Исследование температурной криопреципитации белков при различных типах криопатий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Куликова, Ирина Юрьевна

• Куликова, Ирина Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куликова, Ирина Юрьевна

Актуальность исследования,.,,.,,,.,,.,Л

Цель работы,,,,,.,,.Л

Задачи исследования,,,,,.,,,,,.,,.,.$

Научная новизна,. А

Практическая значимость. Р

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Историческая справка о криоглобулинах. Л

Классификация криоглобулинов и их свойства.,.$ Криоглобулины и криоглобулинемия,./

Клинические проявления криоглобулинвмии. Характеристика криоглобулинов при аутоиммунных заболеваниях, . .{

Существующие представления о механизме аномальной растворимости криоглобулинов.

Роль гидратации поверхности молекулы и аминокислотной последовательности в криопреципитации.,,,,.,,,,.,.,.,,,,,,.,. Роль температурного фактора в криопреципитации.

Влияние на растворимость криопреципитата концентрации криобелков, рН? 3-5 связей и заряда коньюгатоЕ,.

АГ-АТ теория криопреципитации.

Роль вирусов в развитии криоглобулинемии,. Факторы, приводящие к накоплению

4.2 4. криоглобуинов в организме. $

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемые материалы. АЛ

Выделение криоглобулинсв.АА

1 Анализ методик выделения криоглобуиноЕ.

2 Используемая в работе методика выделения криоглобулинов.

Оценка концентрации криопреципитата е сыворотке крови при различных температурах.АА.

Определение качественного состава и размера криопреципитата,. А.(?

Исследование заряда криопреципитата.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ

Кине тика оюпмиБОЕания криопреципитата при циклических изменениях температуры.9$

Качественный состав и размер криопреципитата у исследуемых больных, . .^Р?

Исследование заряда криопреципитата. А?

Особенности кпиоглобулинемии у больных о поражением почек при системных заболеваниях. выводы.АА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование температурной криопреципитации белков при различных типах криопатий»

- 4 -1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность исследования

Известно, что криоглобулины (КГ)- это белки крови, обладающие аномальной растворимостью при понижении температуры. Они довольно часто обнаруживаются при заболеваниях аутоиммунной, вирусной и другой природы.В настоящее время увеличивается число заболеваний, в патогенезе которых коиоглобу-линемия играет важную, если не решающую роль. Одним из проявлений повышенного содержания КГ в крови являются сосудистые нарушения, которые особенно ярко проявляются при охлаждении. Степень нарушения кровообращения варьирует от возникновения болей в охлажденных конечностях до появления кровоизлияний, язв и, в некоторых случаях, гангрены. Так протекает синдром Рейно,болезнь Шегрена, системные васкулиты различной этиологии. Циркулирующие КГ оказывают влияние на систему комплемента, пролиферативную активность Т и В лимфоцитов, хемотаксис клеток воспаления, КГ взаимодействуют о системой свертывания крови, включая в образованные агрегаты молекулы ' Фибронектина. Причины, приводящие к появлению КГ в крови человека до конца не известны. Кроме того, показано, что присутствие КГ в крови сопровождается большей выраженностью и тяжестью проявлений поражения почек [?]. Замечено, что КП различных классов КГ обладают разной устойчивостью к изменениям температуры. Однако, глубоких исследований в данном направлении не проводилось. Причины, лежащие в основе криопреципитации так же полностью не изучены, и нет единого мнения по этому вопросу,

- 5

1.2 Цель работы

Установить особенности криопреципитации у больных о различными типами криоглобулинемии в зависимости от степени тяжести заболевания и обосновать необходимость определения концентрации КГ в алгоритме клинического обследования этих больных,

1.3 Задачи исследования

Задачи исследования,вытекающие из поставленной цели работы, состояли в следующем:

Провести анализ существующих методик выделения криог-лобулинов с целью выбора наиболее информативной и доступной в клинических и лабораторных исследованиях.

-к Исследовать влияние циклического изменения температуры на скорость "формирования и количество образуемого криоп-реципитата криоглобулиноЕ различных классов.

Определить качественный и количественный состав крио-комплексов у больных криоглобулинемией.

Исследовать заряд типпреи, ипитатоб.

-к Оценить особенности криопреципитации в зависимости от вида и тяжести заболевания.

1.4 Научная новизна

Впервые показано, что скорость формирования и физико-химические свойства образующегося криопреципитата зависят от типа КГ,

Установлено, что криопреципитация не является однозначной функцией температуры, а существенно зависит от направления изменения тепературы и от предыдущих воздействий на криопреципитат,.

Впервые оценен размер криопреципитатов при ХГН, заскулите и зссенциальной криоглобулинемии,СК0.

Впервые оценен заряд криопреципитата при ХГН и СКВ,

1,5 Практическая значимость

Предложен простой, информативный и экономичный метод 'выделения криогЗюбулинов, доступный для лабораторного и клинического использования.

Разработан косвенный метод определения типа криогло-булинов у больных с криоглобулинемией исходя из оценки температурных кривых криопреципитации при циклическом изменении температуры.

Показана необходимость определения уровня криоглобу-линое у больных с аутоиммунными и лимфопролиферативными заболеваниями при тяжелых формах заболевания.

Исследование температурной зависимости криоглобулинов позволяет одновременно выделить больных с наличием пирогло-булинов, входящих в состав криопреципитата. Г* Исследование температурной зависимости криопреципита-ции позволяет косвенно судить о динамике заболеваний в процессе лечения,

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Историческая справка о криоглобулинах.

Криоглобулины (КГ) представляют собой патологические белки иммуноглобулиноЕого типа, способные образовывать гель, либо преципитировать при температуре ниже 37° С и вновь растворяться при нагревании,

ПерЕое описание феномена холодоеой преципитации in vitro комплексов антиген-антитело, состоящих из полисахаридов пневмококка и соответствующих антител, было сделано M.Heidelberger, Р.Kendal в 1923 году [5].Wintrobe и Buell впервые определили крйоглобулинемию как клинический и биохимический синдром в 1933 году ЕИй.ини наблюдали за больной, страдавшей множественной миеломой, ранее диагностируемой как болезнь Рейно из-за повышенной чувствительности к холоду, сопровождающейся побледнением кожи, особой депигментацией конечностей, На холоду белки сыворотки выпадали в осадок. В 1943 году G.Peters и B.Horton [7 ] опубликовали наблюдения за больным с диагнозом "аллергическая пурпура".Симптомы заболевания появлялись при понижении температуры окружающей среды и исчезали при потеплении,

Только в 1947 году, после того, как А.Lerner и соавт. С HS ] установили связь между охлаждением и преципитацией М белков, исследован более 100 сывороток больных различными заболеваниями, были применены термины " криоглобулины" и" криоглобулинемия'',

Кроме КГ при низких температурах прещшитируют многие сывороточные белки: криошибриноген, комплексы С-реактивного белка и альбумина, некоторые компоненты комплемента, например С1£} несвертывающийся компонент фракции 1-1 по Кону, полученный ив пула нормальных сывороток, белок Бен-Джонса, агглютинины 13%Ни, {¿3].

Последние отличаются от КГ по биохимическим свойствам и механизмам формирования С Зо, ¿/с?] прециьит&та.

Работа последнего времени С /«?] позволяет придерживаться точки зрения, что криоглобулины - это иммуноглобулины, которые вырабатываются иммунокомпетентными клетками в период их шункциональ нога напряжения,

2.2 Классификация типов криоглобулинов и их свойства

Поскольку КГ не представляют собой нечто единое, существуют различные системы их классификации. Наиболее удачная предложена Вгоией и соаЕТ. [4/]. По зтой классификации КГ разделены на 3 типа, в зависимости от компонентов, входящих в состав криопреципитата,

К типу I относятся КГ, состоящие только из моноклонапь-ных иммуноглобулинов одного класса (1г13, реже 1§-А) с одним типом легких цепей ( каппа, либо лямбда),

К типу II относятся смешанные КГ, состоящие из одного моноклинального иммуноглобулина 1§\ соединенного с поликлоцентрадиях ( более 5мг/мл), чем КГ типа III (менее 1 мкг/мл)

Интересным является обнаружение КГ у здоровых людей, В работе [Ч, 2о] установлено, что в группе доноров концентрация белка криопреципитата колеблется от 0 до 60 мкг/мл, в среднем 17 мкг/мл, С учетом удвоеного стандартного отклонения этот показатель составляет 50 мкг/мл, что расценивается как Еерхняя граница нормы, J,Brouet и соавт, С/г.] не нашли значительного количества КГ в сыворотке 100 здоровых доноров, но выявили их у 40% людей старше 60 лет, J.Cream и соавт, неоднократно обнаруживали КГ у здоровых людей в концентрации до 80 мкг/мл CÄ?],

Romaszko , Tridon указывают на то, что КГ больных, в значительной мере количественно и качественно отличаются от КГ здоровых С S ],

2,3 Крмоглобулины и криоглобулинемия в

Криоглобулинемиии (КГМ) разделяются на первичные или зосенциалные и вторичные, К эссенциальной КГМ относят те случаи, когда не удается выяснить причину, лежащую в основе заболевания, хотя при длительном наблюдении могут проявиться признаки какого-либо конкретного заболевания Е 8 ].

2,3,1 Клинические проявления яри криоглобулинемиях.

Выраженность клинических проявлений зависит от количества КГ. При снижении количества КГ в крови, исчезают симптомы заболевания, хотя KT продолжают выявляться. ллиническии набор признаков КГМ может быть различным, что затрудняет диагностику. Срок от первых проявлений КГМ до постановки диагноза колеблется от нескольких месяцев до 10 лет и более , Органы и ткани поражаются в результате отложения криокомплексоЕ в отенке сосудов и развития, в следствии этого, иммунокомплекского Е&жуттаиоь].

Полагают 1,что в основе клинических проявлений у больных криоглобулинемией II и III типов лежит воспалительное поражение сосудов мелкого и среднего калибра по типу васкулита с криоглобулинемической пурпурой, артралгиями, почечным синдромом, В тоже время, у больных с криоглобулинемией I типа, перечисленные клинические признаки встречаются реже, а преобладают поражения сосудов крупного калибра с артериальным тромбозом, дигитальным некрозом. Эти проявления при КГ I типа связывают с феноменом внутрисосудистой холодо-вой преципитации и гипервязкостью, ведущими к нарушению микроциркуляции и окклюзии крупных артерий,

Частота криоглобулинемии при инфекционных заболеваниях [М,колеблется.« по данным разных авторов, от 2% до £2% , при хронических заболеваниях печени - от 5% до 23% 14? ], при системных ревматических заболеваниях - от 13% до 38% ],

При смешанной КГМ клинические проявления разнообразны и в целом соответствуют сршптомокомплексу системных ревматических заболеваний. Частота проявлений предотавленна в таблице 2 [ ] ,

- 13

Таблица 2

Частота, клинических проявлений при криоглобулинемии

Сиптомокомплекс Частота проявлений!

Повреждения кожи Вазомоторные раотройства Поражения суставов И е в р оло г иче ские расс т роис т в а Нефропатии Г еморрагии

Поражения кожи проявляются в виде криоглобулинемичеокой пурпуры. Основная локализация - кожа нет. реже pvk и нижней части живота» Частые обострения приводят к гиперпигментаттии. При иммуноморфологическом исследовании кожных биоптатов об* надэуживаются отложения иммуноглобулинов и компонентов комплемента в стенке посаженных сосудов, диотальный некроз чаще встречается при наличии моноклональных КГ. Некоторые клинические проявления не зависят от типа КРМ. К ним относятся синдром Рейно, артрит L69 1.

У 10 - 20 % больных наблюдается как проявление кристло-булинемичеокое поражение периферической нервной системы LSI.

Но по данным авторов Г ft, (¿o ]. при более детальном электрофизиологическом исследовании, поражение периферической нервной системы можно определить почти v половины больных, Наиболее типичным симптомом является сенсорная полиней-ропатия. Патология ЦНС 1(2.0, 1<$oj встречается реже и связана

60 60

- 14 с поражением сосудов мозга. У этих больных на фоне повышения вязкости крови возможны развитие транзиторного нарушения зрения, гемипарезов, повышение внутричерепного давления, острый психоз, изменения ЭКГ С 2.0, /✓<?, ],

Есть наблюдения об увеличении КГМ при обострении брон-хообструктиЕного синдрома. Тяжелое течение бронхиальной астмы , наличие осложнений совпадают с высокими уровнями КГ в периферической крови. Субклиническая легочная патология, выявляемая при рентгенологических и функциональных исследованиях, также имеет высокую частоту при КГМ [ J6 ],

Патология печени является частым признаком КГМ, причем, шормы поражения разнообразны - от гепатомегалии с нарушениями лабораторных показателей до развития цирроза. При гепатите А КГМ преходящая, прямо коррелирующая с активностью процесса и о повышением содержания IgM в сыворотке крови. Во всех КП обнаружены IgM к вирусу гепатита А [47

Поражение пЬчек имеется более, чем у половины больных [{4SI У больных с КГМ I или II типа чаше бывает нефротический синдром, а при КГМ III типа - нефритический синдром [35"]. Факторы, определяющие развитие почечной патологии у больных КГМ, неясны. Поражение почек прямо не коррелирует с концентрацией или типом КГМ, Однако, есть корреляция между уровнем КГМ и функциональным состоянием почек, между КГМ и гипокомп-лементемией, причем клиническую и морфологическую активность патологического процесса в почках лучше отражает уровень КГ, чем гипокомплементемия,

При иммунофлюоресцентном исследовании в почках находят характерные отложения компонентов комплемента С 3, реже С 4,

- 15

С- 1 и иммуноглобулинов тех же классов, из которых состоял смешанный КГ, выделенный из сыворотки крови. При электронной микроскопии выявляют очаговую пролиферацию эндотелиальных и мезангиалъных клеток, локальное увеличение мезангиального матрикоа, гиалинов гломерул, полулуния, межуточный фиброз, локализацию депозитов на эпителиальной стороне базальнык мембран гломерул. Характерно, что депозиты обнаруживают в виде гранул при отсутствии линейно окрашенных базальных мембран , как это бывает при цитотокоическом нефрите [ *оо~\.

Особый интерес представляет КГМ при системных ревматических заболеваниях. Частота обнаружения КГ в сыворотке крови варьирует в широких пределах в зависимости от контингента больных и методов выделения КГ, При системных ревматических заболеваниях , за исключением синдрома Шегрена (СШ), как правило имеются КГ II¡типа, реже- IIтипа. Моноклинальная КГМ описана лишь при СШ [ 3, -/56 ],

При СШ развитие КГМ коррелирует с системными проявлениями, поражением легких, почек, лимфоаденопатией, синдромом Рейно, Полагают, что образование КГМ при СШ отражает аномальную лимшопролиферацию, характерную для этого заболевания, Это сближает СШ с классическими лимшопролиферативными заболеваниями, при которых часто развивается КГМ типа I. В составе КГ, выделенных из сыворотки, и в моче нередко обнаруживаются моноклоналъные компоненты, например, свободные и цепи иммуноглобулинов С6 ].

КГМ - частое проявление ревматоидного васкулита и синдрома Фелти. При ревматоидном артрите (РА) частота и уровень КШ коррелируют с такими системными проявлениями, как нейропатия, дигитальный артериит, язвы голени, поражение легки:«: по типу фиброзирущего альвеолита, эписклерит. Эти данные позволяют предположить, что при РА криоглобулины могут иметь важное патогенетическое значение в развитии сосудистой патологии 1*2,1} 6],

КГМ выявлена у больных с лаймовокой болезнью.У больных о КГМ и клиническим маркером лаймовокой болезни - мигрирующей эритемой, в последствии нередко развивался артрит, а у больных с поражением кожи без КГМ поражение суставов не наблюдалось ЩЯ]Эти данные позволяют предполагать единый, связанный с участием иммунных комплексов механизм поражения суставов при лаймовокой болезни.

Повышение уровня КГ III типа описано у больных о болезнью Рейно, при которой КГМ коррелирует с лабораторными параметрами воспалительной и иммунологической активности, в том числе, с увеличением С03, появлением IgM РФ 11гу,1чч1.

При системной красной волчанке (ОКБ) частота и уровень КГМ нередко коррелирует с развитием волчаночного нефрита и другими клинике-лабораторными признаками активности волчаночного процесса [ 31, 415 3. Показано, что при СКВ на фоне КГМ нарушается опсонизирующая активность макрофагов в отношении различных микроорганизмов, что может увеличить риск бактериальной инфекции.

2.3,2 Характеристика криоглобулинов при аутоиммунных заболеваниях

Исследуя свойства КГ при некоторых ревматических заболеваниях, были обнаружены отличия в их иммунохимичеоких характеристиках. При '• ■ СКВ КП преимущественно содержат ( и в меньшей степени 1дМ и 1гА), В КП, выделенных из сывороток больных с РЙ , содержалось больше 1§М. 1§М-РФ выявлен в 65% КП при РА и только в 17% КП при СКВ, КП больных СКВ имели больше ДНК-связывающей активности, чем КП больных РА.

- связывающая активность определена в большинстве сывороток больных РА и СКВ, СЗ и С4 - одинаково в небольших количествах. Различия в составе АТ и комплементсвязывающей активности КГ в сыворотках при РА и СКВ отражают свойства иммунных комплексов, которые обуславливает их тканевое распределение [га, ¿в].

При выраженной активности волчаночного нефрита криопро-теины содержат ревматоидный Фактор (РФ) - это указывает на его роль в формировании ИК при нефрите, В работе указывается на содержание РФ в КГ. При РА содержание РФ в КГ может иметь диагностическое значение.

При исследовании состава КП, в нем, помимо основных классов иммуноглобулинов, были обнаружены иммуноглобулины, имеющие некоторые особенности Е^З, Было обнаружено, что крио -гдМ структурно несколько отличается от нормального ¡еМ,тогда как молекула нормальна. Низкомолекулярный 1цМ-крио патологического значения не имеет, а появляется в процессе полимеризации пентамерной молекулы.

В составе КП неоднократно были обнаружены компоненты комплемента: СЗ, 04, Фактор В, а также С5, иб, С9. Это позволяет предположить, что КГ представляют собой иммунные комплексы (ПК) [ Ю, 95" J.

Кроме комплемента, в составе КП могут содержаться различные белки: антитела; ДНК и анти ДНК; HBsAg, HBcAg1, HBvAg, HBvAb; антигены, представляющие собой структурные элементы патологически измененной печеночной ткани [И, Ш 3.

При изучении иммунохимического состава КГ при аутоимун-ных заболеваниях было обнаружено , что в КП, образованных моноклоналъными и поликлональными КГ, 9-15% белка приходит -ся на фибронектин (ФН) iét /22, /S2, /63 ],

ФН представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 440000 - 500000 даль тон. Установлено С 4, б, щ /53-] ? что ФН не является острофазовым белком, его концентрация не коррелирует с развитием воспаления, с иммунологическими показателями, отражающими активность иммунологического процесса. Существует обратная связь между уровнем ФН и уровнем циркулирующих иммунных комплексов (ДИК), выделенных с применением полиэтиленгликоля ПЭГ-6000, Но между концентрацией криобелка и уровнем ФН в составе КП существует достоверная корреляция [ $Ъ, Ь 9, 90 ], Renversez и соавт, С 4SI 3 показали методом ультрацентрифугирования и электрофореза в ПААГ с додецил-сульфатом Na, что о иммуноглобулинами ассоциирует ФН низкой молекулярной массы. Именно фрагменты с молекулярной массой 117 и 70 кд связаны с иммуноглобулинами во всех типах КП, взаимодействуя с Fc-областью. Кроме этого, удаление ФН значительно снижает способность сыворотки к преципитации, а добавление ФН восстанавливает ее. Это свидетельствует о том, что иммунореактивный ФН является важным компонентом крио-комплекса и в значительной степени ответственен за процесс КП. Полагают, что в основе этого процесса лежит способность ФН взаимодействовать с другими компонентами КГ: иммуноглобулинами, компонентами комплемента Clq; и 03, некоторыми аутоан-тигенами, например ДНК, Связывание с Cig усиливалось в присутствии Са++ и при низкой ионной силе раствора. По мнению J.Kono и соавт. [^взаимодействие СЩ и ФН имеет значение не только в образовании КП, но и в выведении КГ из кровяного русла, поскольку ФН усиливает клиренс Ж клетками ретикуло-эндотелиальной системы.

Из других литературных источников US€1 следует,что цепи ФН в составе КГ и сывороток больных БШ и СШ обладают, наоборот повышенной молекулярной массой, равной 250 кДа. в отличии от сывороток других больных и доноров, где молекулярная 'масса ФН составляла 22икца, Было установлено, что у большей части больных наряду с клиническим улучшением и улучшением показателей сиалометрии произошло включение ФН в КГ после проведенного курса лечения. Таким образом,по мнению авторов, выявление ФН с повышенной молекулярной массой может служить важным дигностическим параметром БШ, а его присутствие в КГ или ЦИК у этих больных является благоприятным прогностическим признаком.

Из работ 150,80,95] следует, что КГ больных ревматоидным артритом , СКВ, КГМ in vivo способны активировать комплемент как классическим, так и альтернативным путем и стимулировать хемотаксис нейтрофилов. В работе 14ЧЫ выявлена ассоциация уровня КМ и 01$ - связывающей активности сыворотки больных РА, При зтом КМ больше коррелировала с системными проявлениями, чем с повышением 01связывающей активности, У больных с люпус-нефритом ÍZJ также отмечена кореляция между положительными результатами с 01^ и наличием в этих сыворотках криопротеинов. В ряде работ [1S5 ] показано, что в сыворотках больных зссенциальной смешанной КГМ или содержащих КГ, обнаружено уменьшение уровня 01, 04, 02 при норме 03.

В работе немецких авторов 1Ш было выявлено, что - гло-булиновый компонент КГ изменяет коллоидное состояние сыворотки, Это изменение может проявиться в трех различных Феноменах; 1) в холодовой преципитации, 2) в холодовом желирова-нии, 3) в приросте выше нормы вязкости сыворотки при охлаждении, Феномены 1 и 2, как и 1 и 3 могут выступать в комбинациях, Холодовые преципитаты, исследуемые под Фазовым микроскопом, чаще всего имеют вид мелкозернисто-аморфной, реже к капельной смеси! Из трех различных холодоизмененных Феноменов, относительно часто, можно наблюдать холодовые преципитаты ,

Исследуя метаболизм криощй при КГМ и нормальных IgG C/é<7], было показано, что оба эти глобулина включаются в комплексы и метаболизируются in vivo с одинаковой скоростью.

2,4 Существующие представления о механизмах аномальной растворимости криоглобулинов.

В настоящее время существует несколько гипотез, пытающихся обьяс у ить механизм криопреципитации.

2,4.1 Роль гидратации поверхности молекулы и аминокислотной последовательности на криопреципитацию,

Как известно, растворимость белка определяется рядом факторов, в частности таких, как рН среды, поверхностный заряд молекулы и ионная сила раствора.

Степень гидратации поверхности молекулы также в большой степени сказывается на ее гидродинамических свойствах [ 70 3. Такие углеводные компоненты иммунноглобулинов, как гексозы, гексозамины и шукоза, также относятся к факторам гидратации, "влияющим на растворимость белка, тогда как остаток опаловой кислоты, несущий отрицательный заряд, вносит непосредственный вклад в полярность поверхности белка. Наибольшее влияние на растворимость оказывают, вероятно, аминокислотные остатки, их природа, а также последовательность и пространственное расположение в молекуле белка. Наиболее полярные остатки ( лизин, аргинин, гистидин, аспарги-новая кислота, глутаминовая кислота, треонин, серии и тирозин) обычно расположены на поверхности, в то время как неполярные остатки чаще всего находятся в середине молекулы в безводном окружении. Было высказано предположение, что уменьшение числа тирозиновых остатков служит причиной криопреципитации IgM, а недостаток серина в L- цепях приводит к осаждению на холоду IgG [64, Ш, /гг.s, ]. В результате изменения аминокислотной последовательности полярные остатки могут погружаться внутрь молекулы, а неполярные - выходить на поверхность, вследствие чего полярность поверхности уменьшается без реальной потери полярных остатков,

Выеод о влиянии аминокислотной последовательности на криопреципитацию звучит в работе L5G , где исследовали аминокислотную последовательность вариабельных регионов тяжелых цепей КГ человека. В этой работе методом сравнения аминокислотной последовательности Ун-доменов двух моноклональных КГ МсЕ и НИ и 22 других иммунноглобулинов не крио, показано, что аминокислотные последовательности Ун-домена КГ больше похожи на таковой некриоглобулин их индивидуальной подгруппы, чем друг на друга. Никаких необычных вставок или делеций остатков не обнаружено, Однако, было показано, что Ун-домен ' МоЕ содержит 2 беспрецендентных остатка Гли-74 и йле-84 в FR3 сегменте внешней -поверхности, а Ун-домен НИ содержит 2 беспрецендентных остатка Ала-7 и Иле-23 в FR1 сегменте и один такой остаток Арг-77 в FR3 сегменте внешней -поверхности, Эти остатки могут вызывать изменения внешней поверхности Ун-домена, в результате чего наблюдается криопреципитация этих белков. Появление этих остатков, определяющих способность КГ преципитировать на холоду, может происходить путем двух точечных мутаций, затрагивающих изменения отдельных оснований, uhersi, Natal! LSI был проведен подробный анализ аминокислотных последовательностей вариабельных участков криоглобулина VER и обнаружены некоторые отличия цепи от нормальных ИГ. Это касалось присутствия тирозина в положении 2, лейцина в положении 44, глицина в положении 100 и аргинина в положении 107 цепей КГ, хотя большинство известных в настоящее время Ig" имеют в этих положениях изолейцин, пролин, глутами-новую кислоту, лизин. Поскольку пролин играет важную роль в образовании полипептидной цепи, замена его на лейцин может существенно влиять на конфирмацию и растворимость белка.

Обсуждается вопрос о роли снижения содержания опаловых кислот и глюкозамина в феномене криопреципитации, но дефект углеводных компонентов, как правило, не характерен для мо-нокдональных Ig1, Однако, в ряде случаев было отмечено отсутствие остатка сиаловой кислоты у IgG - компонента смешанных КГ [ &, ], При анализе семи смешанных КГ IgM-IgG было показано, что в компоненте IgG четырех из них остаток сиаловой кислоты отсутствует, Так же сиаловую кислоту не удалось Обнаружить в моноклинальном КГ IgG у больного с СШ [ 3, 424, 1Sb ], Остальные углеводные компоненты, такие как фукоза, гексоза и гексозамин, которые в отличии от сиаловой кислоты не несут заряда, и вносят вклад в растворимость Ig путем гидратирования их поверхности. При отщеплении некоторых углеводных групп от КГ IgM(}() с помощью гликозида-зы, его растворимость понижалась даже при 37°0, полное растворение белка было достигнуто только при повышении температуры до 52е С С30] , Аналогичные данные получены при изучении КГ IgM (х.) с резко пониженным содержанием шукозы и гексоз, Litman, Scheffel изучали связь молекулярной основы криогло-булинов и некриоглобулинов с их физико-химическими свойствами B*aL Они обнаружили, что полностью восстановленные и ал-килированные тяжелью цепи трех моноклональных КГ субкласса IgGl, в отличии от тяжелых цепей некриоглобулинов, обладали пониженной подвижностью при электрофорезе в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (DCNa), не соответствующей их молекулярной массе. Методом гельфильтрации в 5М растворе солянокислого гуанидина показано, что молекулярные массы тяжелых цепей КГ не отличаются от молекулярных масс тяжелых цепей некриоглобулина. Повышенная злектрофоретичеокая подвижность тяжелых цепей КГ не связана ни с зарядом молекулы, ни с гетерогенностью содержания опаловой кислоты в разных КГ, т,к, ее удаление не влияло на подвижность КГ, Не наблюдали корреляции межлду величиной злектрофоретической подвижности и степенью КП среди трех исследуемых КГ, На основании элект-рофоретического анализа изолированных Fab, Fo и Fci Фрагментов КГ заключаем, что различия в электрофоретической подвижности тяжелых цепей КГ обусловлены Fci Фрагментом.

2,4.2 Роль температурного фактора в криопреципитации.

Пространственная упаковка полипептидной цепи отнюдь не является жесткой и может изменяться в ответ на различные воздействия. Например, изменение температуры влияет на скручивание и полярность полипептидных цепей ОЯВ, В то время как при оптимальных температурных условиях Ig- о пониженной полярностью остается в растворе благодаря агрегации в димеры и тримеры, охлаждение приводит к дополнительным информационным изменениям молекулы и утрате ею полярности и растворимости, т.е. к криопреципитации, При нагревании до 37° О кон-формация молекулы возвращается в ее исходное состояние и молекула вновь становится растворимой.

Теория температурных конфирмационных изменений, приводящих к криопреципитации, подтверждается рядом авторов а, Однако другие авторы не наблюдали существенных температурных изменений, конформации моноклональных КГ в диапазоне температур от 0е до 37* С. Косарев в работе С/3 3 высказывает предположение, что в механизме КП важную роль играют межмолекулярные электростатические взаимодействия, имеющие кооперативный характер, Межмолекулярно взаимодействующий кооперативный центр образуется при понижении температуры и разрушении структурных участков при стабилизирующем елиянии молекул растворителя.

2,4,3 Влияние на растворимость криопреципитата концентрации »фиооелков, рН, 3-3 связей и заряда конъюгатов

Необходимо учитывать то, что на растворимость криокомп-лексов влияет концентрация криобелков: при более высоких концентрациях температура выпадения криоиммуноглобулинов в осадок повышается. Этим объясняется непостоянство температуры выпадения в осадок КГ в одном и том же случае в разное время болезни в условиях терапии.

Кроме того, белки имеют тенденцию преципитировать в зоне, соответствующей их изозлектрической точке. Значения рН ниже 5 и выше 8,5 обычно препятствуют криопреципитации \!&], Связь между концентрацией соли и растворимостью криопротеиhoe более сложная, В большинстве случаев при снижении ионной силы менее 0,05 , уменьшается растворимость криопротеинов, но в некоторых случаях значительные колебания ионной силы от 0,05 до 0,3 не влияют на их растворимость.

Из приведенного выше следует, что сохранность структуры и конформакции КГ оказывает решающее влияние на их способность к КП, В работе [39] показано, что расщепление S-S связей приводило к уменьшению криопреципитирующих свойств КГ, причем эта способность снижалась параллельно степени расщепления дисульфидных межцепочечных связей. Однако, в некоторых случаях изолированные Fab и F(ab) - Фрагменты моноклинальных КГ сохраняют способность к криопреципитации после расщепления иммуноглобулинов папзином или пепсином.

Влияние заряда конъюгатов КП при изучении механизмов образования КГ у мышей линии MEL-Ipr/Icr проявилось в том, что связывание отрицательно заряженных динитрофенольных конъюгатов с ШЗЗ полностью подавляет их способность к криопреципитации, а положительно заряженные коньюгаты в ряде случаев усиливают криопреципитацию, Вероятно, минимальные изменения электростатического баланса ведут к выраженному изменению растворимости Igt33 при 4°и, В феномене КП наряду с зарядом могут играть роль и другие факторы, поскольку криоп-реципитирующие и некриопреципитирующие IgG3 имеют сходные изозлектрические точки при электрофокусировке. Следовательно, не только заряд цельной молекулы IgG3, но и распределение отдельных кластеров положительно заряженных доменов молекулы Ig"G3, локализованных в Fab- и Fc- фрагменте, определяет способность молекулы к криопреципитации If ],

2,4,4 AT-AT теория криопреципитации.

Альтернативным объяснением криопреципитации может служить предположение об образовании за счет нековалентных связей комплекса типа антиген-антитело, что может происходить как с изменением, так и без изменения полярности молекулы, В качестве примера можно привести аномальное поведение Fab-области моноклонального КГ IgG3 [ 15?, {S3 J. Вследствие изменения конформации РаЬ-шрагмента при охлаждении, в нем возникали новые и необычные антителосвязывающие участки, которые проявляли зависимую от температуры антительную активность в отношении как аутологичного Fo-фрагмента, так и Fc-фрагментов миеломных белков (двух IgG3 и одного Igal), в результате чего при 24й и или ниже образовывались комплексы IgG-IgG. Снижение вязкости РаЬ-фрагмента свидетельствовало о том, что происходило постепенное открывание, а затем закрывание РаЬ-шрагмента, что особенно четко было выражено между 16°и и 18°0 ,

С представлением об образовании комплексов антиген-антитело как о причине криопреципитации согласуются также данные о подавлении криопреципитации, наблюдаемое в растворе 2М мочевины, 2М гуанидинхлорида или 1М Naul и в среде с 4,5, Криопреципитацию 22S-KT удалось предотвратить добавлением его собственных Fab -фрагментов, которые ,очевидно, оказывают такое же действие, как избыток антител [/¡И. В этом особом случае антиген находится, по-видимому, в L-цепях, содержащих интактные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Fab- и

Рс-фрагменты, выделенные в результате ферментативного расщепления одиночных моноклональных КГ, не способны осаждаться на холоду [ /59 ].Г(аЬ')^-фрагмент КГ Ъ?А сохранял Ин7 1 эту способность, что свидетельствует скорее о температуроза-виоимой утрате полярности, чем о реакции антиген-антитело.

Имеется мнение [/¿2], что в Феномене криопреципитации смешанных КГ принимает участие образование комплексов антиген-антитело и РФ. Как уже отмечалось, ¡цМ РФ рассматривается как специфический компонент смешанных - КГ, и оба компонента абсолютно необходимы для криопреципитации. Эти результаты позволяют рассматривать КП как двухзтапный процесс, на первом этапе которого длительная антигенная стимуляция экзогенными (бактерии) или эндогенными (ДНК) антигенами ведет к образованию специфических шь-антител, а на втором этапе индуцируется синтез РФ против собственного . Е работе [/яг показано, что ¡¡ш РФ, присутствующий в составе КГ, обладает нйзкой аФинностью к 1£М при температуре 37*0, а пои снижении температуры афинность взаимосвязи 1шз и 1Ш резко усиливается. Примечательно, что РФ в составе КП связывается не только с эпитопами Рс-фрагмента но и с РаЬф-рагментом 1ц13, т.е. обладает антиидиотипической активностью. Это говорит о том, что центральным Фактором преципитации смешанных КГ может явиться усиливающееся на холоде связывание 1рл РФ и 1щЗ, который выступает здесь в качестве аутоан-тигена.

Анализируя литературные данные об аминокислотном строении последовательности легких цепей крио-щМ РФ, антигеновя-зыеэющих участков молекулы 1гМ, можно сделать вывод, что

- 2д усиление антигенсвязывающей активности смешанных КГ связано с их структурными особенностями. Предполагается,что смешанные КГ при КП образуют комплексы,аналогичные ЦИК. В клинических исследованиях показано, что в сьторотке больных со смешанной КГ, как правило определяется высокий уровень ЦИК, но прямой корреляции между уровнем ЦИК и КГМ нет [5"], Это указывает на то, что только часть ИК, образующихся при им-муннокомплеконом процессе, способна преципитироЕать или образовывать гель на холоду.

2,4.5 Роль вирусов в развитии криоглобулмнемии

В пооледнние годы активно обсуждалась вирусная теория происхождения КГ [/<?], С одной стороны, эта теория основывается на частом выявлении КГ у больных вирусными заболеваниями, Сторонники этой теории исследовали как лимшотропные ви-' русы, так гепал?отропные, и другой стороны, вирусная теория основывалась на включении антивирусных белков в криопреципи-таты. Ряд авторов отмечают связь КГ с поликлональной активацией В-клеточного клона, что может быть ответственным за продукцию криоглобулинов т/Щ. Более ранние исследования показали нарушение активности НКПК у больных РА с КГ 1(9 ],что нашло подтверждение в исследованиях других авторов [/£/].Эти исследования показали также влияние снижения продукции -интерферона на уменьшение активности НКПК у больных с КГ. Возможно, "агрессивность" КГ обусловлена изменением физико-химических (иммунологических) свойств белков иммуноглобулинов вследствии их структурных нарушений, вызванных изменениями содержания ионов металлов в ответ на гиперпродукцию антител, которая сопутствует КГ. Обычно КГ является транэиторной при ее возникновении у больных с острой инфекцией !?«]. Но б случаях хронической антигенной стимуляции инфекцией малые количества КГ обнаруживаются в крови длительное время îo/1. Учитывая данные статьи W1, можно считать,что при длительной антигенной стимуляции и напряженной продукции антител образуется дефицит менее "активных ионов" металлов С например Gif" и их замещение более "активными" ( занимающими в ряду акг+ активности металлов более ранние позиции),такими как Fe , Zn,

2,4.6 Факторы, приводящие к накоплению криоглобулинов в организме

Существуют работы, в которых исследовались причины, * приводящие к накоплению КГ в организме. По мнению Levo С/'?] накопление КГ в крови происходит при малигнизации или стимуляции В-клеток, специфически десиализирующем действии инфе-цирующих бактерий и их продуктов на иммуноглобулины и/или уменьшении выведения, в частности при заболеваниях печени. Данные подтверждают гипотезу Levo о снижении клиренса десиалированных гликопротеинов в присутствии вируса гепатита. Высокая концентрация этих белков приводит к усиленной стимуляции В-лимфоцитов и выработке ими больших количеств иммунноглобулинов, обуславливающих КМ. В-клетки из процесса поликлональной активации переключаются на моноклинальный прцесс в ранние стадии заболевания [ ]. ''31 —

В статье ОМ® проанализировали кинетику клиренса аутоло-гичных КГ, меченных Аи , из крови больных, идиопатической смешанной КГМ с различными дефектами функции почек. У больных с бессимптомным и умеренным нефритом белки быстро выводились через печень и, в меньшей мере, через селезенку, У больных с острым мезангио-капиллярным ГН выведение метки через печень пап со слабой обработкой КГ, У всех больных идиопатической КГМ с выраженным нефритом в сыворотке обнаружены РНК вируса гепатита С и КГ, содержащие РНК этого вируса. Подобные изменения не обнаружены у больных идиопатической КГМ без нефрита. Считают, что нарушение системы мононуклеаоных фагоцитов играет важную роль в удалении комплексов 1гМ- вирус гепатита С,

В работе Васильева [6 ] при исследовании связи между развитием КГМ,иммуннохимичеокими свойствами КГ, клиническими проявлениями и прогнозом ВШ сделано заключение, что 8-кле-точная гиперактиЬность и моноклональная КГМ параллельные процессы,

Независимо от природы и механизмов образования КГ, нарушение их специфического клиренса может играть важную роль в развитии тканевого повреждения, Показано, что гипокомпле-ментемия, нарушение экспрессии СИI-рецепторов и тип КГ являются основными факторами, нарушающими их связывание с эритроцитами и создающими предпосылки для их отложения в тканях [?*], Полагают, что КГ типа II, состоящие из 1рд РФ и1£б, обладают низкой комплементактивирующей способностью, что не только приводит к снижению их зритроцитарного транспорта к клеткам ретикулозндотелиальной системы, но и нарушает удалекие КГ фагоцитирующими клетками, поскольку для адекватного фагоцитоза необходимо синергическое взаимодействие между Горецепторами и рецепторами для комплемента^^?.

Персистирование криопреципитирующих комплексов в тканях может быть связано с локальным эффектом низкой температуры, усиливающим взаимодействие 1еМ с комплексами антиген-антитело, и увеличением локальной концентрации иммуноглобулинов, ведущим к повышению айинности связывания крио1гМ РФ и Ж, Кроме того, несмотря на отсутствие опсонизации КГ в периферической крови, фиксация комплемента на КГ, локализованных в тканях, может усиливать тканевое повреждение.

Таким образом, большая вариабельность криоглобулинов и их криопреципитатов, отсутствие единой точки зрения на причины и механизмы криопреципитации, а также несомненная роль этих белков в проявлениях многих заболеваний, приводит к необходимости дальнейшего, более глубокого их исследования с различных позиций,

3, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, 3.1, Исследуемые материалы.

В работе использовали сыворотки крови 83 больных; 30 чел, системной красной волчанкой (СКВ), 30 чел, гемморраги-ческим ваокулитом (ГВ),20 чел, хроническим гломерулонефритом (ХГН), 3 чел, множественной миеломой. Возраст больных 20-60 лет. Клинический диагноз заболевания и обследование проводилось на базе отделения нефрологии Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им.Е.М.Тареева УМА им. Сеченова й.М,

Контролем служила сыворотка крови 10 здоровых доноров, для определения иммунноглобулинового состава КП применялись наборы диагностических антисывороток против IgG,IgM,IgA производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им,Н.Ф.Гамалеи, Для определения фибронектина в составе криопреципитата применяли тест-системы LC-Partigen. Fibronektin производства Behringwerke AG.Marburg, ,

3,2, Выделение криоглобулинов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куликова, Ирина Юрьевна, 2001 год

1. Сатыбалдыев A.M., СычевГ.Л,, Иванова n.M. и др. О значении криоглобулинемии в клинике ревматических болезней на примере жителей Москвы (оседлое население) и Тынды (пришлое население Сибири) //Тер.арх.-1998. -N11. -С.1-8

2. Тихомиров A.A. Криоглобулины и их клиническое значение /У Тер.арх. -197*7. -N4. 144-148.

3. Фримель Г. //Иммунологические методы, М,, "Медицина" -1987.

4. Храмоненко С.С.,Ракитянокая A.A. //Электрофорез клеток крови в норме и патологии. -Минск. -1974,

5. Чернохвостова Е.В. .Баталова. Выявление криоглобулинемии и определение ее типа.//Тер,архив, -1977, -N8, -С. 69-76

6. Чернохвостова Е.В, Количественное определение иммуноглобулинов методом иммунной диффузии в геле.// Микробиология, -1975, -N4, -С.57-62.

7. Шинкаренко А,Я.//Особенности взаимодействия полизти-ленгликоля с белками плазмы крови и возможности использования этого полимера для фракционирования белков.диссерт.на ооиок.уч.ст.д.б.н.Киев,1972г.

8. Циуфао А.Г., Пападопулос Н.М,, Мотсопулос Г.М.Монок-лональные криоглобулины при первичном синдроме СКВ //Тер.арх, -1988, -N4, -С25-27.

9. Цуцаева A.A.,Гольцев А.Н. //Криоиммунопатология, Киев, "Наукова думка", -1988.

10. Adu D,,Gwin D. }Williams D, Complement Activation by Cryoglobulins accompaning Nephrits //Clin.exp. Immunol.-1984. -Vol,55. -P.495-501.- "7 p. —

11. Barnett E.V., Bluestone P., Craoohiolo A. ec al Cryoglobulins' and disease // Ann, Intern, Med, -1970 -vol,73. -P.95-107.35, Bengsson u,, Larsson 0, Monoclonal IgG- cryoglobulins by nephrotic sindrom //Quart, J.Med. -1975, -Vol. 44 -N175, -P491-503,

12. Biserte G, Les cryoglobulinemies //Ann. Biol. Clin -1961, -Vol.19, -P.265-287.

13. Bombardier! S.,Ferri C,,Migliorini P. et al. Cryoglobulins and Immune-Complexes Mixed Cryoglobulinemia //Pi-cerca Clin,Lab. -1986, Vol.6. -P.281-288.

14. Ilan J, Vasculitis and Cryogiobulinemia assooialid with persistiry cholestatic hepatitisA virus infeo-tio.//-1990, -Vol.85, -Nb, -P.586-587.

15. Letendre L,, Kyle R, Monoclonal Cryoglobulinemia wiht Hign //Mayo. Clin. Proc, -1982, -Vol,57, -N9/10, -P.629-693,

16. Renversez J.C., Roussel S.,Vaile M.J. et al. //Antiglobulins, Cryoglobulins and Glomerulonephritis/Ed.C.Ponti-celli et al.-Boston, 1986,-P.147-160.

17. Renversez J,0,, Viatel P., Seigneurin J. et al Cryoglobulins as immune complexes: an immunochemical study of 376 cryoprecipitates. //Protids of Biol, Fluids -1979, -Vo-lo,5, -P.391-395,

18. Renversez J. ,Revol C Fibronectin fragments act as promoters of immunoglobulin cryoprecipitation Markerr Proteins // Inflammation -1986, -Vol.3, -P,195-199

19. Renversez J. Irnmunogold staining of blotted proteins-Demonstration that fibronectin initiated the immunoglobulin cryopreoipitation //Prot. Biol, Fluids Proc, 33rd Col-log1 -1985, -P.601-604,

20. RezaM.j., Roth B,E. , Pops M,A. et al. Intestinal vasculitis in essential,mixed cryoglobulinemia, //Ann. Intern. Med., -1974, -Vol.81, -P.632-634.

21. Rigo P., De Levai-Ruiten F., Salmon J, Cryoglobuli-nemie mixte IgM-IgG-un cas chez une malade atteinte de mac-roglobulinemie de Waldenstrom.// Nouv. Presse Med,, -1974, -Vol.2, -P.2603,

22. Rostagno A.,Frangione B., Golg L. Biochemical bacte-rization of the fibronectin binding sites for Igg//J,Immunol., -1989, -Vol,143, -P.3277-3282.

23. Sohifferli J.,Amos N., Pusey C. et al IgG-turnorer Stutes in Patients //Kidney Int. -1982, -Vol.21, -N4, -P.668-670.

24. Schubothe H.,Westerhausen M. Nachweismetoden una Vorkommen vor Kryoglobuli /Detoh. Med. Wochr. -1970, -Vol.95, -N35, -P.1786-1788

25. Shif'f'erli J. Taylor R, Physiological and pathological aspects of circulating immune complexes /'/Kidney Int. -1989, -Vol.35, p.993-1003,

26. Siguier F., Godeau P,, Levi R, et al.A propos d' un cas de neuropathie cryoglobulinemique // Sem. Hop., -Vol.40, -P.1928-1934.

27. Sikander F. Analiets and immunology Cryoglobulins Studies in SLE //J.Pastgard Med. -1989, Vol.35, -N3, -P.139-143,

28. Sinco R.Identification of glomerular immune deposits in cryoglobulinemia glomerulonephritis //Kidney Int. -1988, -Vol.34, -Nl, -P.16-19.

29. Stastny P., Ziff M. Cold-insoluble complexes and complement levels in systemic lupus erythematosus //N. Engl. J. Med., -1 969. -Vol,280, -P,1376-1381.

30. Stone M.J., Fedak J. Stadies on monoclonal antibodies. II Immunecomplex (IgG-IgM)cryoglobulinemia: The mechanism of oryopreoipitatiop //J. Immunol. -1974, -Vol.113, -P.1377-1385.

31. Strevey J,, Beaulien A., Menard C. The of fibronec-tin in the cryoprec i pi tat i on of monoclonal cryoglobulins.Clin. Exp. Immunol.-1984, -Vol.55, -P.340-345,

32. Turkington R.W. 5 Buckley C.E. Maorocryoglobulinemia and sarcoidosis /7 Am. J. Med., -1966, -Vol.40, -P.156-164.

33. Tzioufas A,, Manoussakis M,, Costello R, et al Cryoglobulinemia in autoimmune rheumatic disease,//Arthritis Rheum, -1986, -Vol,29, -P.1098-1104.

34. Vartio *T,, Vaheri A. Fibronectin: chains of domains with diversified funcions //Trends in Biochemical Soi, -1983, -Vol, 8, -P,442-444,

35. Vartio T,, Muitiple interactions assigned to struc-tual comains. //Med,Biology -1983, -Vol. 61, -P,283-295,

36. Wintrobe M,M,, Buell M,W, Hyperproteinemia assozia-ted with multiple myeloma // Bull, John Hook, Hosp, -1933. -Vol,52, -P.156-165.

37. Zandecht M. Cytologioal and ultrastrucal assessment of tree crystals of precipitates associaled with pseudoleu-kocytosis and pseudothrombocytosis in cryoglobulinemia // Now Rev Fr Hematol -1989, -Vol,31, -N6, -P,397-402

38. Zborowski M, Temperature dependent protein removal by large pore membrane filtration //ASAIOTrans -1989, -Vol.35, -N3, -P,572-575,

39. Zinneman H.H., Fromke V,L,, Seal U.S. Some biochemical properties of a cryomacroglobulin /7 Clin, Chim. Acta, -1973, -Vol.43, -P.91-99.

40. Zlotnik A., Slavin S,, Eliakim M. Mixed cryoglobulinemia withmofiuclonal IgM-component associated with chronic