-46.

60. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A. and Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. — 2013. — T. 8. — № 11. — C. 2281-2308

61. Ran F.A., Cong L., Yan W.X., , Scott D.A., Gootenberg J.S., Kriz A.J., Zetsche B., Shalem O., Wu X., , Makarova K.S., Koonin E.V., Sharp P.A. and Zhang F.

In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. — 2015. — T. 520.

— № 7546. — C. 186-191.

62. Mojica F.J., Ferrer C., Juez G. and Rodriguez-Valera F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning. Molecular microbiology. — 1995. — T. 17. — № 1. — C. 85-93.

63. Amitai G. and Sorek R. CRISPR-Cas adaptation: insights into the mechanism of action. Nature reviews. Microbiology. — 2016. — T. 14. — № 2. — C. 67-76.

64. Li G., Zhang X., Zhong C., Mo J., Quan R., Yang J., Liu D., Li Z., Yang H. and Wu Z. Small molecules enhance CRISPR/Cas9-mediated homology-directed genome editing in primary cells. Scientific reports. — 2017. — T. 7. — № 1. doi: 10.1038/s41598-017-09306-x.

65. Maule G., Casini A., Montagna C., Ramalho A.S., De Boeck K., Debyser Z., Carlon M.S., Petris G, and Cereseto A. Allele specific repair of splicing mutations in cystic fibrosis through AsCas12a genome editing. Nat Commun. — 2019. — T. 10. — № 1. doi: 10.1038/s41467-019-11454-9.

66. Maule G., Arosio D, and Cereseto A. Gene Therapy for Cystic Fibrosis: Progress and Challenges of Genome Editing. International journal of molecular sciences.

— 2020. — T. 21. — № 11. — C. 3903.

67. Xu G., Chapman J.R., Brandsma I., Yuan J., Mistrik M., Bouwman P., Bartkova J., Gogola E., Warmerdam D., Barazas M., Jaspers J.E., Watanabe K., Pieterse M., Kersbergen A., Sol W., Celie P.H.N., Schouten P.C., van den Broek B., Salman A., Nieuwland M., de Rink I., de Ronde J., Jalink K., Boulton SJ., Chen J., van Gent D.C., Bartek J., Jonkers J., Borst P. and Rottenberg S. REV7 counteracts DNA double-strand break resection and affects PARP inhibition. Nature. — 2015. — T. 521. — № 7553. — C. 541-544.

68. Gao, H.R., Smith, J., Yang, M.Z., Jones, S., Djukanovic, V., Nicholson, M. G., West, A., Bidney, D., Falco, S.C., Jantz, D. and Lyznik, L.A. Heritable targeted

mutagenesis in maize using a designed endonuclease. Plant J. — 2010. — T. 61. — № 1. — C. 176-187.

69. Gerlach, M., Kraft, T., Brenner, B., Petersen, B., Niemann, H. and Montag, J. Efficient Knock-in of a Point Mutation in Porcine Fibroblasts Using the CRISPR/Cas9-GMNN Fusion Gene. Genes-Basel. — 2018. — T. 9. — № 6. — C.296.

70. Ghezraoui, H., Oliveira, C., Becker, J.R., Bilham, K., Moralli, D., Anzilotti, C., Fischer, R., Deobagkar-Lele, M., Sanchiz-Calvo, M., Fueyo-Marcos, E., Bonham, S., Kessler, B.M., Rottenberg, S., Cornall, R.J., Green, C. M. and Chapman, J. R. 53BP1 cooperation with the REV7-shieldin complex underpins DNA structure-specific NHEJ. Nature. — 2018. — T. 560. — № 7716. — C. 122-127.

71. Bates G.P., Dorsey R., Gusella J.F., Hayden M.R., Kay C., Leavitt B.R., Nance M., Ross C.A., Scahill R.I., Wetzel R., Wild E.J. and Tabrizi S.J. Huntington disease. Nature reviews. Disease primers. — 2015. — T. 1. doi: 10.1038/nrdp.2015.5.

72. Gupta, R., Somyajit, K., Narita, T., Maskey, E., Stanlie, A., Kremer, M., Typas, D., Lammers, M., Mailand, N., Nussenzweig, A., Lukas, J. and Choudhary, C. DNA Repair Network Analysis Reveals Shieldin as a Key Regulator of NHEJ and PARP Inhibitor Sensitivity. Cell. — 2018. — T. 173. — № 4. — C. 972-988.

73. Deveau H., Garneau J.E. and Moineau S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual review of microbiology. — 2010. — T. 64. — C. 475-493.

74. Ebina H., Misawa N., Kanemura Y. and Koyanagi Y. Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus. Scientific reports. — 2013. — T. 3. doi: 10.1038/srep02510

75. Nishimasu H., Shi X., Ishiguro S., Gao L., Hirano S., Okazaki S., Noda T., Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Mori H., Oura S., Holmes B., Tanaka M., Seki M., Hirano H., Aburatani H., Ishitani R., Ikawa M., Yachie N., Zhang F. and Nureki O. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. — 2018. — T. 361. — № 6408. — C. 1259-1262.

76. Wang H., Yang H., Shivalila C.S., Dawlaty M.M., Cheng A.W., Zhang F. and Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by

CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. — 2013. — T. 153. — № 4. doi: 10.1016/j.cell.2013.04.025

77. Yang H., Gao P., Rajashankar K.R. and Patel D.J. PAM-Dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2c1 CRISPR-Cas Endonuclease. Cell. — 2016. — T. 167. — № 7. — C. 1814-1828.

78. Zhang H., He X., Yu W., Yue B., Yu Z. and Qin Y. Mitotic Arrest-Deficient Protein 2B Overexpressed in Lung Cancer Promotes Proliferation, EMT, and Metastasis. Oncology research. — 2019. — T. 27. — № 8. — C. 859-869.

79. Handel, E.M., Alwin, S. and Cathomen, T. Expanding or restricting the target site repertoire of zinc-finger nucleases: the inter-domain linker as a major determinant of target site selectivity. Mol Ther. — 2009. — T. 17. — № 1. — C. 104111.

80. Klein H.L. The consequences of Rad51 overexpression for normal and tumor cells. DNA repair. — 2008. — T. 7. — № 5. — C. 686-693.

81. Zhang H.S., Gavin M., Dahiya A., Postigo A.A., Ma D., Luo R.X., Harbour J.W. and Dean D.C. Exit from G1 and S phase of the cell cycle is regulated by repressor complexes containing HDAC-Rb-hSWI/SNF and Rb-hSWI/SNF. Cell. — 2000. — T. 101. — № 1. — C. 79-89.

82. Sanoyama I., Sakurai Y., Ichinoe M., Hoshino A., Kesen Y., Kato T., Numata Y., Umezawa A., Jiang S.X. and Murakumo Y. Increased expression of REV7 in small cell lung carcinomas and its association with tumor cell survival and proliferation. Pathology international. — 2021. — T. 71. — № 1. — C. 15-23.

83. Villate-Beitia I., Zarate J., Puras G. and Pedraz J.L. Gene delivery to the lungs: pulmonary gene therapy for cystic fibrosis. Drug development and industrial pharmacy. — 2017. — T. 43. — № 7. — C. 1071-1081.

84. Slaymaker I.M., Gao L., Zetsche B., Scott D.A., Yan W.X. and Zhang F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. — 2016. — T. 351. — № 6268. — C. 84-88.

85. Isobe, S.Y., Nagao, K., Nozaki, N., Kimura, H. and Obuse, C. Inhibition of RIF1 by SCAI Allows BRCA1-Mediated Repair. Cell Rep. — 2017. — T. 20. — № 2.

— C. 297-307.

86. Behmoaras J., Bhangal G., Smith J., McDonald K., Mutch B., Lai P.C., Domin J., Game L., Salama A., Foxwell B.M., Pusey C.D., Cook H.T. and Aitman T.J. Jund is a determinant of macrophage activation and is associated with glomerulonephritis susceptibility. Nature genetics. — 2008. — T. 40. — № 5. — C. 553-559.

87. Boch J., Scholze H., Schornack S., Landgraf A., Hahn S., Kay S., Lahaye T., Nickstadt A. and Bonas U. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. — 2009. — T. 326. — № 5959. — C. 1509-1512.

88. Pinder J., Salsman J and Dellaire G. Nuclear domain 'knock-in' screen for the evaluation and identification of small molecule enhancers of CRISPR-based genome editing. Nucleic Acids Res. — 2015. — T. 43. — № 19. — C. 9379-9392.

89. Song J., Yang D., Xu J., Zhu T., Chen Y.E. and Zhang J. RS-1 enhances CRISPR/Cas9- and TALEN-mediated knock-in efficiency. Nat Commun. — 2016. — T. 7. doi: 10.1038/ncomms10548

90. van der Oost J., Westra E.R., Jackson R.N. and Wiedenheft B. Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology. — 2014. — T. 12. — № 7. — C. 479-492.

91. Wang J., Yuan Z., Cui Y., Xie R., Yang G., Kassab M.A., Wang M., Ma Y., Wu C., Yu X. and Liu X. Molecular basis for the inhibition of the methyl-lysine binding function of 53BP1 by TIRR. Nat Commun. — 2018. — T. 9. — № 1. — C. 2689.

92. Yan J., Chuai G., Zhou C., Zhu C., Yang J., Zhang C., Gu F., Xu H., Wei J, and Liu Q. Benchmarking CRISPR on-target sgRNA design. Briefings in bioinformatics.

— 2018. — T. 19. — № 4. — C. 721-724.

93. Martens J.A. and Winston F. Recent advances in understanding chromatin remodeling by Swi/Snf complexes. Current opinion in genetics & development. — 2003.

— T. 13. — № 2. — C. 136-142.

94. Jachimowicz R.D., Goergens J. and Reinhardt H.C. DNA double-strand break repair pathway choice-from basic biology to clinical exploitation. Cell Cycle. — 2019. — T. 18. — № 13. — C. 1423-1434.

95. Sale J.E. REV7/MAD2L2: the multitasking maestro emerges as a barrier to recombination. The EMBO journal. — 2015. — T. 34. — № 12. — C. 1609-1611.

96. Hu J.H., Miller S.M., Geurts M.H., Tang W., Chen L., Sun N., Zeina C.M., Gao X., Rees H.A., Lin Z, and Liu D.R. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. — 2018. — T. 556. — № 7699. — C. 57-63.

97. Guilinger J.P., Thompson D.B. and Liu D.R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fokl nuclease improves the specificity of genome modification. Nat Biotechnol.

— 2014. — T. 32. — № 6. — C. 57-63.

98. Nelson J.R., Lawrence C.W. and Hinkle D.C. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase zeta. Science. — 1996. — T. 272. — № 5268. — C. 1646-1649.

99. Srouji J.R., Xu A., Park A., Kirsch J.F and Brenner S.E. The evolution of function within the Nudix homology clan. Proteins. — 2017. — T. 85. — № 5. — C. 775-811.

100. Chen J.S., Dagdas Y.S., Kleinstiver B.P., Welch M.M., Sousa A.A., Harrington L.B., Sternberg S.H., Joung J.K., Yildiz A. and Doudna J.A. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature. — 2017. — T. 550. — № 7676. — C. 407-410.

101. Shin J.W., Kim K.H., Chao M.J., Atwal R.S., Gillis T., MacDonald M.E., Gusella JF and Lee JM. Permanent inactivation of Huntington's disease mutation by personalized allele-specific CRISPR/Cas9. Human molecular genetics. — 2016. — T. 25.

— № 20. — C. 4566-4576.

102. Hara K., Hashimoto H., Murakumo Y., Kobayashi S., Kogame T., Unzai S., Akashi S., Takeda S., Shimizu T, and Sato M. Crystal structure of human REV7 in complex with a human REV3 fragment and structural implication of the interaction

between DNA polymerase zeta and REV1. The Journal of biological chemistry. — 2010.

— T. 285. — № 16. doi: 10.1074/jbc.M109.092403

103. Hiranniramol K., Chen Y., Liu W, and Wang X. Generalizable sgRNA design for improved CRISPR/Cas9 editing efficiency. Bioinformatics. — 2020. — T. 36.

— № 9. — C. 2684-2689.

104. Jayathilaka K., Sheridan S.D., Bold T.D., Bochenska K., Logan H.L., Weichselbaum R.R., Bishop D.K. and Connell P.P. A chemical compound that stimulates the human homologous recombination protein RAD51. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2008. — T. 105. — № 41. doi: 10.1073/pnas.0808046105

105. Musunuru K., Pirruccello J.P., Do R., Peloso G.M., Guiducci C., Sougnez C., Garimella K.V., Fisher S., Abreu J., Barry A.J., Fennell T., Banks E., Ambrogio L., Cibulskis K., Kernytsky A., Gonzalez E., Rudzicz N., Engert J.C., DePristo M.A., Daly M.J., Cohen JC., Hobbs H.H., Altshuler D., Schonfeld G., Gabriel S.B., Yue P and Kathiresan S. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia. The New England journal of medicine. — 2010. — T. 363. — № 23. — C. 2220-2227.

106. Musunuru K. and Kathiresan S. Cardiovascular endocrinology: Is ANGPTL3 the next PCSK9? Nature reviews. Endocrinology. — 2017. — T. 13. — № 9.

— C. 503-504.

107. Niimi K., Murakumo Y., Watanabe N., Kato T., Mii S., Enomoto A., Asai M, Asai N., Yamamoto E., Kajiyama H., Shibata K., Kikkawa F. and Takahashi M. Suppression of REV7 enhances cisplatin sensitivity in ovarian clear cell carcinoma cells. Cancer science. — 2014. — T. 105. — № 5. — C. 545-552.

108. Schumann K., Lin S., Boyer E., Simeonov D.R., Subramaniam M., Gate R.E., Haliburton G.E., Ye C.J., Bluestone J.A., Doudna J.A. and Marson A. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2015. — T. 112. — № 33. doi: 10.1073/pnas. 1512503112

109. Suzuki K., Tsunekawa Y., Hernandez-Benitez R., Wu J., Zhu J., Kim E.J., Hatanaka F., Yamamoto M., Araoka T., Li Z., Kurita M., Hishida T., Li M., Aizawa E., Guo S., Chen S., Goebl A., Soligalla R.D., Qu J., Jiang T., Fu X., Jafari M., Esteban CR., Berggren W.T., Lajara J., Nunez-Delicado E., Guillen P., Campistol J.M., Matsuzaki F., Liu G.H., Magistretti P., Zhang K., Callaway E.M., Zhang K. and Belmonte J.C. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. — 2016. — T. 540. — № 7631. — C. 144-149.

110. Nelson K.E., Clayton R.A., Gill S.R., Gwinn M.L., Dodson R.J., Haft D.H., Hickey E.K., Peterson J.D., Nelson W.C., Ketchum K.A., McDonald L., Utterback T.R., Malek J.A., Linher K.D., Garrett M.M., Stewart A.M., Cotton M.D., Pratt M.S., Phillips C.A., Richardson D., Heidelberg J., Sutton G.G., Fleischmann R.D., Eisen J.A., White O., Salzberg S.L., Smith H.O., Venter J.C. and Fraser C.M. Evidence for lateral gene transfer between Archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. Nature. — 1999. — T. 399. — № 6734. — C. 323-329.

111. Anthony K.G., Bai F., Krishnan M.N., Fikrig E. and Koski R.A. Effective siRNA targeting of the 3' untranslated region of the West Nile virus genome. Antiviral research. — 2009. — T. 82. — № 3. — C. 166-168.

112. Khan S.H. Genome-Editing Technologies: Concept, Pros, and Cons of Various Genome-Editing Techniques and Bioethical Concerns for Clinical Application |

Elsevier Enhanced Reader. Molecular Therapy: Nucleic Acids. — 2019. — T. 16.--

C. 326-334.

113. Kim Y.G., Cha J. and Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. — 1996. — T. 93. — № 3. — C. 1156-1160.

114. Makarova K.S., Haft D.H., Barrangou R., Brouns S.J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J., Wolf Y.I., Yakunin A.F., van der Oost J. and Koonin E.V. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology. — 2011. — T. 9. — № 6. — C. 467-477.

115. Pawelczak K.S., Gavande N.S., VanderVere-Carozza P.S. and Turchi J.J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS chemical biology. — 2018. — T. 13. — № 2. — C. 389-396.

116. Feng L., Wei W., Heng Z., Yantao H., and Chunbo W. Knockdown of REV7 Inhibits Breast Cancer Cell Migration and Invasion. Oncology research. — 2016. — T. 24. — № 5. — C. 315-325.

117. Li L., Hu S. and Chen X. Non-viral delivery systems for CRISPR/Cas9-based genome editing: Challenges and opportunities. Biomaterials. — 2018. — T. 171.

— C. 207-218.

118. Liang L., Feng J., Zuo P., Yang J., Lu Y. and Yin Y. Molecular basis for assembly of the shieldin complex and its implications for NHEJ. Nat Commun. — 2020.

— T. 11. — № 1. — C. 1972.

119. Wu L., Fan J. and Belasco J.G. Importance of translation and nonnucleolytic ago proteins for on-target RNA interference. Current biology : CB. — 2008. — T. 18. — № 17. — C. 1327-1332.

120. Yang L., Guell M., Byrne S., Yang J.L., De Los Angeles A., Mali P., Aach J., Kim-Kiselak C., Briggs A.W., Rios X., Huang P.Y., Daley G. and Church G. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. — 2013.

— T. 41. — № 19. — C. 9049-9061.

121. Ye L., Wang C., Hong L., Sun N., Chen D., Chen S., and Han F. Programmable DNA repair with CRISPRa/i enhanced homology-directed repair efficiency with a single Cas9. Cell discovery. — 2018. — T. 4. doi: 10.1038/s41421-018-0049-7

122. Uranga L.A., Reyes E.D., Patidar P.L., Redman L.N. and Lusetti S.L. The cohesin-like RecN protein stimulates RecA-mediated recombinational repair of DNA double-strand breaks. Nat Commun. — 2017. — T. 8. doi: 10.1038/ncomms15282

123. Li L., Wu L.P. and Chandrasegaran S. Functional domains in Fok I restriction endonuclease. Proc Natl Acad Sci U S A. — 1992. — T. 89. — № 10. — P. 4275-4279.

124. Lin S., Staahl B.T., Alla R.K. and Doudna J.A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. — 2014. — T. 3. — C. e04766.

125. Liu M., Rehman S., Tang X., Gu K., Fan Q., Chen D. and Ma W. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Front Genet. — 2018. — T. 9. — C. 691.

126. Liu Q., Segal D.J., Ghiara J.B. and Barbas C.F. Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. — 1997. — T. 94. — № 11. — C. 5525-5530.

127. Cavazzana M. and Mavilio F. Gene Therapy for Hemoglobinopathies. Human gene therapy. — 2018. — T. 29. — № 10. — C. 1142-1154.

128. Charpentier M., Khedher A.H.Y., Menoret S., Brion A., Lamribet K., Dardillac E., Boix C., Perrouault L., Tesson L., Geny S., De Cian A., Itier J.M., Anegon I., Lopez B., Giovannangeli C. and Concordet J.P. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair. Nat Commun. — 2018. — T. 9. — № 1. — C.1133.

129. Christian M., Cermak T., Doyle E.L., Schmidt C., Zhang F., Hummel A., Bogdanove A.J. and Voytas D.F. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. — 2010. — T. 186. — № 2. — C. 757-761.

130. Coisy M., Roure V., Ribot M., Philips A., Muchardt C., Blanchard J.M. and Dantonel J.C. Cyclin A repression in quiescent cells is associated with chromatin remodeling of its promoter and requires Brahma/SNF2alpha. Molecular cell. — 2004. — T. 15. — № 1. — C. 43-56.

131. Gerlach M., Kraft T., Brenner B., Petersen B., Niemann H., and Montag J. Efficient Knock-in of a Point Mutation in Porcine Fibroblasts Using the CRISPR/Cas9-GMNN Fusion Gene. Genes-Basel. — 2018. — T. 9. — № 6. — C. 296.

132. Holkers M., Maggio I., Liu J., Janssen J.M., Miselli F., Mussolino C., Recchia A., Cathomen T., and Gonfalves M.A. Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells. Nucleic Acids Res. — 2013. — T. 41. — № 5. — C. e63.

133. Javle M., and Curtin N.J. The role of PARP in DNA repair and its therapeutic exploitation. British journal of cancer. — 2011. — T. 105. — № 8. — C. 1114-1122.

134. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., and Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. — 2012. — T. 337. — № 6096. — C. 816-821.

135. Mizukoshi M., Nozawa A., Oomizo S., Ihara D., Shiota J., Kikuchi K., Kaito M., Ishibashi Y., Ishikawa M., Fukuchi M., Tsuda M., Takasaki I. and Tabuchi A. Differential localization and roles of splice variants of rat suppressor of cancer cell invasion (SCAI) in neuronal cells. Biochemical and biophysical research communications. — 2020. — T. 529. — № 3. — C. 615-621.

136. Safieh M., Korczyn A.D., and Michaelson D.M. ApoE4: an emerging therapeutic target for Alzheimer's disease. BMC medicine. — 2019. — T. 17. — № 1. doi: 10.1186/s12916-019-1299-4

137. Srivastava M., Nambiar M., Sharma S., Karki S.S., Goldsmith G., Hegde M., Kumar S., Pandey M., Singh R.K., Ray P., Natarajan R., Kelkar M., De A., Choudhary

B. and Raghavan S.C. An inhibitor of nonhomologous end-joining abrogates doublestrand break repair and impedes cancer progression. Cell. — 2012. — T. 151. — № 7. —

C. 1474-1487.

138. Geurts M.H., de Poel E., Amatngalim G.D., Oka R., Meijers F.M., Kruisselbrink E., van Mourik P., Berkers G., de Winter-de Groot K.M., Michel S., Muilwijk D., Aalbers B.L., Mullenders J., Boj S.F., Suen S.W.F., Brunsveld J.E., Janssens H.M., Mall M.A., Graeber S.Y., van Boxtel R., van der Ent C.K., Beekman J.M. and Clevers H. CRISPR-Based Adenine Editors Correct Nonsense Mutations in a Cystic Fibrosis Organoid Biobank. Cell stem cell. — 2020. — T. 26. — № 4. — C. 503-510.

139. Geurts M.H., de Poel E., Pleguezuelos-Manzano C., Oka R., Carrillo L. andersson-Rolf A., Boretto M., Brunsveld J.E., van Boxtel R., Beekman J.M. and Clevers H. Evaluating CRISPR-based prime editing for cancer modeling and CFTR repair in organoids. Life science alliance. — 2021. — T. 4. — № 10. doi: 10.26508/lsa.202000940

140. Miller J., McLachlan A.D. and Klug A. Repetitive zinc-binding domains in the protein transcription factor IIIA from Xenopus oocytes. The EMBO journal. — 1985.

— T. 4. — № 6. — C. 1609-1614.

141. Mirman Z., Lottersberger F., Takai H., Kibe T., Gong Y., Takai K., Bianchi A., Zimmermann M., Durocher D. and de Lange T. 53BP1-RIF1-shieldin counteracts DSB resection through CST- and Polalpha-dependent fill-in. Nature. — 2018. — T. 560.

— № 7716. — C. 112-116.

142. Moscou M.J. and Bogdanove A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. — 2009. — T. 326. — № 5959. — C. 1501.

143. Taylor M.J. and Peculis B.A. Evolutionary conservation supports ancient origin for Nudt16, a nuclear-localized, RNA-binding, RNA-decapping enzyme. Nucleic Acids Res. — 2008. — T. 36. — № 18. — C. 6021-6034.

144. Maeder M.L., Thibodeau-Beganny S., Osiak A., Wright D.A., Anthony R.M., Eichtinger M., Jiang T., Foley J.E., Winfrey R.J., Townsend J.A., Unger-Wallace E., Sander J.D., Müller-Lerch F., Fu F., Pearlberg J., Göbel C., Dassie J.P., Pruett-Miller S.M., Porteus M.H., Sgroi D.C., Iafrate A.J., Dobbs D., McCray P.B., Cathomen T., Voytas D.F. and Joung J.K. Rapid "open-source" engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Molecular cell. — 2008. — T. 31. — № 2. — C. 294-301.

145. Lieber M.R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. — 2010. — T. 79. — C. 698-714.

146. Botuyan M.V., Cui G., Drane P., Oliveira C., Detappe A., Brault M.E., Parnandi N., Chaubey S., Thompson J.R., Bragantini B., Zhao D., Chapman J.R., Chowdhury D. and Mer G. Mechanism of 53BP1 activity regulation by RNA-binding TIRR and a designer protein. Nature structural & molecular biology. — 2018. — T. 25.

— № 7. — C. 1-10.

147. Bergeron N., Phan B.A., Ding Y., Fong A. and Krauss R.M. Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 inhibition: a new therapeutic mechanism for reducing cardiovascular disease risk. Circulation. — 2015. — T. 132. — № 17. — C. 1648-1666.

148. Lietzen N., Ohman T., Rintahaka J., Julkunen I., Aittokallio T., Matikainen S. and Nyman T.A. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS pathogens. — 2011. — T. 7. — № 5. — C. doi: 10.1371/journal.ppat.1001340.

149. Psatha N., Reik A., Phelps S., Zhou Y., Dalas D., Yannaki E., Levasseur D.N., Urnov F.D., Holmes M.C. and Papayannopoulou T. Disruption of the BCL11A Erythroid Enhancer Reactivates Fetal Hemoglobin in Erythroid Cells of Patients with ß -Thalassemia Major. Molecular therapy. Methods & clinical development. — 2018. — T. 10. — C. 313-326.

150. Rivera-Torres N., Strouse B., Bialk P., Niamat R.A and, Kmiec E.B. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PloS one. — 2014. — T. 9. — № 5. — C. doi: 10.1371/journal.pone.0096483.

151. Sanjana N.E., Cong L., Zhou Y., Cunniff M.M., Feng G. and Zhang F. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. — 2012. — T. 7. — № 1. — C. 171-192.

152. Noordermeer S.M., Adam S., Setiaputra D., Barazas M., Pettitt S.J., Ling A.K., Olivieri M., Alvarez-Quilon A., Moatti N., Zimmermann M., Annunziato S., Krastev D.B., Song F., Brandsma I., Frankum J., Brough R., Sherker A., Landry S., Szilard R.K., Munro M.M., McEwan A., Goullet de Rugy T., Lin Z.Y., Hart T., Moffat J., Gingras A.C., Martin A., van Attikum H., Jonkers J., Lord C.J., Rottenberg S. and Durocher D. The shieldin complex mediates 53BP1-dependent DNA repair. Nature. — 2018. — T. 560. — № 7716. — C. 117-121.

153. Ahnesorg P., Smith P. and Jackson S.P. XLF interacts with the XRCC4-DNA ligase IV complex to promote DNA nonhomologous end-joining. Cell. — 2006. — T. 124. — № 2. — C. 301-313.

154. Fanen P., Wohlhuter-Haddad A. and Hinzpeter A. Genetics of cystic fibrosis: CFTR mutation classifications toward genotype-based CF therapies. The international journal of biochemistry & cell biology. — 2014. — T. 52. — C. 94-102.

155. Mali P., Esvelt K.M. and Church G.M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature methods. — 2013. — T. 10. — № 10. — C. 233-240.

156. Verma P. and Greenberg R.A. Noncanonical views of homology-directed DNA repair. Gene Dev. — 2016. — T. 30. — № 10. — C. 1138-1154.

157. Pannunzio N.R., Watanabe G. and Lieber M.R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. — 2018. — T. 293. — № 27. — C. 10512-10523.

158. Paques F. and Duchateau P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Curr Gene Ther. — 2007. — T. 7.

— № 1. — C. 49-66.

159. Parnandi N., Rendo V., Cui G., Botuyan M.V., Remisova M., Nguyen H., Drane P., Beroukhim R., Altmeyer M., Mer G. and Chowdhury D. TIRR inhibits the 53BP1-p53 complex to alter cell-fate programs. Mol Cell. — 2021. — T. 81. — № 12.

— C. 2583-2595 e2586.

160. Pavletich N.P. and Pabo C.O. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A. Science. — 1991. — T. 252. — № 5007. — P. 809817.

161. Baciu P.C., Saoncella S., Lee S.H., Denhez F., Leuthardt D. and Goetinck P.F. Syndesmos, a protein that interacts with the cytoplasmic domain of syndecan-4, mediates cell spreading and actin cytoskeletal organization. Journal of cell science. — 2000. — T. 113 Pt 2. — C. 315-324.

162. Kulcsar P.I., Talas A., Huszar K., Ligeti Z., Toth E., Weinhardt N., Fodor E. and Welker E. Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome biology. — 2017. — T. 18. — № 1. doi: 10.1186/s13059-017-1318-8

163. Pinder J., Salsman J. and Dellaire G. Nuclear domain 'knock-in' screen for the evaluation and identification of small molecule enhancers of CRISPR-based genome editing. Nucleic Acids Res. — 2015. — T. 43. — № 19. — C. 9379-9392.

164. Hermans P.W., van Soolingen D., Bik E.M., de Haas P.E., Dale J.W. and van Embden J.D. Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in

a hot-spot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains. Infection and immunity. — 1991. — T. 59. — № 8. — C. 2695-2705.

165. Ding Q., Strong A., Patel K.M., Ng S.L., Gosis B.S., Regan S.N., Cowan C.A., Rader D.J. and Musunuru K. Permanent alteration of PCSK9 with in vivo CRISPR-Cas9 genome editing. Circulation research. — 2014. — T. 115. — № 5. — C. 488-492.

166. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D.A. and Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. — 2007. — T. 315. — № 5819. — C. 1709-1712.

167. Kalhor R., Mali P. and Church G.M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature methods. — 2017. — T. 14. — № 2. — C. 195-200.

168. Kaminski R., Bella R., Yin C., Otte J., Ferrante P., Gendelman H.E., Li H., Booze R., Gordon J., Hu W. and Khalili K. Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study. Gene therapy. — 2016. — T. 23. — № 8-9. — C. 690695.

169. Torres R., Martin M.C., Garcia A., Cigudosa J.C., Ramirez J.C. and Rodriguez-Perales S. Engineering human tumour-associated chromosomal translocations with the RNA-guided CRISPR-Cas9 system. Nat Commun. — 2014. — T. 5. doi: 10.1038/ncomms4964

170. Haurwitz R.E., Jinek M., Wiedenheft B., Zhou K. and Doudna J.A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science. — 2010. — T. 329. — № 5997. — C. 1355-1358.

171. Redondo P., Prieto J., Munoz I.G., Alibes A., Stricher F., Serrano L., Cabaniols J.P., Daboussi F., Arnould S., Perez C., Duchateau P., Paques F., Blanco F.J. and Montoya G. Molecular basis of xeroderma pigmentosum group C DNA recognition by engineered meganucleases. Nature. — 2008. — T. 456. — № 7218. — C. 107-111.

172. Ihry R.J., Worringer K.A., Salick M.R., Frias E., Ho D., Theriault K., Kommineni S., Chen J., Sondey M., Ye C., Randhawa R., Kulkarni T., Yang Z., McAllister G., Russ C., Reece-Hoyes J., Forrester W., Hoffman G.R., Dolmetsch R. and Kaykas A. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nature medicine. — 2018. — T. 24. — № 7. — C. 939-946.

173. Hansen R.K., Mund A., Poulsen S.L., Sandoval M., Klement K., Tsouroula K., Tollenaere M.A., Räschle M., Soria R., Offermanns S., Worzfeld T., Grosse R., Brandt D.T., Rozell B., Mann M., Cole F., Soutoglou E., Goodarzi A.A., Daniel J.A., Mailand N. and Bekker-Jensen S. SCAI promotes DNA double-strand break repair in distinct chromosomal contexts. Nature cell biology. — 2016. — T. 18. — № 12. — C. 1357-1366.

174. Lillest0l R.K., Redder P., Garrett R.A. and Brügger K. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea. — 2006. — T. 2. — № 1. — C. 59-72.

175. Jackson R.N., Golden S.M., van Erp P.B., Carter J., Westra E.R., Brouns S.J., van der Oost J., Terwilliger T.C., Read R.J. and Wiedenheft B. Structural biology. Crystal structure of the CRISPR RNA-guided surveillance complex from Escherichia coli. Science. — 2014. — T. 345. — № 6203. — C. 1473-1479.

176. Robert F., Barbeau M., Ethier S., Dostie J. and Pelletier J. Pharmacological inhibition of DNA-PK stimulates Cas9-mediated genome editing. Genome Med. — 2015. — T. 7. doi: 10.1186/s13073-015-0215-6

177. Pettit R.S. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-modifying medications: the future of cystic fibrosis treatment. The Annals of pharmacotherapy. — 2012. — T. 46. — № 7-8. — C. 1065-1075.

178. Findlay S., Heath J., Luo V.M., Malina A., Morin T., Coulombe Y., Djerir B., Li Z., Samiei A., Simo-Cheyou E., Karam M., Bagci H., Rahat D., Grapton D., Lavoie E.G., Dove C., Khaled H., Kuasne H., Mann K.K., Klein K.O., Greenwood C.M., Tabach Y., Park M., Côté J.F., Masson J.Y., Maréchal A. and Orthwein A. SHLD2/FAM35A cooperates with REV7 to coordinate DNA double-strand break repair pathway choice. The EMBO journal. — 2018. — T. 37. — № 18. — C. doi: 10.15252/embj.2018100158.

179. Lin S., Staahl B.T., Alla R.K. and Doudna J.A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. — 2014. — T. 3. doi: 10.7554/eLife.04766

180. Tangutoori S., Baldwin P. and Sridhar S. PARP inhibitors: A new era of targeted therapy. Maturitas. — 2015. — T. 81. — № 1. — C. 5-9.

181. Yumlu S., Stumm J., Bashir S., Dreyer A.K., Lisowski P., Danner E. and Kühn R. Gene editing and clonal isolation of human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Methods. — 2017. — T. 121-122. — C. 29-44.

182. Smirnikhina S.A., Anuchina A.A. and Lavrov A.V. Ways of improving precise knock-in by genome-editing technologies. Hum Genet. — 2019. — T. 138. — № 1. — C. 1-19.

183. Carter S.C. and McKone E.F. Pharmacogenetics of cystic fibrosis treatment. Pharmacogenomics. — 2016. — T. 17. — № 13. — C. 1453-1463.

184. Scully R., Panday A., Elango R. and Willis N.A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. — 2019. — T. 20. — № 11. — C. 698-714.

185. Howden S.E., McColl B., Glaser A., Vadolas J., Petrou S., Little M.H., Elefanty A.G. and Stanley E.G. A Cas9 Variant for Efficient Generation of Indel-Free Knockin or Gene-Corrected Human Pluripotent Stem Cells. Stem cell reports. — 2016.

— T. 7. — № 3. — C. 508-517.

186. Setiaputra D. and Durocher D. Shieldin - the protector of DNA ends. EMBO Rep. — 2019. — T. 20. — № 5. doi: 10.15252/embr.201847560

187. Shao S.M., Ren C.H., Liu Z.T., Bai Y.C., Chen Z.L., Wei Z.H., Wang X., Zhang Z.Y. and Xu K. Enhancing CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair in mammalian cells by expressing Saccharomyces cerevisiae Rad52. Int J Biochem Cell B.

— 2017. — T. 92. — P. 43-52.

188. Shibata A. Regulation of repair pathway choice at two-ended DNA doublestrand breaks. Mutat Res-Fund Mol M. — 2017. — T. 803. — C. 51-55.

189. Silva G., Poirot L., Galetto R., Smith J., Montoya G., Duchateau P. and Paques F. Meganucleases and other tools for targeted genome engineering: perspectives and challenges for gene therapy. Curr Gene Ther. — 2011. — T. 11. — № 1. — C. 1127.

190. Simonetta M., de Krijger I., Serrat J., Moatti N., Fortunato D., Hoekman L., Bleijerveld O.B., Altelaar A.F.M. and Jacobs J.J.L. H4K20me2 distinguishes pre-

replicative from post-replicative chromatin to appropriately direct DNA repair pathway choice by 53BP1-RIF1-MAD2L2. Cell Cycle. — 2018. — T. 17. — № 1. — C. 124-136.

191. Byrne SM., Ortiz L., Mali P., Aach J and Church GM. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. — 2015. — T. 43. — № 3. doi: 10.1093/nar/gku1246. Epub 2014 Nov 20

192. Bruegmann T., Deecke K. and Fladung M. Evaluating the Efficiency of gRNAs in CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing in Poplars. International journal of molecular sciences. — 2019. — T. 20. — № 15. doi: 10.3390/ijms20153623

193. Gutschner T., Haemmerle M., Genovese G., Draetta G.F. and Chin L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell reports. — 2016. — T. 14. — № 6. — C. 1555-1566.

194. Iyama T., Abolhassani N., Tsuchimoto D., Nonaka M and Nakabeppu Y. NUDT16 is a (deoxy)inosine diphosphatase. and its deficiency induces accumulation of single-strand breaks in nuclear DNA and growth arrest. Nucleic Acids Res. — 2010. — T. 38. — № 14. — C. 4834-4843.

195. Jiang T., Henderson J.M., Coote K., Cheng Y., Valley H.C., Zhang X.O., Wang Q., Rhym L.H., Cao Y., Newby G.A., Bihler H., Mense M., Weng Z., Anderson D.G., McCaffrey A.P., Liu D.R. and Xue W. Chemical modifications of adenine base editor mRNA and guide RNA expand its application scope. Nat Commun. — 2020. — T. 11. — № 1. — C. doi: 10.1038/s41467-020-15892-8

196. Maruyama T., Dougan S.K., Truttmann M.C., Bilate A.M., Ingram J.R. and Ploegh H.L. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat Biotechnol. — 2015. — T. 33. — № 5. — C. 538-542.

197. Mimori T and Hardin J.A. Mechanism of interaction between Ku protein and DNA. — The Journal of biological chemistry. — 1986. — T. 261. — № 22. — C. 1037510379.

198. Yi T., Zhou X., Sang K., Zhou J. and Ge L. MicroRNA-1270 modulates papillary thyroid cancer cell development by regulating SCAI. Biomedicine &

pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie. — 2019. — T. 109. — C. 23572364.

199. Auer T.O., Duroure K., De Cian A., Concordet J.P. and Del Bene F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. — 2014. — T. 24. — № 1. — C. 142-153.

200. Hughes T.S., Langer S.J., Virtanen S.I., Chavez R.A., Watkins L.R., Milligan E.D. and Leinwand L.A. Immunogenicity of intrathecal plasmid gene delivery: cytokine release and effects on transgene expression. The journal of gene medicine. — 2009. — T. 11. — № 9. — C. 782-790.

201. Rohn T.T., Kim N., Isho N.F. and Mack J.M. The Potential of CRISPR/Cas9 Gene Editing as a Treatment Strategy for Alzheimer's Disease. Journal of Alzheimer's disease & Parkinsonism. — 2018. — T. 8. — № 3. doi: 10.4172/2161-0460.1000439

202. Moll U., Lau R., Sypes M.A., Gupta M.M. and Anderson C.W. DNA-PK, the DNA-activated protein kinase, is differentially expressed in normal and malignant human tissues. Oncogene. — 1999. — T. 18. — № 20. — C. 3114-3126.

203. Boersma V., Moatti N., Segura-Bayona S., Peuscher M.H., van der Torre J., Wevers B.A., Orthwein A., Durocher D. and Jacobs J.J.L. MAD2L2 controls DNA repair at telomeres and DNA breaks by inhibiting 5' end resection. Nature. — 2015. — T. 521. — № 7553. — C. 537-540.

204. Kunin V., Sorek R. and Hugenholtz P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. Genome biology. — 2007. — T. 8. — № 4. — C. doi: 10.1186/gb-2007-8-4-r61

205. Tsakraklides V., Brevnova E., Stephanopoulos G. and Shaw A.J. Improved Gene Targeting through Cell Cycle Synchronization. PloS one. — 2015. — T. 10. — № 7. doi: 10.1371/journal.pone.0133434

206. Verma P. and Greenberg R. A. Noncanonical views of homology-directed DNA repair. Gene Dev. — 2016. — T. 30. — № 10. — C. 1138-1154.

207. Chu V.T., Weber T., Wefers B., Wurst W., Sander S., Rajewsky K. and Kühn R. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced

precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. — 2015. — T. 33. — № 5. — C. 543-548.

208. Dampier W., Nonnemacher M.R., Sullivan N.T., Jacobson J.M. and Wigdahl B. HIV Excision Utilizing CRISPR/Cas9 Technology: Attacking the Proviral Quasispecies in Reservoirs to Achieve a Cure. MOJ immunology. — 2014. — T. 1. — № 4. doi: 10.15406/moji.2014.01.00022

209. Wang W., Ye C., Liu J., Zhang D., Kimata J.T. and Zhou P. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PloS one. — 2014. — T. 9. — № 12. doi: 10.1371/journal.pone.0115987

210. Zhu W., Lei R., Le D., Li J., Guo F., Wainberg M.A. and Liang C. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. — 2015. — T.12. doi: 10.1186/s12977-015-0150-z

211. Heyer W.D., Ehmsen K.T. and Liu J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual review of genetics. — 2010. — T. 44. — C. 3-18.

212. Strapps W.R., Pickering V., Muiru G.T., Rice J., Orsborn S., Polisky B.A., Sachs A. and Bartz S.R. The siRNA sequence and guide strand overhangs are determinants of in vivo duration of silencing. Nucleic Acids Res. — 2010. — T. 38. — № 14. — C. 4788-4797.

213. Liu X., Homma A., Sayadi J., Yang S., Ohashi J. and Takumi T. Sequence features associated with the cleavage efficiency of CRISPR/Cas9 system. Scientific reports. — 2016. — T. 6. doi: 10.1038/srep19675

214. Luo X., Zhang X., Peng J., Chen Y., Zhao W., Jiang X., Su L., Xie M. and Lin B. miR-371b-5p promotes cell proliferation, migration and invasion in non-small cell lung cancer via SCAI. Bioscience reports. — 2020. — T. 40. — № 11. doi: 10.1042/BSR20200163

215. Xu X. and Qi L.S. A CRISPR-dCas Toolbox for Genetic Engineering and Synthetic Biology. Journal of molecular biology. — 2019. — T. 431. — № 1. — C. 3447.

216. Zhang X., Stieber N. and Rutherford M.S. An interfering RNA protocol for primary porcine alveolar macrophages. Animal biotechnology. — 2005. — T. 16. — № 1. — C. 31-40.

217. Zhang X.H., Tee L.Y., Wang X.G., Huang Q.S. and Yang S.H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. — 2015. — T. 4. — № 11. — C. e264.

218. Cai Y., Zhang K., Cao L., Sun H. and Wang H. Inhibition of Microrna-766-5p Attenuates the Development of Cervical Cancer Through Regulating SCAI. Technology in cancer research & treatment. — 2020. — T. 19. doi: 10.1177/1533033820980081

219. Cui Y., Xu J., Cheng M., Liao X. and Peng S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA Design Tools. Interdisciplinary sciences, computational life sciences. — 2018.

— T. 10. — № 2. — C. 455-465.

220. Dai Y., Zhang A., Shan S., Gong Z. and Zhou Z. Structural basis for recognition of 53BP1 tandem Tudor domain by TIRR. Nat Commun. — 2018. — T. 9.

— № 1. doi: 10.1038/s41467-018-04557-2

221. Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M. and Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli. and identification of the gene product. Journal of bacteriology. — 1987. — T. 169. — № 12. — C. 5429-5433.

222. Li Y., Li L., Chen M., Yu X., Gu Z., Qiu H., Qin G., Long Q., Fu X., Liu T., Li W., Huang W., Shi D., Kang T., Luo M., Wu X. and Deng W. MAD2L2 inhibits colorectal cancer growth by promoting NCOA3 ubiquitination and degradation. Molecular oncology. — 2018. — T. 12. — № 3. — C. 391-405.

223. Ma Y., Pannicke U., Schwarz K. and Lieber MR. Hairpin opening and overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologous end joining and V(D)J recombination. Cell. — 2002. — T. 108. — № 6.

— C. 781-794.

224. Pan Y., Shen N., Jung-Klawitter S., Betzen C., Hoffmann G.F., Hoheisel J.D. and Blau N. CRISPR RNA-guided FokI nucleases repair a PAH variant in a phenylketonuria model. Scientific reports. — 2016. — T. 6. doi: 10.1038/srep35794

225. Sakurai Y., Ichinoe M., Yoshida K., Nakazato Y., Saito S., Satoh M., Nakada N., Sanoyama I., Umezawa A., Numata Y., Shi-Xu J., Ichihara M., Takahashi M. and Murakumo Y. Inactivation of REV7 enhances chemosensitivity and overcomes acquired chemoresistance in testicular germ cell tumors. Cancer letters. — 2020. — T. 489. — C. 100-110.

226. Yang D., Scavuzzo M.A., Chmielowiec J., Sharp R., Bajic A. and Borowiak M. Enrichment of G2/M cell cycle phase in human pluripotent stem cells enhances HDR-mediated gene repair with customizable endonucleases. Sci Rep. — 2016. — T. 6. — C. 21264.

227. Luo Y.L., Xu C.F., Li H.J., Cao Z.T., Liu J., Wang J.L., Du X.J., Yang X.Z., Gu Z. and Wang J. Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles. ACS nano. — 2018. — T. 12. — № 2. — C. 9941005.

228. Hu Z., Yu L., Zhu D., Ding W., Wang X., Zhang C., Wang L., Jiang X, Shen H., He D., Li K., Xi L., Ma D. and Wang H. Disruption of HPV16-E7 by CRISPR/Cas system induces apoptosis and growth inhibition in HPV16 positive human cervical cancer cells. BioMed research international. — 2014. — T. 2014. doi: 10.1155/2014/612823

229. Tang Z., Chen S., Chen A., He B., Zhou Y., Chai G., Guo F. and Huang J. CasPDB: an integrated and annotated database for Cas proteins from bacteria and archaea. Database : the journal of biological databases and curation. — 2019. — T. 2019. doi: 10.1093/database/baz093

230. Wei Z., Lyu B., Hou D. and Liu X. Mir-5100 Mediates Proliferation, Migration and Invasion of Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Via Targeting SCAI. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. — 2021. — T. 34. — № 8. — C. 834-841.

231. Zhang J.P., Li X.L., Li G.H., Chen W., Arakaki C., Botimer G.D., Baylink D., Zhang L., Wen W., Fu Y.W., Xu J., Chun N., Yuan W., Cheng T. and Zhang X.B.

Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. — 2017. — Т. 18. — № 1. — C. 35.

232. Zlotorynski, E. Shieldin the ends for 53BP1. Nat Rev Mol Cell Biol. — 2018. — Т. 19. — № 6. — C. 346-347.

233. Вяхирева Ю.В., Филатова А.Ю., Кривошеева И.А. и Скоблов М.Ю. Нокдаун генов с использованием малых интерферирующих РНК. Вестник Российского государственного медицинского университета. — 2017. — № 3. — C.18-31.