Изучение молекулярных механизмов, определяющих различия уровня экспрессии гена АФП в клонах крысиной гепатомы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Кустова, Инна Феликсовна

• Кустова, Инна Феликсовна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кустова, Инна Феликсовна

Список сокращений

Глава 1. Введение

Глава 2. Обзор литературы

2.1. Структура и функции АФП

2.2. Структура и эволюция гена АФП

2.3. Продукты транскрипции гена АФП

2.4. Синтез АФП в норме и при патологии 10 2.5.1. Механизмы регуляции экспрессии гена АФП 15 2.5.2 Транскрипционные факторы, определяющие экспрессию печень-специфических генов 16 2.5.3. Взаимная регуляция ГЯФ

2.6. Структура регуляторного элемента гена АФП. 2(ис-элементы

2.7. Модель регуляции экспрессии гена АФП

2.7.1. Транскрипционные факторы, осуществляющие регуляцию экспрессии гена АФП

2.7.2. Возможная модель регуляции экспресиии гена АФП

2.8. Создание соматических гибридов, как метод изучения регуляции экспрессии генов

2.9. Линия крысиной гепатомы McA-RH

2.10. Изучение профилей экспрессии генов в ГКК

2.11. Использование регуляторных элементов АФП в генной терапии 59 Заключение

Глава 3. Материалы и методы

3.1. Список использованных растворов и сред

3.2. Клеточные линии 63 3.3 Бактериальные штаммы и плазмидные векторы. 63 3.4. Трансформация клетокЕ.Coli 64 3.5 Получение и анализ культур клеток млекопитающих.

3.6. Получение гибридизационных зондов

3.7. Выделение суммарной клеточной РНК с помощью гуанидин-тиоцианата

3.8. Нозерн-блот анализ

3.9. Метод "Обратная Транскрипция - Полимеразная Цепная Реакция"

3.10. Сканирование и компьютерная обработка результатов

Глава 4 . Результаты исследования

4.1. Сравнение спектров экспрессии печень-специфических белков и транскрипционных факторов в АФП+ и АФГТ клонах

4.2. Получение соматических гибридов

4.3. В соматических гибридах не синтезируется АФП

4.4. Экспрессия мРНК АФП в соматических гибридах подавлена

4.5. Экспрессия печень-специфических генов в гибридах

4.6. Изучение экспрессии транскрипционных факторов в соматических гибридах

Глава 5. Обсуждение результатов

5.1. Подавление экспрессии гена А ФП в соматических гибридах

5.2. Синтез СА и других маркеров дифференцированного состояния гепатоцитов в соматических гибридах подавлен

5.3. Экспрессия транскрипционных факторов в соматических гибридах

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение молекулярных механизмов, определяющих различия уровня экспрессии гена АФП в клонах крысиной гепатомы»

Актуальность проблемы.

Альфа-фетопротеин (АФП) - основной белок эмбриональной сыворотки крови млекопитающих. АФП синтезируется висцеральной энтодермой желточного мешка и клетками эмбриональной печени. Сразу после рождения его синтез почти полностью прекращается и АФП замещается родственным ему белком и функциональным аналогом - сывороточным альбумином (СА). АФП вновь появляется в сыворотке при возникновении опухолей печени и герминогенных тератобластом, а также при механических или химических повреждениях печени, вызывающих регенерацию.

Гепатоклеточная карцинома (ГКК) является одной из самых распространенных форм рака в мире. Ее лечение осложняются тем, что опухоли, как правило, возникают на базе хронических заболеваний печени. ГКК могут возникать в результате воздействия химических канцерогенов, например афлатоксина В1. Значительный риск появления первичных опухолей печени существует среди людей, страдающих алкогольным циррозом печени (Wogan, 2000). Однако к группе наиболее высокого риска возникновения ГКК относятся пациенты с хроническими вирусными заболеваниями печени. По эпидемиологическим данным 2000 года, хронические инфекции вирусом гепатита В являются причиной 80% ГКК в мире. Следующей по частоте причиной является инфекция вирусом гепатита С (Bergsland and Venook, 2000). Поскольку заболеваемость гепатитами В и С в мире продолжает расти, можно предполагать, что ГКК останется одной из самых распространенных форм рака в мире. Программы по вакцинации населения против вирусов гепатита В и С направлены на изменение этой ситуации.

Уже несколько десятилетий АФП используется в клинической онкологии для дифференциальной диагностики ГКК, гепатобластом (ГБ) и тератокарцином (ТК). Кроме этого, повышенный уровень АФП в амниотической жидкости и сыворотке крови беременных женщин является признаком врожденной невропатии или дефектов развития мозга. Практикуется также систематическое обследование на АФП больных циррозом печени и хронических носителей гепатита В.

В свете изложенных выше фактов изучение молекулярных и клеточных механизмов, определяющих регуляцию синтеза онко-эмбрионального маркера АФП, представляется важной проблемой современной биологии. Основные события регуляции экспрессии АФП происходят на уровне транскрипции с участием большого числа транскрипционных факторов. Хорошо изучена структура регуляторного района гена АФП, который включает тканеспецифические энхансеры, промотор и сайленсер, по крайней мере частично определяющий падение экспрессии гена во взрослой печени.

Однако практически все описанные печень-специфические факторы, определяющие экспрессию АФП, являются активаторами транскрипции. Предложенные к настоящему времени модели регуляции не объясняют высокую ткане- и стадие-специфичность репрессии теш АФП. По-видимому, подавление экспрессии гена АФП в постэмбриональный период должно осуществляться за счет пока не идентифицированных тканеспецифических негативных регуляторов транскрипции, поиск которых представляется одной из главных задач, открывающихся в этой области.

Одним из генетических методов, позволяющих подойти к проблеме изучения механизмов негативной регуляции экспрессии генов, является создание соматических гибридов, которые получают при слиянии эукариотических клеток с различным фенотипом. При слиянии клеток происходит объединение геномов двух различающихся линий и, следовательно, объединение пула экспрессирующихся в них транскрипционных факторов, участвующих в регуляции экспрессии генов. Соматические гибриды наследуют фенотип одной из исходных клеточных линий, происходит сохранение или подавление синтеза белков, специфических для исходных клеток. Более того, одновременный анализ уровней транскрипции нескольких генов и целых генных блоков может показать, насколько взаимосвязана их экспрессия в той или иной экспериментальной системе. Таким образом, изучение экспрессии генов в соматических гибридах позволяет понять, какие механизмы, активаторные или репрессорные, лежат в основе различия исходных клеточных линий по тем или иным признакам.

В настоящей работе мы использовали метод соматической гибридизации для анализа механизмов регуляции экспрессии гена АФП. Моделью для изучения механизмов регуляции экспрессии теш АФП послужила коллекция клонов крысиной гепатомы McA-RH 7777, различающихся по уровню синтеза АФП, полученная в лаборатории иммунохимии опухолей НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН Т.Л. Эрайзер.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение механизмов, которые лежат в основе различий между АФП-продуцирующими и АФП-непродуцирующими клетками. Эксперимент был поставлен для подтверждения предположения о существовании транскрипционных факторов, подавляющих экспрессию гева. АФП. Для этого предстояло решить следующие экспериментальные задачи:

1. Провести соматическую гибридизацию между клонами крысиной гепатомы, различающимися по уровню экспрессии АФП.

2. Определить АФП-фенотип полученных гибридов.

3. Сравнить уровни экспрессии мРНК печень-специфических генов в исходных клонах и полученных гибридах.

4. Описать спектры экспрессии мРНК ткане-специфических транскрипционных факторов в исходных клонах и соматических гибридах.

5. Определить играют ли изученные транскрипционные факторы ключевуюрольв репрессии тъп&АФП в АФП-непродуцирующих клетках.

Научная новизна.

Впервые проведена соматическая гибридизация между клонами крысиной гепатомы с различным АФП-фенотипом, полученными из одной клеточной линии. Во всех полученных гибридах подавлена экспрессия гешАФП. Впервые проведена полная характеристика экспрессии ткане-специфических транскрипционных факторов в клонах крысиной гепатомы Морриса McA-RH 7777. Спектр экспрессии ключевых регуляторов печеночных генов HNFla, HNF3y, HNF4a и HNF6 полностью совпадает со спектром экспрессии АФП. Показано, что транскрипция HNFip, HNF3a, FTF, C/EBPa, COUP-TFII по-видимому, не играет определяющей роли в установлении АФП-фенотипа в этой системе.

Проведен анализ экспрессии генов семейства альбумина в исходных клонах и соматических гибридах. Показано, что экспрессия генов СА, a-альбумина (а-АЛБ), витамин Д-связывающего белка (ДСВ'), транстиретина (ТТР'), и А ФП происходит координировано.

Выявлено, что транскрипция фактора COUP-TFI коррелирует с подавлением экспрессии генов семейства альбумина и большинства гепатоспецифических ядерных факторов (ГЯФ). Выдвинута гипотеза о существовании в АФП'- клетках негативного регулятора транскрипции гена АФП.

Практическая значимость.

Одним из важнейших направлений исследований современной онкологии и молекулярной биологии в настоящее время является поиск диагностических маркеров опухолей. Однако, не менее важно понимать причины, по которым активируется экспрессия этих белков. Первым описанным и наиболее значимым маркером опухолей печени является АФП, вероятно, причины его активации при гепатоканцерогенезе непосредственно связаны с механизмами, лежащими в основе опухолевой трансформации. Утрата тканеспецифических свойств в ходе гепатоканцерогенеза связаны с изменениями в уровнях экспрессии ГЯФ и печень-специфических генов. Понимание закономерностей экспрессии этих генов может сыграть важную роль в диагностике ГКК и разработке новых методов лечения.

В последнее время все более широкое распространение приобретает генно-терапевтический подход к лечению многих заболеваний. Регуляторные элементы гена АФП подробно описаны и идеально подходят для использования в такой терапии. Промотор гена АФП высоко-тканеспецифичен, экспрессия гена в зрелых гепатоцитах подавлена и возобновляется при патологиях. Однако, пока неясны механизмы, подавляющие транскрипцию гена, которые могут оказывать существенное влияние при терапии. Для применения регуляторных элементов АФП в генной терапии необходимо обладать полной информацией о возможностях регуляции этого гена. Таким образом, результаты проведенной работы способствуют лучшему пониманию механизмов поддержания гепатоспецифического фенотипа, что представляется важным для создания принципиально новых методов лечения злокачественных новообразований.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Кустова, Инна Феликсовна

6. выводы.

1. Впервые описана экспрессия широкого спектра транскрипционных факторов в клонах крысиной гепатомы Морриса McA-RH 7777, различающихся по уровню синтеза АФП. Проанализированы один АФП+ и три АФП" клона. В АФП+ клоне экспрессируются факторы HNFla, HNF3y, HNF4 и HNF6, которые не выявляются ни в одном АФГГ клоне. Факторы HNFip, HNF3a, FTF, C/EBPa, COUP-TFII, выявляемые в АФП+ и одном из АФП" клонов, а также факторы GATA4, GATA6, HNF3P и С/ЕВРР, одинаково экспрессирующиеся во всех клонах, не являются определяющими для установления АФП-фенотипа.

2. Получены соматические гибриды между АФП+ и АФП" клонами крысиной гепатомы. Гибриды по экспрессии АФП наследуют АФП' фенотип, что свидетельствует о существовании в АФП" клонах транскрипционного фактора, подавляющего экспрессию гена АФП.

3. В исходных клонах и соматических гибридах экспрессия генов, специфических для нормальной взрослой печени, коррелирует с экспрессией АФП, но происходит на более низком уровне.

4. Транскрипция фактора COUP-TFI обратно коррелирует с экспрессией гена и ряда ГЯФ, по-видимому COUP-TFI может принимать участие в негативной регуляции экспрессии АФП и печень-специфических генов.

5. Подавление экспрессии АФП в соматических гибридах не является следствием отсутствия в этих клетках основных активаторов транскрипции гепато-специфических генов HNF1, HNF4a и HNF3y, вероятно эти процессы происходят параллельно.

6. Ни один из описанных к настоящему времени гепато-специфических транскрипционных факторов не может осуществлять функцию репрессора АФП.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кустова, Инна Феликсовна, 2002 год

1. Мол. биол., 33 (2): 273-281.- Варга, Е.В., Черемнова, O.A., Овчинников, Д.А., Шапигузов, А.Ю., Кудрявцева,

2. Oncodevelopmental gene expression. Academic Press, NY , 259-270.- Bélanger, L. , Baril, P., Guertin, M . , Gingras, M.C. , Gourdeau, H. , Anderson, A., Hamel,

3. R N A expression during mouse embryogenesis. EMBO J., 2: 549-554.- Engelgardt, N.V., Lazareva, M.N . , Uryvaeva, I.V., Factor, V .M . , Poltoranina, V.S.,

4. Gleiberman, A.S., Brodsky, V.Ya, Abelev, G.I. (1976). AFP in adult differentiatedhepatocytes of the regenerated liver. In: Onco-developmental Gene Expression, S.Sell, W.

6. Sugahiro, J., Ogata, M . , Ohrawara, H. , Omori, Y . , Iwamoto, Y. , and Bell, G.I. (1997).

7. Kobayashi, K., Ueki, t., Fujimoto, J. (2001). HVJ-liposome-mediated transfection ofHSVtkgene driven AFP promoter inhibits hepatic tumor growth of hepatocellular carcinoma in

10. Mol. Cell. Biol., 17: 2790-2797.- Kubicka, S., Kuhnel, P., Zender, L. , Rudolph, K .L . , Plumpe, J., Manns, M . , and Trautwein,

11. Cell Biol, supplement 47 (V.74).- Kuo, C.J., Mendel, D.B., Hansen, L.P., and Crabtree, G.R. (1991). Independent regulation of

12. H N F - l a and HNF- lp by retinóle acid in P9 teratocarcinoma cells. EMBO. I , 10: 2231-2236.- Kuo, C.J., Conley, P.B., Chen, L., Sladek, P.M., Darnell, J.E., Jr., and Crabtree, G.R. (1992).

13. A transcriptional hierarchy involved in mammalian cell-type specification. Nature, 355: 457461. - Kuo, C.T., Morrisey, E.E., Anandappa, R., Sigrist, K., Lu, M .M . , Parmacek, M.S., Soudais,

14. Expression of the L-type pyruvate kinase gene and the hepatocyte nuclear factor in exocrineand endocrine pancreas. L Biol. Chem., 269: 8944-8951. - Miura, Y. , Tam, T., Ido, A. , Morinaga, T., Miki , T., Hashimoto, T., Tamaoki, T. (1995).

15. Disorders. Orlando: Academic Press, p 5-34.- Mizejewski, G.I., Stanton, B.R., Jacobson, H.I. (1989). AFP modification of biological response in estrogen-sensitive tissues. Use of in vivo and in vitro models. In: Mizeyewski GI,

16. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. J. Biol. Chem., 275(50): 38949-38952. - Morinaga, T., Sakai, M . , Wegmann, T.G., Tomaoki, T. (1983). Primary structures of human

18. Comp. Rend. Acad. Sci. (Paris), 273: 831-834.- Nunez, E., Benassayag, C , Crysteff, N . (1987). Estrogen and fatty acid binding properties of murine AFP: a guide to explain some biological activities of this protein. In: Mizeyewski GI,

19. Biol. Chem., 276: 42057-42062.- Ohguchi, S., Nakatsukasa, H., Higashi, T., Ashida, K., Nouso, K. , Ishizaki, M . , Hino, N . ,

20. Acad. Sci., 97,10890-10894.- Pfalf, M . (1994). Vertebrate receptors: molecular biology, dimerization and response elements. Semin. Cell. Biol., 5: 95-103. - Pierreux, C E . , Stafford, J., Demonte, D., Scott, D.K., Vandenhaute, J., O'Brien, R.M. ,

21. The human alpha-fetoprotein gene. Sequence organization and the 5'-flanking reqion. J.

22. Biol. Chem., 260: 5055-5060.- Sala-Trepat, J.-M., Dever, J., Sargent, T.D., Thomas, K., Sell, S., Bonner, J. (1979a).

23. Jr. (1991). The different tissue transcription patterns of genes for HNP-1 C/EBP, HNF-3, and

24. X receptor is an auxiliary protein for thyroid hormón and retinóle acid receptors. Nature, 355:441-446. - Zhang, X .K . , Gauthier, T., Burczynski, P. J., Wang, G.Q., Gong, Y.W., Minuk, G,Y. (1996).