Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Неверов, Александр Александрович

• Неверов, Александр Александрович
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Неверов, Александр Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ. ф ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Семейство Paramyxoviridae. Генетические и биологические свойства. Классификация. Общие сведения.

1.2. Профилактика заболеваний, вызываемых представителями семейства Paramyxoviridae.

1.2.1. Вакцины против эпидемического паротита.

1.2.2. Вакцины против кори.

1.3. Диагностика заболеваний, вызываемых вирусами семейства Paramyxoviridae.

1.3.1. Диагностика эпидемического паротита. Генодиагностика эпидемического паротита.26 ^ 1.3.2. Диагностика кори.

1.3.2.1. Методы лабораторной диагностики кори.

1.3.2.2. Молекулярная эпидемиология и генодиагностика вируса кори.

1.3.2.3. Методы быстрого определения генотипов циркулирующих изолятов вируса кори. Олигонуклеотидные микрочипы как альтернативный метод генетического анализа циркулирующих штаммов вируса кори. 1.4. Лечение заболеваний, вызываемых вирусами кори и паротита.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы. ф 2.2.1. Выделение суммарной РНК.

2.2.2. Проведение реакции обратной транскрипции.

2.2.3. Проведение ПЦР.

2.2.3.1. Амплификация фрагментов генома вируса паротита.

2.2.3.2. Диагностическая ОТ-ПЦР для обнаружения вируса кори.

2.2.3.3. Амплификация кДНК вируса кори из клинических образцов для проведения анализа ДНК-микрочипом.

2.2.4. Очистка продуктов амплификации после проведения ПЦР.

2.2.5. Клонирование продуктов ПЦР в плазмидный вектор pGEM-5Zf(+) Е. Coli.

2.2.6. Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК.

2.2.7. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.2.8. Подготовка молекул одноцепочечной РНК для гибридизации на ДНК-микрочипе. 2.2.9. Приготовление ДНК-микрочипов для генотипирования вируса кори.

2.2.10. Гибридизация молекул одноцепочечной РНК на ДНК-микрочипе.

2.2.11. Сканирование ДНК-микрочипов и анализ данных.

2.2.12. Статистический анализ данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для амплификации и определения полноразмерных последовательностей генома вируса паротита.

3.2. Генетический анализ изолятов вируса паротита, выделенных на территории г. Новосибирска.

3.3. Изучение генетических свойств вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита.

3.3.1. Определение полноразмерной последовательности генома штамма Л-3 вируса паротита.

3.3.2. Исследование состава вирусной популяции в препарате производственного штамма ф Ленинград-3, применяемого при производстве паротитной вакцины.

3.3.3. Исследования генетической стабильности живой паротитной вакцины на основе штамма JI3.

3.3.4. Сравнительный анализ последовательности генома вакцинного штамма JI-3 с описанными ранее штаммами вируса паротита. 3.4. Сравнение полноразмерных последовательностей геномов штаммов Ленинград-3 и • L-Zagreb.

3.5. Генотипирование изолятов вируса кори.

3.6. Разработка олигонуклеотидного микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори.

3.6.1. Определение генотип- и группоспецифических мутаций в гипервариабельном районе гена N вируса кори. Расчет олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа.

3.6.2. Оценка различных платформ для иммобилизации олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа и оптимизация условий метода.

3.6.3. Первичная характеризация разработанного ДНК-микрочипа для генотипирования изолятов вируса кори.

4 3.6.4. Валидация метода генотипирования вируса кори с помощью ДНК-микрочипов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение генетических свойств вирусов кори и паротита»

Высокая контагиозность, восприимчивость разных возрастных групп, возможные тяжелые осложнения и продолжительная иммуносупрессия у переболевших характерны для заболеваний, вызываемых вирусами семейства Paramyxoviridae - паротита и кори (Руководство по инфекционным болезням. Под ред. Ю.В.Лобзина, 2000). Успехи вирусологии в разработке эффективных вакцин способствовали широкому использованию иммунизации против данных заболеваний во многих странах мира. Обе инфекции относят к категории заболеваний, контролируемых с помощью вакцинации (Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. В.И. Покровского, 1993; Galazka A.M. et al., 1999).

Средством профилактики эпидемического паротита являются вакцины на основе аттенуированных штаммов. Наибольшее применение имеют вакцины, приготовленные на основе штаммов Ленинград-3 (Россия), Leningrad-Zagreb (Египет, Хорватия, Индия), Jeryl Lynn (США, Бельгия), Urabe (Франция, Бельгия, Италия) (Galazka A.M. et al., 1999; www.who.int/vaccines/en/mumps.shtml). Одним из факторов, заставляющих настороженно относится к использованию вакцин против вируса паротита на основе аттенуированных штаммов, является их возможная нейровирулентность (Sugiura A. and A. Yamada, 1991; Forsey Т. et al„ 1992; Miller E.M. et al., 1993). ВОЗ предлагает не только выяснить причины нейровирулентности вакцинных штаммов, применяемых при производстве вакцин для профилактики эпидемического паротита, но и осуществлять контроль их генетической стабильности на этапах производства. Такая работа проведена для штамма Jeryl Lynn (Amexis G.S. et al., 2002). Изучение штамма Jeryl Lynn показало, что он генетически гетерогенен и содержит 2 различных субштамма (Afzal М.А. et al., 1993; Amexis G.S. et al., 2002). Вакцина на основе этого штамма достаточно иммуногенна и не вызывает неврологических осложнений у привитых. Известна полноразмерная последовательность генома штамма Urabe (Amexis G. et al., 2001a), однако, работы по изучению генетической стабильности этого штамма в условиях производства не проводятся. В России (ранее в СССР) для производства вакцины против эпидемического паротита используется штамм Ленинград-3 (JI-3). В Хорватии, Индии и Египте используется штамм Leningrad-Zagreb. История появления штамма с таким названием указывает на его связь со штаммом Ленинград-3 (Beck М. et al., 1989). Анализ данных о поствакцинальных осложнениях после иммунизации вакциной на основе штамма Л-3 в России обнаружил чрезвычайно низкую частоту неврологических осложнений (0,018 на 100000 привитых) (Максимова О.А. и др., 2001). В то же время при применении вакцины производства Хорватии и Индии (штамм L-Zagreb) осложнения в виде асептического менингита неоднократно регистрировались (Cizman М. et al., 1989; Kraigher A. and Tesovic G. et al., 1993; da Cunha S.S et al., 2002; da Silveira C.M et al., 2002). Многие авторы обсуждают штаммы L-Zagreb и Ленинград-3 как один и тот же штамм. Подобные факты вызывали спекуляции о низком качестве российской вакцины, однако, никто из зарубежных (равно и отечественных) исследователей не сообщали данных о генетических свойствах штамма Ленинград-3. Отсутствие таких данных не позволяет говорить об идентичности штаммов Leningrad-Zagreb и Ленинград-3. Средством, позволяющим положить конец подобным инсинуациям, является изучение структуры штамма Ленинград-3 и его генетической стабильности.

Несмотря на широкое применение профилактических прививок, заболеваемость эпидемическим паротитом в различных странах, включая Россию, остается значительной (4,2 на 100000 человек в 2004 году) (http://www.mzsrrf.ru/stat/41.html). Данные о генетических свойствах циркулирующих штаммов вируса паротита очень ограничены. На территории России подобные исследования проводятся спорадически и в очень ограниченных масштабах (Heider A. et al., 1997b; Нестеров А.Е. и др., 2004). Общеизвестно, что под давлением иммунной системы вирус способен изменять свои антигенные и другие биологические свойства. Поэтому анализ циркулирующих на отдельной территории изолятов, выделенных в разное время, может предоставить информацию об изменениях в геноме вируса и возможных путях его эволюции. Иммунизация вакцинным штаммом вируса паротита потенциально может не приводить к формированию полноценного протективного иммунного ответа вакцинированных против различающихся по антигенным свойствам (Orvell, С.A. et al., 1997а; Yates, P.J. et al., 1996) штаммов «дикого» типа. Об этом свидетельствуют случаи заболевания вакцинированных лиц (Hersh, B.S. et al., 1991) и случаи повторного заболевания ранее переболевших при инфицировании вирусами гомологичных генотипов (Nojd, J. et al., 2001). Поэтому сравнение последовательностей эпитопов и других иммунологически и функционально значимых районов белков циркулирующих штаммов «дикого» типа и штаммов, используемых для приготовления вакцин, представляет определенный интерес для выяснения причин названных выше явлений.

В рамках программы по элиминации кори, проводящейся под эгидой ВОЗ и ЮНЕСКО (WHO-UNICEF, 2002) генотипирование изолятов этого вируса является важным компонентом слежения за заболеваемостью (Bellini W.J. and Helfand R.F. 2003; Bellini W.J. and Rota P.A. 1998; Mulders M.N. et al., 2001; Rota J.S. et al., 1996). Исследование генотипов вируса кори, циркулирующих на определенной территории, позволяет отслеживать пути передачи вируса (Rota, J.S. et al., 1996) и помогает отличать поствакцинальные осложнения от случаев заболевания, вызванных инфицированием штаммами "дикого" типа (Bellini W.J. and P.A. Rota, 1998). Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований, в совокупности с анализом данных классической эпидемиологии, позволяют корректировать календарь профилактических прививок для повышения эффективности контроля над инфекцией (Mulders M.N. et al., 2001).

Молекулярная характеризация изолятов вируса кори проводится, в основном, крупными лабораториями, расположенными в развитых странах (Featherstone, D.D. et al., 2003). Сложности, связанные с необходимостью транспортировки инфекционных образцов, высокой термолабильностью вируса кори, а также длительным сроком проведения анализа подчас не позволяют эффективно осуществлять генодиагностику заболевания для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий. Из-за изменений в клинической картине и атипичности серологических показателей у вакцинированных против кори (Heider A., 1997b; Atrasheuskaya A.V. et al., 2005), диагностика заболевания рекомендованными ВОЗ методами (WHO Department of vaccines and Biologicals, 1999) затруднена. В случае инфицирования вакцинированных штаммами вируса кори "дикого" типа, принадлежащими генотипу А (идентичному с генотипом вакцины), молекулярные методы (ОТ-ПЦР и генотипирование) являются единственным способом лабораторного подтверждения клинического диагноза (Heider A., 1997b; Atrasheuskaya A.V. et al., 2004; Atrasheuskaya A.V. et al., 2005).

Определение последовательности нуклеотидных остатков продуктов ПЦР в настоящее время является самым точным и эффективным способом идентифицировать генотипы вируса кори (Kremer J.R. et al., 2004). Однако, существует необходимость использовать альтернативные методы, позволяющие быстро проводить генотипирование большого количества образцов. Так же может быть необходимо анализировать несколько областей генома вируса одновременно, например, для повышения точности или чувствительности анализа. Поэтому необходима разработка методов, позволяющих проводить генетический анализ изолятов вируса кори за наиболее короткое время и как можно ближе от мест их выделения. Метод ДНК-микрочипов с применением олигонуклеотидных зондов (Pease А.С. et al., 1994; Schena М. et al., 1995; Hoheisel J.D. 2006) представляет одну из возможных альтернатив, т.к. он применим для исследования большого количества образцов и может быть легко модифицирован для одновременного анализа нескольких генов вируса или всего генома.

Целью настоящего исследования являлось изучение генетических свойств вирусов кори и паротита.

Задачами настоящего исследования являлись:

1. Изучение генетических свойств Российского вакцинного штамма Ленинград-3 вируса эпидемического паротита: определение полной последовательности генома штамма Ленинград-3 (Л-3); сравнение последовательностей генома штамма Л-3 и штаммов вируса паротита с определенными полноразмерными последовательностями (как вакцинных, так и штаммов "дикого" типа); изучение состава вирусной популяции вакцинного штамма Л-3; изучение генетической стабильности штамма Л-3 в готовых вакцинных препаратах и при пассировании на культуре клеток, используемой при производстве вакцины.

2. Сравнительный анализ последовательностей геномов штаммов вируса эпидемического паротита "дикого" типа, выделенных на территории г. Новосибирска: определение полной последовательности геномов штаммов "Драгун" (генотип С, выделен в 1994 году) и "ПетроНов" (генотип Н, выделен в 2003 году); сравнение полученных последовательностей с ранее определенными последовательностями геномов штаммов вируса паротита, доступных в базе данных GenBank.

3. Изучение разнообразия генотипов вируса кори, циркулирующих на территории с высоким уровнем охвата населения профилактическими прививками: анализ клинических образцов методом ОТ-ПЦР для определения геномной РНК вируса кори; определение генотипов изолятов вируса кори, циркулирующих на данной территории.

4. Разработка ДНК-микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори: разработка метода и его оптимизация, используя установленные ВОЗ эталонные штаммы генотипов вируса кори и изоляты "дикого" типа, выделенные на территории различных стран; валидация метода используя панели клинических образцов, собранных от больных корью и лиц, инфицированных другими вирусами, вызывающими экзантемные заболевания; определение чувствительности и специфичности разработанного метода.

Научная новизна работы. Впервые определены полноразмерные последовательности геномов сибирских изолятов вируса паротита (генотипы С и Н). Получена полноразмерная последовательность генома штамма JI-3, применяющегося при производстве паротитной вакцины в России. Показана генетическая стабильность и гомогенность штамма JI-3. Для обработки данных ДНК-микрочипов при генотипировании изолятов вируса кори впервые применен метод иерархического кластерного анализа.

Практическая значимость работы. Выделен и депонирован в коллекцию культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (номер V-330) штамм вируса паротита ПетроНов (генотип Н). Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков генома штаммов вируса паротита. В соответствии с рекомендациями ВОЗ (Global Advisory Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.) охарактеризован штамм JI-3, применяющийся для производства паротитной вакцины в России. Разработан метод генотипирования изолятов вируса кори без использования определения последовательности нуклеотидных остатков участков генома вируса.

Положения, выносимые на защиту.

1. Показана стабильность и генетическая гомогенность штамма JI-3 вируса паротита, применяемого для производства паротитной вакцины в России.

2. Установлены генетические различия между вакцинными штаммами вируса паротита JI-3 (Росиия) и L-Zagreb (Хорватия, Индия, Египет).

3. Разработан и апробирован ДНК-микрочип, способный детектировать и эффективно дискриминировать все 23 описанных генотипа вируса кори в клинических образцах.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Генодиагностика Инфекционных Болезней" (Москва, 19-21 октября 2004 г.), "IUMS 2004 - Microbes in the changing world. XIII International Congress of Virology" (San

Francisco, CA, July 23-28, 2005), "A Century of FDA Science: Pioneering the Future of Public Health. FDA Science Forum" (Washington, DC, April 18-20,2006) Публикации. По материалам диссертации опубликование 10 печатных работ. Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением клинических исследований, получены непосредственно автором.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Неверов, Александр Александрович

выводы

1. Впервые определена полноразмерная последовательность генома вакцинного штамма Л-3 вируса паротита. Полученная последовательность депонирована в базе данных GenBank.

2. Показана генетическая стабильность и гомогенность штамма Л-3 вируса паротита, используемого для производства вакцины в России.

3. Впервые в России определены полноразмерные последовательности геномов изолятов вируса паротита (генотипы С и Н). Последовательность штамма "Драгун" представляет первую полноразмерную последовательность генома вируса паротита генотипа С в мире. Сравнение полноразмерных последовательностей штамма "ПетроНов" генотипа Н, выделенного в г. Новосибирске в 2003 г. с последовательностью штамма 88-1961 (1988 г., США) выявило их незначительую вариацию (1,67%).

4. Впервые определены генотипы вируса кори, циркулирующие на территории г. Минск, республика Беларусь. В 2001-2003 гг. выделены изоляты генотипа А вируса кори, в 2003 году выделены изоляты генотипов D6 и D7.

5. Разработан ДНК-микрочип для генотипирования изолятов вируса кори. Метод апробирован, используя образцы вируса кори всех описанных генотипов, включая новый генотип D10. Анализом клинических материалов, полученных от больных другими экзантемными заболеваниями, показана строгая специфичность метода для вируса кори. Чувствительность и специфичность разработанного метода при исследовании панелей кодированных образцов составила (90,7%) и (100%), соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день определены полноразмерные последовательности геномов 13 штаммов вируса паротита. Шесть из них представляют собой последовательности вариантов штамма Urabe, 7 - последовательности уникальных штаммов. Проведению сравнительных исследований на уровне полноразмерных последовательностей геномов мешает их существенная дивергенция (достигает 8% между наиболее удаленными представителями), не позволяющая использовать специфичные для определенного штамма праймеры при амплификации кДНК других штаммов. В данной работе впервые применен подход к дизайну олигонуклеотидов-праймеров, обеспечивающий их применимость для амплификации любых штаммов вируса паротита, как вакцинных, так и штаммов «дикого типа». Использованный подход позволяет комплексно изучать изменчивость различных генов в ходе эволюции при исследовании штаммов "дикого" типа и является единственно доступным на сегодняшний день для выяснения молекулярных механизмов аттенуации вируса. Определение полной последовательности генома вируса паротита, используемого в качестве посевного вируса при производстве вакцины может также быть использовано в качестве дополнительного контрольного теста при определении ее качества.

С помощью предложенного метода определена полноразмерная последовательность генома вакцинного штамма Ленинград-3, а также штаммов "дикого" типа ПетроНов и Драгун, выделенных в г. Новосибирске в 1994 и 2003 годах. Штамм Драгун представляет собой первый в мире штамм вируса паротита генотипа С с определенной полнополноразмерной последовательностью генома. Штамм ПетроНов относится к генотипу Н - широко распространенному в настоящее время на территории Европейских стран и США. В базе данных GenBank доступна последовательность штамма 88-1961, этого же генотипа, выделенного в 1988 году в США. Проведенные исследования позволили получить данные о генетических различиях между циркулирующими в Сибири штаммами вируса паротита генотипов С и Н (штаммы "ПетроНов" и "Драгун"), вакцинными штаммами

Ленинград-3, Leningrad-Zagreb, Urabe, Jeryl Lynn major, Jeryl Lynn minor и другими ранее описанными штаммами "дикого" типа (Dgl062, 88-1961, Gloucl) на уровне полноразмерных последовательностей геномов. Сравнение различных генов данных штаммов вируса паротита выявило, что помимо гена SH вариабельными также являются гены N, I и F. Наиболее консервативными во всем геноме являются гены М и особенно L. Филогенетический анализ, как для полных геномов в целом, так и отдельно для каждого гена показал, что между дикими и вакцинными штаммами явных отличий нет. С незначительными перестановками внутри подгрупп, топология деревьев, построенных по последовательностям всех генов были схожи и практически повторяли топологию дерева, построенного при анализе последовательностей полного генома. Помимо кодирующих участков, геном вируса содержит достаточно большое количество (около 7% всего генома) не кодирующих, регуляторных участков. Сохранение их в ходе эволюции указывает на функциональную значимость. Регуляторные последовательности найдены во многих вирусных геномах, они необходимы для правильной реализации генетической информации на различных этапах жизненного цикла вируса. Точные функциональные значения замен нуклеотидов в данных участках генома вируса паротита эксперементально не определены, однако мутация в 5'-некодирующей части гена F приводит к отсутствию нормальной экспрессии следующего за ним в геноме гена SH (Takeuchi К. et al., 1996). При анализе последовательности генома штамма Л-3 обнаружена аналогичная замена в последовательности сигнала полиаденилирования матричной РНК гена Р, который также кодирует дополнительные белковые продукты V и I.

Определение и сравнение полноразмерных последовательностей генома вариантов штамма Ленинград-3 с различной пассажной историей показало, что штамм не претерпевает каких-либо генетических изменений после 6 последовательных пассажей на первичной культуре клеток эмбрионов японского перепела, используемой в качестве клеточного субстрата при производстве вакцины в Росиии. Исследование гипервариабельного локуса генома - гена SH, показало генетическую гомогенность препарата производственного штамма Российской вакцины на основе штамма Ленинград-3.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в отличие от штамма Jeryl Lynn (США), вакцина на основе отечественного штамма Л-3 генетически гомогенна - т.е. она не содержит нескольких субштамов вируса. Более того, генетически гомогенным является не только исходныйпроизводственный вакцинный штамм, но и пассажи, применяемые для получения серий посевного вируса и готовой паротитной вакцины. В отношении других используемых вакцинных штаммов вируса паротита - Urabe, Rubini, Miyahara, L-Zagreb подобная информация отсутствует. Таким образом, живые вакцины, производимые только из штаммов Jeryl Lynn и Ленинград-3 охарактеризованы по составу вирусной популяции в их препаратах.

В работе определена полноразмерная последюовательность генома штамма L-Zagreb, применяемого для производства паротитной вакцины фирмой Serum Institute of India (Индия). Сравнение полноразмерных последовательностей геномов штаммов Л-3 и L-Zagreb (номер в базе данных GenBank AY685920) (Ivancic J. et al., 2005), а также индийского варианта этого штамма показало, что штамм L-Zagreb имеет замены нуклеотидов в гене F (G-* А, позиция в геноме 5037) и N (А-* A/G, позиция 1059). Индийский штамм содержит оба варианта (A/G) в соответствующей позиции гена N. Мутация в гене белка слияния (F) не приводит к смене аминокислоты, в то время как замена в гене нуклеопротеина штамма L-Zagreb является значащей, т.е. приводит к существованию 2 различных вариантов данного белка в препарате вакцины, производимой на основе штамма в Индии и полностью меняет кодируемую аминокислоту в штамме, используемом в Хорватии. Российский штамм содержит остаток аспарагиновой кислоты - полярной, гидрофильной, отрицательно заряженной аминокислоты; другой - глицин - полярной, не заряженной. Таким образом, происходит смена класса кодируемой аминокислоты, что, потенциально, может привести к изменению биологических свойств нуклеокапсидного белка. При сравнении лидерной последовательности штаммов Л-3 и L-Zagreb обнаружено, что оба варианта штамма L-Zagreb (Хорватский и Индийский) содержат замену двух нуклеотидов в данном регионе генома (позиции 14 и 30) по сравнению с Российским штаммом Ленинград-3. Таким образом, показано, что вакцинные штаммы Л-3 и L-Zagreb, генетически очень близки, но не идентичны, и поэтому нельзя говорить о полном соответствии российского штамма Л-3 хорватскому (и индийскому) штамму L-Zagreb.

При лабораторном подтверждении случаев с клиническим диагнозом "корь" на территории республики Беларусь диагноз подтверждался по серологическим показателям только у 6 пациентов из 14. В то же время генодиагностика кори подтверждала клинический диагноз у всех пациентов (14 из 14). Установлено, что с 2001 по 2003 гг. регистрировали циркуляцию штаммов вируса кори генотипа А, генотипы D6 и D7 вируса кори среди исследованных случаев на территории г. Минск определены в 2003 году. Вирусы генотипа А продолжали циркулировать на данной территории несмотря на высокий охват вакцинацией населения. Данные молекулярной эпидемиологии, полученные в ходе программы надзора за корью во множестве других стран мира, показывают низкое количество случаев заболеваний корью, вызванных генотипом А вируса в настоящее время. Клинический диагноз "корь" у пациентов, проживающих на территории с высоким показателем применения профилактических прививок (привиты И пациентов из 14 (охват прививками против кори в Белоруссии - 99%)) лабораторно подтверждался в основном методами молекулярной диагностики (ОТ-ПЦР и генотипированием), а не серологическими методами. Таким образом, большинство случаев кори на территории с высоким показателем применения профилактических прививок представляют собой случаи нетипично протекающей "вакцинно модифицированной" кори, для правильной диагностики которых необходимо применение как серологических, так и молекулярно-вирусологических методов анализа клинических образцов в комплексе. Очевидно, что для современных условий необходим метод, позволяющий быстро (в течении 1-2 дней) проводить генодиагностику кори в лабораториях регионального уровня. Существующие общепринятые методы анализа, основанные на ОТ-ПЦР и определении последовательности нуклеотидных остатков участков вирусного генома для данных целей не подходят. Таким образом, разработка альтернативных методов генотипирования вирусов кори, необходима и оправдана.

ДНК-микрочипы для генотипирования микроорганизмов основаны на использовании относительно коротких (15-40 звеньев) олигонуклеотидных зондов, которые могут гибридизоваться с определенными участками некоторых последовательностей из анализируемой совокупности. Таким образом эти последовательности могут быть дискриминированы относительно других. В настоящее время существует несколько компьютерных программ для автоматизированного расчета уникальных олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипов. Однако расчет олигонуклеотидных зондов для близко родственных последовательностей, различающихся одной или несколькими рассеянными точковыми мутациями, представляет собой непростую задачу. Возможность перекрестная гибридизация с неспецифическими для анализируемого образца зондами также ограничивает возможности метода. Процедуры, применяемые в исследованиях, связанных с ДНК-микрочипами, пока не оптимизированы для стандартного использования в полевых условиях, они все еще относительно дороги. Несмотря на указанные недостатки, последние достижения в области жидкостных систем малого размера, кремниевой технологии, электроники и нанотехнологии обещают создание небольших по размерам, недорогих, и удобных в использовании устройств, комбинирующих различные лабораторные приборы в виде одного инструмента разового использования.

Использование стандартных подходов для расчета олигонуклеотидных зондов для дискриминации последовательностей гена N вируса кори не привело к нахождению достаточного количества уникальных для каждого генотипа олигонуклеотидных зондов. Чтобы преодолеть данное затруднение, использовались зонды, специфичные для сложных групп, состоящих из образцов, принадлежащих нескольким генотипам, которые использовались в дополнение к зондам, специфичным для одного генотипа вируса кори. Таким образом, генотипирование изолятов вируса кори в работе базировалось на комплексном анализе паттернов гибридизации, содержащих сигналы от нескольких зондов, специфичных для перекрывающихся групп вируса кори. Пары олигонуклеотидных зондов ("специфические" и "контрольные") использовались для детекции единичных замен нуклеотидных остатков в анализируемых образцах - мишенях.

Чтобы идентифицировать генотип анализируемого образца вируса кори, сравнивали его гибридизационный паттерн с паттернами, полученными при анализе эталонных штаммов генотипов. Коэффициент корреляции Пирсона использовался в качестве меры расстояния между сравниваемыми гибридизационными паттернами образцов. Вычислением расстояния во всевозможных вариантах парных сравнений результатов анализа ДНК-микрочипом клинических образцов и эталонных штаммов получали матрицу расстояний, которая использовалась для построения древовидной схемы, отражающей меру родства образцов между собой. Данная методика, обычно используемая при анализе дифференцильной экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов, впервые использована для целей классификации последовательностей вируса кори. Разработанный метод прошел валидацию с использованием панелей клинических образцов, полученных от больных корью и другими экзантемными заболеваниями (54 клинических образца от больных корью, 16 образцов от больных другими вирусными заболеваниями). В результате исследования, метод показал высокую чувствительность (90,7%) и специфичность (100%). Совпадение результатов генотипирования изоляов вируса кори, полученных методами ДНК-микрочипов и определением первичной последовательности участков вирусного генома с последующим филогенетическим анализом составило 85,7%. Данные различия были обусловлены малым размером выборки последовательностей, использованной для дизайна олигонуклеотидных зондов для детекции генотипа В2. После включения дополнительных зондов для детекции данного генотипа вируса кори, ДНК-микрочип был способен дифферинцировать все ранее описанные, ровно как и неизвестный на момент расчета генотип D10 вируса кори. Исходя из полученных результатов, разработанный метод может быть использован в качестве альтернативного для быстрого генотипирования большого количества изолятов вируса кори, относящихся как к ранее описанным, так и к новым генотипам.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Неверов, Александр Александрович, 2006 год

1. Агафонов А.П., Нечеухина С.Н., Патрушев Н.А., Денисов С.И., Орловская С.П., Рябчикова Е.И., Блинов В.М., Игнатьев Г.М. (1997). Выделение сибирского изолята вируса паротита. Вопросы вирусологии 42(5): 222.

2. Агафонов А.П., Каменева С.Н., Агафонова О.А., Неверов А.А., Игнатьев Г.М. (2004). Изучение вирусологических и иммунологических показателей у больных рассеянным склерозом. Вестник Российской Аадемии Медицинских Наук 8: 3.

3. Журавлева Ю.Н., Луговтцев В.Ю., Воронина О.Л., Шилов И.А., Ванюшева О.В., Лунин В.Г., Наумова М.А., Мамаева Т.А., Тихонова Н.Т. (2003). Вопросы вирусологии 4:29.

4. Максимова О.А., Попов В.Ф., Бектимиров Т.А., Григорьева Л.В., Юнасова Т.Н., Каплунова О.П., Шарова O.K. (2001). Сравнительная оценка нейровирулентности отечественной и зарубежных живых паротитных вакцин. Вопросы вирусологии 5:31.

5. Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Бурчик М.А., Рота П. Генотипический анализ диких штаммов вируса кори, циркулирующих в России в 2000-2001гг. Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. Т.3:299.

6. Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Рота П., Бурчик М.А., Седак Е.Ф. (2004). Генетическая характеристика диких штаммов вируса кори, циркулирующих на европейской территории России в период 1998-2002 гг. Вопросы вирусологии 4:12.

7. Нестеров А.Е., Каменева С.Н., Максимов Н.Л., Игнатьев Г.М. (2004). Лимфаденопатия при эпидемическом паротите у ранее вакцинированного ребенка. Инфекционные болезни 2(4): 92.

8. Попов В.Ф. Корь и коревая вакцина JI-16. М. Триада-Х, 2002:192

9. Руководство по инфекционным болезням. Под ред. Ю.В.Лобзина. С-Петербург. Фолиант, 2000: 480.

10. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Т.2. Под ред. В.И. Покровского. М. Медицина, 1993:374

11. Чумаков К.М. и Юшманов С.В. (1988). Принцип максимального топологического подобия в молекулярной систематике. Молекулярная генетика микробиология и вирусология 3:3.

12. Юшманов С.В и Чумаков К.М. (1988). Алгоритмы построения филогенетических деревьев максимального топологического подобия. Молекулярная генетика микробиология и вирусология 3:9.

13. Afzal, M. A., J. Buchanan, A. B. Heath and P. D. Minor (1997b). Clustering of mumps virus isolates by SH gene sequence only partially reflects geographical origin. Archives of Virology 142(2): 227.

14. Afzal, M. A., A. R. Pickford, T. Forsey, A. B. Heath and P. D. Minor (1993). The Jeryl Lynn vaccine strain of mumps virus is a mixture of two distinct isolates. J Gen Virol 74 (Pt 5): 917.

15. Albrecht, P., K. Herrmann and G. R. Burns (1981). Role of virus strain in conventional and enhanced measles plaque neutralization test. Journal of Virological Methods 3(5): 251.

16. Amexis, G., N. Fineschi and K. Chumakov (2001a). Correlation of genetic variability with safety of mumps vaccine Urabe AM9 strain. Virology 287(1): 234.

17. Amexis, G., S. Rubin, N. Chatteijee, K. Carbone and K. Chumakov (2003). Identification of a new genotype H wild-type mumps virus strain and its molecular relatedness to other virulent and attenuated strains. J Med Virol 70(2): 284.

18. Amexis, G., S. Rubin, V. Chizhikov, F. Pelloquin, K. Carbone and K. Chumakov (2002). Sequence diversity of Jeryl Lynn strain of mumps virus: quantitative mutant analysis for vaccine quality control. Virology 300(2): 171.

19. Arista, S., D. Ferraro, A. Cascio, E. Vizzi and R. Di Stefano (1995). Detection of IgM antibodies specific for measles virus by capture and indirect enzyme immunoassays. Research in Virology 146(3): 225.

20. Arens M. (1999). Methods for subtyping and molecular comparison of human viral genomes Clin Microbiol Rev 12(4):612.

21. Atrasheuskaya, A. V., S. N. Kameneva, A. A. Neverov and G. M. Ignatyev (2004). Acute infectious mononucleosis and coincidental measles virus infection. J Clin Virol 31(2): 160.

22. Atrasheuskaya, A. V., E. M. Blatun, A. A. Neverov, S. N. Kameneva, N. L. Maksimov, I. A. Karpov, G. M. Ignatyev (2005). Measles in Minsk, Belarus, 2001-2003: clinical, virological and serological parameters. J Clin Virol. 34(3): 179.

23. Bech, V. (1959). Studies on the development of complement fixing antibodies in measles patients. J Immunol 83:267.

24. Bellini, W. J., G. Englund, S. Rozenblatt, H. Arnheiter and C. D. Richardson (1985). Measles virus P gene codes for two proteins. J Virol 53(3): 908.

25. Bellini, W. J. and R. F. Helfand (2003). The challenges and strategies for laboratory diagnosis of measles in an international setting. J Infect Dis 187 Suppl 1: S283.

26. Bellini, W. J. and P. A. Rota (1998). Genetic diversity of wild-type measles viruses: Implications for global measles elimination programs. Emerging Infectious Diseases 4(1): 29.

27. Biellik, R., S. Madema, A. Taole, A. Kutsulukuta, E. Allies, R. Eggers, N. Ngcobo, M. Nxumalo, A. Shearley, E. Mabuzane, E. Kufa and J. M. Okwo-Bele (2002). First 5 years of measles elimination in southern Africa: 1996-2000. Lancet 359(9317): 1564.

28. Black, F. L. (1989). Measles active and passive immunity in a worldwide perspective. Progress in medical virology. Fortschritte der medizinischen Virusforschung. Progres en virologie medicale 36:1.

29. Schaffner (1994). Sustained transmission of mumps in a highly vaccinated population: Assessment of primary vaccine failure and waning vaccine-induced immunity. Journal of ® Infectious Diseases 169(1): 77.

30. Broliden, К., E. R. Abreu, M. Arneborn and M. Bo?ttiger (1998). Immunity to mumps p before and after MMR vaccination at 12 years of age in the first generation offered the twodose immunization programme. Vaccine 16(2-3): 323.

31. Brown, E. G., K. Dimock and К. E. Wright (1996). The Urabe AM9 mumps vaccine is a mixture of viruses differing at amino acid 335 of the hemagglutinin-neuraminidase gene with one form associated with disease. Journal of Infectious Diseases 174(3): 619.

32. Cattaneo, R., К. Kaelin, К. Baczko and M. A. Billeter (1989). Measles virus editing provides an additional cysteine-rich protein. Cell 56(5): 759.

33. Cattaneo, R., G. Rebmann, A. Schmid, K. Baczko, V. ter Meulen and M. A. Billeter (1987). Altered transcription of a defective measles virus genome derived from a diseased human brain. Embo J 6(3): 681.

34. Chamot, E., L. Toscani, P. Egger, D. Germann and C. Bourquin (1998). Estimation of the efficacy of three strains of mumps vaccine during an outbreak in Geneva state (Switzerland). Rev Epidemiol Sante Publique 46(2): 100.

35. Chen, R. Т., L. E. Markowitz, P. Albrecht, J. A. Stewart, L. M. Mofenson, S. R. Preblud and W. A. Orenstein (1990). Measles antibody: Reevaluation of protective titers. Journal of Infectious Diseases 162(5): 1036.

36. Chibo, D., C. J. Birch, P. A. Rota and M. G. Catton (2000). Molecular characterization of measles viruses isolated in Victoria, Australia, between 1973 and 1998. J Gen Virol 81(Pt 10): 2511.

37. Chibo, D., M. Riddell, M. Catton and C. Birch (2002). Novel measles virus genotype, East Timor and Australia. Emerg Infect Dis 8(7): 735.

38. Chibo, D., M. Riddell, M. Catton, M. Lyon, G. Lum and C. Birch (2003). Studies of measles viruses circulating in Australia between 1999 and 2001 reveals a new genotype. Virus Res 91(2): 213.

39. Chizhikov, V., A. Rasooly, K. Chumakov and D. D. Levy (2001). Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl Environ Microbiol 67(7): 3258.

40. Cizman, M., M, Mozetic, R. Radescek-Rakar, D. Pleterski-Rigler and M. Susec-Michieli (1989). Aseptic meningitis after vaccination against measles and mumps. Pediatric Infectious Disease Journal 8(5): 302.

41. Cochi, S. L., M. Wharton and S. A. Plotkin (1994). Mumps vaccine. In: Vaccines. Plotkin S.A., Mortimer E.A.Philadelphia, WB Saunders: 277.

42. The risk of aseptic meningitis associated with the Leningrad-Zagreb mumps vaccine strain il following mass vaccination with measles-mumps-rubella vaccine, Rio Grande do Sul,

43. Brazil, 1997. Int J Epidemiol 31:978.

44. Medicina Tropical de Sao Paulo 33(1): 32.57. de Swart, R.L., S. Yuksel and A. D. Osterhaus (2005). Relative contributions of measles virus hemagglutinin- and fusion protein-specific serum antibodies to virus neutralization. J Virol. Sep;79(17): 11547

45. Drake, J.W. and J.J. Holland (1999). Mutation rates among RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A 96 (24): 13910.

46. Eisen, M. В., Р. Т. Spellman, P. 0. Brown and D. Botstein (1998). Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 95(25): 14863.

47. Elango, N., Т. M. Varsanyi, J. Kovamees and E. Norrby (1988). Molecular cloning and characterization of six genes, determination of gene order and intergenic sequences and leader sequence of mumps virus. J Gen Virol 69 (Pt 11): 2893.

48. Elango, N., Т. M. Varsanyi, J. Kovamees and E. Norrby (1989). The mumps virus fusion protein mRNA sequence and homology among the paramyxoviridae proteins. Journal of General Virology 70(4): 801.

49. Elliott, G. D., M. A. Afzal, S. J. Martin and В. K. Rima (1989). Nucleotide sequence of the matrix, fusion and putative SH protein genes of mumps virus and their deduced amino acid sequences. Virus Research 12(1): 61.

50. Featherstone, D., D. Brown and R. Sanders (2003). Development of the Global Measles Laboratory Network. J Infect Dis 187 Suppl 1: S264.

51. Fescharek, R., U. Quast, G. Maass, W. Merkle and S. Schwarz (1990). Measles-mumps vaccination in the FRG: An empirical analysis after 14 years of use. II. Tolerability and analysis of spontaneously reported side effects. Vaccine 8(5): 446.

52. Forleo-Neto, E., E. S. Carvalho, I. C. P. Fuentes, M. S. Precivale, L. H. A. Forleo and С. K. Farhat (1997). Seroconversion of a trivalent measles, mumps, and rubella vaccine in children aged 9 and 15 months. Vaccine 15(17-18): 1898.

53. Forsey, Т., M. L. Bentley, P. D. Minor and N. Begg (1992). Mumps vaccines and meningitis 25. Lancet 340(8825): 980. W 69. Furesz, J. and G. Contreras (1990). Vaccine-related mumps meningitis-Canada. Canadadiseases weekly report 16(50): 253.

54. Galazka, A. M., S. E. Robertson and A. Kraigher (1999). Mumps and mumps vaccine: A global review. Bulletin of the World Health Organization 77(1): 3.

55. Giraudon, P., M. F. Jacquier and T. F. Wild (1988). Antigenic analysis of African measles virus field isolates: Identification and localisation of one conserved and two variable epitope$sites on the NP protein. Virus Research 10(2-3): 137.

56. Gluck, R., J. M. Hoskins and A. Wegmann (1986). Rubini, a new live attenuated mumps vaccine virus strain for human diploid cells. Developments in Biological Standardization• Vol. 65: 29.

57. Gotoh, В., Т. Komatsu, К. Takeuchi and J. Yokoo (2001). Paramyxovirus accessory ^ proteins as interferon antagonists. Microbiology and Immunology 45(12): 787.

58. Hamaguchi, M., T. Yoshida, K. Nishikawa, H. Naruse and Y. Nagai (1983). Transcriptive complex of Newcastle disease virus. I. Both L and P proteins are required to constitute an active complex. Virology 128(1): 105.

59. Hersh, В. S., P. E. M. Fine, W. K. Kent, S. L. Cochi, L. H. Kahn, E. R. Zell, P. L. Hays and C. L. Wood (1991). Mumps outbreak in a highly vaccinated population. Journal of Pediatrics 119(2): 187.

60. Hersh, B. S., G. Tambini, A. C. Nogueira, P. Carrasco and C. A. De Quadras (2000). Review of regional measles surveillance data in the Americas, 1996-99. Lancet 355(9219): 1943.

61. Hilleman, M. R., E. B. Buynak, R. E. Weibel and J. Stokes, Jr. (1968). Live, attenuated mumps-virus vaccine. N Engl J Med 278(5): 227.

62. Howley, P. M., B. Lafont, D. Spehner, K. Kaelin, M. A. Billeter and R. Drillien (1999). A functional measles virus replication and transcription machinery encoded by the vaccinia virus genome. J Virol Methods 79(1): 65.

63. Hummel, К. В., D. D. Erdman, J. Heath and W. J. Bellini (1992). Baculovirus expression of the nucleoprotein gene of measles virus and utility of the recombinant protein in diagnostic enzyme immunoassays. Journal of Clinical Microbiology 30(11): 2874.

64. Ihara, Т., H. Ochiai, K. Kitamura, M. Ito, M. Sakurai and H. Kamiya (1995). Markedly elevated levels of a2-microglobulin in urine with measles viruria in patients with measles. Clinical and Diagnostic Virology 4(4): 285.

65. Isa, M. В., L. Marti?nez, M. Giordano, M. Zapata, С. Passeggi, M. С. De Wolff and S. Nates (2001). Measles virus-specific immunoglobulin G isotype immune response in early and late infections. Journal of Clinical Microbiology 39(1): 170.

66. Ivancic, J., Т. K. Gulija, D. Forcic, M. Baricevic, R. Jug, M. Mesko-Prejac and R. Mazuran (2005). Genetic characterization of L-Zagreb mumps vaccine strain. Virus Res 109(1): 95.

67. Jefferson, Т., D. Price, V. Demicheli and E. Bianco (2003). Unintended events following immunization with MMR: a systematic review. Vaccine 21(25-26): 3954.

68. Jenkerson, S. A., M. Beller, J. P. Middaugh and D. D. Erdman (1995). False positive ® rubeola IgM tests 4. New England Journal of Medicine 332(16): 1103.

69. Jin, L., S. Beaid and D. W. Brown (1999). Genetic heterogeneity of mumps virus in the United Kingdom: identification of two new genotypes. J Infect Dis 180(3): 829.

70. Jin, L., D. W. G. Brown, P. A. Litton and J. M. White (2004). Genetic diversity of mumps p virus in oral fluid specimens: Application to mumps epidemiological study. Journal ofф Infectious Diseases 189(6): 1001.

71. Jin, L., D. W. G. Brown, M. E. B. Ramsay, P. A. Rota and W. J. Bellini (1997). The diversity of measles virus in the United Kingdom, 1992-1995. Journal of General Virology 78(6): 1287.

72. Jin, L., B. Rima, D. Brown, C. Orvell, T. Tecle, M. Afzal, K. Uchida, T. Nakayama, J. W.t

73. Song, C. Kang, P. A. Rota, W. Xu and D. Featherstone (2005). Proposal for geneticcharacterisation of wild-type mumps strains: preliminary standardisation of the nomenclature. Arch Virol 150(9): 1903.

74. Johansson, В., Т. Tecle and C. Orvell (2002). Proposed criteria for classification of new genotypes of mumps virus. Scand J Infect Dis 34(5): 355.

75. Kashiwagi, Y., T. Takami, T. Mori and T. Nakayama (1999). Sequence analysis of F, SH, and HN genes among mumps virus strains in Japan. Archives of Virology 144(3): 593.

76. Kobune, F., H. Sakata and A. Sugiura (1990). Marmoset lymphoblastoid cells as a sensitive host for isolation of measles virus. Journal of Virology 64(2): 700.

77. Kolakofsky, D. and A. Bruschi (1975). Antigenomes in Sendai virions and Sendai virus-infected cells. Virology 66(1): 185.

78. Kolakofsky, D., T. Pelet, D. Garcin, S. Hausmann, J. Curran and L. Roux (1998). Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. J Virol 72(2): 891.

79. Kouomou, D. W., E. Nerrienet, J. Mfoupouendoun, G. Тепе, H. Whittle and T. F. Wild (2002). Measles virus strains circulating in Central and West Africa: Geographical distribution of two B3 genotypes. J Med Virol 68(3): 433.

80. Kovamees, J., R. Rydbeck, C. Orvell and E. Norrby (1990). Hemagglutinin-neuraminidase (HN) amino acid alterations in neutralization escape mutants of Kilham mumps virus. Virus Research 17(2): 119.

81. Kraigher, A. Monitoring Side-Effects and Adverse Events Following Immunization Against Measles and Mumps in a National Vaccination Programme in Slovenia from 1982 to 1986.

82. Kreis, S. and T. Whistler (1997). Rapid identification of measles virus strains by the heteroduplex mobility assay. Virus Res 47(2): 197.

83. Kremer, J. R., F. Fack, С. M. Olinger, M. N. Mulders and C. P. Muller (2004). Measles virus genotyping by nucleotide-specific multiplex PCR. J Clin Microbiol 42(7): 3017.

84. Kumar, S., K. Tamura, I. B. Jakobsen and M. Nei MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software.

85. Kumar, S., K. Tamura and M. Nei (2004). MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief Bioinform 5(2): 150.

86. Kunkel, U., G. Driesel, U. Henning, E. Gerike, H. Willers and E. Schreier (1995). Differentiation of vaccine and wild mumps viruses by polymerase chain reaction and nucleotide sequencing of the SH gene: brief report. J Med Virol 45(2): 121.

87. Laassri, M., V. Chizhikov, M. Mikheev, S. Shchelkunov and K. Chumakov (2003). Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. J Virol Methods 112(1-2): 67.

88. Lamb R.A. and Kolakofsky D. (2001). Paramyxoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields Virology. Knipe D.M. and Howley P.M. Philadelphia, Lippincott Williams and Wilkins. 2: 1305.

89. Lee, J. Y., Y. Y. Kim, G. C. Shin, В. K. Na, J. S. Lee, H. D. Lee, J. H. Kim, W. J. Kim, J. Kim, C. Kang and H. W. Cho (2003). Molecular characterization of two genotypes of mumps virus circulated in Korea during 1998-2001. Virus Research 97(2): 111.

90. Levitt, L.P., D.H. Mahoney, H.L. Casey, J.O. Bond (1970). Mumps in a general population: A sero-epidemiologic study. Am J Dis Child 120:134.

91. Lim, С. S., К. P. Chan, К. Т. Goh and V. Т. К. Chow (2003). Hemagglutinin-neuraminidase sequence and phylogenetic analyses of mumps virus isolates from a vaccinated population in Singapore. Journal of Medical Virology 70(2): 287.

92. Lund, G. A., D. L. Tyrrell, R. D. Bradley and D. G. Scraba (1984). The molecular length of measles virus RNA and the structural organization of measles nucleocapsids. J Gen Virol 65 (Pt 9): 1535.

93. Margraf, R.L., M. Erali, M. Liew, C.T. Wittwer (2004). Genotyping hepatitis С virus by heteroduplex mobility analysis using temperature gradient capillary electrophoresis. J Clin Microbiol. 42(10): 4545.

94. Matsumoto, T. (1982). Assembly of paramyxoviruses. Microbiol Immunol 26(4): 285.

95. McCarthy, M. and R. A. Lazzarini (1982). Intracellular nucleocapsid RNA of mumps virus. J Gen Virol 58 Pt 1:205.

96. Miller, E., M. Goldacre, S. Pugh, A. Colville, P. Farrington, A. Flower, J. Nash, L. MacFarlane and R. Tettmar (1993). Risk of aseptic meningitis after measles, mumps, and rubella vaccine in UK children. Lancet 341(8851): 979.

97. Miller, E., A. Hill, P. Morgan-Capner, T. Forsey and M. Rush (1995). Antibodies to measles, mumps and rubella in UK children 4 years after vaccination with different MMR vaccines. Vaccine 13(9): 799.

98. Minnich, L. L., F. Goodenough and C. G. Ray (1991). Use of immunofluorescence to identify measles virus infections. Journal of Clinical Microbiology 29(6): 1148.

99. Mori, T. (1994). A simple method for genetic differentiation of the AIK-C vaccine strain from wild strains of measles virus. Biologicals 22(2): 179.

100. Muhlemann, K. (2004). The molecular epidemiology of mumps virus. Infect Genet Evol 4(3): 215.

101. Mulders, M. N., A. T. Truong and C. P. Muller (2001). Monitoring of measles elimination using molecular epidemiology. Vaccine 19(17-19): 2245.

102. Muwonge, A., M. Nanyunja, P. A. Rota, J. Bwogi, L. Lowe, S. L. Liffick, W. J. Bellini and S. Sylvester (2005). New measles genotype, Uganda. Emerg Infect Dis 11(10): 1522.

103. Nates, S. V., G. Y. Rey, M. 0. Giordano, M. T. Zapata, A. Depetris and J. Boshell (1994). Modified seroneutralization assay for measles virus antibody detection. Research in Virology 145(1): 45.

104. Nojd, J., T. Tecle, A. Samuelsson and C. 0?rvell (2001). Mumps virus neutralizing antibodies do not protect against reinfection with a heterologous mumps virus genotype. Vaccine 19(13-14): 1727.

105. Ohara, O., R. L. Dorit and W. Gilbert (1989). Direct genomic sequencing of bacterial DNA: the pyruvate kinase I gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 86(18): 6883.

106. Okazaki, К., K. Tanabayashi, K. Takeuchi, M. Hishiyama, K. Okazaki and A. Yamada (1992). Molecular cloning and sequence analysis of the mumps virus gene encoding the L protein and the trailer sequence. Virology 188(2): 926.

107. Orvell, C. (1978). Structural polypeptides of mumps virus. J Gen Virol 41(3): 527.

108. Orvell, C., A. R. Alsheikhly, M, Kalantari and B. Johansson (1997a). Characterization of genotype-specific epitopes of the HN protein of mumps virus. Journal of General Virology 78(12): 3187.

109. Orvell, С., M. Kalantari and В. Johansson (1997b). Characterization of five conserved genotypes of the mumps virus small hydrophobic (SH) protein gene. Journal of General Virology 78(1): 91.

110. Paccaud, M. F., P. Hazeghi, M. Bourquin, A. M. Maurer, C. A. Steiner, A. J. Seiler, P. Helbling and H. Zimmermann (1995). Two mumps outbreaks in retrospect RUCKBLICK AUF ZWEIMUMPSAUSBRUCHE. Sozial- und Praventivmedizin 40(2): 72.

111. Paterson, R. G. and R. A. Lamb (1990). RNA editing by G-nucleotide insertion in mumps virus P-gene mRNA transcripts. Journal of Virology 64(9): 4137.

112. Pease, A.C., D. Solas, E. J. Sullivan, M. T. Cronin, C. P. Holmes, S. P. Fodor (1994). Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci USA. 91:5022.

113. Preblud, S.R. and S.L. Katz (1994). Measles vaccine. In: Vaccines. Plotkin S.A., Mortimer E.A. Philadelphia, WB Saunders: 182

114. Ratnam, S., G. Tipples, C. Head, M. Fauvel, M. Fearon and B. J. Ward (2000). Performance of indirect immunoglobulin M (IgM) serology tests and IgM capture assays for laboratory diagnosis of measles. Journal of Clinical Microbiology 38(1): 99.

115. Riddell, M. A., J. S. Rota and P. A. Rota (2005). Review of the temporal and geographical distribution of measles virus genotypes in the prevaccine and postvaccine eras. Virol J 2: 87.

116. Rota, J. S., P. A. Rota, S. B. Redd, S. C. Redd, S. Pattamadilok and W. J. Bellini (1998). Genetic analysis of measles viruses isolated in the United States, 1995-1996. J Infect Dis177(1): 204.

117. Rota, P. A. and W. J. Bellini (2003). Update on the global distribution of genotypes of wild type measles viruses. J Infect Dis 187 Suppl 1: S270.

118. Rota, P. A., S. L. Liffick, J. S. Rota, R. S. Katz, S. Redd, M. Papania and W. J. Bellini (2002). Molecular epidemiology of measles viruses in the United States, 1997-2001. Emerg Infect Dis 8(9): 902.Ш

119. Rubin, S. A., G. Amexis, M. Pletnikov, Z. Li, J. Vanderzanden, J. Mauldin, C. Sauder, T. Malik, K. Chumakov and К. M. Carbone (2003). Changes in mumps virus gene sequence associated with variability in neurovirulent phenotype. J Virol 77(21): 11616.

120. Sallie, R. (2005). Replicative Homeostasis: A fundamental mechanism mediating selective viral replication and escape mutation. Virol J 2(1): 10.

121. Santibanez, S., A. Heider, E. Gerike, A. Agafonov and E. Schreier (1999). Genotyping of measles virus isolates from Central Europe and Russia. Journal of Medical Virology 58(3): 313.Ъ

122. Santibanez, S., A. Tischer, A. Heider, A. Siedler and H. Hengel (2002). Rapid replacement of endemic measles virus genotypes. Journal of General Virology 83(11): 2699.

123. Sauder, С. J., К. M. Vandenburgh, R. С. Iskow, Т. Malik, К. M. Carbone and S. A. Rubin (2006). Changes in mumps virus neurovirulence phenotype associated with quasispecies heterogeneity. Virology.

124. Schena, M., D. Shalon, R, W. Davis, P. 0. Brown (1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270:467.

125. Schrag, S. J., P. A. Rota and W. J. Bellini (1999). Spontaneous mutation rate of measles virus: Direct estimation based on mutations conferring monoclonal antibody resistance. Journal of Virology 73(1): 51.

126. Sergeev, N., M. Distler, S. Courtney, S. F. Al-Khaldi, D. Volokhov, V. Chizhikov and A. Rasooly (2004). Multipathogen oligonucleotide microarray for environmental and biodefense applications. Biosens Bioelectron 20(4): 684.

127. Server, A. C., D. C. Merz, M. N. Waxham and J. S. Wolinsky (1982). Differentiation of mumps virus strains with monoclonal antibody to the HN glycoprotein. Infection and Immunity 35(1): 179.

128. Singh, R., T. J. John, T. Cherian and P. Raghupathy (1994). Immune response to measles, mumps and rubella vaccine at 9, 12 and 15 months of age. Indian Journal of Medical Research ЮО(ОСТ.): 155.

129. Smaron, M. F„ E. Saxon, L. Wood, C. McCarthy and J. A. Morello (1991). Diagnosis of measles by fluorescent antibody and culture of nasopharyngeal secretions. Journal of Virological Methods 33(1-2): 223.

130. Smit, S. В., D. Hardie and С. T. Tiemessen (2005). Measles virus genotype B2 is not inactive: evidence of continued circulation in Africa. J Med Virol 77(4): 550.

131. Smorodintsev, A. A., M. N. Nasibov and N. V. Jakovleva (1970). Experience with live rubella virus vaccine combined with live vaccines against measles and mumps. Bull World Health Organ 42(2): 283.

132. Stallcup, К. C., S. L. Wechsler and B. N. Fields (1979). Purification of measles virus and characterization of subviral components. J Virol 30(1): 166.

133. Strohle, A., C. Bernasconi and D. Germann (1996). A new mumps virus lineage found in the 1995 mumps outbreak in western Switzerland identified by nucleotide sequence analysis of the SH gene. Archives of Virology 141(3-4): 733.

134. Sugiura, A. and A. Yamada (1991). Aseptic meningitis as a complication of mumpsvaccination. Pediatric Infectious Disease Journal 10(3): 209.

135. Takahashi, M., T. Nakayama, Y. Kashiwagi, T. Takami, S. Sonoda, T. Yamanaka, H.

136. Takeuchi, К., K. Tanabayashi, M. Hishiyama and A. Yamada (1996). The mumps virus SH protein is a membrane protein and not essential for virus growth. Virology 225(1): 156.

137. Tamin, A., P. A. Rota, Z. D. Wang, J. L. Heath, L. J. Anderson and W. J. Bellini (1994).ф Antigenic analysis of current wild type and vaccine strains of measles virus. Journal of1.fectious Diseases 170(4): 795.

138. Tanabayashi, К., К. Takeuchi, К. Okazaki, М. Hishiyama and A. Yamada (1992). Expression of mumps virus glycoproteins in mammalian cells from cloned cDNAs: both Fj** and HN proteins are required for cell fusion. Virology 187(2): 801.

139. Tanabayashi, К., K. Takeuchi, K. Okazaki, M. Hishiyama and A. Yamada (1993). Identification of an amino acid that defines the fusogenicity of mumps virus. Journal of Virology 67(5): 2928.

140. Tecle, Т., В. Bottiger, С. Orvell and B. Johansson (2001). Characterization of two decades of temporal co-circulation of four mumps virus genotypes in Denmark: Identification of anew genotype. Journal of General Virology 82(11): 2675.

141. Tecle, Т., В. Johansson, A. Jejcic, M. Forsgren and C. Orvell (1998). Characterization of three co-circulating genotypes of the small hydrophobic protein gene of mumps virus. J Gen1. Ф Virol 79 (Pt 12): 2929.

142. Tecle, Т., В. Johansson, Z. Yun and C. 0?rvell (2000). Antigenic and genetic t characterization of the fusion (F) protein of mumps virus strains. Archives of Virology145(6): 1199.

143. Tesovic, G., J. Begovac and A. Bace (1993). Aseptic meningitis after measles, mumps, and rubella vaccine. Lancet 341(8859): 1541.

144. Thomas, H. I. J., E. Barrett, L. M. Hesketh, A. Wynne and P. Morgan-Capner (1999). ^ Simultaneous IgM reactivity by EIA against more than one virus in measles, parvovirus В19ф and rubella infection. Journal of Clinical Virology 14(2): 107.

145. Tidona, С. A., H. W. Kurz, H. R. Gelderblom and G. Darai (1999). Isolation and molecular characterization of a novel cytopathogenic paramyxovirus from tree shrews. Virology 258(2): 425.

146. Tikhonova, N., T. Mamaeva, M. Naumova, E. Leschinskaja, M. Volkov, I. MartynenkoЬ1992). Wild measles virus strain: Isolation and Identification. Acta Virol. 36: 557.

147. Tipples, G. A., M. Gray, M. Garbutt and P. A. Rota Genotyping of measles virus in Canada: 1979-2000. J Infect Dis 189 Suppl 1: S171

148. Tuokko, H. (1995). Detection of acute measles infections by indirect and capture enzyme immunoassays for immunoglobulin M antibodies and measles immunoglobulin G antibody avidity enzyme immunoassay. Journal of Medical Virology 45(3): 306.

149. Uchida, К., M. Shinohara, S. I. Shimada, Y. Segawa and Y. Hoshino (2001). Characterization of mumps virus isolated in Saitama Prefecture, Japan, by sequence analysis of the SH gene. Microbiology and Immunology 45(12): 851.

150. Ueda, К., C. Miyazaki, Y. Hidaka, K. Okada, K. Kusuhara and R. Kadoya (1995). Asepticmeningitis caused by measles-mumps-rubella vaccine in Japan. Lancet 346(8976): 701.

151. Utz, S., J. L. Richard, S. Capaul, H. C. Matter, M. G. Hrisoho and K. Muhlemann (2004). ^ Phylogenetic Analysis of Clinical Mumps Virus Isolates from Vaccinated and Non

152. Vaccinated Patients with Mumps during An Outbreak, Switzerland 1998-2000. Journal of % Medical Virology 73(1): 91.

153. Vesikari, Т., F. E. Andre and E. Simoen (1983). Evaluation in young children of the Urabe Am 9 strain of live attenuated mumps vaccine in comparison with the Jeryl Lynn strain. Acta Paediatrica Scandinavica 72(1): 37.

154. Waxham, M. N., J. Aronowski, A. C. Server, J. S. Wolinsky, J. A. Smith and H. M. Goodman (1988). Sequence determination of the mumps virus HN gene. Virology 164(2): 318.

155. Waxham, M. N., A. C. Server, H. M. Goodman and J. S. Wolinsky (1987). Cloning and sequencing of the mumps virus fusion protein gene. Virology 159(2): 381.

156. WHO-UNICEF (2002). Joint statement on strategies to reduce measles mortality worldwide. Wkly Epidemiol Rec 77(27): 224.

157. WHO (2001a). Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (update). Wkly Epidemiol Rec 76(33): 249.

158. WHO (2001b). Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (update). Part I. Weekly epidemiological record. Releve epidemiologique hebdomadaire. World Health Organization 76(32): 242.

159. WHO (2001c). Progress toward interrupting indigenous measles transmission Region of the Americas, January-November 2001. Morbidity and Mortality Weekly Report 50(50): 1133.

160. WHO (2003). Update of the nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses: new genotypes and reference strains. Wkly Epidemiol Rec 78(27): 229.

161. WHO (2005a). Global measles and rubella laboratory network-update. Wkly Epidemiol Rec 80(44): 384.

162. WHO (2005b). Global Measles and Rubella Laboratory Network, January 2004-June 2005. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 54(43): 1100.

163. WHO (2005c). Measles. Fact sheet no. 286. Geneva, Switzerland, World Health Organization.

164. WHO (2005d). New genotype of measles virus and update on global distribution of measles genotypes. Wkly Epidemiol Rec 80(40): 347.

165. WHO Expert Committee on Biological Standardization Forty-fourth report. WHO Expert Technical Report Series 848.

166. WHO Mortality Reduction and Regional Elimination (2001). Strategic Plan 2001-2005; Global Measles'. 1.

167. WHO Vaccines Immunization and Biologicals. Belarus Reported Cases.

168. Wild, T. F., E. Malvoisin and R. Buckland (1991). Measles virus: both the haemagglutinin ^ and fusion glycoproteins are required for fusion. J Gen Virol 72 (Pt 2): 439.

169. Wolinsky, J. S., M. N. Waxham and A. C. Server (1985). Protective effects of glycoprotein-I specific monoclonal antibodies on the course of experimental mumps virusmeningoencephalitis. Journal of Virology 53(3): 727.

170. Wu, L., Z. Bai, Y. Li, В. K. Rima and M. A. Afzal (1998). Wild type mumps viruses circulating in China establish a new genotype. Vaccine 16(2-3): 281.

171. Xu, W. В., A. Tamin, J. S. Rota, L. Zhang, W. J. Bellini and P. A. Rota (1998). New genetic ^ group of measles virus isolated in the People's Republic of China. Virus Research 54(2):147.

172. Yates, P. J., M. A. Afzal and P. D. Minor (1996). Antigenic and genetic variation of the HN protein of mumps virus strains. Journal of General Virology 77(10): 2491.

173. Yeo, R. P., M. A. Afzal, T. Forsey and В. K. Rima (1993). Identification of a new mumps virus lineage by nucleotide sequence analysis of the SH gene of ten different strains. Archives of Virology 128(3-4): 371.1. ОТ АВТОРА

174. Работа выполнялась при финансовой поддержке ВТЕР (грант ВТЕР-16 (МНТЦ-2168)) в Лаборатории Иммунологической Безопасности ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва) и US FDA (Rockville, США).