Факторы, влияющие на пролиферацию и апоптоз в мышиных гепатокарциномах различного уровня дифференцировки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Овчинников, Дмитрий Александрович

• Овчинников, Дмитрий Александрович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Овчинников, Дмитрий Александрович

Список сокращений

Введение

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Гепатоцеллюлярные карциномы.

1.1.1. Факторы риска возникновения ГК.

1.1.1.1. Хронический вирусный гепатит.

1.1.1.2. Вирус гепатита В.

1.1.1.3. Вирус гепатита С.

1.1.1.4. Химические канцерогены.

1.1.1.5. Наследственные генетические изменения.

1.1.2. Этапы гепатоканцерогенеза.

1.1.3. Генетические основы трансформации гепатоцитов. 2 Гепатоцитарные ядерные факторы и их роль в развитии и ^з функционировании печени.

1.2.1. Семейство 1ЮТ1.

1.2.2. Семейство С/ЕВР.

1.2.3. Семейство Н^З.

1.2.4. Семейство ИЧЕб.

1.2.5. Семейство ИЧЕ4.

1.2.6. Регуляция ГЯФ.

1.2.7. ГЯФ при патологиях.

1.2.8. ГЯФ и гепатоканцерогенез.

1.3. Модель одноступенчатой прогрессии ГК мышей.

1.4. Трансформирующий фактор роста р.

1.4.1. ТСЕр лигавд.

1.4.2. Рецептор к ТСЕр.

1.4.2.1. Рецепторы к ТСЕр 3 типа.

1.4.2.2. Рецепторы к ТСЕр 1 и 2 типов.

1.4.3. Взаимодействие ТСЕр лиганд - рецептор.

1.4.4. БМАБ белки.

1.4.5. ТСЕР сигнальный путь.

1.4.6. ТСЕр респонсивные гены.

1.4.7. Прекращение ТСЕр-зависимой сигнализации.

1.4.8. Белки, взаимодействующие с рецепторами к ТСЕр.

1.4.9. SMAD-независимая сигнализация.

1.4.10. TGFP сигнальный путь и канцерогенез.

1.4.10.1. Антиопухолевая активность TGFp.

1.4.10.2. Нарушения сигнального пути TGFp в опухолях. 58 1.4.103. Про-опухолевые эффекты TGFp.

1.4.11. Эпителиально-мезенхимальный переход и TGFp.

1.4.11.1. Эпителиально-мезенхимальный переход.

1.4.11.2. Роль TGFp в эпителиально-мезенхимальном переходе.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Список использованных растворов и сред.

2.2. Линии перевиваемых гепатокарцином. 66 23. Клеточные линии.

2.4. Трансформация клеток Е. ColL

2.5. Выделение нуклеиновых кислот.

2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях. Метод "Обратная Транскрипция — Полимеразная Цепная Реакция" (ОТ-ПЦР).

2.8. Тест на цитотоксичность с использованием тиазолила синего.

2.9. Измерение уровня активации белка р53.

2.10. Измерение скорости роста ГК in vitro и in vivo.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Модель одноступенчатой прогрессии гепатокарцином мышей.

3.2. Экспрессия HNF4al влияет на ростовые характеристики ГК. . Сравнение уровня апоптоза в ГК с различным уровнем

J.Z.I. , , /о дифференцировки. . . Влияние экспрессии HNF4al на уровень пролиферации и оп

5.Z.L. . . oU скорость роста 6ГК in vitro.

3.23. Ре-экспрессия HNF4al снижает скорость роста 6ГК in vivo. ^ Сравнение уровней экспрессии генов, вовлеченных в g^ контроль пролиферации и апоптоза, в 6ГК и мГК.

2 2 2 Гиперэкспрессия TGFp респонсивных генов при g^ одноступенчатой прогрессии ГК.

Исследование спектров экспрессии TGFp-респонсивных генов

3.3.2. и генов, участвующих, в TGFp-зависимом сигнальном пути, 83 методом ОТ-ПЦР. j 2 Изменения уровней экспрессии генов, участвующих в gg контроле пролиферации и апоптоза в гепатоцитах. . Кондиционированная среда НЗЗ обладает цитопротективным оа

J.4. , . о? эффектом.

2 g КС-ЮЗ подавляет химически индуцированную активацию ^ белка р53.

3.6. Подавление синтеза TGF02 в культуре клеток 6ГК.

3.6.1. Трансформация НЗЗ вектором, экспрессирующим ми TGF02«

3.6.2. Определение количества TGFfh в кондиционированной среде. ^ з Подавление продукции TGF02 приводит к ухудшению ^^^ ростовых характеристик НЗЗ in vitro и in vivo.

2 g 4 Снижение синтеза TGF02 приводит к ослаблению ^ цитопротективного эффекта КС-НЗЗ.

Введение mhTGF02 привело к подавлению экспрессию ряда ^^^ TGFP респонсивных генов в культуре 6ГК.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. HNF4al влияет на уровень пролиферации и скорость роста ГК.

4.2. TGFP сигнальный путь активирован в 6ГК.

TGF02, продуцируемый НЗЗ в среду, обладает цитопротективным эффектом. ^ Инактивация синтеза TGF02 приводит к ухудшению ростовых ^ ^ характеристик ГК.

Подавление синтеза TGFp2 привело к снижению уровня ^ экспрессии генов-мишеней TGF0.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Факторы, влияющие на пролиферацию и апоптоз в мышиных гепатокарциномах различного уровня дифференцировки»

Канцерогенез - сложный и многостадийный процесс, для реализации которого необходимо множество последовательных событий. Исследования показывают, что процесс появления опухоли можно условно разделить на 3 этапа. На первом этапе (инициация) происходит накопление мутаций в генах, приводящих к нарушению контроля пролиферации в клетках. В ходе второго этапа (промоция) трансформированные клетки, преодолевают сдерживающие влияние тканевого микроокружения и образуют пренеопластический фокус. На третьем этапе, получившем название прогрессия, происходит усиливающееся накопление генетических изменений, ведущее к приобретению клетками злокачественного фенотипа. Изменения, происходящие в трансформированных клетках на этой стадии, приводят к их клональной экспансии и образованию опухоли [1,2].

Одним из основных событий канцерогенеза является усиление пролиферации опухолевых клеток и уклонение их от программируемой клеточной смерти (апоптоза) [35]. На это направлены многие из генетических изменений, происходящих в опухолевых клетках.

Для большинства типов опухолей также характерна постепенная утрата маркеров дифференцировки и подавление экспрессии генов, препятствующих размножению опухолевых клеток (опухолевые супрессоры), или не требующихся опухоли для поддержания ее жизнедеятельности (антигенное упрощение) [6]. Поэтому снижение уровня дифференцировки также относится многими авторами к числу основных событий канцерогенеза [3-5].

Эти три основных признака опухолевой клетки (скорость пролиферации, уровень апоптоза и уровень дифференцировки) тесно связаны между собой. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимосвязи между этими процессами, является важным и перспективным направлением исследований в современной молекулярной биологии и онкологии. С их помощью могут быть расширены представления о взаимосвязи фундаментальных клеточных процессов и открыты новые мишени для лекарственной терапии, а также разработаны принципиально новые подходы к лечению рака.

В последние годы во всем мире наблюдается рост частоты возникновения гепатоцеллюлярных карцином (ГК) - наиболее часто встречающегося вида опухолей печени и одной из наиболее распространенных форм рака. Ежегодно в мире выявляются до 1 ООО ООО новых больных с диагнозом ГК [7, 8]. В некоторых регионах ГК являются основной причиной смертности от новообразований.

К факторам риска для возникновения ГК следует отнести вирусы гепатита В или С (НВУ или НСУ), ряд химических канцерогенов, цирроз печени любого происхождения и некоторые другие факторы [7, 9]. Быстрое распространение вирусов НВУ и НСУ ведет к увеличению частоты встречаемости ГК в мире. Изучение процессов, лежащих в основе появления ГК, привело к выявлению ряда генов, участвующих в возникновении и развитии этой патологии. К ним можно отнести гены, кодирующие факторы роста (Трансформирующий фактор роста ТвРа и -0, фактор роста гепатоцитов НОР и др.), их рецепторы, опухолевые супрессоры (р53 и рШэ и др.), молекулы межклеточных контактов и адгезии [10].

ГК в течение длительного времени являются моделью для изучения как общих, так и ткане-специф ических механизмов канцерогенеза. В этом типе опухолей было открыто явление ре-экспрессии эмбрио-специфических белков [11] и первый из онкоэмбриональных маркеров - альфа-фетопротеин (АФП) [12-14].

Накопленный массив данных о механизме контроля уровня дифференцировки, пролиферации и апоптоза делает ГК интересным объектом для изучения способов взаимодействия между этими процессами.

Недавно было показано, что прогрессия ГК может быть связана с нарушением функции гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), которые являются одними из основных регуляторов экспрессии генов, специфичных для печени [15, 16]. Важнейшим из ГЯФ во взрослой печени представляется ядерный рецептор гепатоцитарного ядерного фактора (1ЮТ4а1) [17]. Показана его связь с уровнем дифференцировки в ГК [18], но остается нерешенным вопрос о его связи с общими механизмами контроля уровня пролиферации и апоптоза.

Цитокины семейства ТСРР являются одними из основных кандидатов на роль связующего звена между печень-специфическими и общими сигнальными путями, задействованными в процессе канцерогенеза. Показано, что члены этого семейства участвуют в поддержании дифференцировочного статуса, а также в контроле пролиферации и апоптоза, как в печени, так и в других органах [19-22].

Данные о роли ТСРР в канцерогенезе противоречивы. ТСР01 был открыт как фактор, стимулирующий рост опухолей, но в дальнейшем было показано, что ТСБр! ингибирует рост и развитие многих типов опухолей [19]. В последнее время выяснилось, что эффект ТСРР зависит от стадии канцерогенеза и особенностей исходной ткани, из которой произошла опухоль [20,22,23].

Для изучения факторов, контролирующих апоптоз и пролиферацию, и их связи с уровнем дифференцировки опухолей мы использовали уникальную модель одноступенчатой прогрессии ГК, полученную и охарактеризованную в нашей лаборатории [24, 25], а также коллекцию независимо индуцированных ГК мышей с различным уровнем дифференцировки для проверки универсальности полученных результатов.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в поиске факторов, ответственных за различие в скорости пролиферации и уровня апоптоза между опухолями печени с различным уровнем дифференцировки, составляющими модель одноступенчатой прогрессии ГК. В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Изучение влияния HNF 4а1 на уровень пролиферации и апоптоза в ГК.

2. Анализ изменений экспрессии генов, участвующих в контроле пролиферации и апоптоза, при одноступенчатой прогрессии ГК.

3. Проверка универсальности выявленных закономерностей на панели независимо индуцированных ГК мышей с разным уровнем дифференцировки.

4. Идентификация фактора, ответственного за усиление пролиферации и снижение уровня апоптоза в ходе одноступенчатой прогрессии ГК.

5. Описание эффектов инактивации этого фактора на скорость роста ГК in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В течение длительного времени исследования генетических основ прогрессии ГК были сфокусированы на изучении функции основных клеточных онкогенов и антионкогенов в ходе гепатоканцерогенеза. В данной работе показано, что экспрессия гена гепато-специфического транскрипционного фактора HNF4al приводит к подавлению роста ГК, как in vitro, так и in vivo.

С другой стороны мы обнаружили, что клетки дедифференцированной высокозлокачественной. ГК секретируют фактор TGFP2, стимулирующий их пролиферацию и обладающий выраженным анти-апоптотическим эффектом.

Было показано, что в ходе прогрессии ГК, а так же при дедифференцировке нормальных мышиных гепатоцитов в культуре наблюдается гиперэкспрессия этого цитокина. Выявленная закономерность, скорее всего, носит универсальный характер, так как она была подтверждена в ходе исследований коллекции независимо индуцированных ГК с различным уровнем дифференцировки. Гиперэкспрессия TGFP2 сопровождается активацией многих TGFP респонсивных генов.

Впервые показана способность членов семейства TGFß (TGFßi, TGFß2) подавлять активацию р53. Можно предполагать, что этот эффект лежит в основе анти-апоптотического действия TGFß2

В работе продемонстрировано, что инактивация TGFß2 приводит к подавлению скорости пролиферации клеток и снижает скорость роста ГК у экспериментальных животных.

Изучение механизмов прогрессии опухолей печени относится к числу фундаментальных проблем современной онкологии и может способствовать разработке новых методов терапии злокачественных новообразований. В ходе работы выявлены потенциальные прогностические маркеры (TGFß2, фибронектин, Tbi68, TGIF) и мишени для терапии (TGFß2) ГК.

Апробация работы.

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 9 октября 2003 года. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались на 1 конференции Европейской организации естествоиспытателей (Женева, 2000), 16, 17 и 18 конференциях Европейского общества исследователей рака (Халкидики, 2000; Гранада, 2002; Иннсбрук, 2004), 11 конференции Европейских раковых организаций (Лиссабон, 2001), конференциях «Механизмы дифференцировки и патогенеза печени» Федерации американских обществ экспериментальной биологии (Колорадо, 2000 и 2002) и на ученых советах НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях и 9 тезисов международных конференций.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит 22 рисунка, 6 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 307 источников, в том числе 17 в отечественных рецензируемых изданиях.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Овчинников, Дмитрий Александрович

выводы.

1. Показан противоопухолевый и антипролиферативный эффект ре-экспрессии HNF4al в гепатокарциномах мышей.

2. В системе одноступенчатой прогрессии ГК выявлена активация TGFP сигнального пути и усиление транскрипции ряда респонсивных генов.

3. Впервые описана гиперэкспрессия гена TGFP2 в культуре нормальных мышиных гепатоцитов и при прогрессии опухолей печени.

4. Выявленные закономерности подтверждены при анализе независимо индуцированных ПС мышей с различным уровнем дифференцировки.

5. Описан цитопротективный и антиапоптотический эффект продукции TGFP2 на трансформированные клетки.

6. Впервые показана способность TGFP2 ингибировать транс-активационные свойства р53.

7. Инактивация TGFP2 в клетках дедифференцированной ПС приводит к снижению скорости пролиферации клеток в культуре и замедлению роста опухоли in vivo.

Заключение.

На модели одноступенчатой прогрессии ГК нами ранее было показано, что в основе целого ряда изменений, приводящих к развитию высоко злокачественного фенотипа ПС, лежит снижение уровня экспрессии основного транскрипционного регулятора генов печени — HNF4al. Подавление транскрипции HNF4al приводит к утрате эпителиальной морфологии и подавлению синтеза многих дифференцировочных маркеров.

В этой работе мы показали, что ре-экспрессия HNF4al в культуре клеток низкодифференцированной ПС помимо частичной реверсии уровня дифференцировки и морфологических свойств опухоли, приводит к значительному снижению ростового потенциала трансформированных клеток in vivo и in vitro. Согласно нашим данным, одной из причин снижения скорости роста при ре-экспрессии HNF4al является замедление пролиферации в два раза по сравнению с контрольными клетками. Это первое указание на то, что нарушение функции гепато-специфических транскрипционных регуляторов может стать причиной изменения пролиферационного статуса трансформированных гепатоцитов.

Мы показали, что в 6ГК и культуре ее клеток наблюдается активация TGFP-зависимого сигнального пути, вызванная гиперэкспрессией TGFP2. Мы установили, что снижение уровня дифференцировки, наблюдаемое при нарушении межклеточных контактов или контактов клетка-ВКМ (в первичной культуре НМГ), или в процессе гепатоканцерогенеза (панель ПС с различным уровнем дифференцировки), приводит к активации транскрипции гена TGFP2, но не TGFPi. Следствием активации экспрессии TGFp2 в дедифференцированных ПС стало усиление транскрипции ряда TGFP-респонсивных генов, некоторые из которых могут способствовать ускорению роста ПС.

Мы установили, что TGFP2, секретируемый клетками ЮЗ в среду культивирования, может оказывать цитопротективный и антиапоптотический эффект на трансформированные клетки различной видовой и тканевой специфичности. В основе антиапоптотического эффекта, оказываемого TGFP2 на клеточные культуры, согласно нашим данным, лежит подавление транс-активационных свойств опухолевого супрессора р53. Подобный эффект TGFP2 ранее не был описан.

С помощью метода РНК интерференции мы подавили синтез TGFp2 в клетках НЗЗ. В полученных клонах H33-mhTGFP2 подавление синтеза TGFP2 привело к снижению экспрессии ряда генов-мишеней, а также к замедлению роста ПС in vitro и in vivo.

Таким образом, в ходе одноступенчатой прогрессии ГК наряду с репрессией гена HNF4al наблюдается усиление ростовых характеристик опухолей. Мы продемонстрировали, что транскрипция HNF4al влияет на скорость роста ГК in vitro и in vivo, но вопрос о механизмах такого влияния не был однозначно решен в ходе нашей работы. Хотя наше предположение о том, что гиперэкспрессия гена TGF02 в дедифференцированных ГК способствует ускорению их роста, подтвердилась, проведенные исследования не дали однозначного ответа на вопрос, связаны ли между собой активация TGFP сигнального пути и подавление экспрессии HNF4al в ходе прогрессии ГК. В клонах H33-mhTGFP2 мы не обнаружили восстановления синтеза мРНК этого гена, но возможно, что уровень подавления синтеза TGFP2 в НЗЗ был не достаточен для pe-активации экспрессии HNF4al. Мы рассчитываем, что разработка и использование более эффективных механизмов инактивации синтеза TGFP2 помогут получить однозначный ответ на этот вопрос.

Два новых вопроса, появившихся в ходе нашей работы, остались не решенными. Различаются ли сигнальные пути и эффекты, индуцируемые TGFPi и TGFP2, и каким образом активация TGFP-сигнального пути приводит к подавлению транс-активационных способностей р53? Хотя ответ на эти вопросы выходит за рамки исследования механизмов прогрессии ГК, они, безусловно, представляют большое фундаментальное значение и будут решены в ходе дальнейших исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Овчинников, Дмитрий Александрович, 2004 год

1. Faber, Е., The sequental analysis of liver cancer induction. Biochem Biophys Acta, 1980. 605: p. 149-166.

2. Pitot, H. and Y. Dragan, Facts and theories concerning the mechanisms of carcinogenesis. FASEB J., 1991. 5: p. 2280-6.

3. Hahn, W. and R.A. Weinberg, Rules for making human tumor cells. N Engl J Med, 2002. 347(20): p. 1593-1603.

4. Копнин, Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманиюь базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия, 2000. 65(1): р. 5-33.

5. Hanahan, D. and R.A. Weinberg, The Hallmarks of Cancer. Cell, 2000. 100: p. 57-70.

6. Абелев, Г.И. Опухолевый рост как проблема биологии развития, ed. В.И. Гелыптейн. 1979, Москва: Наука. 148-173.

7. Feitelson, М.А., В. Sun, N.L. Satiroglu Tufan, J. Liu, J. Pan, and Z. Lian, Genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis. Oncogene, 2002. 21(16): p. 2593-604.

8. Заридзе, Д.Г. Этиология, эпидемиология и патогенез злокачественных опухолей. Справочник по онкологии. Н.Н. Трапезников, Editor. 1996, КАППА: Москва, р. 425.

9. Лазаревич, Н.Л. Молекулярные механизмы прогрессии опухолей печени. Успехи биологической химии, 2004. 44: р. в печати.

10. Buendia, М.А., Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Cancer Biol, 2000. 10(3): p. 185-200.

11. Абелев, Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост. Биохимия, 2000. 65(1): р. 127-38.

12. Abelev, G.I., Alpha-fetoprotein biology. Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol., 1993.11: p. 85-109.

13. Abelev, G.I., S. Perova, N.I. Khramkova, Z.A. Postnikova, and I. Irlin, Production of embrional alpha-globulin by the transplantable mouse hepatomas. Transplant. Bull, 1963. 1: p. 174-180.

14. Комов, Д.В. Опухоли печени, Справочник по онкологии. Н.Н. Трапезников, Editor. * 1996, КАППА: Москва, р. 275-293.

15. Spath, G.F. and M.C. Weiss, Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells. J Cell Biol, 1998. 140(4): p. 935-46.

16. Duncan, S. A., Mechanisms controlling early development of the liver. Mech Dev, 2003. 120(1): p. 19-33.

17. Massague, J., TGF-beta signal transduction. Annu Rev Biochem, 1998. 67: p. 753-91.

18. Derynck, R., R.J. Akhurst, and A. Balmain, TGF-b signaling in tumor suppression and cancer progression. Nat Genet, 2001. 29: p. 117-29.

19. Piek, E. and A.B. Roberts, Suppressor and oncogenic roles of transforming growth factor-b and its signaling pathways in tumorigenesis. Advances in cancer research, 2001. 83: p. 1-53.

20. Bissell, D.M., D. Roulot, and J. George, Transforming growth factor b and the liver. Hepatology, 2001.34(5): p. 859-67.23