Изучение молекулярных механизмов передачи сигналов от митохондрий к ядру в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Зырина, Анна Николаевна

• Зырина, Анна Николаевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Зырина, Анна Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о ретроградной сигнализации

1.2. Ретроградная сигнализация у растений и животных

1.3. Ретроградная сигнализация у дрожжей

1.4. Основные участники Rtg-пути

1.5. Ретроградная сигнализация и клеточный цикл

1.6. Редокс-сигнализация

1.7. Уар1р - сенсор перекиси водорода у дрожжей

1.8. Супероксиддисмутазы дрожжей

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы, использованные в исследовании

2.2. Реактивы, ферменты, наборы реактивов

2.3. Среды и условия для культивирования дрожжей

2.4. Измерение выживаемости клеток при различных видах стресса методом колониеобразующих единиц (КОЕ)

2.5. Микроскопия

2.6. Проточная цитофлуориметрия

2.7. Индукция образования псевдогиф

2.8. Скрещивание штаммов и растаскивание тетрад

2.9. Индукция потери мтДНК (получение клеток [гИоО])

2.10. Амплификация дрожжевых генов при помощи ПЦР

2.11. Переосаждение ДНК

2.12. Трансформация дрожжей & свгву181ав

2.13. Выделение геномной ДНК из дрожжей

2.14. Получение мутантных дрожжевых штаммов путем модифицирования дрожжевых генов с помощью гомологичной рекомбинации

2.15. Горизонтальный гель-электрофорез ДНК

2.16. Выделение тотальной РНК из дрожжей

2.17. Обработка РНК, выделенной из дрожжей, дезоксирибонуклеазой I

2.18. Переосаждение РНК

2.19. Обратная транскрипция

2.20. ПЦР в реальном времени

2.21. Выделение митохондрий и измерение концентрации белка

2.22. Измерение скорости дыхания митохондрий

2.23. Измерение скорости образования Н202 выделенными митохондриями

2.24. Трансформация бактериальных клеток методом электропорации

2.25. Генетический скрининг, направленный на поиск генов, влияющих на выживание клеток после длительного ареста в М-фазе клеточного цикла

2.26. Определение места встраивания транспозона

2.27. Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Роль Rtg-пути при длительном аресте в различных фазах клеточного цикла у дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав

3.2. Роль Rtg-пути при мицелиально-дрожжевом диморфизме, связанном с изменением длительности G2-фазы клеточного цикла и проявляющемся в образовании псевдогиф

3.3. Митохондриальная супероксиддисмутаза, как часть каскада, передающего сигнал с помощью Н202 от митохондрий к ядру, защищает клетки дрожжей от высокой концентрации этилового спирта

3.4. Изучение взаимодействия двух ретроградных сигнальных каскадов: Rtg -пути и Sod2p-зависимого пути

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. БЛАГОДАРНОСТИ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Rtg-путь - ретроградный сигнальный путь с участием Rtg-белков Rtg-белки - белки, участвующие в Rtg-пути

MAPK - митоген-активируемая протеинкиназа (mitogen-activated protein kinase)

TORC1 - комплекс 1 мишени рапамицина (target of rapamycin complex 1)

TOR комплекс - мишень рапамицина (target of rapamycin)

SCF - комплекс из трех субъединиц: Skpl, Cull, F-box

APC - комплекс, стимулирующий анафазу (anaphase-promoting complex)

мтДНК - митохондриальная ДНК

кДНК - комплементарная ДНК

мРНК - матричная РНК

АТФ - аденозинтрифосфат

НТФ - нуклеозидтрифосфат

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

FCCP - карбонилцианид-4-(трифлуорометокси) фенилгидразон

CCCP - цианид-3-хлорфенилгидразон

JC-1 - 5,5',6,6'-тетрехлор-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид

PCP - пентахлорфенол

DAPI - 4',6-диамидин-2-фенилиндол

[rho0] - клетки без мтДНК

[rho+] - клетки c мтДНК

ДТТ - дитиотреитол

РНКаза - рибонуклеаза А

Tween 20 - полисорбат

HEPES - 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

PBS - фосфатно-солевой буфер

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

GFP - зеленый флуоресцентный белок

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение молекулярных механизмов передачи сигналов от митохондрий к ядру в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Взаимная координация действий митохондрий и ядра важна для функционирования клетки. За передачу информации о функциональном состоянии митохондрий в ядро отвечают механизмы, которые принято объединять общим названием — ретроградная сигнализация. Нарушение работы этих механизмов связывают с различными патологиями: сердечной недостаточностью, появлением раковых клеток, нейродегенеративными заболеваниями и другими. Понимание молекулярных механизмов ретроградной сигнализации может помочь в разработке лекарственных препаратов для лечения заболеваний, связанных с нарушениями взаимной регуляции между ядром и митохондриями. Поэтому исследование сигнальных каскадов, передающих информацию от митохондрий в ядро, является актуальной задачей современных исследований.

Степень разработанности темы. Ретроградная сигнализация известна у разных групп эукариот, однако лучше всего она изучена у пекарских дрожжей 8ассЬагошусв8 свгву181ав. Считается, что ключевую роль в ретроградной сигнализации свгву181ав играют Rtg-белки. При нарушении работы

митохондрий активируется белок Rtg2p, что приводит к перемещению димера транскрипционных факторов Rtg1/3p из цитоплазмы в ядро, где он активирует экспрессию генов-мишеней. Главной функцией Rtg-пути при нарушениях в работе митохондрий считается запуск экспрессии некоторых генов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла для поддержания необходимого уровня глутамата. Кроме того, показано, что Rtg -путь принимает участие в таких процессах, как метаболизм аминокислот и контроль качества митохондрий. Однако молекулярные механизмы действия ретроградного каскада в этих процессах недостаточно изучены. Помимо Rtg-белков, у дрожжей существуют другие способы передачи сигнала от митохондрий к ядру, которые также нуждаются в более детальном исследовании. Кроме того, немалый интерес вызывает взаимная регуляция между разными ретроградными сигнальными путями.

Представленная работа направлена, во-первых, на исследование роли Rtg-пути в регуляции смены фаз клеточного цикла. Опираясь на литературные данные, мы предположили существование «митохондриальных сверочных точек», которые при нарушении работы митохондрий замедляют или останавливают смену фаз клеточного цикла. Мы показали, что ретроградная сигнализация, основанная на Rtg-белках, может быть примером работы такой сверочной точки.

Во-вторых, данная работа направлена на поиск независимых от Rtg-белков молекулярных механизмов ретроградной сигнализации. Известно, что дрожжи обладают высокой устойчивостью к этанолу. До сих пор было не до конца понятно, как зависит резистентность дрожжей к этанолу от функционального состояния их митохондрий. Принимая во внимание данные об исключительной чувствительности к этанолу клеток дрожжей с делетированным геном митохондриальной супероксиддисмутазы ($>ОВ2) и участии перекиси водорода во внутриклеточной сигнализации, мы решили определить возможную роль белка Sod2p в ретроградном каскаде в условиях стресса, вызванного высокой концентрацией этанола.

Цели и задачи исследования. Целью работы была проверка гипотезы о сигнальной роли митохондрий в регуляции смены фаз клеточного цикла, а также поиск новых механизмов передачи сигнала от митохондрий к ядру. Задачи:

1. Определить устойчивость клеток дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав с инактивированной системой ретроградной сигнализации (Rtg-путь) к длительному аресту в различных фазах клеточного цикла.

2. Проверить предположение о том, есть ли в псевдогифах дрожжей (удлиненные клетки, процесс образования которых связан с задержкой G2-фазы) митохондрии с различающимся трансмембранным потенциалом.

3. Оценить способность клеток дрожжей с инактивированной системой ретроградной сигнализации (Rtg-путь) к образованию псевдогиф.

4. Проверить гипотезу о том, что митохондриальная супероксиддисмутаза

(Sod2p) принимает участие в передаче сигнала от митохондрий к ядру в

условиях стресса, вызванного высокой концентрацией этанола. Оценить

7

активацию транскрипционного фактора Yap1p в условиях экспрессии и в отсутствие экспрессии гена митохондриальной супероксиддисмутазы.

5. Определить характер взаимодействия генов SOD2, RTG2 и YAP1. Проверить гипотезу о взаимной активации Rtg-пути и белка Yap1p в условиях стресса, вызванного высокой концентрацией этанола.

Положения, выносимые на защиту:

1. Инактивация Rtg-пути увеличивает выживаемость клеток термочувствительного мутанта cdc13-1 при непермиссивной температуре за счет снижения эффективности ареста в Б-фазе.

2. В псевдогифах Saccharomyces cerevisiae содержатся субпопуляции митохондрий, различающиеся по значению трансмембранного потенциала. Данный результат подразумевает, что эта гетерогенность способствует образованию псевдогиф.

3. Роль митохондрий в образовании псевдогиф заключается в активации сигнальных каскадов, одним из которых является Rtg -путь

4. Репрессия гена SOD2 снижает уровень активации белка-сенсора перекиси водорода ^ар1р).

5. Митохондриальная супероксиддисмутаза (Sod2p) и сенсор перекиси водорода ^ар1р) участвуют в одном ретроградном сигнальном каскаде.

6. Сигнальный каскад Боё2р-Уар1р играет роль в защите от стресса, вызванного высокой концентрацией этанола.

7. Предварительная инкубация с перекисью водорода клеток с репрессированным геном SOD2 повышает их устойчивость к высокой концентрации этанола.

8. Инактивация Rtg-пути приводит к активации Уар1р, которая сохраняется в условиях репрессии гена SOD2.

Научная новизна работы. В результате проделанной работы был

обнаружен новый аспект ретроградной сигнализации, основанной на Rtg-белках, а

именно взаимосвязь этого каскада со сменой фаз клеточного цикла у дрожжей.

Во-первых, было показано, что делеция генов, продукты которых являются

участниками Rtg-пути, увеличивала выживаемость клеток после длительного

ареста в S-фазе. Во-вторых, было установлено, что Rtg-путь - положительный

8

регулятор процесса образования псевдогиф, связанного с задержкой G2-фазы клеточного цикла. Кроме того, мы обнаружили у дрожжей ранее неизвестный механизм передачи сигнала от митохондрий к ядру с помощью перекиси водорода и с участием митохондриальной супероксиддисмутазы в условиях стресса, вызванного высокой концентрацией этанола. С помощью стандартных молекулярно-биологических методов (ПЦР, трансформация дрожжей) была получена генетическая конструкция, позволившая поставить ген SOD2 под регулируемый промотор. Впервые было показано, что в условиях репрессии SOD2 не происходило активации известного сенсора перекиси водорода у дрожжей, белка Yaplp, и перемещения его в ядро в ответ на добавление спирта. Также обнаружено генетическое взаимодействие между SOD2 и YAP1, что предполагает участие обоих белков (продуктов этих генов) в одном сигнальном каскаде. Кроме того, с помощью анализа фенотипов двойных мутантов было продемонстрировано существование сложного взаимодействия между Rtg- и Sod2-сигнальными путями.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов координации работы митохондрий и ядра. В частности, были обнаружены новые функции ретроградной сигнализации. Наши исследования имеют не только фундаментальную, но и практическую значимость. Так, мы показали, что Rtg-путь участвует в образовании удлиненных клеток (псевдогиф) у дрожжей (процесс, связанный с задержкой G2-фазы клеточного цикла). Такой мицелиально-дрожжевой диморфизм привлекает большое внимание исследователей, поскольку у некоторых видов грибов, например у Candida albicans, процесс образования псевдогиф связан с переходом к патогенной форме и развитием кандидоза. Полученные данные могут использоваться для разработки более эффективных противогрибковых лекарственных препаратов. Кроме того, результаты по изучению нового механизма ретроградной сигнализации, запускаемого с помощью перекиси водорода при стрессе, вызванном добавлением этанола, могут быть использованы в промышленности для создания более

устойчивых к этанолу штаммов дрожжей.

9

Методология и методы исследования. Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae растили на богатой среде (2% глюкозы, 2% пептона и 1% дрожжевого экстракта). Необходимые для исследования штаммы получали одним из способов по стандартному протоколу: (1) индукция потери мтДНК с помощью бромистого этидия; (2, 3) постановка гена под галактозный промотор или делеция гена путем замены на канамициновую кассету с использованием ПЦР-продукта с плазмиды pFA6a-His3MX6-PGAL1 или pFA6a-kanMX4, соответственно, а затем трансформации дрожжей ПЦР -продуктом с помощью полиэтиленгликоля и литий-ацетатного буфера; (4) скрещивание штаммов и растаскивание тетрад. Выживаемость клеток оценивали по числу КОЕ (колониеобразующих единиц), образованных на твердой среде через двое суток после прекращения стресса (длительный арест клеточного цикла, добавление прооксидантов или этанола). Цифровые изображения были получены с помощью камеры Olympus DP30BW на флуоресцентном микроскопе Olympus BX51 с применением дифференциально -интерференционного контраста. Для визуализации клеточного ядра использовали краситель DAPI. Для приблизительной оценки уровня трансмембранного потенциала митохондрий в клетках использовали флуоресцентный зонд JC-1. Количественную оценку интенсивности флуоресценции GFP мы проводили на проточном цитофлуориметре CytoFLEX (Beckman Coulter, США), данные были проанализированы с помощью программы CytExpert software (Beckman Coulter, США). Для индукции образования псевдогиф добавляли 1% н-бутанола к клеткам, растущим на среде SLADB (синтетическая среда с низким содержанием азота). Оценку экспрессии генов-мишеней Rtg-пути на уровне мРНК проводили методом ПЦР в режиме реального времени. Данные обработаны с использованием пакета статистических программ R (http://www.R-project.org) с помощью рангового непарного критерия Вилкоксона и представлены в виде среднего значения со стандартной ошибкой.

Апробация работы. Результаты проделанной работы были представлены автором на 6 международных конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011»

(Москва, Россия, 2011); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, Россия, 2012); Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, Россия, 2015); the 40th FEBS Congress, The Biochemical Basis of Life (Берлин, Германия, 2015); V Съезд Физиологов СНГ, V Съезд Биохимиков России (Дагомыс, Россия, 2016); 4-й съезд Микологов России (Москва, Россия, 2017).

Личный вклад автора. Основные результаты работы были получены самим автором. Личный вклад заключается в планировании и проведении экспериментов, а также в обработке и анализе полученных данных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, индексируемых в международных системах цитирования Web of Science, Scopus или в WoS Emerging Sources и в библиографической базе PubMed; 13 материалов в виде тезисов международных конференций.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 108 страницах машинописного текста и включают 30 рисунков и 10 таблиц. Диссертация состоит из разделов: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, благодарности, список литературы (последний раздел содержит 146 источников).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общие сведения о ретроградной сигнализации

Митохондрии в эукариотических клетках выполняют множество важных функций: синтез АТФ, бета-окисление жирных кислот, биосинтез гема, участие во внутриклеточной сигнализации и другие. Хотя митохондрии частично сохранили собственный геном, большинство митохондриальных белков кодируется ядерной ДНК и транспортируется из цитоплазмы в данные органеллы. Такая ситуация вынуждает клетку создавать систему, координирующую работу между митохондриями и ядром не только для регуляции синтеза митохондриальных белков во время биогенеза, но и для сообщения о нарушениях в митохондриях, вызывающих компенсаторные ответы в ядре. Эта система, передающая информацию от митохондрий в ядро, получила название «ретроградная сигнализация». Неполадки в ретроградной сигнализации связаны с различными патологиями. Так, нарушение работы сигнальных каскадов, передающих информацию о функциональном состоянии митохондрий к ядру, связывают с появлением раковых клеток (Biswas et al., 1999; Amuthan et al., 2001; Guha and Avadhani, 2013), клеточным старением (Borghouts et al., 2004; Kirchman et al., 1999), сердечной недостаточностью, диабетом и нейродегенеративными заболеваниями (Wallace, 2013).

Наиболее подробно ретроградная сигнализация изучена у пекарских

дрожжей Saccharomyces cerevisiae: известно несколько сигнальных каскадов,

участвующих в передаче информации от митохондрий к ядру. Тем не менее, до

сих пор непонятно, какие конкретно нарушения в функциональном состоянии

митохондрий служат пусковым механизмом для активации каскадов.

Митохондрии по-разному «отвечают» на эти нарушения. Например, добавление

различных ингибиторов дыхания может приводить как к понижению

(ингибирование дыхательной цепи), так и к повышению (ингибирование АТФ -

синтазы) трансмембранного потенциала митохондрий. Кроме того, существует

ряд различных соединений, с помощью которых клетка оценивает

функциональный статус митохондрий: АТФ (Zhang et al., 2013), интермедиаты

12

биосинтеза аминокислот (Eisenberg-Bord and Schuldiner, 2016), АФК (Bourges et al., 2005), короткие пептиды (C. Lee et al., 2015), Fe-S кластеры и гем (Kaniak-Golik and Skoneczna, 2015), предшественники белков (Wang and Chen, 2015). Однако уровень этих соединений зависит не только от митохондрий. Они распознаются цитоплазматическими белками-сенсорами, которые передают сигнал в ядро, вызывая общий транскрипционный ответ. Возможно, сигнализация от митохондрий к ядру — это не один каскад, а несколько неспецифических и сложно взаимодействующих между собой процессов, которые во многом зависят и от других (немитохондриальных) факторов клеточного метаболизма.

Однако некоторые особенности митохондрий делают их уникальными участниками клеточных сигнальных каскадов. Во-первых, митохондрии имеют две мембраны. Внешняя мембрана непроницаема для молекул с молекулярной массой выше 8 кДа (Zalman et al., 1980), таким образом, сигнальные молекулы могут накапливаться в межмембранном пространстве. Так, у высших эукариот белки межмембранного пространства играют роль в запуске апоптоза (van Gurp et al., 2003), например, Smac и Diablo (Du et al., 2000), цитохром с (Zou et al., 1997). Предполагают, что у дрожжей цитохром с также участвует в активации апоптоза, хотя его цитоплазматическая мишень до сих пор неизвестна (Ludovico et al., 2002; Pozniakovsky et al., 2005). Внутренняя мембрана непроницаема для молекул с низкой молекулярной массой, таким образом, матрикс митохондрий способен задерживать некоторые промежуточные продукты метаболизма и ионы. Во-вторых, митохондрии являются мощным источником АФК, которые участвуют в клеточной сигнализации (Starkov, 2008; Dröse and Brandt, 2012).

1.2. Ретроградная сигнализация у растений и животных

Ретроградная сигнализация активно изучалась у разных групп эукариот, от растений до животных. Выявленные молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса, имеют как схожие черты, так и существенные различия.

Клетки высших растений могут реагировать на различные неблагоприятные

условия изменением функционального статуса митохондрий (уровень АФК,

13

различных метаболитов, окислительно-восстановительный статус и т.д.), что приводит к изменению экспрессии ядерных генов путем ретроградной регуляции. Ретроградная сигнализация у высших растений от митохондрий к ядру включает в себя несколько возможных путей передачи сигнала. Например, было показано, что у Brassica juncea (горчица сарептская) MAPK сигнальный путь участвует в ретроградном пути и приводит к изменению экспрессии ядерных генов, ассоциированных с мужской стерильностью. Хорошо изучен митохондриальный ретроградный путь у растений, включающий в себя активацию ядерного гена, кодирующего альтернативную оксидазу в ответ на дисфункцию митохондрий. Было показано, что экспрессия генов, кодирующих альтернативную оксидазу, активируется при ингибировании III комплекса с помощью антимицина А или ингибировании аконитазы в ЦТК с помощью фторацетата (Yang et al., 2008).

Сигнальный путь от митохондрий к ядру также известен у млекопитающих. Ретроградный сигнальный путь был впервые описан у скелетных миобластов C2C12, он включает в себя увеличение внутриклеточного уровня ионов кальция, что приводит к изменению экспрессии генов, отвечающих за разнообразные клеточные функции (Biswas et al., 1999). В дальнейшем данный кальций-зависимый сигнальный путь был подтвержден на клетках карциномы человека (Govindasamy Amuthan et al., 2002).

У Drosophila melanogaster, например, известны два независимых ретроградных сигнальных пути, которые активируются митохондриями с нарушенной функцией и контролируют переход G1/S -фазы клеточного цикла. Первый из них активирует АМФ-зависимую протеинкиназу и p53. Затем p53 активирует белок, отвечающий за специфическое убиквитинирование циклина E, что вызывает его деградацию и задержку G1/S перехода клеточного цикла. Второй путь включает в себя увеличение уровня АФК и, в конечном счете, активацию белка Dacapo, который вызывает арест Gl/S-фазы клеточного цикла (Owusu-Ansah et al, 2008; Freije et al., 2012).

У Caenorhabditis elegans существует ретроградный ответ, запускаемый при

накоплении в митохондриях неправильно свернувшихся белков. В результате

такого стресса активируется протеаза ClpP матрикса митохондрий, разрезающая

14

неправильно свернувшиеся белки на пептиды. Далее эти пептиды перемещаются через экспортер HAF -1 в цитоплазму, где они служат сигналом для активации транскрипционного фактора ATFS-1. Затем ATFS-1 перемещается в ядро и участвует в запуске экспрессии генов, кодирующих митохондриальные белки теплового шока (Hill and Van Remmen, 2014; Haynes et al., 2007).

1.3. Ретроградная сигнализация у дрожжей

Лучше всего ретроградная сигнализация изучена у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. На данный момент у дрожжей известно несколько сигнальных путей от митохондрий к ядру, регулирующих функционирование клетки при различных нарушениях в работе митохондрий. Однако эти каскады, кроме Rtg -пути, слабо изучены. Например, известно, что пептиды, образуемые при деградации митохондриальных белков различными АТФ-зависимыми протеазами, могут активно выбрасываться из митохондрий. Предполагают, что существует взаимосвязь между экспортом митохондриальных пептидов и экспрессией ядерных генов. Было показано, что делеция гена YME1, кодирующего i-AAA протеазу внутренней мембраны митохондрий, приводит к прекращению образования пептидов в межмембранном пространстве и активации ядерных генов, продукты которых участвуют в экспрессии митохондриальных генов и биогенезе дыхательной цепи (Arnold et al., 2006). Также в штамме с делетированным компонентом большой субъединицы митохондриальной рибосомы (Afolp) был показан запуск сигнального пути от митохондрий к ядру, включающего в себя активацию TORC1 комплекса и транскрипционного фактора Spflp, который активирует синтез рибосом (Heeren et al., 2009).

Rtg-зависимая ретроградная регуляция является наиболее хорошо изученным способом передачи сигнала от митохондрий к ядру у дрожжей. За работу этого каскада отвечают так называемые Rtg-белки: Rtglp, Rtg2p и Rtg3p. При дисфункции митохондрий активируется Rtg -путь, который в упрощенном виде представляет собой следующие события: белок Rtg2p инактивирует ингибитор Rtg-пути Mkslp. В результате этого активируется Rtg3p и вместе с

Rtg1p белки перемещаются в ядро, где гетеродимер Rtg1/3p связывается с промоторами генов-мишеней (рис. 1.1.).

Рис. 1.1. Упрощенная схема активации ретроградного сигнального пути в клетках дрожжей.

Rtg-путь включает в себя множество факторов, которые в ответ на сигналы от митохондрий изменяют экспрессию ядерных генов (рис. 1.2.). Такие изменения приводят к перестройке метаболизма клетки, помогая ей приспособиться к нарушениям в работе митохондрий. Основными положительными регуляторами Rtg-пути являются Rtg-белки. Rtglp, Rtg3p - транскрипционные факторы по типу лейциновая молния. Эти белки образуют гетеродимер и при частичном дефосфорилировании Rtg3p перемещаются в ядро, где связываются с R-box последовательностями в промоторах генов-мишеней (Jia et al., 1997). Rtg2p -цитоплазматический белок, который инактивирует отрицательный регулятор пути Mkslp, способствуя дефосфорилированию Rtg3p и перемещению Rtg1/3p в ядро (Liao and Butow, 1993). Кроме того, положительным регулятором является убиквитинлигаза Grrlp, вызывающая деградацию отрицательного регулятора пути Mkslp (Liu et al., 2005).

Главным отрицательным регулятором Rtg-пути является Mkslp, образующий комплекс с Bmhlp и Bmh2p, который поддерживает Rtg3p в гиперфосфорилированном состоянии и препятствует его перемещению в ядро с Rtglp (Sekito et al., 2002). Также к отрицательным регуляторам относятся субъединица TOR комплекса Lst8p (Liu et al., 2001) и так называемые 14-3-3 белки Bmhlp и Bmh2p, образующие комплекс с Mkslp и предотвращающие его убиквитинирование белком Grrlp (Liu et al., 2003).

Grrlp

Lst8p ЯдР°

Tor1/2p

Рис. 1.2. Схема активации Rtg-пути. Отрицательные (синим цветом) и положительные (зеленым цветом) регуляторы Rtg-пути. При дисфункции митохондрий активируется Rtg2p, он связывается с Mkslp и нарушает комплекс Mks1p-Bmh1/2p, который удерживал Rtg3p в гиперфосфорилированном состоянии. Как только комплекс распадается, Rtg3p частично дефосфорилируется, что приводит к перемещению гетеродимера Rtg1/3p из цитоплазмы в ядро, где он запускает экспрессию генов -мишеней Rtg-пути. Свободный Mkslp убиквитинируется Grr1p.

В чем заключается физиологическая роль Rtg-пути? При нарушениях в работе дыхательной цепи митохондрий (например, в клетках без мтДНК ([ rho0])) блокируется ЦТК из-за прекращения работы сукцинатдегидрогеназы, которая закодирована в мтДНК. Тем не менее первые три реакции ЦТК способны функционировать, и эта часть цикла может обеспечивать клетку а-кетоглутаратом, предшественником глутамата, до тех пор, пока доступен для образования а-кетоглутарата цитрат. Цитрат образуется на первой стадии ЦТК, а также в глиоксилатном цикле из оксалоацетата и ацетила-КоА. Образующийся таким образом глутамат вместе со следующим за ним по цепочке превращений глутамином обеспечивают клетку жизненно необходимым азотом для биосинтетических реакций. Следовательно, концентрация глутамата в клетке даже при нефункциональных митохондриях поддерживается на определенном уровне. Это основная особенность адаптации [rho0] клеток, которая позволяет им функционировать без электрон -транспортной цепи. Описанные выше фенотипические изменения относят к одному из важных проявлений ретроградного ответа (Jazwinski and Kriete, 2012). Таким образом, одна из главных функций Rtg-пути - это обеспечение клетки а-кетоглутаратом для синтеза

глутамата, особенно в респираторно-некомпетентных клетках. Активация ретроградного пути ведет к повышению уровня глутамата и глутамина, которые при достижении необходимого клетке количества начинают ингибировать Rtg -путь - явление отрицательной обратной связи (Liu and Butow, 2006).

Какие гены являются мишенями Rtg-пути для поддержания необходимого уровня глутамата в клетке? Показано, что Rtg-путь активирует экспрессию генов первых трех стадий ЦТК, необходимых для синтеза а-кетоглутарата: CIT1 -кодирует цитрат синтазу, IDH1/2 - кодируют НАД-зависимую изоцитратдегидрогеназу (Liu and Butow, 1999), ACO1 - кодирует аконитазу (Velot et al., 1996) (рис. 1.3.). Также данный сигнальный путь активирует экспрессию гена цитратсинтазы глиоксилатного цикла CIT2 (Liao et al., 1991; Chelstowska and Butow, 1995). Кроме того, к генам-мишеням Rtg-пути относится DLD3. Этот ген кодирует цитоплазматическую изоформу D-лактатдегидрогеназы, которая превращает пируват в лактат с окислением НАДН (Chelstowska et al., 1999). Роль активации Rtg-путем гена DLD3 для синтеза глутамата до конца не известна, но, вероятно, благодаря экспрессии этого гена восстанавливается уровень НАД+, необходимый для работы части ЦТК, при нефункционирующей дыхательной цепи митохондрий (Liu and Butow, 2006).

гены-мишени RTG

Рис. 1.3. Схема шунтирования ЦТК при активации ретроградного пути. Гены-мишени Ш^-пути. CIT1 - кодирует цитратсинтазу, ACO1 - аконитазу, IDH1/2 - НАД+ зависимую изоцитратдегидрогеназу, CIT2 - цитратсинтазу глиоксилатного цикла.

Также стоит отметить, что до сих пор неизвестно, какой сигнал от

нефункциональных митохондрий активирует Rtg2p. Рассматривают два

18

возможных параметра в качестве сигнала митохондриальной дисфункции: изменение уровня АТФ и митохондриальный трансмембранный потенциал (AY). Ранее было показано, что введение в клетки без мтДНК ([rho0]) мутации ATP1-111 повышало AY и ингибировало Rtg-сигнализацию (Miceli et al., 2012). Эти данные указывают на важную роль трансмембранного потенциала митохондрий в активации Rtg-пути, но авторы не предложили механизма, по которому Rtg2p будет «чувствовать» изменение AY в митохондриях. В другой статье было показано, что высокий уровень АТФ индуцирует диссоциацию Rtg2p c Mkslp, что приводит к ингибированию ретроградного пути (Zhang et al., 2013). С одной стороны, эти данные дополняют друг друга. С другой стороны, концентрация АТФ в клетке не строго коррелирует с трансмембранным потенциалом митохондрий. В условиях активного гликолиза и неработающей дыхательной цепи митохондрии не вносят значительный вклад в уровень АТФ (Warburg, 1956). Поэтому в таких условиях потеря мтДНК не обязательно приведет к падению уровня АТФ в клетке. Было показано, что уровень активации Rtg-пути значительно выше в клетках, выращенных на плохо сбраживаемых источниках углерода (Guaragnella et al., 2013). Кроме того, ингибитор АТФ-азы олигомицин активирует гены отличные от тех, которые активируются в [rho0] мутантах или при добавлении разобщителя CCCP (Epstein et al., 2001). Эти данные указывают на то, что активация Rtg2p скорее зависит от уровня АТФ, чем от трансмембранного потенциала митохондрий. Кроме того, так как концентрация АТФ зависит не только от митохондриальной функции, Rtg-путь не является единственным в своем роде сигнальным каскадом от митохондрий к ядру.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зырина, Анна Николаевна, 2017 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Aguilera, A., and Benitez, T. (1985). Role of mitochondria in ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology, 142(4), 389-92.

Alarco, A. M., Balan, I., Talibi, D., Mainville, N., and Raymond, M. (1997). API-mediated multidrug resistance in Saccharomyces cerevisiae requires FLR1 encoding a transporter of the major facilitator superfamily. The Journal of Biological Chemistry, 272(31), 19304-13

Alvino, G. M., Collingwood, D., Murphy, J. M., Delrow, J., Brewer, B. J., and Raghuraman, M. K. (2007). Replication in hydroxyurea: it's a matter of time. Molecular and Cellular Biology, 27(18), 6396-406.

Amuthan, G., Biswas, G., Ananadatheerthavarada, H. K., Vijayasarathy, C., Shephard, H. M., and Avadhani, N. G. (2002). Mitochondrial stress-induced calcium signaling, phenotypic changes and invasive behavior in human lung carcinoma A549 cells. Oncogene, 21(51), 7839-49.

Amuthan, G., Biswas, G., Zhang, S. Y., Klein-Szanto, A., Vijayasarathy, C., and Avadhani, N. G. (2001). Mitochondria-to-nucleus stress signaling induces phenotypic changes, tumor progression and cell invasion. The EMBO Journal, 20(8), 1910-20.

Antunes, F., and Cadenas, E. (2000). Estimation of H2O2 gradients across biomembranes. FEBS Letters, 475(2), 121-6.

Arnold, I., Wagner-Ecker, M., Ansorge, W., and Langer, T. (2006). Evidence for a novel mitochondria-to-nucleus signalling pathway in respiring cells lacking i-AAA protease and the ABC-transporter Mdl1. Gene, 367, 74-88.

Azevedo, D., Tacnet, F., Delaunay, A., Rodrigues-Pousada, C., and Toledano, M. B. (2003). Two redox centers within Yap1 for H2O2 and thiol-reactive chemicals signaling. Free Radical Biology and Medicine, 35(8), 889-900.

Bazhenova, E.N., Deryabina, Y.I., Eriksson, O., Zvyagilskaya, R.A., Saris, N.E.J (1998). Characterization of a high capacity calcium transport system in mitochondria of the yeast Endomyces magnusii. Biological Chemistry,273(8), 4372-7.

Bermingham-McDonogh, O., Gralla, E. B., and Valentine, J. S. (1988). The copper, zinc-superoxide dismutase gene of Saccharomyces cerevisiae: cloning, sequencing, and biological activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 55(13), 478993.

Bhattacharyya, S., Rolfsmeier, M. L., Dixon, M. J., Wagoner, K., and Lahue, R. S. (2002). Identification of RTG2 as a Modifier Gene for CTGCAG Repeat Instability in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 162(2).

Bienert, G. P., M0ller, A. L. B., Kristiansen, K. A., Schulz, A., M0ller, I. M., Schjoerring, J. K., and Jahn, T. P. (2007). Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes. The Journal of Biological Chemistry, 282(2), 1183-92.

Biswas, G., Adebanjo, O. A., Freedman, B. D., Anandatheerthavarada, H. K., Vijayasarathy, C., Zaidi, M., ... Avadhani, N. G. (1999). Retrograde Ca2+ signaling in C2C12 skeletal myocytes in response to mitochondrial genetic and metabolic stress: a novel mode of inter-organelle crosstalk. The EMBO Journal, 18(3), 522-33.

Borghouts, C., Benguria, A., Wawryn, J., and Jazwinski, S. M. (2004). Rtg2 Protein Links Metabolism and Genome Stability in Yeast Longevity. Genetics, 166(2).

Bork, P., Sander, C., and Valencia, A. (1992). An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(16), 7290-4.

Bourges, I., Horan, S., and Meunier, B. (2005). Effect of Inhibition of the bc1 complex on gene expression profile in yeast. Journal of Biological Chemistry, 280(33), 29743-29749.

Branco, M. R., Marinho, H. S., Cyrne, L., and Antunes, F. (2004). Decrease of H2O2 plasma membrane permeability during adaptation to H2O2 in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry, 279(8), 6501-6.

Burns, N., Grimwade, B., Ross-Macdonald, P. B., Choi, E. Y., Finberq, K., Roeder, G. S., Snyder, M. (1994). Large-scale analysis of gene expression, protein localization and gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development, 8(9), 1087-1105.

Chelstowska, A., and Butow, R. A. (1995). RTG genes in yeast that function in communication between mitochondria and the nucleus are also required for expression of genes encoding peroxisomal proteins. The Journal of Biological Chemistry, 270(30), 18141-6.

Chelstowska, A., Liu, Z., Jia, Y., Amberg, D., and Butow, R. A. (1999). Signalling between mitochondria and the nucleus regulates the expression of a new D-lactate dehydrogenase activity in yeast. Yeast (Chichester, England), 15(13), 1377-91.

Chen, S., Liu, D., Finley, R. L., and Greenberg, M. L. (2010). Loss of mitochondrial DNA in the yeast cardiolipin synthase crd1 mutant leads to up-regulation of the protein kinase Swe1p that regulates

the G2/M transition. The Journal of Biological Chemistry, 255(14), 10397-407.

Cohen, B. A., Pilpel, Y., Mitra, R. D., and Church, G. M. (2002). Discrimination between paralogs using microarray analysis: application to the Yap1p and Yap2p transcriptional networks. Molecular Biology of the Cell, 13(5), 1608-14.

Contamine, V., and Picard, M. (2000). Maintenance and integrity of the mitochondrial genome: a plethora of nuclear genes in the budding yeast. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR, 64(2), 281-315.

Costa, V., Amorim, M. A., Reis, E., Quintanilha, A., and Moradas-Ferreira, P. (1997). Mitochondrial superoxide dismutase is essential for ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae in the post-diauxic phase. Microbiology, 143(5), 1649-1656.

Crider, D. G., Garcia -Rodriguez, L. J., Srivastava, P., Peraza -Reyes, L., Upadhyaya, K., Boldogh, I. R., and Pon, L. A. (2012). Rad53 is essential for a mitochondrial DNA inheritance checkpoint regulating G1 to S progression. The Journal of Cell Biology, 195(5), 793-8.

D'Autréaux, B., and Toledano, M. B. (2007). ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5(10), 813-824.

Dickinson, J. R. (2008). Filament formation in Saccharomyces cerevisiae — a review. Folia Microbiologica, 53(1), 3-14.

Dikalov, S. (2011). Cross talk between mitochondria and NADPH oxidases. Free Radical Biology and Medicine, 51(7), 1289-301.

Drose, S., and Brandt, U. (2012). Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in Experimental Medicine and Biology, 745, 145-69.

Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L., and Wang, X. (2000). Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell, 102(1), 33-42.

Edskes, H. K., Hanover, J. A., and Wickner, R. B. (1999). Mks1p is a regulator of nitrogen catabolism upstream of Ure2p in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 153(2), 585-94.

Eisenberg-Bord, M., and Schuldiner, M. (2016). Ground control to major TOM: mitochondria-nucleus communication. The FEBS Journal.

Emran, S., Yang, M., He, X., Zandveld, J., and Piper, M. D. W. (2014). Target of rapamycin signalling mediates the lifespan-extending effects of dietary restriction by essential amino acid alteration. Aging, 6(5), 390-8.

Epstein, C. B., Waddle, J. A., Hale, W., Davé, V., Thornton, J., Macatee, T. L., ... Butow, R. A. (2001). Genome-wide responses to mitochondrial dysfunction. Molecular Biology of the Cell, 12(2), 297-308.

Feller, A., Ramos, F., Piérard, A., and Dubois, E. (1997). Lys80p of Saccharomyces cerevisiae, previously proposed as a specific repressor of LYS genes, is a pleiotropic regulatory factor identical to Mkslp. Yeast (Chichester, England), 13(14), 1337-46.

Ferreira, P., Cardoso, T., Ferreira, F., Fernandes-Ferreira, M., Piper, P., and Sousa, M. J. (2014). Mentha piperita essential oil induces apoptosis in yeast associated with both cytosolic and mitochondrial ROS-mediated damage. FEMS Yeast Research, https://doi.org/10.1111/1567-1364.12189

Ferreira Júnior, J. R., Spírek, M., Liu, Z., and Butow, R. A. (2005). Interaction between Rtg2p and Mks1p in the regulation of the RTG pathway of Saccharomyces cerevisiae. Gene, 354, 2-8.

Finkel, T. (2011). Signal transduction by reactive oxygen species. The Journal of Cell Biology, 194(1).

Fourquet, S., Huang, M.-E., D'Autreaux, B., and Toledano, M. B. (2008). The Dual Functions of Thiol-Based Peroxidases in H 2 O 2 Scavenging and Signaling. Antioxidants and Redox Signaling, 10(9), 1565-1576.

Freije, W. A., Mandal, S., and Banerjee, U. (2012). Expression profiling of attenuated mitochondrial function identifies retrograde signals in Drosophila. G3 (Bethesda, Md.), 2(8), 843-51.

Furukawa, Y., Torres, A. S., and O'Halloran, T. V. (2004). Oxygen-induced maturation of SOD1: a key role for disulfide formation by the copper chaperone CCS. The EMBO Journal, 23(14), 28722881.

Garvik, B., Carson, M., and Hartwell, L. (1995). Single-stranded DNA arising at telomeres in cdc13 mutants may constitute a specific signal for the RAD9 checkpoint. Molecular and Cellular Biology, 15(11), 6128-38.

Giannattasio, S., Liu, Z., Thornton, J., and Butow, R. A. (2005). Retrograde Response to Mitochondrial Dysfunction Is Separable from TOR1/2 Regulation of Retrograde Gene Expression. Journal of Biological Chemistry, 280(52), 42528-42535.

Grant, C. M., Collinson, L. P., Roe, J.-H., and Dawes, I. W. (1996). Yeast glutathione reductase is required for protection against oxidative stress and is a target gene for yAP-1 transcriptional regulation. Molecular Microbiology, 21(1), 171-179.

Grant, C. M., Perrone, G., and Dawes, I. W. (1998). Glutathione and catalase provide overlapping defenses for protection against hydrogen peroxide in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochemical and Biophysical Research Communications, 253(3), 893-8.

Guaragnella, N., Zdralevic, M., Lattanzio, P., Marzulli, D., Pracheil, T., Liu, Z., ... Giannattasio, S.

(2013). Yeast growth in raffinose results in resistance to acetic-acid induced programmed cell death mostly due to the activation of the mitochondrial retrograde pathway. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 7533(12), 2765-2774.

Guha, M., and Avadhani, N. G. (2013). Mitochondrial retrograde signaling at the crossroads of tumor bioenergetics, genetics and epigenetics. Mitochondrion, 73(6), 577-591.

Gulshan, K., Lee, S. S., and Moye-Rowley, W. S. (2011). Differential oxidant tolerance determined by the key transcription factor Yap1 is controlled by levels of the Yap1-binding protein, Ybp1. The Journal of Biological Chemistry, 256(39), 34071-81.

Gulshan, K., Rovinsky, S. A., Coleman, S. T., and Moye-Rowley, W. S. (2005). Oxidant-specific Folding of Yap1p Regulates Both Transcriptional Activation and Nuclear Localization. Journal of Biological Chemistry, 250(49), 40524-40533.

Hamanaka, R. B, Chandel, N. S. (2014). Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences, 35(9), 505-13.

Harbauer, A. B., Opalinska, M., Gerbeth, C., Herman, J. S., Rao, S., Schonfisch, B., ... Meisinger, C.

(2014). Mitochondria. Cell cycle-dependent regulation of mitochondrial preprotein translocase. Science (New York, N.Y.), 346(6213), 1109-13.

Hartman, J. L. (2007). Buffering of deoxyribonucleotide pool homeostasis by threonine metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 704(28), 11700-5.

Hashim, Z., Mukai, Y., Bamba, T., and Fukusaki, E. (2014). Metabolic profiling of retrograde pathway transcription factors rtg1 and rtg3 knockout yeast. Metabolites, 4(3), 580-98.

Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., and Ron, D. (2007). ClpP Mediates Activation of a Mitochondrial Unfolded Protein Response in C. elegans. Developmental Cell, 73(4), 467-480.

Heeren, G., Rinnerthaler, M., Laun, P., von Seyerl, P., Kossler, S., Klinger, H., Breitenbach, M. (2009). The mitochondrial ribosomal protein of the large subunit, Afo1p, determines cellular longevity through mitochondrial back-signaling via TOR1. Aging, 7(7), 622-36.

Herrero, E., Ros, J., Belli, G., and Cabiscol, E. (2008). Redox control and oxidative stress in yeast cells. Biochimica et Biophysica Acta, 1780(11), 1217-35.

Hill, S., and Van Remmen, H. (2014). Mitochondrial stress signaling in longevity: a new role for mitochondrial function in aging. Redox Biology, 2, 936-44.

Holmstrom, K. M., and Finkel, T. (2014). Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 15(6), 411-21.

Huh, W.-K., Falvo, J. V., Gerke, L. C., Carroll, A. S., Howson, R. W., Weissman, J. S., and O'Shea, E. K. (2003). Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature, 425(6959), 686-691.

Hutter, A., and Oliver, S. G. (1998). Ethanol production using nuclear petite yeast mutants. Applied Microbiology and Biotechnology, 49(5), 511-6.

Inoue, Y., Matsuda, T., Sugiyama, K., Izawa, S., and Kimura, A. (1999). Genetic analysis of glutathione peroxidase in oxidative stress response of Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry, 274(38), 27002-9.

Jazwinski, S. M., and Kriete, A. (2012). The yeast retrograde response as a model of intracellular signaling of mitochondrial dysfunction. Frontiers in Physiology, 3, 139.

Jia, Y., Rothermel, B., Thornton, J., and Butow, R. A. (1997). A basic helix-loop-helix-leucine zipper transcription complex in yeast functions in a signaling pathway from mitochondria to the nucleus. Molecular and Cellular Biology, 17(3), 1110-7.

Jiang, J. C., Stumpferl, S. W., Tiwari, A., Qin, Q., Rodriguez-Quinones, J. F., and Jazwinski, S. M. (2016). Identification of the Target of the Retrograde Response that Mediates Replicative Lifespan Extension in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 204(2), 659-673.

Kang, C. M., and Jiang, Y. W. (2005). Genome-wide survey of non-essential genes required for slowed DNA synthesis-induced filamentous growth in yeast. Yeast, 22(2), 79-90.

Kaniak-Golik, A., and Skoneczna, A. (2015). Mitochondria-nucleus network for genome stability. Free Radical Biology and Medicine, 82, 73-104.

Kirchman, P. A., Kim, S., Lai, C. Y., and Jazwinski, S. M. (1999). Interorganelle signaling is a determinant of longevity in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 152(1), 179-90.

Kitagaki, H., Araki, Y., Funato, K., and Shimoi, H. (2007). Ethanol-induced death in yeast exhibits features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway. FEBS Letters, 581(16), 29352942.

Koç, A., Wheeler, L. J., Mathews, C. K., and Merrill, G. F. (2004). Hydroxyurea arrests DNA replication by a mechanism that preserves basal dNTP pools. The Journal of Biological Chemistry, 279(1), 223-30.

Koonin, E. V. (1994). Yeast protein controlling inter-organelle communication is related to bacterial phosphatases containing the Hsp 70-type ATP-binding domain. Trends in Biochemical Sciences, 19(4), 156-7.

Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., and Starkov, A. A. (1997). High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters, 416(1), 158.

Kramer, P. A., Duan, J., Qian, W.-J., and Marcinek, D. J. (2015). The Measurement of Reversible Redox Dependent Post-translational Modifications and Their Regulation of Mitochondrial and Skeletal Muscle Function. Frontiers in Physiology, 6, 347.

Kron, S. J., Styles, C. A., and Fink, G. R. (1994). Symmetric cell division in pseudohyphae of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell, 5(9), 1003-22.

Kuge, S., and Jones, N. (1994). YAP1 dependent activation of TRX2 is essential for the response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress by hydroperoxides The role of the YAP1 transcription factor in the response of Saccharomyces cerevisiae cells to a variety of conditions. The EMBO Journal, 13(3), 655-664.

Lee, C., Zeng, J., Drew, B. G., Sallam, T., Martin-Montalvo, A., Wan, J., Cohen, P. (2015). The mitochondrial-derived peptide MOTS-c promotes metabolic homeostasis and reduces obesity and insulin resistance. Cell Metabolism, 21(3), 443-54.

Lee, J., Godon, C., Lagniel, G., Spector, D., Garin, J., Labarre, J., and Toledano, M. B. (1999). Yap1 and Skn7 control two specialized oxidative stress response regulons in yeast. The Journal of Biological Chemistry, 274(23), 16040-6.

Levina, N. N., and Lew, R. R. (2006). The role of tip-localized mitochondria in hyphal growth. Fungal Genetics and Biology, 43(2), 65-74.

Lew, D. J. (2003). The morphogenesis checkpoint: how yeast cells watch their figures. Current Opinion in Cell Biology, 15(6), 648-53.

Liao, X., and Butow, R. A. (1993). RTG1 and RTG2: two yeast genes required for a novel path of communication from mitochondria to the nucleus. Cell, 72(1), 61-71.

Liao, X. S., Small, W. C., Srere, P. A., and Butow, R. A. (1991). Intramitochondrial functions regulate nonmitochondrial citrate synthase (CIT2) expression in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology, 11(1), 38-46.

Liu, H., and Wang, Y. (2006). The function and regulation of budding yeast Swe1 in response to interrupted DNA synthesis. Molecular Biology of the Cell, 17(6), 2746-56.

Liu, Z., and Butow, R. A. (1999). A transcriptional switch in the expression of yeast tricarboxylic acid cycle genes in response to a reduction or loss of respiratory function. Molecular and Cellular Biology, 19(10), 6720-8.

Liu, Z., and Butow, R. A. (2006). Mitochondrial retrograde signaling. Annual Review of Genetics, 40, 159-85.

Liu, Z., Sekito, T., Epstein, C. B., and Butow, R. A. (2001). RTG-dependent mitochondria to nucleus signaling is negatively regulated by the seven WD-repeat protein Lst8p. The EMBO Journal, 20(24), 7209-19.

Liu, Z., Sekito, T., Spírek, M., Thornton, J., and Butow, R. A. (2003). Retrograde signaling is regulated by the dynamic interaction between Rtg2p and Mks1p. Molecular Cell, 12(2), 401-11.

Liu, Z., Spírek, M., Thornton, J., and Butow, R. A. (2005). A novel degron-mediated degradation of the RTG pathway regulator, Mks1p, by SCFGrr1. Molecular Biology of the Cell, 16(10), 4893904.

Longtine, M. S., Mckenzie III, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., ... Pringle, J. R. (1998). Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 14(10), 953-961.

Ludovico, P., Rodrigues, F., Almeida, A., Silva, M. T., Barrientos, A., and Corte-Real, M. (2002). Cytochrome c release and mitochondria involvement in programmed cell death induced by acetic acid in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell, 13(8), 2598-606.

Luk, E., Carroll, M., Baker, M., and Culotta, V. C. (2003). Manganese activation of superoxide dismutase 2 in Saccharomyces cerevisiae requires MTM1, a member of the mitochondrial carrier family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(18), 10353-7.

Luk, E. E.-C., and Culotta, V. C. (2001). Manganese Superoxide Dismutase in Saccharomyces cerevisiae Acquires Its Metal Co-factor through a Pathway Involving the Nramp Metal Transporter, Smf2p. Journal of Biological Chemistry, 276(50), 47556-47562.

Luk, E., Yang, M., Jensen, L. T., Bourbonnais, Y., and Culotta, V. C. (2005). Manganese activation of superoxide dismutase 2 in the mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry, 250(24), 22715-20.

Lushchak, O. V, Semchyshyn, H. M., and Lushchak, V. I. (2007). Growth on ethanol results in coordinated Saccharomyces cerevisiae response to inactivation of genes encoding superoxide dismutases. Redox Report: Communications in Free Radical Research, 72(4), 181-8.

Martinez-Anaya, C., Dickinson, J. R., and Sudbery, P. E. (2003). In yeast, the pseudohyphal phenotype induced by isoamyl alcohol results from the operation of the morphogenesis checkpoint. Journal of Cell Science, 776(16), 3423-3431.

Matsuura, A., and Anraku, Y. (1993). Characterization of the MKS1 gene, a new negative regulator of the Ras-cyclic AMP pathway in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics: MGG, 235(1-2), 6-16.

Miceli, M. V., Jiang, J. C., Tiwari, A., Rodriguez-Quinones, J. F., and Jazwinski, S. M. (2012). Loss of Mitochondrial Membrane Potential Triggers the Retrograde Response Extending Yeast Replicative Lifespan. Frontiers in Genetics, 2.

Miller, A.-F. (2012). Superoxide dismutases: Ancient enzymes and new insights. FEBS Letters, 556(5), 585-595.

Ojovan, S. M., Knorre, D. A., Markova, O. V, Smirnova, E. A., Bakeeva, L. E., and Severin, F. F. (2011). Accumulation of dodecyltriphenylphosphonium in mitochondria induces their swelling and ROS-dependent growth inhibition in yeast. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 43(2), 175-80.

Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., and Banerjee, U. (2008). Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nature Genetics, 40(3), 356-61.

Park, J. I., Grant, C. M., Davies, M. J., and Dawes, I. W. (1998). The cytoplasmic Cu,Zn superoxide dismutase of saccharomyces cerevisiae is required for resistance to freeze-thaw stress. Generation of free radicals during freezing and thawing. The Journal of Biological Chemistry, 273(36), 22921-8.

Park, S. G., Cha, M. K., Jeong, W., and Kim, I. H. (2000). Distinct physiological functions of thiol peroxidase isoenzymes in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry, 275(8), 5723-32.

Patton, E. E., Willems, A. R., Sa, D., Kuras, L., Thomas, D., Craig, K. L., and Tyers, M. (1998).

Cdc53 is a scaffold protein for multiple Cdc34/Skp1/F-box proteincomplexes that regulate cell division and methionine biosynthesis in yeast. Genes and Development, 12(5), 692-705.

Paulsen, C. E., and Carroll, K. S. (2009). Chemical dissection of an essential redox switch in yeast. Chemistry and Biology, 16(2), 217-25.

Pérez-Gallardo, R. V, Briones, L. S., Díaz-Pérez, A. L., Gutiérrez, S., Rodríguez-Zavala, J. S., and Campos-García, J. (2013). Reactive oxygen species production induced by ethanol in Saccharomyces cerevisiae increases because of a dysfunctional mitochondrial iron-sulfur cluster assembly system. FEMS Yeast Research, 13(8), 804-19.

Petrova, V. Y., Drescher, D., Kujumdzieva, A. V, and Schmitt, M. J. (2004). Dual targeting of yeast catalase A to peroxisomes and mitochondria. The Biochemical Journal, 380(Pt 2), 393-400.

Piper, P. W. (1999). Yeast superoxide dismutase mutants reveal a pro-oxidant action of weak organic acid food preservatives. Free Radical Biology and Medicine, 27(11-12), 1219-27.

Pozniakovsky, A. I., Knorre, D. A., Markova, O. V., Hyman, A. A., Skulachev, V. P., and Severin, F. F. (2005). Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. The Journal of Cell Biology, 168(2), 257-269.

Pray-Grant, M. G., Schieltz, D., McMahon, S. J., Wood, J. M., Kennedy, E. L., Cook, R. G., ... Grant, P. A. (2002). The novel SLIK histone acetyltransferase complex functions in the yeast retrograde response pathway. Molecular and Cellular Biology, 22(24), 8774-86.

Proctor, P. H., and Reynolds, E. S. (1984). Free radicals and disease in man. Physiological Chemistry and Physics and Medical NMR, 16(3), 175-95.

Qi, H., Li, T.-K., Kuo, D., Nur-E-Kamal, A., and Liu, L. F. (2003). Inactivation of Cdc13p triggers MEC1-dependent apoptotic signals in yeast. The Journal of Biological Chemistry, 278(17), 15136-41.

Rattanawong, K., Kerdsomboon, K., and Auesukaree, C. (2015). Cu/Zn-superoxide dismutase and glutathione are involved in response to oxidative stress induced by protein denaturing effect of alachlor in Saccharomyces cerevisiae. Free Radical Biology and Medicine, 89, 963-971.

Rhee, S. G. (2006). H2O2, a Necessary Evil for Cell Signaling. Science, 312(5782).

Schieber, M., Chandel, N. S., Cross, C. E., Halliwell, B., Borish, E. T., Pryor, W. A., ... Blüher, M. (2014). ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology: CB, 24(10), 45362.

Schieke, S. M., McCoy Jr., J. P., and Finkel, T. (2008). Coordination of mitochondrial bioenergetics with G i phase cell cycle progression. Cell Cycle, 7(12), 1782-1787.

Schulz, E., Wenzel, P., Munzel, T., Daiber, A. (2014). Mitochondrial Redox Signaling: Interaction of Mitochondrial Reactive Oxygen Species with Other Sources of Oxidative Stress. Antioxidants and Redox Signaling, 20(2), 308-324.

Schweitzer, B., and Philippsen, P. (1991). CDC15, an essential cell cycle gene in Saccharomyces cerevisiae, encodes a protein kinase domain. Yeast (Chichester, England), 7(3), 265-73.

Schwöb, E., Böhm, T., Mendenhall, M. D., and Nasmyth, K. (1994). The B-type cyclin kinase inhibitor p40SIC1 controls the G1 to S transition in S. cerevisiae. Cell, 79(2), 233-44.

Sekito, T., Liu, Z., Thornton, J., and Butow, R. A. (2002). RTG-dependent mitochondria-to-nucleus signaling is regulated by MKS1 and is linked to formation of yeast prion [URE3]. Molecular Biology of the Cell, 73(3), 795-804.

Sekito, T., Thornton, J., and Butow, R. A. (2000). Mitochondria-to-nuclear signaling is regulated by the subcellular localization of the transcription factors Rtg1p and Rtg3p. Molecular Biology of the Cell, 77(6), 2103-15.

Sia, R. A. L., Bardes, E. S., and Lew, D. J. (1998). Control of Swe1p degradation by the morphogenesis checkpoint. The EMBO Journal, 77(22), 6678-6688.

Singh, K. K. (2004). Mitochondria damage checkpoint in apoptosis and genome stability. FEMS Yeast Research, 5(2), 127-32.

Starkov, A. A. (2008). The role of mitochondria in reactive oxygen species metabolism and signaling. Annals of the New York Academy of Sciences, 7747, 37-52.

Stone, J. R., and Yang, S. (2006). Hydrogen Peroxide: A Signaling Messenger. Antioxidants and Redox Signaling, 8(3-4), 243-270.

Surana, U., Amon, A., Dowzer, C., McGrew, J., Byers, B., and Nasmyth, K. (1993). Destruction of the CDC28/CLB mitotic kinase is not required for the metaphase to anaphase transition in budding yeast. The EMBO Journal, 72(5), 1969-78.

Tatchell, K., Robinson, L. C., and Breitenbach, M. (1985). RAS2 of Saccharomyces cerevisiae is required for gluconeogenic growth and proper response to nutrient limitation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82(11), 3785-9.

Tate, J. J., Cox, K. H., Rai, R., and Cooper, T. G. (2002). Mks1p is required for negative regulation of

retrograde gene expression in Saccharomyces cerevisiae but does not affect nitrogen catabolite repression-sensitive gene expression. The Journal of Biological Chemistry, 277(23), 20477-82.

Turrens, J. F. (1997). Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Bioscience Reports, 17(1), 3-8.

van Gurp, M., Festjens, N., van Loo, G., Saelens, X., and Vandenabeele, P. (2003). Mitochondrial intermembrane proteins in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications, 304(3), 487-97.

Veal, E. A., Ross, S. J., Malakasi, P., Peacock, E., and Morgan, B. A. (2003). Ybpl is required for the hydrogen peroxide-induced oxidation of the Yapl transcription factor. The Journal of Biological Chemistry, 278(33), 30896-904.

Velot, C., Haviernik, P., and Lauquin, G. J. (1996). The Saccharomyces cerevisiae RTG2 gene is a regulator of aconitase expression under catabolite repression conditions. Genetics, 144(3), 893903.

Venters, B. J., Wachi, S., Mavrich, T. N., Andersen, B. E., Jena, P., Sinnamon, A. J., ... Pugh, B. F. (2011). A comprehensive genomic binding map of gene and chromatin regulatory proteins in Saccharomyces. Molecular Cell, 41(4), 480-92.

Wallace, D. C. (2013). A mitochondrial bioenergetic etiology of disease. Journal of Clinical Investigation, 123(4), 1405-1412.

Wang, X., and Chen, X. J. (2015). A cytosolic network suppressing mitochondria-mediated proteostatic stress and cell death. Nature, 524(7566), 481-484.

Warburg, O. (1956). On the Origin of Cancer Cells. Source: Science, New Series, 123(3191), 309-314.

Weinberger, M., Feng, L., Paul, A., Smith, D. L., Hontz, R. D., Smith, J. S., ... Burhans, W. C. (2007). DNA Replication Stress Is a Determinant of Chronological Lifespan in Budding Yeast. PLoS ONE, 2(8), e748.

Wemmie, J. A., Szczypka, M. S., Thiele, D. J., and Moye-Rowley, W. S. (1994). Cadmium tolerance mediated by the yeast AP-1 protein requires the presence of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene, YCF1. The Journal of Biological Chemistry, 269(51), 32592-7.

Wendler, F., Bergler, H., Prutej, K., Jungwirth, H., Zisser, G., Kuchler, K., and Hogenauer, G. (1997). Diazaborine resistance in the yeast Saccharomyces cerevisiae reveals a link between YAP1 and the pleiotropic drug resistance genes PDR1 and PDR3. The Journal of Biological Chemistry,

272(43), 27091-8.

Winterbourn, C. C., and Hampton, M. B. (2008). Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radical Biology and Medicine, 45(5), 549-561.

Wu, A. L., and Moye-Rowley, W. S. (1994). GSH1, which encodes gamma-glutamylcysteine synthetase, is a target gene for yAP-1 transcriptional regulation. Molecular and Cellular Biology, 74(9), 5832-9.

Wu, C.-Y., Steffen, J., and Eide, D. J. (2009). Cytosolic Superoxide Dismutase (SOD1) Is Critical for Tolerating the Oxidative Stress of Zinc Deficiency in Yeast. PLoS ONE, 4(9).

Wysocki, R., and Kron, S. J. (2004). Yeast cell death during DNA damage arrest is independent of caspase or reactive oxygen species. The Journal of Cell Biology, 766(3), 311-6.

Yang, J., Zhang, M., and Yu, J. (2008). Mitochondrial retrograde regulation tuning fork in nuclear genes expressions of higher plants. Journal of Genetics and Genomics, 35(2), 65-71.

Zachariae, W., Shin, T. H., Galova, M., Obermaier, B., and Nasmyth, K. (1996). Identification of subunits of the anaphase-promoting complex of Saccharomyces cerevisiae. Science (New York, N.Y.), 274(5290), 1201-4.

Zalman, L. S., Nikaido, H., and Kagawa, Y. (1980). Mitochondrial outer membrane contains a protein producing nonspecific diffusion channels. The Journal of Biological Chemistry, 255(5), 1771-4.

Zhang, F., Pracheil, T., Thornton, J., and Liu, Z. (2013). Adenosine Triphosphate (ATP) Is a Candidate Signaling Molecule in the Mitochondria-to-Nucleus Retrograde Response Pathway. Genes, 4(1), 86-100.

Zinser, E., Paltauf, F., and Daum, G. (1993). Sterol composition of yeast organelle membranes and subcellular distribution of enzymes involved in sterol metabolism. Journal of Bacteriology, 775(10), 2853-8.

Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., and Wang, X. (1997). Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell, 90(3), 405-13.