Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата "Бефунгин" тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат фармацевтических наук Калашникова, Екатерина Александровна

• Калашникова, Екатерина Александровна
• кандидат фармацевтических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Калашникова, Екатерина Александровна

Бефунгин» (Обзор литературы)

1.1. Общая характеристика чаги, её биологическая роль и использование в медицине

1.2. Влияние химического состава чаги на механизм фармакологического действия

1.3. Методы анализа действующих веществ чаги

1.4. Получение и анализ лекарственного препарата "Бефунгин"

1.5. Методы элементного анализа

1.6. Методы идентификации и количественного определения ионов кобальта

1.6.1. Методы идентификации

1.6.2. Методы количественного определения ионов кобальта 31 Заключение по обзору литературы 35 Экспериментальная часть 37 Объекты и методы исследования

Глава 2. Изучение химического состава чаги 39 2.1. Исследование хромогенного комплекса чаги

2.1.1. Установление оптимальных условий гидролиза хромогенного комплекса чаги и разделения полученного гидролизата на фракции

2.1.2. Исследование фенольной фракции хромогенного комплекса чаги методом ТСХ

2.1.3. Идентификация фенолов, содержащихся в хромогенном комплексе чаги с помощью химических реакций

2.1.4. Идентификация фенолов, содержащихся в хромогенном комплексе чаги методом непосредственной спектрофотометрии

2.1.5. Исследование кислотной фракции хромогенного комплекса чаги методом ТСХ

2.1.6. Идентификация флавоноидов хромогенного комплекса чаги

2.1.7. Исследование флавоноидной фракции хромогенного комплекса чаги методом спектрофотометрии

2.1.8. Хроматографическое изучение водной фракции из гидролизата хромогенного комплекса чаги

2.2. Анализ водного раствора чаги после осаждения хромогенного комплекса методами бумажной и тонкослойной хроматографии

2.2.1. Анализ свободных фенолов в сырье чаги

2.2.1.1. Идентификация свободных фенолов, содержащихся в чаге с помощью химических реакций

2.2.1.2. Разработка условий хроматографического анализа свободных фенолов, содержащихся в сырье чаги

2.2.1.3. Определение свободных фенолов методом непосредственной спектрофотометрии в сырье чаги

2.2.2. Анализ свободных углеводов в сырье чаги 62 2.2.2.1. Идентификация свободных углеводов, содержащихся в чаге с помощью химических реакций

2.2.3. Идентификация биологически активных веществ, содержащихся в чаге

2.3. Количественное определение фенолов в сырье чаги

2.3.1. Количественное определение связанных фенолов, содержащихся в сырье чаги

2.3.2. Количественное определение свободных фенолов в сырье

2.4. Количественное определение углеводов в сырье чаги

2.4.1. Количественное определение связанных углеводов, содержащихся в хромогенном комплексе чаги

2.4.2. Определение содержания свободных углеводов в сырье чаги 72 2.5. Определение элементов в чаге методом эмиссионного спектрального анализа 74 Выводы по главе

Глава 3. Изучение химического состава и стандартизация бефунгина по биологически активным компонентам 77 3.1. Изучение хромогенного комплекса бефунгина

3.1.1. Разработка условий выделения, гидролиза и разделения гидролизата хромогенного комплекса бефунгина

3.1.2. Изучение хлороформной фракции методом спектрофотометрии

3.1.3. Анализ фенольной фракции хромогенного комплекса бефунгина

3.1.3.1. Идентификация фенолов, содержащихся в хромогенном комплексе бефунгина, с помощью метода тонкослойной хроматографии и химических реакций

3.1.3.2. Количественное определение фенолов, содержащихся в хромогенном комплексе бефунгина

3.1.4. Изучение кислотной фракции хромогенного комплекса бефунгина методом тонкослойной хроматографии

3.1.5. Исследование кислотной фракции хромогенного комплекса бефунгина методом ВЭЖХ

3.1.6. Исследование флавоноидной фракции хромогенного комплекса бефунгина методом ТСХ

3.1.7. Исследование флавоноидной фракции хромогенного комплекса бефунгина методом спектрофотометрии

3.1.8. Исследование водной фракции хромогенного комплекса бефунгина методом тонкослойной хроматографии

3.2. Анализ водного раствора бефунгина после осаждения хромогенного комплекса методами бумажной и тонкослойной хроматографии

3.3. Анализ биологически активных веществ, находящихся в бефунгине в несвязанном в хромогенный комплекс состоянии

3.3.1. Идентификация свободных фенолов в бефунгине

3.3.2. Количественное определение свободных фенолов в бефунгине

3.3.3. Идентификация свободных углеводов в бефунгине

3.3.4. Количественное определение углеводов в бефунгине

3.4. Определение макро- и микроэлементов, содержащихся в бефунгине 112 Выводы по главе

Глава 4. Идентификация и количественное определение ионов кобальта в лекарственном препарате «Бефунгнн»

4.1. Разработка методик идентификации ионов кобальта в бефунгине

4.2. Обоснование выбора метода количественного определения ионов кобальта в бефунгине

4.3. Спектральные характеристики комплексного соединения ионов кобальта с 1 -нитрозо-2-нафтолом

4.4. Исследование условий образования комплексного соединения ионов кобальта бефунгина с 1-нитрозо-2-нафтолом

4.4.1. Изучение условий извлечения кобальта из бефунгина

4.4.2. Изучение условий экстракции комплекса кобальта с 1-нитрозо-2-нафтолом

4.4.2.1. Выбор оптимального значения рН и концентрации реактива

4.4.2.2. Изучение зависимости экстрагирования комплекса от порядка прибавления компонентов, кратности и продолжительности экстрагирования

4.4.2.3. Продолжительность контакта фаз

4.4.2.4. Устойчивость хлороформных экстрактов. Интенсивность перемешивания

4.5. Изучение распределения экстрагируемых продуктов в водной и органической фазах

4.6. Определение состава и устойчивости комплекса ионов кобальта с 1-нитрозо-2-нафтолом

4.7. Разработка методики количественного определения солей кобальта в бефунгине 136 Выводы по главе 4 140 Общие выводы 141 Литература

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата "Бефунгин"»

Актуальность темы. Лекарственные препараты из растительного сырья находят широкое применение в медицине при лечении различных заболеваний, что обусловлено их малой токсичностью и высокой биологической активностью. В связи с возрастающей потребностью здравоохранения в лекарственных препаратах растительного происхождения, на первый план в настоящее время выходят проблемы их стандартизации. Они отличаются сложностью химического состава растений, необходимостью выделения комплекса биологически активных веществ, его разделения на отдельные компоненты, многие из которых весьма лабильны. Важнейшей особенностью является непостоянство состава, обусловленное, прежде всего, качеством лекарственного растительного сырья.

Точные сведения о химическом составе лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов позволяют проводить разработку достоверных методов для их стандартизации — как с помощью качественных реакций, используемых для испытания подлинности, так и для количественного определения биологически активных веществ. Возможности достоверной идентификации зависят от наличия стандартных образцов определяемых соединений, число которых ограничено наиболее распространёнными и, следовательно, доступными веществами.

Всё это относится к берёзовому грибу (чаге) и получаемому из него лекарственному препарату "Бефунгин", которые находят широкое применение в народной и традиционной медицине при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта и злокачественных новообразований. Недостаточно изученные соединения, содержащиеся в чаге, принадлежат к разнообразным группам биологически активных веществ, таких как фенолы, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, углеводы и др.

Фармакопейная статья на лекарственное растительное сырьё чаги (ГФ XI) предусматривает его стандартизацию лишь по таким показателям, как сухой остаток, влага, зола, содержание примесей, что не позволяет дать объективную оценку качества сырья по фармакологически активным компонентам.

Стандартизацию бефунгина в соответствии с ФС 42-3291-96 проводят по хромогенному комплексу, кроме которого нормируют содержание солей кобальта, вводимых в лекарственный препарат дополнительно. Методики идентификации солей кобальта предусматривают предварительное выпаривание, сжигание и прокаливание лекарственного препарата, что требует значительных затрат времени. Для количественного определения солей кобальта используют метод непосредственной спектрофотометрии. Однако рекомендуемая методика трудно воспроизводима.

В связи с этим актуальными являются исследования в области поиска . новых способов анализа отдельных групп биологически активных веществ, содержащихся в чаге и бефунгине, которые обусловливают их фармакологическое действие, а так же необходимость разработки экспрессных методик идентификации и количественного определения солей кобальта в бефунгине.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось изучение химического состава чаги и лекарственного препарата "Бефунгин" для совершенствования их стандартизации, выбор оптимальных условий для разработки экспрессных методик идентификации и количественного определения биологически активных веществ, а также совершенствование способов анализа солей кобальта, содержащихся в бефунгине.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать химический состав и идентифицировать биологически активные соединения и микроэлементы, содержащиеся в грибе чага и лекарственном препарате "Бефунгин".

2. Изучить состав хромогенного комплекса чаги: фракции фенолов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, углеводов.

3. Идентифицировать биологически активные вещества, содержащиеся в чаге и бефунгине в несвязанном состоянии.

4. Установить какие группы биологически активных веществ переходит из сырья в бефунгин при производстве лекарственного препарата.

5. Разработать методики идентификации и количественного определения биологически активных веществ, содержащихся в сырье чаги и бефунгине.

6. Осуществить выбор оптимальных методик качественного и количественного анализа ионов кобальта в бефунгине.

7. Предложить оптимальные методики стандартизации бефунгина по основным биологически активным веществам.

Научная новизна. Исследован химический состав и идентифицированы биологически активные вещества, содержащиеся в чаге и бефунгине, как в составе хромогенного комплекса, так и в свободном виде. Установлено, какие группы веществ переходят в бефунгин при его производстве из сырья чаги.

Изучена возможность использования методов планарной хроматографии, ВЭЖХ, спектрофотометрии и качественных химических реакций для идентификации фенолов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, углеводов, содержащихся в сырье чаги и лекарственном препарате "Бефунгин".

Осуществлён выбор оптимальных фотометрических методик для количественного определения фенолов и углеводов, содержащихся в чаге и бефунгине, как в связанном (в составе хромогенного комплекса) так и в свободном состоянии. Выбор этих групп биологически активных веществ для стандартизации лекарственного растительного сырья чаги и бефунгина основан на том, что согласно литературным данным фармакологическая активность чаги обусловлена присутствием различных групп веществ, в том числе хромогенного комплекса и по одной из версий, фенолами. Углеводы, улучшая растворимость полифенольных комплексов в водных растворах (к которым относится и хромогенный комплекс), потенцируют их фармакологическое действие. Кроме того, эти группы веществ относятся к легко окисляемым, и их содержание в процессе хранения уменьшается, что позволяет контролировать качество сырья чаги и лекарственных препаратов на его основе.

Усовершенствованы методики идентификации ионов кобальта в бефунгине, установлены условия выполнения анализа, не требующие озоления лекарственного препарата. Изучены оптимальные условия образования и экстракции комплексного соединения ионов кобальта с 1-нитрозо-2-нафтолом. Установлено, что биологически активные вещества, содержащиеся в бефунгине, не оказывают влияния на образование и устойчивость образующегося комплекса. Проведённые исследования позволили разработать экстракционно-фотометрическую методику количественного определения, позволяющую достоверно определять содержание хлорида кобальта в лекарственном препарате "Бефунгин".

Практическая значимость результатов исследования. На основе проведённых исследований разработаны методики идентификации и количественного определения основных групп биологически активных веществ, содержащихся в чаге и бефунгине, обусловливающих фармакологическое действие. Предложены методики идентификации и количественного определения ионов кобальта в бефунгине. Методики характеризуются простотой выполнения, экспрессностью, высокой чувствительностью и позволяют достоверно оценивать качество исследуемого лекарственного сырья и лекарственного препарата. Проанализированы несколько серий сырья и бефунгина производства Ярославской фармацевтической фабрики и установлены нормы содержания фенолов и углеводов, входящих в состав хромогенного комплекса, а так же свободных фенолов и углеводов, содержащихся в сырье и лекарственном препарате.

Внедрение результатов исследования в практику. Работа выполнялась по договору №1 от 23.04.2002 г. с ЗАО "Ярославская фармацевтическая фабрика". На основании результатов исследования совместно с Ярославской фармацевтической фабрикой разработан и представлен в Фармакопейный государственный комитет проект ФСП на "Бефунгин". Имеются акты внедрения. Разработан и передан заказчику проект ведомости изменений ФС на сырьё чаги, позволяющий оценивать его качество по некоторым биологически активным веществам.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных научно-практических конференциях по фармакологии, фармации и подготовке кадров (г. Пятигорск, 2002-2003 гг.), и на конкурсе молодых ученых, в рамках IX национального конгресса "Человек и лекарство" (Москва, 2002 г.).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских наук ПятГФА (номер государственной регистрации 01.2.00101061) в рамках проблемы "Фармация" секции №38 Ученого совета МЗ РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц, 28 рисунков, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 154 источника, в том числе 46 иностранных, и приложения.

В первой главе диссертации обобщены данные литературы по химическому составу чаги и бефунгина, описаны методы анализа основных групп биологически активных веществ, содержащихся в чаге, а так же особенности фармакологического действия чаги и бефунгина.

Во второй главе приведены результаты исследований по изучению химического состава чаги, как компонентов, входящих в состав хромогенного комплекса, так и биологически активных веществ, существующих в свободном состоянии.

Третья глава посвящена исследованиям по стандартизации и разработке норм качества лекарственного препарата "Бефунгин".

Четвёртая глава содержит экспериментальный материал по разработке методик идентификации, выбору условий выделения и количественного определения солей кобальта в бефунгине.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты исследования химического состава сырья чаги и лекарственного препарата "Бефунгин", оптимальных методов контроля их качества и стандартизации.

2. Методы стандартизации лекарственного препарата "Бефунгин", по некоторым содержащимся в нём биологически активным веществам.

3. Изучение условий и разработка методик качественного и количественного анализа ионов кобальта, содержащихся в бефунгине.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ й

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Калашникова, Екатерина Александровна

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Исследованы условия выделения и гидролиза хромогенного комплекса из сырья чаги и лекарственного препарата "Бефунгин", а также условия разделения полученного гидролизата на фракции фенолов, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов и углеводов.

2. Изучен состав хромогенного комплекса чаги и бефунгина и разработаны методики идентификации, содержащихся в них фенолов, кислот и флавоноидов методами тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии.

3. Показана возможность использования метода ВЭЖХ для идентификации фенолкарбоновых кислот, содержащихся в хромогенном комплексе бефунгина.

4. Выбраны условия выделения "свободных" фенолов и углеводов из чаги и бефунгина и проведена их идентификация с помощью химических реакций, хроматографических методов и УФ спектрофотометрии.

5. Разработаны методики количественного определения "свободных" фенолов и фенолов, содержащихся в хромогенном комплексе чаги и в бефунгине методом спектрофотометрии. Относительная погрешность определения не превышает ±3%.

6. Определение количественного содержания "связанных" и "свободных" углеводов, содержащихся в чаге и бефунгине, проведено фотометрическим фенол - сернокислотным методом. Относительная погрешность определения не превышает ±3%.

7. Установлено, что из чаги при производстве бефунгина извлекаются фенолы, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, углеводы.

8. Проведено исследование элементного состава чаги и бефунгина методом эмиссионного спектрального анализа.

9. Усовершенствованы методики идентификации ионов кобальта в бефунгине, характеризующиеся ярко выраженным аналитическим эффектом и не требующие предварительного озоления лекарственного препарата.

10. Методами изомолярных серий и молярных отношений («насыщения») изучен состав комплексного соединения ионов кобальта и 1-нитрозо-2-нафтола в присутствии биологически активных веществ. Рассчитана константа устойчивости комплекса (5,54-Ю10) свидетельствующая об образовании прочного комплекса.

11. Разработана экстракционно-фотометрическая методика количественного определения хлорида кобальта в бефунгине. Методика не отягчена систематической ошибкой, хорошо воспроизводима и позволяет определять содержание хлорида кобальта в лекарственном препарате бефунгин, с относительной погрешностью определения ±1,9%.

143

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Берёзовый гриб чага и полученные из него лекарственные препараты находят широкое применение в медицинской практике при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также злокачественных новообразований. О целесообразности использования для лечения онкологических заболеваний особенно убедительно говорит то, что при продолжительном применении они хорошо переносятся, не вызывая токсических явлений, что выгодно отличает их от химиотерапевтических противоопухолевых препаратов.

Чага содержит различные группы биологически активных веществ: фенолы, флавоноиды, карбоновые кислоты, птерины, стерины, углеводы, аминокислоты, макро- и микроэлементы. Для анализа данных соединений используются различные физико-химические методы. Тем не менее, фармакопейная статья на лекарственное растительное сырьё чаги предусматривает его стандартизацию лишь по таким показателям как сухой остаток, влага, зола, содержание примесей, что не позволяет дать объективную оценку качества сырья.

Стандартизацию бефунгина проводят по сумме действующих веществ, определяя сухой остаток, что не даёт точного представления о его качестве. Многокомпонентность химического состава и его непостоянство, обусловленное прежде всего вариациями качества исходного сырья, а также низкие концентрации действующих веществ приводят к объективным сложностям стандартизации лекарственного препарата — «Бефунгин». В связи с этим актуальными являются исследования в области разработки новых методик анализа отдельных групп действующих веществ, содержащихся в чаге и бефунгине, которые обусловливают их фармакологическое действие.

Для идентификации и количественного определения ионов кобальта используются различные титриметрические, гравиметрические и физико-химические методы. Существующие методики идентификации и количественного определения ионов кобальта, содержащихся в бефунгине, трудоёмки и длительны. Поэтому актуальной является проблема совершенствования методик анализа ионов кобальта в бефунгине, не требующих озоления лекарственного препарата и позволяющих достоверно определять в нём соли кобальта.

Поскольку фармакологическое действие бефунгина обусловливают различные группы органических соединений, для оценки качества этого лекарственного препарата необходима разработка методик анализа, основанных на идентификации и количественном определении тех из них, которые проявляют наибольшую активность (фенолов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили гриб чага, лекарственный препарат "Бефунгин" производства «ЗАО» Ярославская фармацевтическая фабрика.

Для проведения анализа химическими и физико-химическими методами использовали реактивы и растворители марки "ХЧ" и "ЧДА", удовлетворяющие требованиям ГФ XI издания.

В качестве растворителей использовали воду очищенную, спирт этиловый 96%, хлороформ (ТУ 2631-066-44493179-01), этилацетат (ГОСТ 22300-76), бутанол (ГОСТ 6006-78).

В работе использованы аналитические весы марки Т-А-13.

Спектры поглощения растворов измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм.

Фотоколориметрическое определение проводили на приборе КФК-3 в, кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм.

Спектральный анализ проводили на кварцевом»'спектрографе ДФС-8 в лаборатории спектрального анализа ФГУП «Кавказгеолсъёмка».

Потенциометрическое определение проводили на рН метре марки "Checker".

Хроматографические исследования в тонких слоях сорбента проводили с использованием готовых пластинок "Сорбфил" марки ПТСХ-П-УФ и ПТСХ-АФ-А производства АО "Сорбполимер", г. Краснодар.

Для идентификации веществ на хроматографических пластинках использовали денситометр "DenScan" LTD 400.00.00 ТУ 4436-011-275366682000.

В качестве стандартных образцов использовали препараты, соответствующие НД.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на жидкостном хроматографе "Милихром - 5" с УФ детектором и использованием колонки КАХ 6-80-4 0 2x80 мм, заполненной сорбентом диасорб Ci6.

Все использованные приборы ежегодно проходили метрологическую поверку, а в ходе выполнения работы подвергались соответствующей калибровке.

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1, с. 199-252.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ЧАГИ

Как следует из обзора литературы, фармакологическая активность чаги обусловлена наличием комплекса биологически активных веществ различной химической природы, существующих как в свободном, так и в связанном состоянии: фенолами, углеводами, флавоноидами, фенолкарбоновыми кислотами и др. Стандартизацию лекарственного сырья чаги проводят по сухому остатку, что не даёт точного представления как о химическом составе, так и о его качестве [3].

В настоящее время при анализе лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов используются химические и физико-химические методы, среди которых наибольшее распространение получили хроматографические и фотометрические методы.

Одной из задач нашего исследования являлось изучение химического состава чаги, так как он изучен недостаточно и отсутствуют методики контроля качества сырья по биологически активным компонентам.

Биологически активные вещества в сырье чаги могут содержаться как в свободном состоянии, так и виде различных комплексов, одним из которых является хромогенный комплекс. Нами были проведены исследования как хромогенного комплекса чаги, так и некоторых групп биологически активных веществ, находящихся в водном извлечении в несвязанном состоянии (свободных).

2.1. Исследование хромогенного комплекса чаги 2.1.1. Установление оптимальных условий гидролиза хромогенного комплекса чаги и разделения полученного гидролизата на фракции

Для химического изучения биологически активных веществ, входящих в состав чаги, предварительно получали водное извлечение из гриба по методике, рекомендуемой фармакопейной статьёй на сырьё чаги (ГФ XI) [3]: помещали 10 г сырья в термостойкую колбу вместимостью 500 мл, заливали 300 мл воды и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Затем колбу соединяли с обратным холодильником и кипятили на электрической плитке, поддерживая слабое кипение в течение 2 часов. После этого водное извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 500 мл, сырьё переносили на фильтр и промывали тёплой водой. Водное извлечение в колбе охлаждали до температуры 18-20°, доводили водой до метки и тщательно перемешивали.

Водное извлечение представляло собой жидкость тёмно-коричневого цвета со слабым запахом и горьковатым вкусом.

Далее из водного извлечения проводили выделение и гидролиз хромогенного комплекса.

На основании литературных данных [49,53,55] гидролиз хромогенного комплекса проводили раствором хлористоводородной кислоты в автоклаве под давлением 121,59 кПа. Для этого к 50 мл полученного извлечения прибавляли 5 мл разведённой хлористоводородной кислоты, образовавшийся осадок фильтровали через бумажный фильтр и переносили в термостойкую колбу вместимостью 25 мл. Затем к осадку прибавляли 10 мл разведённой хлористоводородной кислоты, закрывали плотно крышкой и автоклавировали в течение двух часов. По окончании гидролиза, пробу, состоящую из жидкой части и нерастворимого осадка фильтровали через бумажный фильтр, осадок промывали водой очищенной, и промывные воды присоединяли к фильтрату. Полученный фильтрат нейтрализовывали раствором гидроксида натрия до рН 6,0, переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили водой до метки.

В полученном гидролизате предположительно должны содержаться фенолы, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, углеводы [55]. Разделение суммы этих биологически активных веществ возможно с помощью многоступенчатой экстракции.

Условия экстрагирования зависят от свойств веществ. Одним из существенных факторов является рН водного раствора.

Фенолы представляют собой очень слабые кислоты, поэтому их экстракция существенно зависит от рН водной фазы. С уменьшением концентрации водородных ионов (рН>7) в растворе присутствуют феноляты. При увеличении концентрации водородных ионов равновесие смещается в сторону образования неионизированных молекул фенола [146]. Учитывая это обстоятельство, и была проведена нейтрализация гидролизата хромогенного комплекса до рН 6, что позволило провести экстракцию фенольных соединений органическими растворителями [146].

Для выделения из гидролизата фракций, содержащих фенолы, фенолкарбоновые кислоты и флавоноиды, 25 мл гидролизата переносили в делительную воронку и трижды экстрагировали хлороформом по 10,10 и 5 мл. Полноту экстракции фенолов контролировали спектрофотометрически. Хлороформные извлечения пропускали через безводный сульфат натрия, объединяли и доводили до метки хлороформом в мерной колбе вместимостью 25 мл.

В хлороформном извлечении наряду с фенолами должны находиться и фенолокислоты [55]. Их разделение проводили следующим образом: хлороформную фракцию переносили в делительную воронку и встряхивали с 25 мл 5% раствора гидрокарбоната натрия. В данных условиях в хлороформном растворе оставались фенолы (фенольная фракция), а в водный раствор переходили кислоты [55]. В дальнейшем водное извлечение, отделённое от хлороформного, подкисляли разведённой хлористоводородной кислотой до рН 2 - для перевода натриевых солей фенолокислот в кислоты, которые вновь экстрагировали хлороформом. Полноту экстракции кислот контролировали хроматографически. Хлороформное извлечение, содержащее кислоты, пропускали через безводный сульфат натрия, переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили хлороформом до метки (кислотная фракция).

Согласно литературным данным [150] оптимальным экстрагентом для флавоноидов является этилацетат, поэтому к оставшейся после экстрагирования фенолов водной фазе прибавляли 25 мл этилацетата и экстрагировали в течение 5 минут. После расслоения фаз этилацетатную фракцию отделяли и доводили до метки этилацетатом в мерной колбе вместимостью 25 мл (флавоноидная фракция). Полноту экстракции флавоноидов контролировали хроматографически.

Согласно литературным данным в гидролизате после извлечения из него фенолов, фенолокислот и флавоноидов остаются углеводы [55] (водная фракция).

Таким образом, нами были получены хлороформная, этилацетатная и водная фракции, содержащие предположительно фенолы, фенолокислоты, флавоноиды и углеводы. В дальнейшем были проведены исследования каждой из этих фракций для идентификации выше перечисленных биологически активных веществ.

2.1.2. Исследование фенольной фракции хромогенного комплекса чаги методом ТСХ

Нами изучена возможность использования хроматографии в тонком слое сорбента для идентификации и разделения суммы связанных фенолов, содержащихся в хромогенном комплексе чаги. В качестве свидетелей использовали рабочие стандартные образцы резорцина (ФС 42-3267-96) и пирокатехина (ТУ 6-09-4025-83). Хроматографирование проводили восходящим методом при комнатной температуре на пластинках "Сорбфил" с ультрафиолетовым покрытием.

Детектирование пятен проводили в УФ - свете, а также раствором диазотированной сульфаниловой кислоты (подбор проявителей описан ниже).

Предварительно была изучена подвижность веществ в растворителях разной полярности, и, основываясь на полученных результатах, составлено несколько систем растворителей, позволяющих отделить фенолы от других веществ, входящих в состав чаги (таблица 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Калашникова, Екатерина Александровна, 2004 год

1. Wasser, S.P. Therapeutic effects of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective / S.P. Wasser, A.L. Weis // Crit Rev Immunol 1999. - Vol. 19, №1. - P.65-96.

2. Saar, M. Fungi in Khanty folk medicine / M. Saar // J. Ethnopharmacol -1991.-Vol. 31, №2.-P. 175-179.

3. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд.: В 2т. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырьё. - М.: Медицина, 1983. - Т. 2. - 400 с.

4. Муравьёва, Д.А. Фармакогнозия: Учеб. 4-е изд., перераб. и доп. / Муравьёва Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.

5. Лекарственные растения СССР (культивируемые и дикорастущие). 2-е изд., испр. и доп. М.: Планета, 1988. - 193 с.

6. Гончарова, Т.А. Энциклопедия лекарственных растений (лечение травами): В 2 т. / Гончарова Т.А. - М.: Изд. Дом МСП, 1997.-Т.2-528с.

7. Кьосев, П.А. Полный справочник лекарственных растений / Кьосев П.А. М.: ЭКСМО - Пресс, 2000.- 992с.

8. Попов, А.И. Макро- и микроэлементы чаги, заготовленной в Кемеровской области и республике Тыва / А.И. Попов, Д.Н. Шпанько // Фармация на соврем, этапе проблемы и достижения. Науч. тр. - М.;- 2000. - т. ХХХ1Ч.И.-С. 251-253.

9. Махов, А.А. Зелёная аптека: Лекарственные растения Красноярского края Изд. 3-е, испр. и доп. / Махов А.А. — Красноярск: Кн. изд - во, 1986. — 352 с.

10. Булатов, П.К. Чага, её свойства и применение при раке IV стадии / П.К. Булатов, М.П. Березина, П.А. Якимов // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. Л.; 1959.-С.7-22.

11. Государственный реестр лекарственных средств. М., 2000. - 1202 с.

12. Настойка чаги: Фармакоп. ст.: Утв. 4.01.94. МЗРФ. -М., 1994. 3 с.

13. Рудаков, В.Ф. Влияние чаги на метастазирование опухоли Эрлиха у мышей / В.Ф. Рудаков // Высшие грибы и их физиологически активные соединения. Л., 1973.-С.52-54.

14. Гурский, Т. О влиянии препарата БИН чага на перевиваемую саркому M-I и на перевиваемую мышиную аденокарциному Эрлиха / Т. Гурский // XVIII студ. научн. конф. 1-го Лен. мед. инст., поев. XX съезду КПСС: Тез. докл. -Л., 1956.-С. 21-22.

15. Березина, М.П. Влияние чаги на развитие привитой саркомы МОП у крыс / М.П. Березина, П.К. Булатов, Ф.Я. Вандышева // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959.- С. 119-126.

16. Козлов, В.В. О действии больших доз чаги на организм животного и развитие перевиваемой карциномы Эрлиха /В.В. Козлов // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. — Л., 1959.- С. 127-131.

17. Кроткина, Н.А. Влияние чаги на перевиваемые опухоли у крыс / Н.А. Кроткина // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959.- С. 114-118.

18. Kier, L.B. Triterpenes of Poria oblique J. / L.B. Kier // Pharmac. Sci. 1961. -Vol.50, №6.-P. 471-474.

19. Lucas, E.H. Folklore and plant drugs / E.H. Lucas // Mich. Acad. Sci., Arts a. Lett. 1960. - Vol. 45. - P. 127-136.

20. Петропавловская, И.М. Рентгенологические наблюдения над больными с некоторыми заболеваниями желудочно-кишечного тракта при лечении чагой / И.М. Петропавловская // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М.-Л.,1966. - С. 100-101.

21. Булатова, З.В. Изменение секреторной функции желудка у больных язвенной болезнью при лечении препаратом чаги / З.В. Булатова // Высшие грибы и их физиологически активные соединения. Л., 1973.-С.-76-79.

22. Березина, М.П. О механизме физиологического действия осаждённого пигментного комплекса чаги на организм / М.П. Березина, М.В. Ерёменко, Е.Я.

23. Мартынова и др. // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. M.-JL, 1961.-С. 190-205.

24. Адаптогенное действие препарата чаги / А. С. Гавр ил ов, А. А. Щеголев, Е.В. Гусельникова и др. // Хим. фармац. журн. 2003. - Т.37, № 2. - С. 43-46.

25. Изучение фитопрепаратов в качестве средств фармакологической коррекции радиационных воздействий / JI.H. Расина, Л.П. Ларионов, Н.М. Любашевский и др. // Фармация 2003. - № 1. - С. 30-32.

26. Турищев, С.Н. Фитотерапия язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки / С.Н. Турищев // Фармация — 2002. №4. - С. 4748.

27. Перегонцева, С.А. Фитотерапия сухим экстрактом чаги, ахиграном, настоем крапивы в комплексном лечении язвенной болезни двенадцатиперстной кишки: Автореф. дис. . канд. мед. наук / С.А. Перегонцева. Томск, 2000. - 16 с.

28. Федотов, А.А. Изучение лечебного действия бефунгина у больных язвенной болезнью: Дис. .канд. мед. наук. / А.А. Федотов —Л., 1976. — 160 с.

29. Гапаненко, Е.В. Медико-биологическая оценка нового продукта питания на основе берёзового гриба чаги: Автореф. дис. . .канд. мед. наук / Е.В. Гапаненко. Пермь, 1995. - 20с.

30. Лазовская, А.В. О токсичности чаги / А.В Лазовская // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.; 1959.-С.96-102.

31. Растительные лекарственные средства / Под ред. Н.П. Максютиной. -К.: Здоров'я, 1985.-280 с.

32. Махланюк, В.П. Лекарственные растения в народной медицине. 2-е изд. / В. П. Махланюк. — Саратов, Приволж. кн. изд - во, 1967. - 560 с.

33. Федотов, А.А. Изучение лечебного действия бефунгина у больных язвенной болезнью: Автореф. дис. .канд. мед. наук / А.А. Федотов. Л., 1977. -21 с.

34. Епанчинов, А.В. Лекарственные растения Урала и Зауралья / А.В. Епанчинов. М.: Прометей, 1990. - С. 114-115.

35. Babitskaia, V.G. Melanin complex of the fungus Inonotus obliquus / Babitskaia V.G., ShcherbaV.V., Ikonnikova N.V. / Prikl Biokhim Mikrobiol. 2000. - Vol. 36, №4. - P. 439-444.

36. Rzymowska, J. The effect of aqueous extracts from Inonotus obliquus on the mitotic index and enzyme activities / Rzymowska J. // Boll Chim Farm. 1998. -Vol. 137, № l.-P. 13-15.

37. The substances of plant origin that inhibit protein biosynthesis / Galasinski W., Chlabicz J., Paszkiewicz Gadek A., et al. // Acta Pol Pharm. - 1996. - Vol. 53, №5.-P. 311-318.

38. Antimitotic activity of aqueous extracts of Inonotus obliquus / Burczyk J., Gawron A., Slotwinska M. et al. // Boll Chim Farm. 1996. - Vol. 135, №5. - P. 306-309.

39. Effect of the extracts from fungus Inonotus obliquus on catalase level in HeLa and nocardia cells / Jarosz A., Skorska M., "Rzymowska J. et al. // Acta BiochimPol. 1990.-Vol. 37, №1.-P. 149-151.

40. Якимов, П.А. К проблеме образования физиологически активных веществ / П.А. Якимов // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л.Д961. — С. 6-9

41. Грибель, Н.В. Некоторые аспекты противоопухолевого действия бефунгина в эксперименте / Н.В. Грибель // Актуальные проблемы современной онкологии: Сб. ст. Томск, 1988. - Вып. 6. — С. 54-58.

42. Грибель, Н.В. Противометастатический эффект подорожника, полыни, почек берёзы, бефунгина // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. Томск, 1984. - Т. 1. - С. 119-124.

43. Балицкий, К.П. Лекарственные растения и рак / Балицкий К.П., Воронцова A.JI. Киев: Наук, думка, 1982. - 376 с.

44. Соловьёв, В.А. Применение метода парамагнитного резонанса для изучения чаги и продуктов метаболизма некоторых других дереворазрушающих грибов / В.А. Соловьёв, A.M. Кутневич // Высшие грибы и их физиологически активные соединения. Д., 1973.-С.35-38.

45. Ловягина, Е.В. О стероидных соединениях гриба чага / Е.В. Ловягина, А.Н. Шиврина // Биохимия,-1962. №5. - С.794-800.

46. Гшдець, Z.P. Про антибластичну дно на саркому Крокера препарату з березового гриба / Z.P-Гшдець, М.Д Подшьчак // Фармацевт1ч. журн. 1959. -№2.-С. 17-19.

47. Шиврина, А.Н. К характеристике комплекса сложных органических соединений чаги / А.Н. Шиврина, Е.В. Ловягина, Е.Г. Платонова // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.; 1959.-С.72-84.

48. Шиврина, А.Н. О биохимии древоразрушающих грибов / А.Н. Шиврина // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л.Д961.-С.47-61.

49. Шиврина, А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги / А.Н. Шиврина // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. -М.-Л., 1966.-С. 49-55.

50. Ловягина, Е.В. Изучение продуктов гидролиза действующего начала чаги методами распределительной хроматографии / Е.В. Ловягина, А.Н. Шиврина, Е.Г. Платонова//Биохимия. 1958. - № 1. - С.41-46.

51. Ловягина, Е.В. Изучение кислотного состава чаги методом распределительной хроматографии на бумаге / Е.В. Ловягина, А.Н. Шиврина,

52. Е.Г. Платонова // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.; 1959.-С. 62-71.

53. Ловягина, Е.В. Исследование карбонильной фракции гидролизатов водорастворимого пигментного комплекса, образуемого трутовым грибом чага / Е.В. Ловягина, А.Н. Шиврина, Е.Г. Платонова // Биохимия. — 1960. №4. -С.640-645.

54. Шиврина, А.Н. Спектрофотометрическая характеристика кристаллического карбонильного соединения, выделенного из пигментного комплекса гриба чага / А.Н. Шиврина, Е.В. Ловягина, Е.Г. Платонова // Докл. АН СССР 1960.-Т. 132, №6.-С. 1444-1447.

55. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги / Г.Л. Рыжова, С.С. Кравцова, С.А. Матасова и др. // Хим. фармац. журн. - 1997. -№Ю. -С.44-47.

56. Кузнецова, Г.А. Химия пигментов чаги / Г.А. Кузнецова // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л.; 1959.-С.85-89.

57. Бреднева, Н.Д. Теоретические основы к разработке БАД, применяемых при заболеваниях органов пищеварения и их стандартизация: Автореф. дис. . д-ра фармац. наук / Н.Д. Бреднева. — М., 2001. 48 с.

58. Платонова, Е.Г. Характеристика водорастворимых углеводных комплексов чаги / Е.Г. Платонова // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л., 1961.-С. 62-69.

59. Шиврина, А.Н. О полисахаридных комплексах гуминоподобных соединений, образуемых древоразрушающими грибами / А.Н. Шиврина, Е.Г. Платонова // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М.-Л., 1966.-С. 38-39.

60. Жданов, Ю.А. Практикум по химии углеводов / Жданов Ю.А. -М.,1973. 120 с.

61. Захарова, И.Я. Методы изучения микробных полисахаридов / Захарова И .Я., Косенко Л.В. Киев, 1982. - 192 с.

62. Colorimetric method for determination of sugas and substans / Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. et al. // Anal. Chem. 1956. - Vol. 28, N3. - P. 350-356.

63. Биохимические методы анализа растений / Под ред. М.Н. Запромётова. М.: Изд-во Ин. лит-ры, 1960. - 592 с.

64. Сафонова, М.Ю. Спектрофотометрический метод определения содержания полисахаридов в слоевищах Cetraria islandica (L). / М.Ю. Сафонова, Е.И. Саканян, Е.Е. Лесиовская // Раст. ресурсы. 1999. - Т.35, вып.2. - С. 101105.

65. Георгиевский, В.П. Физико-химические методы анализа биологически активных веществ растительного происхождения / Георгиевский В.П., Казаринов Н.А., Каррыев М.О. Ашхабад: Ылым, 1976. - 240 с.

66. Фтиц, В.В. Исследование адсорбции глюканов на лекарственных веществах и суспензиях: Автореф. дис. .канд. фармац. наук. / В.В. Фтиц Л., 1990.-20с.

67. Цаль, О.Я. Спектрофотометрическое определение полисахаридов в корнях кульбабы лекарственной / О.Я. Цаль, Л.Я. Роговская, Л.В. Бензель //Фармацевт1ч. журн. 1992. - №2. - С. 64-65.

68. Выделение и анализ полисахаридной фракции из биомасс штаммов Panax Ginseng С.А. MEY и P. Quinque folius L. с гермартраном «LX -5» / Е.Г. Остроженкова, Е.С. Тулупова, Е.И. Саканян, Л.И. Слепян // Раст. ресурсы. -2002. Т. 38, вып. 2. - С. 120-125.

69. Сбежнева, В.Г. Анализ полисахаридов / В.Г. Сбежнева, Н.Е. Козлов // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (46;1991;Пятигорск): Материалы. -Пятигорск, 1991. —С. 95-96.

70. Государственная фармакопея СССР. XI изд. - М., 1987. - Вып.1. -336с.

71. Методы химии углеводов / Под ред. Н.К. Кочеткова. М.: Мир, 1967. -512 с.

72. Методы исследования углеводов / Под ред. А.Я. Хормена. М.: Мир, 1975.-446 с.

73. Евтушенко, Е.В. Газожидкостная хроматография углеводов / Е.В. Евтушенко, Ю.С. Оводов // Химия природ, соединений. 1984. - №4. — С. 411425.

74. Жидкостная хроматография полисахаридов / С.В. Залялиева, Б.Д. Кабулов, К.А. Ахунджанов, С.Ш. Рашидова // Химия природ, соединений. — 1999.-№1.-С.З-18.

75. Асатиани, B.C. Биохимическая фотометрия / B.C. Асатиани М.: Изд. АНСССР, 1957.-836 с.

76. Игамбердиева, М.И. Углеводы Eremurus regeli / М.И. Игамбердиева, ДА. Рахимов, З.Ф. Исмаилов // Химия природ, соединений. 1974. - №4. — С. 429-432.

77. Алиев, A.M. К изучению углеводов корней некоторых видов Cephalaria / A.M. Алиев, И.С. Мовсумов // Химия природ, соединений. 1974. - №5. - С. 650.

78. Бочков, А.Ф. Углеводы / Бочков А.Ф., Афанасьев В.А., Заиков Г.Е. -М.: Наука, 1980.-176 с.

79. Шиврина, А.Н. Содержание соединений типа фолиевой кислоты в древоразрушающих грибах / А.Н. Шиврина, Е.В. Ловягина // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л., 1961.-С.58-61.

80. Ludwiczak, R.S. Badania skladnikon Chemycznych Inonotus obliquus. I. Inotodiol / R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono // Roczn. chem. 1958. - Vol. 32, №1. -P. 39-47.

81. Ludwiczak, R.S. Badania skladnikon Chemycznych Inonotus obliquus. II Lanosterol (Lanostadienol) / R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono // Roczn. chem. 1960. -Vol. 34, № l.-P. 77-84.

82. Ludwiczak, R.S. Badania skladnikon Chemycznych Inonotus obliquus. III. Inotodiol i niektore jego pochodne / R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono // Roczn. chem. -1960.-Vol. 34, №6.-P. 1629-1637.

83. Ludwiczak, R.S. Badania skladnikon Chemycznych Inonotus obliquus. IV. Ergosterol / R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono // Roczn. chem. 1960. - Vol. 34, №6. -P. 1701-1705.

84. Ludwiczak, R.S. Az Inonotus obliquus nehany hatoanyagarol / R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono // Acta pharm. hung. 1961. - №1. - P. 17-21.

85. Kempska, K. Badania skladnikon Chemycznych Inonotus obliquus. VI. Kwas 3p hydrooksylanostadieno - 8: 24 - karboksytowy - 21 / K. Kempska, R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono // Roczn. chem. - 1962. - Vol. 36. - P. 1453-1457.

86. Иванкина, Н.Ф. Липиды чаги / Н.Ф. Иванкина, Г.Ф. Соловьева, С.В. Исай // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока: Тез. Всесоюз. конф. Томск, 1989.-Вып.2. - С.70-71.

87. Шиврина, А.Н. Биологически активные вещества высших грибов / А.Н. Шиврина. М.-Л.: Наука, 1965. - 200 с.

88. Шиврина, А.Н. Аминокислотный состав гуминоподобных веществ, образуемых некоторыми древоразрушающими грибами / А.Н. Шиврина, Р.А. Маслова // Почвоведение 1963. - №11. - С. 63-67.

89. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. 14-е изд. перераб. и доп. / М.Д. Машковский - М.: Новая волна, 2000. - Т. 2. - С. 180.

90. Якимов, П.А. Методы переработки чаги в лекарственные формы / П.А. Якимов, С.М. Андреева, Е.В. Алексеева // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л., 1961.-С.129-137.

91. Бефунгин: Фармакоп. ст.: Утв. 25.04.96. МЗ РФ. М., 1996. - 8 с.

92. Ohta, К. Determination of zine in biological by segmental metal vapor elution analysis with atomic absorption detectin / Ohta K., Koihe Y., Mizuno T. // Anal. chem. acta. 1996. - Vol. 329, №1-2. - P. 191-195.

93. Nondestructive determination of maior elements in a large sample by promtr y-ray neutron activation analysis / Sueki., Kohayasky K., Sato W. et al. // Anal. chem.- 1996. Vol. 68, №23. - P. 2203-2209.

94. Листов, С.А. Применение элементного анализа в фармакопейном контроле качества лекарственных средств / С.А. Листов // Фармация 1989. -№4.-С. 28-32.

95. Булатов, М.И. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа изд. 4-е, перераб. и доп. / Булатов М.И., Калинкин И.П. - Л.: Химия, 1976. - 376 с.

96. Kubare, P. Simultaneous determination of small cations and anions bycapillary eltctrophoresis / Kubare P., Karllerg B. // Anal. Chem. 1998. - Vol. 70, №2.-P. 360-365.

97. Separation and determination of divalent metal ions with UV-absorsing chelating agents by capillary electrophoresis / Motomizu S., Nishimura S.Y., Obata Y., TanakaH. //Anal Sci. 1981. - Vol. 7, № 1, - P. 253-256.

98. Wang, T. Determination of sodium, potassium, magnesium and calcium in hawater by capillary electrophoresis with indirect photometric detection / Wang Т., Lu H.K., Li S.F.Y. // J. Lig. Chromatog. And Kelat. Techol. 1998. - Vol. 21, № 16. -P. 2485-2436.

99. Bachmann, K. Simultaneous determination of inorganic cations and anions in capillary zone electrophoresis (CZE) with indirect fluorescens detection / Bachmann K., Haumann J., Groh T. // Feresenius j. Anal. Chem. 1998. - № 12. - P. 901-902.

100. Jedrzejewski, W. The use of calmagite in the differential pulse palarographic determination of magnesium / Jedrzejewski W., Skrzypele S. // Chem. Anal. 1993. - Vol. 38, № 1. - P. 95-102.

101. Bharathibai, I. Differential pulse polarographic determination of trace levels of iron (III) by using the catalytic cueret / Bharathibai I., Paolma D.K., Kajagopalan S.R. // J. Anal. chem. 1994. - Vol. 349, №6. - P. 477-478.

102. Полонская, JI.C. Полярографическое определение цинка с использованием цинкона / Полонская Л.С. // Завод, лаб. — 1996. Т.2, №9. - С. 9-10,66.

103. Петров, С.Н. Вольтамперометрическое определение меди, свинца, кадмия и цинка в присутствии ПАВ / Петров С.Н., Иванова Ж.В. // Завод, лаб. -1998. Т.64, №6. - С. 6-8,67.

104. Komorsky-Louric, S. Brta nedestruktivna metodoza odoedivanje A1 u Mg voltametrijiom s abra zivnim urorkoanjem // 6 Jugosloven. simp. anal, hem., Sajajevo Sept. 30. Okt. 2., 1001: Simp. rol. - Sarajevo., 1991.-C. 108.

105. Amperometric technique in flaw injection analysis determination of magnesium in sera and natural waters / Downard A.I., Hart J.B., Kipton H. et al. // Anal. Chem. acta. - 1992. - Vol. 269, № 1-6. - P. 41-48.

106. Srivastava, H.P. Biamperometric determination some bivalen metal ions / Srivastava H.P., Tiwari D. // J. Indian Chem. Sci. 1998. - Vol. 71, №10. - P. 847849.

107. Сахаров, А. А. Амперометрическое определение железа в фармацевтических препаратах / Сахаров А.А., Раневич В.И., Гаель Е.В. // Хим.- фармац. журн. 1992. - Т. 26, №1. - С. 84-87.

108. Кирхнер, Ю. Тонкослойная хроматография. В 2-х т. / Кирхнер Ю, -М.: Мир, 1981.-Т.2.- 1135 с.

109. Schwedt, G. Ion pair chromatography of alkali and alkaline ions new reagent n-hexylsuceinic acid / Schwedt G., Schaper H.H. // Feresenius J. Anal. Chem.- 1990. Vol. 336, №5. — P.415-418.

110. Williams, T. Determination of Mg and Ca by ion chromatography with post-colunn reaction fluorescens detection / Williams Т., Barnett N.W. // Anal. Chem. acta. 1992. - Vol. 259, №1. - P. 19-23.

111. Janoy, P. Ion chromatographic determination of some alkali and alkaline earths ions with indirect photometric detections / Janoy P. // Scs. Fac. sci. nature. Ucriv. Masarykianae brun. chem. - 1994. - Vol. 24. - P. 52-72.

112. Gros, N. Ion chromatographic determination of some alkali and alkaline earthsmetals in mineral water / Gros N., Gorenc B. // Chromatographia. - 1994. — Vol. 38, №7-8.-P. 448-452.

113. Le Gras Cristopher, A.A. Simultaneous determination of anions and divalent cations using ion chromatography with EDTA as eluent / Le Gras Cristopher A.A.//Analyst.- 1993.-Vol. 118, №8.-P. 1035-1048.

114. Horris, J. Ion-chromatography of metals cations on carboxylic acid resins / Horris J., Fritz J.S. // J. Chromatogr. 1992. - Vol. 602, №1-2. - P. 11Ы17.

115. Анваер, Б.И. Газовая хроматография неорганических веществ / Анваер Б.И., Другов Ю.С. М.:Химия, 1971. - 328 с.

116. Adams, M.J. Quantitative X-ray fluorescence analysis of geological materials using partial least squares regression / Adams M.J., Allen I.R. // Analyst. - 1998.-Vol. 123, №4.-P. 537-541.

117. Determination of metal ion mixtures using pH gradient flow-injection analysis with fluorescens detection / Porter N., Hart B.T., Morrison R., Hamilton J.C. //Anal. chim. acta. 1995. - Vol. 308, №1. - P. 313-328.

118. Якимов, П.А. Зольные элементы чаги и препарата из нее / П.А. Якимов, М.Ф. Ступак // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. -Л.; 1959. -С.50-54.

119. Попов, А.И. Элементный состав Tanacetum vulgare L. / А.И. Попов // Растит, ресурсы. 1994. - Вып. 3. - С. 85-92.

120. Попов, А.И. Фронтальный элементный анализ травы тысячелистника / А.И. Попов, В.А. Попков // Хим. фармац. журн. 1992. - Т.26, №9-10. - С. 9697.

121. Листов, С.А. Методы элементного анализа в стандартизации и контроле качества лекарственных средств: Автореф. дис. . д-ра. фармац. наук. / С.А. Листов М., 1990. - 80 с.

122. Baker, D.E. Chimical monitoring of soils for environmental quality and animal and hyman health / Baker D.E., Chesnis L. // Advanc. Argon. 1975. - Vol. 27.-P. 305-375.

123. Schilcher, H. Empfehlung von Richt und Crenz werten fur den maximalen Blei und Cadmium-Gehalt von Arzheidrogen und daraus hergestellter pharmazeutisher Zubereitungen / Schilcher H., Peters H. // Pharm. Ind. 1990. — Vol.52, №7.-P. 916-921.

124. Общая химия. Биофизическая химия, химия биогенных элементов: Учеб. для вузов / Ершов Ю.А., Попков В.А., Берлянд А.С. и др. 3-е изд., стер. - М.: Высш. шк., 2002. - 560 с.

125. Слесарёв, В.И. Конспект лекций по общей химии / В.И. Слесарёв — СПб: Химия, 1994. С. 246-247.

126. Слесарёв, В.И. Химия: Основы химии живого: Учеб. для вузов / В.И. Слесарёв — СПб: Химиздат, 2000. 768 с.

127. Крешков, А.П. Курс аналитической химии. Качественный анализ: В 2 кн. /Крешков А.П., Ярославцев А.А.-М.:Химия, 1981.-кн. 1.-416 с.

128. Мурашова, В.И. Качественный химический дробный анализ / Мурашова В.И., Тананаева А.Н., Ховякова Р.Ф. М.: Химия, 1976. - 280 с.

129. Файгль, Ф. Капельный анализ неорганических веществ: В 2 т. / Файгль Ф., Ангер В. М.: Мир, 1976. - 2 т.

130. Пономарёв, В.Д. Аналитическая химия. 4.1. Учеб. для фармац. и фак. мед. ин-тов / В.Д. Пономарёв М.: Высш. шк.,1982. - 288 с.

131. Шарло, Г. Методы аналитической химии. 4.2. Количественный анализ неорганических соединений / Г. Шарло М.: Химия, 1969. - С. 834-843.

132. Марченко, 3. Фотометрическое определение элементов / 3. Марченко -М.: Мир, 1971.-482 с.

133. Пешкова, В.М. Методы абсорбционной спектроскопии в аналитической химии: Учеб. пособие для ун-тов / Пешкова В.М., Громова М.И.- М.: Высш. шк., 1976. 280 с.

134. Вассерберг, А.В. Электрофотоколориметрическое определение кобальта / А.В. Вассерберг // Методы анализа лекарственных веществ: Тр. Ленинград, хим. фармац. инст - та. - Л., 1959. - С.6.

135. Андреева, С.М. К вопросу определения содержания солей кобальта в экстракте из чаги / С.м. Андреева, Е.В. Алексеева, П.А. Якимов // Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства. М.-Л.: Наука, 1965.-С. 116-121.

136. Шестопалова, Л.Ф. Количественное определение солей кобальта в «Бефунгине» / Л.Ф. Шестопалова, Л.В. Беляева, В.А. Маняк // Материал. V Всерос. съезда фармацевтов (5; 1987; Ярославль): Тез. докл. —Ярославль, 1987.- С.322-323.

137. Коренман, Я.И. Экстракция фенолов / Я.И. Коренман Горький: Волго-Вятское кн. изд- во, 1973. - 216 с.

138. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии / Под ред. П.Л. Сенова. М.: Медицина, 1978. - 360 с.

139. Коренман, И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений 2-е изд. перераб и доп. / И.М. Коренман - М.: Химия, 1975.-360 с.

140. Казаков, А.Л. Углеводы, аминокислоты, фитин и макроэлементы травы Trifolium pratense / А.Л. Казаков, И.И. Самокиш // Химия природ, соединений 1980. - №4. - С. 483-485.

141. Клышев, Л.К. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования) / Клышев Л.К., Бандюкова В.А., Алюкина Л.С. Алма-Ата: Наука, 1978. - 220с.

142. Попова, И.Ю. Патогенетическое применение некоторых микроэлементов при лечении анемии / И.Ю. Попова, Д.Н. Лазарева, Ф.С. Зарудий // Эксперим. и клинич. фармакология 1996. — Т.59, №3. - С.72-77.

143. Иммуномодуляторы растительного происхождения / А.Д. Бакуридзе, М.Ш. Курцикидзе, В.М. Писарев и др. // Хим. фармац. журн. 1993. - №8. -С.43-47.

144. Бакуридзе, А.Д. Качественное определение фенолкарбоновых кислот в траве горечавки жёлтой методом ВЭЖХ / А.Д. Бакуридзе, А.В. Патудин, В.М. Эриашвили // Современные методы анализа фармацевтических препаратов: Сб. науч. тр.-М., 1988.-Т. 26.-С. 153-155.

145. Бургер, К. Органические реактивы в неорганическом анализе. / К. Бургер. -М.: Мир, 1975.-238 с.