Молекулярно-генетические подходы к изучению РНК-содержащих вирусов на моделях морбилливируса байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, доктор биологических наук Беликов, Сергей Иванович

• Беликов, Сергей Иванович
• доктор биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации доктор биологических наук Беликов, Сергей Иванович

ВВЕДЕНИЕ . В

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Таксономия вирусов.

ГЛАВА 2. Род Morbillivirus: организация генома, структурные белки, транскрипция и репликация

ГЛАВА 3. Род Flavivirus: организация генома, структурные белки и репликация флавивирусной РНК.

ГЛАВА 4. Методы молекулярной биологии, используемые для анализа нуклеотидной последовательности вирусного РНКгенома.

4.1. Получение кДНК на основе вирусной РНК.

4.2. Методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК.

4.3. Методы построения филогенетических схем

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5.1. Материалы.

5.2. Методы.

ГЛАВА 6. Идентификация неизвестного патогена, вызвавшего эпизоотию байкальской нерпы, методом гибридизации нуклеиновых кислот.

6.1. Выбор ол иго нуклеотидных зондов для обнаружения РНК вируса чумы плотоядных.

6.2. Гибридизация РНК из тканей нерпы, имеющей клиническую картину заболевания, характерную для вируса чумы плотоядных.

6.3. Сравнительная гибридизация РНК, выделенных от погибших животных и животных без клинических проявлений инфекции.

6.4. Оптимизация условий гибридизации, выбор эффективных зондов.

6.5. Оценка уровня зараженности популяции нерпы.

6.6. Выявление уровня гомологии между вакцинным штаммом

СБУ и вирусом байкальской нерпы.

ГЛАВА 7. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей морбилливирусов.

7.1. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена N изолята вируса от байкальской нерпы и вакцинных штаммов СЭУ.

7.2. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена Р вируса от байкальской нерпы, вакцинных штаммов СБУ и изолятов СБУ от животных.

7 3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей генов и белков Р, С и V.

7.4. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена Н белка гемагглютинина.

7.5. Изучение структуры фрагмента гена Р изолятов вируса байкальской нерпы в течение 10-летнего периода от начала эпизоотии.

ГЛАВА 8. Молекулярно-генетическое изучение вируса КЭ, циркулирующего на территории России.

8.1. Определение структуры фрагмента гена Е.

8.2. Филогенетический анализ.

8.3. Анализ аминокислотной структуры фрагмента белка Е

ГЛАВА 9. Определение гетерогенности популяции вируса на территории России методом гибридизации.

9.1. Усовершенствование подходов к количественному анализу данных гибридизационных тестов.

9.2. Генетическая гетерогенность штаммов вируса, вызвавших заболевание различной тяжести у больных людей.

9.3. Сравнительный анализ гетерогенности региональных вирусных популяций.

9.4. Различия в генетических вариантах вируса КЭ, выделенного от клещей и животных в Прибайкалье-Забайкалье.

9.5. Поиск корреляции между вирулентностью штамма и данными его гибридизации с различными зондами.

ГЛАВА 10. Синтез олигонуклеотидов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетические подходы к изучению РНК-содержащих вирусов на моделях морбилливируса байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита»

Актуальность проблемы. В последние годы на территории России, и на территории Иркутской области в частности, стремительно увеличивается заболеваемость населения, обусловленная РНК содержащими вирусами (вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека и вирус клещевого энцефалита). Эти РНК-содержащие вирусы обладают высокой скоростью изменчивости, что затрудняет использование для их диагностики и идентификации обычных методов иммуноанализа. Отсутствие знаний о штаммовых различиях вируса не позволяет на научной основе разрабатывать необходимые вакцинные и лекарственные препараты для борьбы с этими эпидемиологически опасными инфекциями.

РНК содержащий вирус явился также причиной вспышка в 1987-1988 годах на Байкале острого инфекционного заболевания у байкальских тюленей (Phoca sibirica Gmel., байкальская нерпа), которая привела к гибели более 6500 животных из общего числа 80-100 тысяч (Петров, 1992; Пронин, 1992). Несмотря на то, что вирус, вызвавший эпизоотию, не патогенен для человека, сам факт появления у него мутаций, которые привели к смене хозяина, является чрезвычайно опасным. Не исключено, что при попадании в новые экологические условия, вирус будет мутировать с существенно большей скоростью и, таким образом, существует возможность еще одной смены хозяина и появление вируса, патогенного для человека.

Ранее эпизоотии у байкальских тюленей не регистрировались. Клиническая картина болезни, патологические изменения органов и тканей животных и характер распространения заболевания указывали на то, что популяция байкальских тюленей подверглась воздействию инфекционного агента, вероятно, вируса чумы плотоядных (CDV - род Morbillivirus, семейство Paramyxovirus). Массовое заболевание байкальской нерпы стало первым зарегистрированным случаем морбилливирусной инфекции среди водных млекопитающих. До 1987 г. были описаны 4 вируса рода Morbillivirus: вирус кори (MV), патогенный для человека, вирус чумы крупного рогатого скота (RPV, риндерпест), вирус чумы мелких жвачных животных (PPRV) и вирус чумы плотоядных (CDV), поражающий в основном домашних собак и пушных зверей. Считалось, что каждый представитель рода морбилливирусов имеет свой круг хозяев (Barrett, 1991). Так, вирус чумы плотоядных может поражать представителей 5 из 7 семейств отряда хищных. Данных о восприимчивости к морбилливирусам не только байкальских тюленей, но и других представителей отряда ластоногих, не было.

Через полгода в 1988 г. вспышке аналогичной болезни подверглись популяции других ластоногих (Pinnipedia), а именно серых {Halichoerus gryphus) и обыкновенных (Phoca vitulina) тюленей в Балтийском и Северном морях (Osterhaus, 1988а). Позднее морбилливирусные инфекции были зарегистрированы в Средиземном море среди популяций морских свиней и дельфинов - представителей отряда китообразных {Cetáceo). За прошедшее десятилетие вирус чумы плотоядных продолжал менять своих хозяев и инфицировал не только морских млекопитающих, но и большое число других наземных животных, включая кошачьих и гиеновых, у которых ранее данная инфекция также не наблюдалась (Appel, 1994; Harder, 1995; Harder, 1996).

Молекулярно-биологическое изучение новых морбилливирусов, в том числе вируса байкальской нерпы и других вариантов вируса чумы плотоядных, представляет особый интерес, поскольку это не только расширяет существующие знания относительно разнообразия циркулирующих в природе вирусов, но и раскрывает некоторые возможные молекулярные механизмы неожиданной смены хозяина, обнаруженной практически одновременно в нескольких местах. Относительно низкий риск заражения исследователя этим вирусом делает его хорошей моделью для отработки методов исследования морбилливирусов, один из представителей которых, вирус кори, является патогенным для человека.

Вирус клещевого энцефалита, в отличие от морбилливируса' байкальской нерпы, известен давно. Вызываемый этим вирусом клещевой энцефалит является наиболее тяжелой и распространенной, природно-очаговой инфекцией на территории России. Несмотря на 60-летний опыт изучения и борьбы с этим заболеванием, разработкой и практическим применением нескольких поколений профилактических вакцин, заболеваемость КЭ в стране неуклонно растет. Особенно неблагоприятно ситуация складывается в азиатской части России. Например, заболеваемость клещевым энцефалитом в Иркутской области постоянно увеличивается, и выросла в 5 раз за последние 5 лет (Саламатова, 1999). В то же время существует проблема эффективности препаратов для вакцинации и экстренной профилактики, которая обусловлена высокой изменчивостью вируса и отсутствием знаний о штаммовом составе вируса, циркулирующего в настоящее время. До последнего времени считалось, что существуют два варианта вируса клещевого энцефалита, дальневосточный и центрально-европейский. Известно, что дальневосточный вариант КЭ протекает чрезвычайно тяжело и обусловливает летальность порою до 30 % (Леонова, 1997). Центрально-европейский вариант вируса отличается сравнительно доброкачественным течением. Недавно на территории России обнаружен третий вариант вируса КЭ, который по тяжести заболевания занимает промежуточное положение между дальневосточными и центрально-европейскими вариантами вируса. Несмотря на то, что в литературе опубликован ряд работ о существовании нескольких антигенных вариантов вируса КЭ, эти данные нельзя считать абсолютно убедительными, так как они получены на основе различных методологических подходов и критериев оценки различий.

Учитывая высокую точность и информативность методов молекулярной биологии для понимания генетической структуры региональных природных популяций вируса КЭ и для анализа фундаментальных вопросов его эволюции в прошлом и в настоящее время, мы посчитали актуальным изучить молекулярно-эпидемиологические особенности вируса КЭ на территории бывшего Советского Союза. Применение современных методов молекулярной вирусологии, таких как молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот с различными высокоспецифичными зондами и определение структуры генома вируса важно также для решения практических задач, направленных на совершенствование прогноза эпидситуации, диагностики, профилактики и лечения различных инфекций.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилась разработка методических подходов для решения вопросов идентификации и молекулярно-эпидемиологической характеристики на примере двух РНК содержащих вирусов морбилливируса байкальской нерпы и вируса клещевого энцефалита.

Для этого необходимо было последовательно решить следующие задачи:

1. Подобрать структуры олигонуклеотидных зондов для определения наличия вирусоспецифических РНК в образцах тканей павших и больных животных на основании сравнения опубликованных нуклеотидных последовательностей известных морбилливирусов кори и СЭУ;

2. Показать наличие как вирионной, так и матричных морбилливирусных РНК в тканях павших и больных животных, используя метод гибридизации;

3. Определить по результатам гибридизации наиболее консервативные участки генома морбилливирусов, пригодные для использования в качестве универсальных праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) при массовой диагностике морбилливирусных инфекций и оптимизировать условия экспресс - диагностики морбилливирусных инфекций методом

ПЦР, с использованием образцов тканей, минуя этап культивирования вируса;

4. Определить нуклеотидные последовательности генов Р и Н изолята вируса байкальской нерпы и сравнить полученные последовательности с аналогичными структурами других морбилливирусов;

5. Определить таксономическое положение вируса байкальской нерпы среди других морбилливирусов;

6. Исследовать популяцию байкальской нерпы на наличие в ней морбилливирусов через 10 лет после вспышки 1987/88 гг.

7. Определить структуру фрагмента гена Е вируса КЭ и определить таксономическое положение и генетическую принадлежность вариантов вируса, циркулирующих на территории России;

8. Изучить на основе гибридизационного анализа гетерогенность и географическое распространение генетических вариантов вируса КЭ;

9. Адаптировать методы кластерного анализа для характеристики генетических различий штаммов вируса КЭ на базе данных гибридизационных тестов и выявить геновариантные кластеры в региональных вирусных популяциях;

10. Оценить возможность корреляции вирулентности вируса КЭ и его спектра гибридизации с олигонуклеотидными зондами.

Научная новизна работы.

Впервые методами молекулярной биологии, включающими гибридизацию с олигонуклеотидными зондами, амплификацию, с использованием полимеразной цепной реакции, выбранных участков генома вирусов, клонирование и последующее определение нуклеотидной последовательности полученных фрагментов, был обнаружен новый, ранее не известный вирус, вызвавший эпизоотию байкальской нерпы.

В результате анализа нуклеотидных последовательностей, однозначно установлено, что вспышка болезни на Байкале была вызвана вариантом вируса чумы плотоядных, который отличается от других, циркулирующих в природе штаммов СЭУ.

Показано существенное отличие вируса байкальской нерпы от морбилливирусов других морских млекопитающих, как ластоногих, так и китообразных.

Продемонстрировано, что морбилливирус байкальской нерпы продолжает циркулировать в популяции, причем циркулирует два варианта вируса различной вирулентности.

Впервые на репрезентативном материале получены детальные сведения об основных генотипах вируса клещевого энцефалита, их генетическому разнообразию и географическому распространению в различных физико-географических регионах России.

Впервые показано, что на территории России в основном циркулирует вирус клещевого энцефалита третьего генотипа, в тоже время, вирусы первого и второго генотипов встречаются мозаично.

Так вирус дальневосточного (первого) генотипа имеется во всех, кроме трех, исследуемых регионах от Сахалина до Калининграда. Вирус центрально-европейского (второго) генотипа циркулирует на западе России и его ареал распространяется до Урала и Алтая.

Впервые на основании филогенетического анализа высказано предположение, что высокой вирулентностью обладают штаммы вируса клещевого. энцефалита не только дальневосточного генотипа, но и ряд штаммов вируса второго и третьего генотипов. Высокая вирулентность вариантов вируса связана, по-видимому, со структурой белка N826.

Предложены модификации метода синтеза олигонуклеотидов, разработана схема синтеза и изготовлен автоматический синтезатор, обеспечивающий быстрый и экономный синтез олигонуклетидов.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в результате работы нуклеотидные последовательности двух генов вируса байкальских тюленей и ряда других изолятов СБУ значительно расширяют существующие представления о разнообразии вирусов чумы плотоядных, циркулирующих в природе. В распоряжении исследователей оказался дополнительный материал для изучения различий между вирусами на генетическом уровне, для анализа вирусных белков и определения значения изменений в структуре генов и белков.

В ходе изучения вируса байкальской нерпы разработан и синтезирован ряд морбилливирусных праймеров для выявления и тонкого анализа любой морбилливирусной инфекции с помощью метода полимеразной цепной реакции. Отработанные методики позволяют быстро, без применения трудоёмкой стадии культивирования вируса, подтвердить или опровергнуть наличие морбилливирусной инфекции, а в сочетании с методами секвенирования определить принадлежность выявленного вируса к тому или иному виду морбилливируса и показать его отличие от других близких ему вирусов. Полученные результаты показывают, что данный подход оказался достаточно эффективным для этих целей. Разработанная методика с набором «универсальных морбилливирусных праймеров» может без изменений применяться при анализе вируса кори и других морбилливирусов.

Достоверное доказательство о превалировании на территории России вируса КЭ третьего генотипа не только расширяет наши представления о путях эволюции вируса, но и ставит вопросы о необходимости разработки новых коммерческих препаратов для диагностики, профилактики и лечения клещевого энцефалита.

Показанные выраженные отличия в частоте встречаемости основных генотипов вируса КЭ на различных территориях требуют от эпидемиологических служб необходимость разработки региональных схем диагностики и профилактики КЭ.

Разработанный патогенетический подход к анализу вирусной популяции применим для оценки эпидситуации в регионах с целью профилактики и диагностики заболевания. Предложенный метод графического отображения спектра гибридизации вирусной РНК совместно с патогенетическим подходом целесообразно использовать при изучении других РНК-содержащих вирусов.

Предположение о связи вирулентности вируса клещевого энцефалита со структурой гена белка №2Ь ставит перед исследователями новую задачу изучения структуры и функции белка, кодируемого этим геном, и механизма его действия.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Эпизоотия в популяции байкальской нерпы в 1987-1988гг. вызвана морбилливирусом, который наиболее близок к вирусу чумы плотоядных и является его новым вариантом.

2. Вирус, поразивший популяцию байкальской нерпы, не являлся причиной эпизоотии обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе.

3. Переход морбилливирусов к морским и пресноводным позвоночным произошёл независимо в нескольких эволюционных линиях.

4. Коммерческие живые вакцины против вируса чумы плотоядных непричастны к заражению популяции байкальской нерпы.

5. На территории России выявлен высокий уровень генетической гетерогенности циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита.

6. На всей эндемичной территории России доминируют штаммы вируса КЭ третьего генотипа.

7. Штаммы вируса КЭ дальневосточного (первого) генотипа в основном встречаются на Дальнем Востоке, но в тоже время имеются в большинстве исследованных регионах от Калининграда до Сахалина.

8. Штаммы вируса КЭ центрально-европейского (второго) генотипа встречаются в западных областях России, а ареал их распространения достигает Урала и Алтая.

9. Среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипа могут встречаться высоковирулентные штаммы.

Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные последовательности генов М, N, Р и Н изученных штаммов CDV, а также структуры фрагмента гена Е депонированы в международный компьютерный банк данных Genbank, а именно: AF259552, AF259551, AF259550, AF259549, AF224667, AF224666, AF224665, AF224664, AF224663, AF241774, AF241773, AF241772, AF236055, AF231807, AF231806, AF229364, AF229363, AF229362, AFI81446, AFI39491, AF139490, AF139489, Х84998, Х84999, Х85000. Получены следующие свидетельства на изобретения:

Беликов С.И., Горбунов Ю.А., Попов С.Г. Способ удаления тритильных защитных групп с производных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов.// A.C. № 828671.- 1981. - 5с;

Беликов С.И., Рыбак В.К. Способ получения 4-1\[-бензоил-2-дезоксицитидина.// A.C. № 1266164. -1986а.- Зс;

Беликов С.И., Рыбак В.К., Озолс A.M., Стопникова М.Н., Зиемелис K.M. 5'-0-Тритолилметильные производные 2'-дезоксинуклеозидов в качестве исходных веществ в синтезе олигонуклеотидов. // A.C. № 1270153.-19866.-7с;

Абрамова JT.M., Беликов С.И., Белова Н.В., Чекавая Н.И. Способ получения олиготимидилатного производного целлюлозы. // Авторское свидетельство № 1438189, 1988, 4с;

Кумарев В.П., Беликов С.И., Кобзев В.Ф., Кузнеделов К.Д., Баранова Л.В., Средин Ю.Г. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и устройство для его осуществления.//Авторское свидетельство № 1773916, 1992, 11 с.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме "Morbillivirus infections", Hannover, 1994; на второй Верещагинской байкальской международной конференции, Иркутск, 1995; на юбилейной научной конференции "Природно-очаговые болезни человека", Омск, 1996; на международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами", Иркутск, 1996; на научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998; на первой международной конференции "Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia", Новосибирск, 2000.

По материалам диссертации имеется 18 публикаций, включая монографию 4 статьи в центральной печати, 4 статьи в зарубежной печати и 5 авторских свидетельств.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (4 главы), 6-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы (219 отечественных и зарубежных источников) и приложения. Объем работы составляет 234 страницы машинописного текста, включающего 13 таблиц и 37 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Беликов, Сергей Иванович

выводы

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность генов >1, Р и Н вируса байкальской нерпы, что позволило провести сравнительный анализ с аналогичными структурами других морбилливирусов.

2. Эпизоотия, вызвавшая массовую гибель байкальской нерпы в 1988 году, обусловлена морбилливирусом, родственным вирусу чумы плотоядных (СЭУ).

3. Показано, что морбилливирус, вызвавший эпизоотию байкальской нерпы наиболее близок морбилливирусу собак и является его новым вариантом.

4. Установлено, что варианты вакцинных штаммов вируса не были предковыми формами вируса байкальской нерпы.

5. Доказано, что морбилливирус, вызвавший эпизоотию 1989 года у обыкновенных и серых тюленей в Северной Европе, не является ближайшим родственником вируса, вызвавшего массовую гибель байкальской нерпы, а вирус байкальской нерпы, не был причиной этой эпизоотии.

6. Показана в динамике на протяжении 12 лет циркуляция морбилливируса байкальской нерпы и формирование, по крайней мере, двух вариантов морбилливируса различной вирулентности.

7. Определена первичная структура фрагмента гена белка оболочки 29 штаммов вируса КЭ, установлены их таксономическое положение и принадлежность к трем различным генетическим вариантам.

8. На территории России отмечен высокий уровень генетической гетерогенности циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита с абсолютным доминированием штаммов третьего генотипа.

9. Установлено, что штаммы вируса КЭ первого генотипа доминируют на Дальнем Востоке, но, в тоже время, в разной степени встречаются во всех исследованных регионах от Сахалина до Калининграда, причем их количество мозаично варьирует по территориям.

10. Показано, что штаммы вируса КЭ второго (центрально-европейского) генотипа встречаются от западных областей России до Урала с приобладанием их на Алтае.

11. Впервые показано, что среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипов могут встречаться высоковирулентные штаммы, аналогичные штамму Шейнин, выделенному в Приморском крае от больного, умершего от КЭ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методы молекулярной биологии, такие как гибридизация со специфическими зондами, амплификация с помощью ПЦР, определение первичной структуры генома и филогенетический анализ структур и гибридизационных событий являются перспективными методами исследования вирусов. Особенно полезны они при анализе РНК содержащих вирусов, отличающихся высокой скорость мутационной изменчивости, что затрудняет применение для их исследования серологических методов.

На примере вируса, вызвавшего эпизоотию байкальской нерпы, было убедительно показана не только полезность этих методов исследования, но и их уникальная скорость и точность. На этом примере показано, что смена вирусом хозяина возможна в настоящее время, при жизни исследователей, а не в течение столетий, как считалось ранее. Показано, что метод гибридизации нуклеиновых кислот со специфичными зондами является чрезвычайно быстрым и надежным методом для идентификации вируса, по крайней мере, до рода, и что этот метод нельзя выбрасывать из арсенала методов исследования в связи с его относительной древностью. Методы определения структуры нуклеиновых кислот и их филогенетический анализ являются наиболее точными для выявления тонких отличий у близкородственных вирусов. Так, методом иммуноанализа не различаются два варианта вируса, циркулирующие в настоящее время в популяции байкальской нерпы, в тоже время данные филогенетического анализа убедительно доказывают это.

В отличие от вируса нерпы, при анализе вируса клещевого энцефалита основной задачей являлась оценка генетического разнообразия большого количества штаммов вируса, выделенных со всех территорий России. В этом случае наиболее оптимальным является применение гибридизационных методов для анализа популяций. Так методом секвенирования и филогенетического анализа было оценено 29 штаммов вируса, а методом гибридизации оценено 265 штаммов вируса КЭ. Убедительно показано, что на территории России преобладают штаммы вируса КЭ генотипа III, а штаммы вируса генотипа I (дальневосточный) и генотипа II (центрально-европейский) встречаются значительно реже. Количество вариантов вируса этих двух генотипов значительно варьирует в различных регионах, причем районы с высоким содержанием этих генотипов вируса расположены мозаично и относительная концентрация этих вариантов вируса не уменьшается линейно по мере удаления от их основного очага. Варианты вируса КЭ первого генотипа обнаружены во всех исследованных регионах, в том числе в западных областях России. Штаммы вируса КЭ второго генотипа в основном изолированы в западной части России, но максимальное их количество выявлено на Урале и, особенно, на Алтае. Только один штамм вируса второго генотипа обнаружен восточнее этих районов, в Иркутской области.

В тоже время генотипический состав вирусов, выделенных от клещей и от мелких животных, в одной и той же области существенно различается. Так, в Иркутской области штаммы вируса, выделенные от животных, оказались существенно обогащены вариантами вируса первого и, особенно, второго генотипов. Этот факт указывает на то, что часть вариантов вируса, циркулирующего в клещах, не способна размножаться в теплокровных животных. Впрочем, этот факт следует тщательно перепроверить, так как штаммы вируса от клещей и штаммы вируса от животных собирались в разное время и в различных экологических районах, а известно, что и численность и типовой состав вируса меняются во времени и зависят от экологических условий в конкретной местности.

Впервые отмечено также, что среди вариантов вируса КЭ второго и третьего генотипов выделяется группа штаммов, спектр гибридизации которой, близок спектру высоковирулентного штамма Шейнин, выделенного в Приморском крае от умершего больного клещевым энцефалитом.

Показано также, что вирулентность вируса в большой степени совпадает с гибридизацией зондов к генам белков С, NS1 и NS2b, причем наибольшее совпадение отмечено при гибридизации с зондом на участок гена NS2b.

Методы молекулярной биологии, использованные в настоящей работе, дали не только новую информацию о РНК- содержащих вирусах, выбранных в качестве модели, но и позволили наметить новые направления исследований. Так, факт обнаружения нового варианта морбилливируса в популяции байкальской нерпы, который существует одновременно с вариантом вируса, вызвавшего эпизоотию, и который возник на протяжении нескольких лет, указывает на экстремально высокую скорость эволюции вируса. В связи с этим имеется уникальная возможность оценить пути и механизм эволюции нового вируса. Для этого необходимо продолжить ежегодное изучение структуры РНК вируса, до начала стабилизации и окончания «взрывного» характера эволюции вируса. Важно также исследовать варианты вируса у диких и домашних животных, тесно связанных с Байкалом, так как высокая скорость эволюции вируса может быстро привести к появлению новых вариантов, способных поражать другие виды животных и, возможно, человека.

В изучении вируса клещевого энцефалита также очерчены новые направления исследований.

Очевидно, что при разработке вакцинных препаратов и диагностических наборов необходимо учитывать доминирование на территории России вируса третьего генотипа. При оценке эпидситуации и прогнозе заболеваемости клещевым энцефалитом необходимо учитывать особенности региональной популяции вируса и содержание основных генотипов вируса.

Для повышения точности генотипирования необходимо осуществить дизайн новых зондов на основе структур трех основных генотипов вируса. Необходимо также существенно упростить методику генотипирования для

190 того, чтобы ее можно было применить в медицинских диагностических лабораториях. Определение генотипа вируса, в течение нескольких дней после укуса клещом, может помочь в предсказании тяжести течения заболевания и в назначении адекватного лечения.

Необходимо провести более четкую связь между спектром гибридизации вирусной РНК и патогенностью вируса. В первую очередь эту работу важно провести на группе изолятов, близких штамму Шейнин. Вопрос о существовании высоковирулентных штаммов вируса среди доминирующих на территории России вариантов второго и третьего генотипа принципиально важен.

Чрезвычайно важно также точное подтверждение связи вирулентности вируса со структурой и функцией конкретных белков, в частности со структурой белка N821». Ичитывая, что этот белок маленький и длина гена, кодирующего этот белок, лежит в оптимальных пределах, удобных для секвенирования, такую связь между вирулентностью и структурой белка N821? можно провести в сжатые сроки.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Беликов, Сергей Иванович, 2000 год

1. Абрамова Л.М., Беликов С.И., Белова Н.В., Чекавая Н.И. Способ получения олиготимидилатного производного целлюлозы. // A.C. № 1438189. 1988.-5с.

2. Баранова Л.В., Бейм A.M., Беликов С.И. и др. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы (1987/88 г.). // Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние. 1992. - 71 с.

3. Бейм A.M., Колесник B.C., Куделин В.М. и др. О клинической симптоматике эпизоотии в популяции байкальской нерпы // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск, Наука, Сиб-е отд. - е -1992. - С.26-30.

4. Беликов С.И., Горбунов Ю.А., Попов С.Г. Способ удаления тритильных защитных групп с производных нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов.// A.C. № 828671.- 1981. 6с.

5. Беликов С.И., Рыбак В.К. Способ получения 4-.М-бензоил-2-дезоксицитидина.// A.C. № 1266164. -1986а.- 5с.

6. Беликов С.И., Рыбак В.К., Озолс A.M., Стопникова М.Н., Зиемелис K.M. 5'-0-Тритолилметильные производные 2'-дезоксинуклеозидов в качестве исходных веществ в синтезе олигонуклеотидов. // A.C. № 1270153.-19866.-7с.

7. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем. М., «Медицина», 1987.

8. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная биология парамиксовирусов. М.: Медицина. - 1978. - С. 183.

9. Верета Л.А. Принципы прогнозирования заболеваемости клещевым энцефалитом. М., -1975.

10. Верета Л.А., Островская О.В., Николаева С.П., Пуховская И.М. Выявление естественной неоднородности природных популяций вируса клещевого энцефалита и группировка штаммов. // Вопр. вирусол. 1983,- Т. 6.-С. 706- 710.

11. Вотяков В.И., Протас И.И., Жданов В.М. Западный клещевой энцефалит. Минск, 1978. - 256с.

12. Гайдамович С.Я. Арбовирусы: классификация и таксономия // Арбовирусы,- М., 1986. С. 5-15.

13. Демина Т.В. Характеристика генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии участков вирусного генома //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Владивосток., 1999. -22 с.

14. Дживанян Т.И., Батикова М., Грешикова М., Чунихин С.П. Отличия в штаммах вируса клещевого энцефалита в свете чувствительности их гемагглютининов к действию детергентов. // Вопр. вирусол. 1981. - Т. 2. -С. 237-239.

15. Джиоев Ю.П. Молекулярно-эпидемиологический и филогенетический анализ генетической гетерогенности популяций вирусу клещевого энцефалита на азиатской территории России. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Иркутск., 1999.-22 с.

16. Добрикова Е. Ю., Плетнев А.Г., Шаманин В.А. Детекция вируса клещевого энцефалита в крови человека и в индивидуальных клещах методом гибридизации нуклеиновых кислот. // Вопр. вирусол. 1986. - Т. 31. - С. 739-742.

17. Живоляпина P.P. Этиологическая структура очагов КЭ в Иркутской области. Автореф. дис. . канд. мед. наук. Иркутск, 1971. 41с.

18. Злобин В.И. Молекулярная эпидемиология новый подход к анализу вариабельности вируса клещевого энцефалита. // Ж. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. - 1991. - Т. 7. - С. 80 - 82.

19. Злобин В.И. Молекулярно-биологическое определение и генотипическая дифференциация вируса клещевого энцефалита: Автореф. дис. . докт. мед. наук . М., 1992. - 67с.

20. Злобин В.И., Горин О.З. Клещевой энцефалит (Этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири) Иркутск: Наука, 1996. - 177 с.

21. Злобин В.И., Дрокин Д.А., Мансуров П.Г., Калмин О.Б., Якименко В.В Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита по растворимому антигену. // Вопр. вирусол. 1991,- Т. 36. - С. 24-27.

22. Карпов С. П. Томский очаг КЭ и вопросы его оздоровления. //Клещевой энцефалит. Минск, 1965. - С. 212-221.

23. Краминская H.H., Живоляпина P.P., Мейерова P.A. Своеобразный штамм вируса КЭ, выделенный от больного с проградиентным течением заболевания. // Актуал. пробл. вирусных заболеваний. М., 1965. - С. 190 -191

24. Кумарев В.П., Беликов С.И., Кобзев В.Ф., Кузнеделов К.Д., Баранова JI.B., Средин Ю.Г. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и устройство для его осуществления. // АС № 1773916. 1992. - 11с.

25. Левкович E.H., Погодина В.В., Засухина Г.Д., Карпович Л.Г. Вирусы комплекса клещевого энцефалита. Л.: Медицина, 1967. - 245 с.

26. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае: вирусологические и эколого-эпидемические аспекты. Владивосток: Дальнаука, 1997,- 187 с.

27. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Борисевич В.Г. Филогенетический анализ популяции клещевого энцефалита. -2000. 7с. -в печати.

28. Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б., Исаева М.П., Майстровская О.С. Молекулярная характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алиньского очагового региона. // Вопр. вирусол. 1996. -Т.41. -С. 154-158.

29. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М., 1989

30. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование М: Мир, 1984.-432 с.

31. Морозова О.В., Бахвалова В.Н., Добрикова Е.Ю., Максимова Т.Г. Клеточные белки взаимодействуют с РНК вируса клещевого энцефалита // Журн. инфекц. паталогии. 1996. - т.З, N4. - С. 44-46.

32. Наумов З.Л. Клещевой энцефалит и болезнь Лайма: эпизоотологические параллели и мониторинг. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1999. - Т.2. - С. 20 - 26.

33. Павловский E.H. Паразитологические факторы существования природного очага КЭ. // Совещ. по паразитологическим проблемам .- М.ю 1939.-С.13.

34. Павловский E.H. Природная очаговость и понятие о ланшафтной эпидемиологии трансмиссивных болезней человека. // Мед. паразитол. и паразитарные болезни. 1944. - № 6. - С. 29-38.

35. Петров Е.А., Елагин O.K., Егорова Л.И. и др. Состояние популяции байкальской нерпы // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. -Новосибирск.: Наука, Сиб. отд-ние, 1992. С. 20-26.

36. Пищенко Н.М., Кветкова Е.А., Шаманин В.А., Плетнев А.Г., Ильюшенко Л.П. Использование метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот для диагностики клещевого энцефалита. // Тр. инст. им Пастера.- 1989. Т.65.- С. 169-175.

37. Плетнев А.Г., Ямщиков В.Ф., Блинов В.М. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотнаяпоследовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита. // Биоорг. химия, 1989.-Т. 15, N 11. - С. 1504-1521.

38. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса КЭ. // Вопр. вирусол. 1981а. - Т. 6. - С. 741-746

39. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С., Жезмер В.Ю., Мейерова P.A. Иммунологические и некоторые этиологические аспекты изучения серотипа Айна/1448 вируса КЭ. // Вопр. вирусол.- 1981. Т. 6. С. 735-741.

40. Погодина В.В., М.П. Чумаков: вклад в изучение проблемы хронического клещевого энцефалита// Журн. инфекц. патологии. 1996,-т.З. - N4. - С. 52-56.

41. Погодина В.В., Трухина А.Г., Шаманин В.А., Бочкова Н.Г., Фролова Т.В. Дезоксиолигонуклеотидные пробы, различающие антигенные и патогенные варианты вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол.- 1992. -Т.37 С.53-56.

42. Погодина В.В., Фролова М.П., Ермак Б.А. Хронический клещевой энцефалит: Этиология, иммунология, патогенез. Новосибирск:Наука., 1986. -233 с.

43. Пронин Н.М., Кабанов Д.Е. Оценка масштабов гибели байкальских тюленей в 1987 / 1988 гг. // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1992. - С. 12-20

44. Пуховская Н, М., Верета JI.A., Шаманин В.А., Плетнев А.Г. Диагностические возможности метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот для обнаружения вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. 1991. - Т. 36. - С. 250-253.

45. Пуховская Н.М., Верета JI.A., Островская О.В., Шаманин В.А., Плетнев А.Г. Обнаружение вируса клещевого энцефалита в клещах гибридизацией нуклеиновых кислот.// Мед. паразит. -1989.- Т.З.- С. 11-14.

46. Рубин С.Г., Чумаков М.П., Семашко И.В. Антигенные типы и подтипы штаммов вируса КЭ из различных регионов (вопросы классификации, географического распространения) // Вирусы и вирусные инфекции человека: Тез. конф. М, -1981. - С. 63-64.

47. Саламатова Г.А., Горин О.З., Малов И.В., Борисов В.А., Злобин В.И., Антонова A.M. Некоторые аспекты эпидемиологии, клиники и лечения клещевого энцефалита. // Ж. инфект. патол. 1999 - №4. — С. 4-10.

48. Сиссонс Г.П., Олдстоун М.Б., Иоклик В.К. и др. Вирусология в 3-х т. Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа М.: Мир. - 1989.

49. Цилинский Я.Я. Генетика вирусов // Общая и частная вирусология. / Под ред. В.М.Жданова, С.Я.Гайдамович. М., Медицина. - 1982. - т.Г, гл.7.-С. 213-259.

50. Цилинский Я.Я. Популяционная структура и эволюция вирусов. // М.,1988

51. Чумаков М.П., Рубин С.Г., Линев М.Б. Три антигенных типа вируса клещевого энцефалита, их зависимость от основных видов клещей-переносчиков и географическое распространение // Вопр. медиц. вирусологии. М., 1975. С. 371-372

52. Чунихин С.П., Леонова Т.Н. Экология и географическое распространение арбовирусов. М.: Медицина. - 1985. - 126 с.

53. Шаманин В.А., Плетнев А.Г., Злобин В.И. Применение молекулярной гибридизации с синтетическими дезоксиолигонуклеотидами для дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. — 1990,- Т. 35.- С.474-478.

54. Шаманин В.А., Плетнев А.Г., Рубин С.Г., Злобин В.И. Дифференциация вирусов комплекса клещевого энцефалита с помощью РЖ-ДНК гибридизации. //Вопр. вирусол. 1991. - Т.36. - С. 27-31.

55. Шоуп Р. Эпидемиология: механизм возникновения, распространения и передачи вирусных инфекции. // Вирусология. Под ред. Филдса Б., Найпа Д. М.; Мир .- 1989. - т.1. - гл.1Х. - С. 264-276.

56. Baron M., Barrett T. The sequence of the N and L genes of rinderpest virus, and the 5' and 3" extra-genic sequences: the completion of the genome sequence of the virus // Vet. Microbiol. 1995. - V. 44. - P. 175-186.

57. Baron M., Subbarao S.M. and Barrett T. Cloning and sequence analysis of the phosphoprotein (P) gene of rinderpest virus. // J. Gen. Virol. 1993.

58. Barret A.D.T., Monath T.P., Cropp C.B., Adkins J.A., Ledger T.N., Gould E.A., Schlesinger J.J., Kurney R.M., Trent D.W. Attenuation of wild-type yellowfever virus by passage in HeLa cells. // J. Gen. Virol. 1990. - V.71. - P. 27572764.

59. Barrett T, Subbarao S.M., Belsham G.J., Mahy B.W.J. The molecular biology of morbilliviruses. In Kingsbury D. (e<±), The Paramyxoviruses, Plenum Press, New York. 1991.-P. 83-102.

60. Barrett T. and Underwood B. Comparison of messenger RNAs induced in cells infected with each member of the morbillivirus group. // Virology. 1985. -V.145. - P.195-199.

61. Barrett T., Mahy B.W.J. Genome organisation and genetics relationships among the morbilliviruses. // Rev. sci. tech. off. Int. Epiz. 1986. - V. 5, N. 2. -P. 395-405.

62. Barrett T., Romero C.H., Baron M.D. et al. The molecular biology of rinderpest and pest des petits ruminants. // Ann. Med. Vet.- 1993b. V.137. - P. 77-85.

63. Barrett T., Shimpton S.B., Russel S.E.H. Nucleotide sequence of the entire protein coding region of canine distemper virus polymerase associated (P) protein mRNA. // Virus Research. 1985. - V.3. - P. 367- 372.

64. Barrett T., Visser I.K.G., Mamaev L.V., Goatley L., Van Blessem M.-F., Osterhaus A.D.M.E. Dolphin and porpoise morbilliviruses are genetically distinct from phocine distemper virus. // Virology. 1993b. - V. 193. - P. 1010-1012.

65. Bartholomeusz A., and Thompson P. Flaviviridae polymerase and RNA replication.//J.Viral Hepatitis. 2000.- V. 6. - P. 261-270.

66. Bartholomeusz AI, Wright PJ. Synthesis of dengue virus RNA in vitro: initiation and the involvement of the proteins NS3 and NS5. // Arch. Virol. 1993. - 128. - P. 111-121.

67. Bellini W.J., Englund G., Rozenblatt S. et al. Measles virus P gene codes for two proteines. // J. Virol. 1985. -V. 53. - P. 908-919.

68. Blackwell JL, Brinton MA. BHK cell proteins that bind to the 3' stem-loop structure of the West Nile virus genome RNA. // J. Virol. 1995. -V. 69. - P. 5650-5658.

69. Bohn W., Ciampor F., Rutter R., Mannweiler K. Localization of nucleocapsid associated polypeptides in measles virus infected cells by immunogold labeling after resin embedding // Arch. Virol. 1990. - V. 114. - P. 53-64.

70. Bond C. W., Virology, Lectures at Montana State University (Internet), 2000

71. Borisov V., Malov I., Uschuk N. et al. Tick-born infections in Eastern Siberia: epidemiology and clinical features. // VIII Int. Conference on Lyme borreliosis and other emerging tick-borne diseases. Munich, Germany, June 20-24, 1999. - P. 297.

72. Boshell J., Goverdhan M.K., Rajagopalan P.K. Preliminary studies on the susceptibility of wild rodents and shrews to KFD virus. // Indian J Med Res. -1968,-V.56.-P. 614-627.

73. Brandt W.E. From the World Health Organization. Current approaches to the development of dengue vaccines and related aspects of the molecular biology of flaviviruses. // J. Infect. Dis. 1988. - V. 157. - P. 1105-1111.

74. Buchhold C.J., Spehner D., Drillien R., Neubert W.J. and Homann H.E. The conserved N-terminal region of Sendai virus nucleocapsid protein NP is required for nucleocapsid assembly. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 5803-5812.

75. Cao J.X., Ni H., Wills M.R., Campbell G.A., Sil B.K, Ryman K.D., Kitchen I., Barrett A.D.T. Passage of Japanese encephalitis virus in HeLa cells results in attenuation of virulence in mice. // J. Gen. Virol. 1975. - V.76. -P. 2757-2764.

76. Caruthers M.H., Barone A.D., Beaucage S.L., Dodds D.R., Fisher E.F., McBride I.J., Matteucci M. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. //Methods Enzymol. -1987. V.154. - P. 287-313.

77. Caruthers M.H., Beaucage S.L., Efcavitch J.W, Fisher E.F., Matteucci M.D., Stabinsky Y. New chemical methods for synthesizing polynucleotides.// Nucl. Acids Symp. Ser. 1980. -V 7. -P. 215-23.

78. Cattaneo R., Kaelin K., Baczko K., Billeter M.A. Measle virus editing provides an additional cystein-rich protein. // Cell. 1989. - V. 56. - P. 759-764.

79. Cattaneo R., Rebmann G., Baczko K. et al. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains. // Virology. 1987a. - V. 160 — P. 523-526.

80. Cattaneo R., Rebmann G., Schmidt A. Altered transcription of a defective measles virus genome derived from a diseased human brain. // EMBO J. 1987b. -V.6. - P. 681-688.

81. Chamberlain R.W., Wamwayi H., Hockley E., Subbarao S.M., Goatley L., Knowles N.J. and Barrett T. Evidence for different lineages of rinderpest virus reflecting their geographic isolation. // J. Gen. Virol. 1993. - V. 72. - P. 443-447.

82. Chen CJ, Kuo MD, Chien LJ, Hsu SL, Wang YM, Lin JH. RNA-protein interactions: involvement of NS3, NS5 and the 3' noncoding regions of Japanese encephalitis virus genomic RNA. // J. Virol. 1997. - V. 71. - P. 3466-3473.

83. Chirgwin J.M., Przybyla A.E., MacDonald R.J. et al. Isolation of biologikally active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. // Biochemistry. 1979. - V.18. - P. 5294.

84. Chomczynski P. and Sachi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.// Anal. Biochem. 1987. -Vol. 162.-P. 156-159.

85. Chu PW, Westaway EG. Molecular and ultrastructural analysis of heavy membrane fractions associated with the replication of Kunjin virus RNA. //Arch Virol.-1992.-V. 125.-P. 177-191.

86. Chu PW, Westaway EG. Replication strategy of Kunjin virus: evidence for recycling role of replicative form RNA as template in semiconservative and asymmetric replication. // Virology. 1985. -V. 140. - P. 68-79.

87. Chungue E., Cassar O., Drouet M.T. et al. Molecular epidemiology of dengue-1 and dengue-4 viruses. // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 1877-1884.

88. Clarke D.H. Father studies on antigenic relationships among the viruses of the group B tick-borne complex. // Bulletin of the World Health Organization. -1964,-V. 31.-P. 45-56.

89. Coelen RJ, Mackenzie JS. Genetic variation of Murray Valley encephalitis virus.//J. Gen. Virol. 1988.-V. 69.-P. 1903 - 1912.

90. Collett M.S., Larson R., Gold C., Strick D., Anderson D.K., Purchio A.F. Molecular cloning and nucleotide sequence of the pestivirus bovine viral diarrhea virus. // Virology. 1988. -V. 165. - P. 191-199.

91. Curran J., Boeck R. and Kolakofsky D. The Sendai virus P gene expresses both an essential protein and an inhibitor of RNA synthesis by shuffling modules via mRNA editing. // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 3079-3085.

92. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. An N-terminal domain of the Sendai paramyxovirus P protein acts as a chaperone for the NP protein during the nascent chain assembly step. // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 849-855.

93. Curran J., Marq J.-B. and Kolakofsky D. The Sendai virus non-structural proteins specifically inhibit viral mRNA synthesis. // Virol. 1992. - V. 189. - P. 647-656.

94. Curran J., Pelet T. and Kolakofsky D. An acidic activation-like domain of the P protein is required for RNA synthesis and encapsidation. // Virology. -1994,- V. 202.-P. 875-884.

95. Curran M.D. and Rima B.K. The genes encoding the phospho- and matrix proteins of phocine distemper virus. // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - P. 15871591

96. Deshpande K.L., Portner A. Monoclonal antibodies to the P protein of Sendai virus define its structure and role in transcription. // Virology. 1985. - V. 140.-P. 125-134.

97. Deubel V, Digoutte JP, Monath TP, Girard M. Genetic heterogeneity of yellow fever virus strains from Africa and the Americas. // J. Gen. Virol. 1986. -V. 67. - P. 209 -213.

98. Dunster L.M., Gibson C.A., Stephenson J.R., Minor P.D., Barrett A.D.T. Attenuation of virulence of flaviviruses following passage on HeLa cells. // J. Gen. Virol. 1990. - V.71 - P. 601-607.

99. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. // J.Gen.Virol. 1999. - V.80. - P.179-185.

100. Eckert K.A., Kunkel T.A. High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. // Nucl. Acids Res. 1990. - V. 37. - P. 165-167.

101. Falker W.A., Diwan A.R., Halstead SB. Human antibody to dengue soluble complement-fixing (SCF) antigens. // J. Immunol. 1973 -V. -111. -P. 1804-9.

102. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. // J. Mol. Evol. 1981. - V. 17. - P. 368-376.

103. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. (eds) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. // Arch. Virol. 1991. - Supple 2.

104. Froehler B.C., Ng P.G., Matteucci M.D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acids Res. 1986. - V. 14(13). - P.5399-5407.

105. Gargadennec L. and Lalanne A. La peste des pestits ruminants. // Bulletin des services Zootechniques et des Epizootics de L'Afrique Occidentale Française. 1942,-V. 5.-P. 16-21.

106. Godovikova T.S., Orlova T.N., Zarytova V.F., Shamanin V.A., Vorobjova N.V., Serdjukova N.A., Romashchenko A.G. Direct non-radioactive detection of virus RNA by a novel RNA-PCR test. // Nucl. Acids Symp. Ser.- 1991. V.24. -P. 284.

107. Gong YH, Trowbridge R, Macnaughton TB, Westaway EG, Shannon AD, Gowans EJ. Characterization of RNA synthesis during a one-step growth curve and of the replication mechanism of bovine viral diarrhea virus. // J. Gen. Virol. — 1996. V.77. - P. 2729-2736.

108. Grun JB, Brinton MA. Separation of functional West Nile virus replication complexes from intracellular membrane fragments. // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69.-P. 3121-3127.

109. Hambleton P, Stephenson JR, Baskerville A, Wiblin CN.Pathogenesis and immune response of vaccinated and unvaccinated rhesus monkeys to tick-borne encephalitis virus. // Infect Immun. 1983. - V. 40(3). - P. 995-1003.

110. Hanahan D. Techniques for transformation of E.coli. // DNA cloning, V. 1 / Ed. D.M. Glover. Oxford, Washington DC: IRL. Press, 1985. - P.109-136.

111. Harder T.C., Kenter M., Appel M.J.G. et al. Phylogenetic evidence for canine distemper virus in Serengeti's lions //Vaccine. 1995. - V. 13. - P. 521-523.

112. Harder T.C., Liess B., Osterhaus A.D.M.E. and Barrett T. Characterization of morbi Hi viruses isolated from lake Baikal seals (Phoca sibirica). II Vet. MicrobiolSpecial Issue: Morbilliviruses. 1995. - V. 44. - P. 251-259.

113. Hardy F.M. The growth of Asibi strain yellow fewer virus in tissue cultures. II/ Modification of virus and cells. // Journal of infectious Diseases. 1963. -V.113.-P. 9-14.

114. Heinz F.X., Kunz C. Homogeneity of the structural glycoprotein from European isolates of tick-borne encephalitis virus: comparison with other flaviviruses. // J. Gen. Virol. 1981. - V.57. - P. 263-274.

115. Heinz F.X., Roehrig J.T. Flaviviruses. // Immunochemistry of viruses, II. The basis for serodiagnosis and vaccines. (Eds. M.H.V. van Regenmortel and A.R.Neurath). 1990. - P. 289-305.

116. Heinz FX, Tuma W, Kunz C. Antigenic and immunogenic properties of defined physical forms of tick-borne encephalitis virus structural proteins. // Infect. Immun. 1981. - V. 33. - P. 250- 257.

117. Henchal EA, McCown JM, Seguin MC, Gentry MK, Brandt WE. Rapid identification of dengue virus isolates by using monoclonal antibodies in anindirect immunofluorescence assay. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1983. V. 32. - P. 164-169.

118. Holzmann H.,.Vorobyova M.S, Ladyyzhenskaya I.P., Ferenczi E., Kundi M., Kunz C., Heinz F.X. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes. //Vaccine. 1992. -V. 10,- P. 345-349.

119. Hori H, Morita K, Igarashi A. Oligonucleotide fingerprint analysis on Japanese encephalitis virus strains isolated in Japan and Thailand. //Acta Virol. -1986.-V.30.-P.353 -359.

120. Jenner E. (cited by Kirk H.) Canine distemper, its complications, sequelae and treatment. // 1st Ed., Baillere, Tindall and Cox, London. 1809. - P. 1922.

121. Junean M.L. Famille des Paramyxoviridae // Can J. Med. Technol. 1991. -V. 53.-P. 169-173.

122. Kamata H., Tsukiyama K., Sugiyama M., Kamata Y., Yoshikawa Y., and Yamanouchi K. Nucleotide sequence of cDNA to the rinderpest virus mRNA encoding the nucleocapsid protein. // Virus Genes. 1991. - V. 5. - P. 5-15.

123. Kerschner JH, Vorndam AV, Monath TP, Trent DW. Genetic and epidemiological studies of dengue type 2 viruses by hybridization using synthetic deoxyoligonucleotides as probes. // J. Gen. Virol. -1986. -V.67. -P. 2645-61.

124. Khorana H.G. Total synthesis of transfer RNA genes. // Symp. Soc. Dev. Biol. -1974. V.30. - P. 193-4.

125. Kim D.W, Gwack Y., Han J.H., Choe J. Towards defining a minimal functional domain for NTPase and RNA helicase activities of the hepatitis C virus NS3 protein. // Virus Res. 1997b. - V. 49. - P. 17-25.

126. Kim D.W, Kim J., Gwack Y., Han J.H., Choe J. Mutational analysis of the hepatitis C virus RNA helicase. // J. Virol. 1997a. -V. 71. - P. 9400-9409.

127. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. // J. Mol. Evol. 1980.-V. 16.-P. 111-120.

128. Kimura-Kuroda J, Yasui K.Topographical analysis of antigenic determinants on envelope glycoprotein V3 (E) of Japanese encephalitis virus, using monoclonal antibodies. // J. Virol. 1983. - V. 45. - P. 124-132.

129. Kitano T, Suzuki K, Yamaguchi T. Morphological, chemical, and biological characterization of Japanese encephalitis virus virion and its hemagglutinin. // J. Virol. 1974. - V. 14(3).-P. 631-639.

130. Koonin E.V. Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reoviruses. // J. Gen. Virol. 1993. -V. 74. - P. 733-740.

131. Kuno G., Chang G-J.J., Tsuchiya K.R., Karabatsos N., Cropp C.B. Phylogeny of genus Flavivirus. II J. Virol. 1998 - V.72- P.73-83.

132. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonstructural proteins NS2A and NS4A. // Virology. 1998. -V. 245. - P. 203-215.

133. Mamaev L.V., Visser I.K.G., Belikov S.I., Denikina N.N., Harder Т., Goatley L., Rima В., Edginton В., Osterhaus A.D.M.E., Barrett T. Canine distemper virus in Lake Baikal seals (Phoca sibirica). // Veterinary Record. 1996. -V. 138.-P. 437-439.

134. Mandl C.W., Heinz F.X., Kunz C.H. Sequence of the structural proteins of tick-borne encephalitis virus (western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses. // Virol. -1988. -V.166. P.197-205.

135. Maxam A.M., Gilbert W.A. A new method for sequencing DNA. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 174. - P. 560-564.

136. Mayer V. Study of the virulence of tick-borne encephalitis virus. //Acta Virol. 1965. - V.9. - P. 397-408.

137. Mayo M.A., Pringle C.R. Virus Taxonomy 1997. // J.Gen. Virol. -1998. -V.79. - P. 649-657.

138. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses. // J. Gen. Virol. -1997. -V. 78. P. 2711-2722.

139. McMinn P.C., Marshall I.D., Dangarno L. Neirovirulence and neuroinvasivenes of Murray Valey encephalitis vims mutants selected by passage in a monkey kidney cell line. // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76 - P. 865-872.

140. McNeill W.H. Plagues and peoples: a natural history of infectious disease // Garden City, New York: Anchor Press, Doubleday. 1976. - P. 76.

141. Meincoth J., Wahl G. Hybridisation of nucleic acid immobilized on solid support // Anal.Biochem. -1984. V.138. - P.267-284

142. Monath T.P. Yelow fever and dengue viruses the interaction of virus, vector and host in the re-emergence of epidemic disease. // Semin. Virol. - 1994. -V.5. - P. 133-145.

143. Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarvis A.W., Martelli G.P., Mayo M.A., Summers M.D. (Ed) // Virus taxonomy: classification and nomenclature of virus. 1995. - P. 415-421. Spring-Verlag, New York, N.Y.

144. Murphy G., Kavanagh T. Speeding-up the sequencing of double-stranded DNA. // Nucl. Acids Res. 1988.-V. 16.-P. 5198.

145. Murrey V. Improved double-stranded DNA sequencing using the linear polymerase chain reaction. // Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 8889.

146. Muylaert I.R., Chambers TJ., Galler R., Rice C.M. Mutagenesis of the N-linked glycosiiation sites of the fellow fever virus NS1 protein: effects on virus replication and mouse neurovirulence. // Virology. 1996. -V. 222 -P. 159-168.

147. Ni H., Barrett A.D.T. Molecular differences between wild-type encephalitis virus strains of high and low mouse neuroinvasiveness. // J. Gen. Virol. 1996. — V.77.-P. 1449-1455.

148. Norrby E., Utter G., Orvell C., Appel M.J.G. Protection against canine distemper virus in dogs after immunization with isolated fusion protein. // J. Virol., 1986. - V. 58.-P. 536-541.

149. Osterhaus A.D.M.E. Seal death. //Nature. 1988a. - V. 334. - P. 301-302.

150. Peeples M.E. Paramyxovirus M proteins: Pulling it all together and taking it on the road. In: Kingsbury D.W. (Eds.) // The paramyxoviruses. Plenum press: New York. - 1991. - P. 427-456.

151. Pletnev A.G., Bray M., Huggins J., Lai C.-J. Construction and characterization of chimeric tick-borne encephalitis/dengue type 4 viruses. // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. -1992. V. 89. - P. 10532-10536.

152. Pletnev A.G., Bray M., Lai C.J. Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4: effects of mutations on neurovirulence in mice. // J. Virol. 1993. - V. 67. -P. 4956-4963.

153. Pogodina VV, Frolova TV, Frolova MP, Sobolev SG, Shamanin VA, Pletnev AG Molecular hybridization with cloned fragments of tick-borne encephalitis (TBE) virus cDNA in acute and chronic TBE infection. // Acta Virol. -1991. -V.35 (1). -P.71-80.

154. Rice C.M., Lenches E.M., Eddy S.R., Shin S.J., Sheets R.L., Strauss J.H. Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression. // Science. 1985. - V. 229. - P. 726-733.

155. Rice C.M., Strauss E.G., Strauss J.H. In Togaviridae and Flaviviridae (Schleisinger S., Schleisinger M.J., eds.) 1986a - Plenum Press, New York, P. 279-326.

156. Rice C.M, Aebersold R, Teplow DB, Pata J, Bell JR, Vorndam AV, Trent DW, Brandriss MW, Schlesinger JJ, Strauss JH. Partial N-terminal amino acid sequences of three nonstructural proteins of two flaviviruses. // Virology. 1986b. -V. 151.-P. 1-9.

157. Richardson C.D., Scheid A., Choppin P.W. Specific inhibition of paramyxovirus replication by oligopeptides with amino acid sequences similar to those at the N-termini of the F1 or HA2 viral polypeptides. // Virilogy. 1980. -V. 105. - P. 205-222.

158. Rima B.K. The proteins of morbilliviruses. // J. Gen. Virol. 1983 - V. 64. -P. 1205-1219.

159. Rozenblatt S., Eizenberg O., Ben-Levy R., Bellini W.J. Sequence homology within the morbilliviruses. // J. Virol. 1985. - V.54. - P. 684-690.

160. Saitou, N., Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. // Mol. Biol. Evol. 1987. -V. 4. -P. 406-425.

161. Sanger F., Niclen S., Coulson A.R. DNA Sequence with chain-terminating inhibitors. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 304. - P. 5463 - 5467.

162. Schildkraut C.L., Marmur J., Doty P. The formation of hybrid DNA molecules and their use in studies of DNA homologies. // J. Mol. Biol. 1996. -V.3.-P.597-617.

163. Schlesinger J.J., Brandriss M.W., Cropp C.B., Monath T.P. Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever virus nonstructural protein NS1. // J. Virol. 1986. - V. 60/ - P. 1153-1155.

164. Seal J.J. Crossing the species barrier viruses and the origins of AIDS in perspective. // Royal Soc. Med. - 1989. - V. 82. - P. 285-300.

165. Shamanin VA, Pletnev AG, Rubin SG, Zlobin VI Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization. // J. Gen. Virol. 1990.-V.71.-P. 1505- 1515.

166. Shiu S.Y.W., Ayres M.D., Gould E.A. Genomic sequence of the structural proteins of Louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus.//Virology. 1991.-Vol. 180. - P.411-415.

167. Stettler M., Zurbriggen A. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the nucleocapsid protein of the virulent A75/17-CDV strain of canine distemper virus // Vet. Microbiology. 1995. - V. 44. - P. 211-217.

168. Suzich J.A., Tamura J.K., Palmer-Hill F. et al. Hepatitis C NS3 protein polynucleotide-stimulated triphosphatase and comparison with the related pestivirus and flavivirus enzymes. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 6152-6158.

169. Tai C., Chi W., Chen D., Hwang L. The helicase activity associated with hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3). // J. Virol. 1996. -V. 70. - P. 8477-8484.

170. Takegami T, Hotta S. In vitro synthesis of Japanese encephalitis virus (JEV) RNA: membrane and nuclear fractions of JEV-infected cells possess high levels of virus-specific RNA polymerase activity. // Virus Res. 1989. - V. 13. - P. 337350.

171. Takegami T, Miyamoto H, Nakamura H, Yasui K. Biological activities of the structural proteins of Japanese encephalitis virus. // Acta Virol. 1982. -V.26 -P.312-320.

172. Tan B.H., Fu J., Sugrue R.J., Yap E.H., Chan Y.C., Tan Y.H. Recombinant dengue type 1 virus NS5 protein expressed in Escherichia coli exhibits RNA-dependent RNA polymerase activity. // Virology. 1996. -V. 216. - P. 317-325.

173. Tanaka T., Tamatsukuri S., Ikehara M. Solid phase synthesis of oligoribonucleotides using the 0-nitrobenzyl group for 2'-hydroxyl protection and H-phosphonate chemistry. //Nucl. Acids Res. 1987. - V.15 . - P.7235 - 7248.

174. Taylor M.J., Godfrey E., Baczko K., ter Meulen V., Wild T.F. and Rima B.K. Identification of different lineages of measles virus // J. Gen. Virol. 1991. -V. 72.-P. 83 - 88.

175. Thomas S.M., Lamb R.A. and Paterson R.G. Two mRNAs that differ by nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramixovirus SV5 // Cell. 1988. -V. 54. - P. 891-902.

176. Trent DW, Grant JA, Vorndam AV. Monath TP. Genetic heterogeneity among Saint Louis encephalitis virus isolates of different geographic origin.// Virology. 1981.-V. 114.-P. 319-332.

177. Van de Peer Y., De Wachter Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. // Comput. Applic. Biosci. 1994. - V. 10. - P. 569 - 570.

178. Vandevelde M. and Zurbriggen A. The neurobiology of canine distemper virus infection. // Vet. Microbiol. 1995. - V. 44. - P. 271-280.

179. Wallner G., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. The flavivirus 3'-noncoding region: extensive size heterogeneity is independent of evolutionary relationships among strains of tick-borne encephalitis virus. // Virology. 1995. - V. 213. - P. 169-178.

180. Wallner G., Mandl C.W., Ecker M., Holzmann H., Stiasny K., Kunz C., Heinz F.X. Characterization and complete genome sequences of high- and low-virulence variants of tick-borne encephalitis viruses. // J. Gen. Virol. -1996. V. 77.-P. 1035-1042.

181. Wardrop E.A., Briedis D.I. Characterization of V Protein in Measles virus-infected cells. // Virology. 1991. -V. 65. - P. 3421-3428.

182. Warrener P., Tamura J.K., Collett M.S. RNA stimulated NTPase activity associated with yellow fever virus NS3 protein expressed in bacteria. // J. Virol. -1993.- V. 67-P. 989-996.

183. Westway E.G., Brinton M.A., Gaidamovich S.Y., Horzinek M.G., Igarashi A., Kaariainen L., Lvov D.K. Portfield J.S., Russell P.K., Trent D.W.// Intervirology. 1985. - V.24. - P. - 183 - 192.

184. Wild T.F., Malvoisin E., Buckland R. Measles virus: both the haemagglutinin and fusion glycoproteins are required for fusion. // J. Gen. Virol. -1991,-V. 72.-P. 439-442.

185. Wild T.F., Naniche D., Rabourdin-Combe C., Gerlier d., Malvoisin E., Lecouturier V., Buckland R. Mode of entry of morbilliviruses. // Vet. Microbiol. -1995,-V. 44.-P. 267-270.

186. Wilkinson L. Rinderpest and mainstream infectious disease concepts in the eighteenth century // Medical History. 1984. - V. 28. - P. 129-150.

187. Yamashita T., Kaneko S., Shirota Y. et al. RNA-dependent RNA polymerase activity of the soluble recombinant hepatitis C virus NS5B protein truncated at the C-terminal region. // J. Biol.Chem. 1998. - V. 273. - P. 1547915486.

188. Yu M., Hansson E., Shiell B., Michalski W., Eaton B.T., Wang L.F. Sequence analysis of the Hendra virus nucleoprotein gene: comparison with other members of the subfamily Paramyxovirinae. // J. Gen. Virol. 19986. - V. 79. - P. 1775 - 1780.

189. Yuan Z-H. Kumar U., Thomas H.C., Wen Y-M., Monjatdino J. Expression, purification and partial characterization of HCV RNA polymerase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. -V232. - P. 231-235.

190. Zlobin VI, Drokin DA, Shamanin VA Synthetic deoxyoligonucleotide probes for identification of flaviviruses. // Nucl. Acids Symp. Ser.- 1991. -V.24. -P. 280.

191. Zlobin VI, Shamanin VA, Drokin DA, Pletnev AG Use of synthetic oligonucleotide probes for investigation of tick-borne encephalitis virus genetic variability. //Nucl. Acids Symp. Ser. 1991. -24. -P.220.