Исследование фитопрепаратов и оценка их качества с использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат фармацевтических наук Бродова, Мария Сергеевна

• Бродова, Мария Сергеевна
• кандидат фармацевтических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Бродова, Мария Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Определение качества лекарственных препаратов.

1.1.1 .Химические методы.

1.1.2 Физико-химические методы.

1.1.3 Биологические методы.

1.2 Специфические ферментные биотест-системы in vitro.

1.2.1 Глутатионредуктаза и глутатионредуктазная биотест-система in vitro

1.2.2 Каталаза и каталазная биотест-система in vitro.

1.2.3 НАДФ Н-оксидаза и НАДФН-оксидазная биотест-система in vitro

1.3 Адаптогены и синдром хронической усталости.

1.3.1 Элеутерококк и его применение в медицине.

1.3.2 Женьшень и его применение в медицине.

1.3.3 Левзея и ее применение в медицине.

1.3.4 Крапива и ее применение в медицине.

1.3.5 Зверобой и его применение в медицине.

1.4 Синдром хронической усталости.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1 Материалы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Спектрофотометрическое определение активности глутатионредуктазы.

2.2.2. Спектрофотометрическое определение активности каталазы.

2.2.3. Получение гомогената лейкоцитов.

2.2.4. Спектрофотометрическое определение НАДФ Н-оксидазной активности гомогенатов полиморфноядерных лейкоцитов и перитонеальных макрофагов.

2.3. Методика изучения работоспособности и выносливости на животных

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

ЗЛ.Выбор оптимальных условий получения экстракта крапивы с выраженными адаптогенными и иммуномодулирующими свойствами с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro.

3.1.1 Получение сухих экстрактов крапивы на 20, 30 и 40% спирте этиловом

3.1.2 Оценка биологической активности экстрактов крапивы с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro.

3.2. Оценка качества разных партий растительного сырья по целевой биологической активности с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro.

3.3. Влияние сухих экстрактов женьшеня, элеутерококка, левзеи и крапивы при системном введении на физическую работоспособность и выносливость.

3.4. Исследование целевой биологической активности композиций сухих экстрактов с помощью глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ»Н-оксидазной биотест-систем in vitro.

3.5. Исследование применения специфических ферментных биотест-систем in vitro для оценки качества БАВ биотехнологического происхождения.

3.6. Статистическая обработка данных.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование фитопрепаратов и оценка их качества с использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro»

Актуальность проблема

В настоящее время в медицине широко применяются фармацевтические препараты, получаемые из лекарственного растительного сырья (JIPC). Многовековые традиции российской медицины сформировали высокое доверие к лекарственным растениям практически во всех социальных группах населения. Обусловленный этим спрос российских покупателей на растительные препараты значительно выше, чем в большинстве развитых стран, где, тем не менее, на долю природных лекарств приходится в последние годы около 20-25 % всех выписываемых рецептов. В настоящее время в России особенно рационально производство фитопрепаратов. Это связано с утратой многих баз по производству химических субстанций, а также реактивов, необходимых для изготовления химических субстанций. Такое положение приводит к необходимости закупки зарубежных компонентов, и следовательно, к производству достаточно дорогостоящих препаратов.

Сложные смеси экстрактивных веществ отличаются частично известным химическим составом, а содержание отдельных компонентов может варьировать в заметных пределах. Химический состав JIPC может колебаться в зависимости от погодных условий, места произрастания, изменений в составе почвы и прочих факторов. В растении может снизиться содержание основных действующих веществ, нормируемых частной фармакопейной статьей для лекарственного растительного сырья. При этом могут накапливаться другие БАВ, обладающие фармакологическим эффектом той же направленности. В результате, после проведения анализа, из-за снижения содержания БАВ, нормируемых частной статьей ГФ XI изд., может быть забраковано растительное сырье, обладающее высокой целевой биологической активностью. Колебания по количественным и качественным характеристикам химического состава указывают на необходимость контроля каждой партии лекарственного растительного сырья по химическому составу или по целевой биологической активности. Для оценки качества фармацевтических продуктов растительного происхождения, в том числе для оценки качества сырья, для оптимизации способа получения целевого продукта, применяются химические и биологические методы, регламентируемые ГФ XI изд. [26]. Оценка биологической активности согласно ГФ XI изд. проводится на животных. В настоящее время во всем мире стремятся к сокращению количества используемых животных для исследований, направленных на разработку и создание лекарственных средств. В связи с этим, является актуальным поиск новых эффективных способов первичной оценки фармацевтических продуктов in vitro. В Научно-исследовательском и учебно-методическом центре биомедицинских технологий Всероссийского института лекарственных и ароматических растений (НИЦ БМТ ВИЛАР) в течение ряда лет разрабатываются специфические ферментные биотест-системы для выявления целевой биологической активности in vitro, отличающиеся высокой информативностью, чувствительностью и воспроизводимостью. В частности, разработаны и запатентованы тест-системы на основе ферментов антиоксидантной защиты [63, 64, 65] для выявления биологической активности адаптогенной, антиоксидантной и противомикробной направленности, а также тест-система на основе НАДФ Н-оксидазы [66], позволяющая выявлять иммуномодулирующ>ю активность. Однако пригодность ферментных биотест-систем для фармации экспериментально не изучалась. Поэтому экспериментальное изучение эффективности применения ферментных биотест-систем in vitro в фармации является актуальным. В качестве ферментных биотест-систем, подлежащих изучению были использованы глутатионредуктазная, каталазная и НАДФН-оксидазная биотест-системы in vitro, позволяющие выявить адаптогенную, антиоксидантную, противомикробную и иммуномодулирующую активность, соответственно. Применимость указанных ферментных биотест-систем in vitro, изучали на веществах обладающих адаптогенной, иммуномодулирующей и общеукрепляющей направленностью: экстрактах женьшеня, элеутерококка, левзеи, крапивы, зверобоя.

Цель исследования

Целью работы являлось экспериментальное обоснование применения специфических ферментных биотест-систем in vitro для исследования фитопрепаратов и оценки их качества.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение по биологической активности сухих экстрактов, композиций растительных экстрактов, полученных из различных партий ЛРС 2000 и 2001 гг. с помощью глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ Н-оксидазой биотест-систем in vitro.

2. Выбрать оптимальную концентрацию этанола для получения экстракта крапивы, обладающего адаптогенными и иммуномодулирующими свойствами с использованием глутатионредуктазной, каталазной и НАДФН-оксидазной биотест-систем in vitro.

3. Изучить растительные экстракты женьшеня, элеутерококка, левзеи, зверобоя и крапивы с помощью химических методик, регламентированных нд.

4. Изучить и провести сравнительную оценку адаптогенной активности экстрактов полученных из партий сырья 2000 и 2001 гг. при системном введении животным по тестам на работоспособность и выносливость.

5. Провести сравнительное изучение биотехнологических продуктов, полученных из культуры клеток женьшеня и арники горной, по биологической активности иммуномодулирующей направленности с применением НАДФ-Н-оксидазной биотест-системы in vitro.

Научная новизна проведенных исследований

1. Впервые на примере глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ-Н-оксидазной биотест-систем in vitro показана целесообразность применения специфических ферментных биотест-систем in vitro в фармации для первичной оценки качества фитопрепаратов.

2. Впервые с помощью глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ-Н-оксидазной биотест-систем in vitro экспериментально обосновано применение этанола 20-30 % концентрации для получения экстракта крапивы, обладающего адаптогенными и иммуномодулирующими свойствами.

3. Впервые с помощью НАДФ-Н-оксидазной биотест-системы in vitro были выявлены различия по выраженности биологического действия иммуномодулирующей направленности экстрактов, полученных из биотехнологических клеточных культур.

4. При анализе результатов, полученных с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro, впервые установлено, что оценка адаптогенной активности элеутерококка по содержанию элеутерозида В не является исчерпывающей.

Практическая значимость

Специфические ферментные биотест-системы in vitro отличаются высокой информативностью, воспроизводимостью, быстротой получения результатов. Они позволяют выявлять целевую биологическую активность образцов без использования животных и могут быть применены в качестве методов выбора для подбора оптимальных условий извлечения из растений веществ с целевой биологической активностью, для первичной оценки качества растительных экстрактов, для оценки качества клеточных культур как продуцентов БАВ.

Глутатионредуктазная, каталазная и НАДФ-Н-оксидазная тест-системы in vitro могут быть использованы в фармации для первичной оценки адаптогенной, антиоксидантной, противомикробной и иммуномодулирующей активности и отбора наиболее активных образцов.

Полученные результаты использовались в ВИЛАР при создании нового препарата с адаптогенными свойствами.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения; трех глав; заключения; выводов; списка литературы, содержащего 155 источника; 8 рисунков и 12 таблиц. Общий объем работы составляет 106 страниц машинописного текста.

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Бродова, Мария Сергеевна

Выводы

1. Проведена первичная оценка качества по биологической активности сухих экстрактов, полученных из ЛРС натурального и биотехнологического происхождения с применением глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ-Н-оксидазной биотест-систем in vitro.

2. Установлены различия в биологической активности адаптогенной и иммуномодулирующей направленности в экстрактах женьшеня, элеутерококка и левзеи, полученных из партий сырья 2000 и 2001 гг.

3. С применением глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ-Н-оксидазной биотесг-систем in vitro, найдена оптимальная концентрация этанола для получения экстракта крапивы двудомной, обладающего адаптогенными и иммуномодулирующими свойствами.

4. Сопоставление данных, полученных с применением специфических ферментных биотест-систем in vitro, с результатами фармакологического эксперимента и с результатами определения содержания элеутерозида В в экстрактах элеутерококка, полученных из партий сырья 2000 и 2001 гг., позволяет сделать вывод о том, что оценка адаптогенной активности элеутерококка по содержанию элеутерозида В не является исчерпывающей.

5. С использованием глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ-Н-оксидазной биотест-систем in vitro, проведена первичная оценка целевой биологической активности композиций растительных экстрактов. Установлено, что композиция «ВИЛАР» проявляет выраженные адаптогенные и иммуностимулирующие свойства. Композиция 1, с иным соотношением компонентов, чем в композиции «ВИЛАР» (левзея, элеутерококк, женьшень, крапива, зверобой в соотношении 3:1:1:4:2 соответственно) обладает антимикробными и иммуностимулирующими свойствами.

6. Адаптогенные свойства экстрактов женьшеня, элеутерококка, левзеи, крапивы, выявленные с помощью глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ-Н-оксидазной биотест-систем in vitro, подтверждены в фармакологических экспериментах: мыши, получавшие per os изучаемые экстракты, показали в плавательном тесте с грузом более высокую работоспособность и выносливость, чем контрольные животные.

7. Специфические ферментные биотест-системы in vitro предлагаются для первичной оценки качества фитопрепаратов по целевой биологической активности.

Заключение

Целью нашей работы являлось экспериментальное обоснование эффективности применения специфических ферментных биотест-систем in vitro в фармации для первичной оценки фармацевтических продуктов на примере фитопрепаратов - сухих экстрактов из JIPC женьшеня, элеутерококка, левзеи, зверобоя и крапивы. Для достижения цели нами были применены разработанные и запатентованные в НИЦ БМТ ВИЛАР оригинальные специфические ферментные биотест-системы in vitro: глутатионредуктазная, каталазная и НАДФ Н-оксидазная [63, 64, 65, 66]. В глутатионредуктазной системе тест-объектом является фермент антиоксидантной защиты ГР, основная биологическая роль которого заключается в поддержании высокого уровня глутатиона восстановленного, эндогенного антиоксиданта, играющего важную роль в защите белков, липидов, нуклеиновых кислот от перекисного окисления. Субстратом ГР является окисленный глутатион. ГР занимает важные позиции в обеспечении жизненных сил организма. В каталазной системе тест-объекюм является антиоксидантный фермент КАТ, который, превращает перекись водорода в воду и кислород и таким образом препятствует образованию свободных гидроксильных радикалов. КАТ принимает участие в защите организма, в том числе микроорганизма, от оксидативного стресса. Особенно важна КАТ как фактор защиты для микроорганизмов. В НАДФ-Н-оксидазной системе тест-объектом является лимитирующий фермент «респираторного взрыва» НАДФ-Н-оксидаза, катализирующий начальную и регуляторную стадию фагоцитоза. Эти свойства лежат в основе «способности» ГР, КАТ, НАДФ-Н-оксидаза способны «узнавать» адаптогены и антиоксиданты, антимикробные вещества, иммуномодуляторы, соответственно. Таким образом, нами выбраны три тест-системы, основанные на ферментах, относящихся к разным классам и выполняющих важные функции в организме.

По результатам проведенных экспериментов, на примере ферментных глутатионредуктазной, каталазной и НАДФ-Н-оксидазной тест-систем in vitro, показана эффективность применения специфических ферментных биотест-систем in vitro как новых способов первичной оценки фитопрепаратов по их биологической активности. Следует подчеркнуть специфичность каждой из этих биотест-систем для определенного вида биологической активности. Результаты исследований показали возможность применения специфических ферментных биотест-систем in vitro для выбора оптимальных условий экстрагирования JIPC с целью получения продукта с искомой биологической активностью, первичной оценки качества J1PC, препаратов растительного происхождения, продуктов биотехнологического происхождения.

Специфические ферментные биотест-системы in vitro позволяют первично оценить качество образца. В случае удовлетворительной оценки, полученной в результате первичного тестирования in vitro, далее следует оценка с помощью методов, регламентированных ГФ XI изд., на исследуемый препарат (химические, физико-химические или биологические). При этом с помощью ферментных биотест-систем in vitro, можно значительно увеличить скорость проведения первичной оценки качества исследуемого вещества. Прежде всего, это связано с высокой селективностью и информативностью ферментных биотест-систем in vitro. Каждая ферментная биотест-система in vitro позволяет оценить продукт по одному биологическому параметру. Для выявления спектра биологически активных свойств, проявляющихся в фармакологическом действии, следует применять соответствующий набор ферментных тестов in vitro. С помощью ферментных биотест-систем in vitro, можно первично оценить целевую биологическую активность без определения химического состава изучаемого объекта, его природы, что весьма существенно для препаратов сложного состава. Существующие регламентированные методики часто позволяют определить химическую группу, к которой относится стандартизируемое вещество, а не идентифицируют его в отдельности. В частности, проведение капельных, микрокристаллических реакций, титрования и других химических методов в ряде случаев дает информацию о наличии химической группы, в которую входит действующее вещество. Таким образом, при исследовании качества можно дать ошибочную оценку изучаемому объекту. В другом случае, когда действующим началом является не одно, а несколько веществ, относящихся к одной и той же химической группе, как, например, в женьшене, не найдя всех регламентируемых панаксозидов, можно забраковать ЛРС высокой биологической активности. Это связано с тем, что минорные компоненты, как установлено в последнее десятилетие, вносят большой вклад в биологическое действие женьшеня. Специфические ферментные биотест-системы in vitro позволяют до проведения анализа, регламентированного ГФ XI изд., дать адекватную первичную оценку качества препарата с точки зрения биологической активности.

Применение специфических ферментных биотест-систем in vitro позволило в короткие сроки оценить направленность биологической активности 4 композиций, состоящих из сухих экстрактов женьшеня, элеутерококка, левзеи, зверобоя и крапивы в различных соотношениях. Было установлено, что композиция «ВИЛАР» проявляет адаптог&нную и иммуностимулирующую активность. Композиция 1, где крапивы содержится 4 части, а соотношение крапивы и зверобоя составляет 2/1, проявила антимикробные и иммуностимулирующие свойства. Композиция 2, в которой зверобоя содержится 4 части, а соотношение крапивы и зверобоя составляет обладает только антимикробными свойствами. Таким образом, в нашей работе было показано, что из смеси одних и тех же компонентов можно получить препараты разной направленности: адаптогенной и иммуностимулирующей, антимикробной, антимикробной и иммуностимулирующей.

Специфические ферментные биотест-системы in vitro могут также применяться для поиска и разработки стандартов. Сопоставляя результаты, полученные с помощью химического анализа и данных, полученных с применением ферментных биотест-систем in vitro, можно за достаточно короткие сроки и с высокой степенью достоверности выявить действующие вещества, ответственные за определенную биологическую активность и разработал» стандарт. Так, обнаружение адаптогенных свойств в экстрактах крапивы, полученных на 20-30 % этаноле, позволяет применить эти биотест-системы для поиска действующих веществ-маркеров, отвечающих за адаптогенный эффект. Специфические ферментные биотест-системы in vitro не заменяют имеющиеся традиционные методы анализа, но могут успешно применятся в совокупности с ними. Таким образом, направленное изучение с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro биологической активности фармацевтических препаратов, особенно фитопрепаратов, в совокупности с изучением химического состава и изучением составляющих веществ с помощью этих тестов - реальный путь для поиска веществ, ответственных за определенную биологическую активность.

Данные нашей работы, полученные в фармакологических исследованиях на животных, подтверждают результаты, полученные с помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro.

С помощью специфических ферментных биотест-систем in vitro удалось показать, что оценка адаптогенной активности экстракта элеутерококка по элеутерозиду В, регламентированному НД, не является исчерпывающей.

Таким образом, представленный материал показывает, что применение специфических ферментных биотест-систем in vitro является новым перспективным способом проведения первичной оценки качества фитопрепаратов по целевой биологической активности. Использование специфических ферментных биотест-систем in vitro может значительно ускорить и упростить первичную оценку фитопрепаратов, а также извлечений, полученных из культур клеток, методами, регламентированными НД.

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Бродова, Мария Сергеевна, 2003 год

1. Аносова О.Г., Николаев С.М., Попов Д.М. Фармакологическое исследование цветков бузины черной, красной, сибирской // Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях. М. -1997. -4.2. -С.159-161.

2. Аруианян Э.Б., Бейер Э.В. Хронобиологические особенности антистрессорного действия анксиолитических средств // Экспериментальная и клиническая фармакология. -1998. -Т. 61. -№ 6. -С.13-16.

3. Арцимович Н.Г., Галушина Т.С. Синдром хронической усталости. -М: Научный мир, 2001. -221 с.

4. Арцимович Н.Г., Корнев А.В., Иванова Т.М., Чугунов А.В. и др. Подходы к иммунодиагностике и лечению синдрома хронической усталости и нейроиммунных расстройств // Иммунология. -1994. -№ 7. -С. 42-45.

5. Арцимович Н.Г., Корнев А.В., Иванова, Т.М. Чугунов А. В. и др. СХУ и иммунной дисфункции // Иммунология. -1994. -№6. -С. 10-13.

6. Арцимович Н.Г., Настоящая Н.Н. Антибиотики как регуляторы иммунитета // Гематология и трансфузиология. -1992. -Т. 37, -№ 11-12. -С.40-42.

7. Атлас лекарственных растений СССР./ Под ред. Цицина Н.В. -Госуд. издательство медицинской литературы. -М. 1962. -С. 258-259.

8. Бобкова Л.Н. Контроль качества лекарственных форм, содержащих кортикостероиды и другие активные вещества: Автореф. дис. к. фарм. наук. Харьков, 1992. -24 с.

9. Ц.Брехман И.И. Женьшень. Л., -1968. -185 с.

10. Брехман И.И., Грушвицкий И.В., Гутникова З.И. Женьшень как лекарственное растение, -М: Наука, 1954. -16с.

11. Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В.А., Александрова И.В. и др. Первичная оценка культур клеток растений как продуцентов БАВ по их биологической активности // Биомедицинские технологии. -М.-1999. -Вып. 11. -С.56-61.

12. Бэрроу М. СХУ: Пер. с англ. Е.К. Денякиной. -М.: Междунородный журнал «Панорама», 1999. -192с.

13. Василяускас Ю.Ф. Некоторые биохимические исследования крапивы двудомной // Съезд фармацевтов Лит. ССР.2-ОЙ. Тез. докл. -Каунас. -1977. -С.115.

14. Варболович В.П., Подгорная Л.М. Определение активности глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы на биохимическом автоанализаторе // Лаб. дело. -1987. -№ 2. -С. 17-20.

15. Владимиров Ю.А. Эфферентная медицина.-М.:НИИФХМ.-1994.-С.23-28.

16. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика.-М.: ВИНИТИ, 1991.-Т.29.-С.248.

17. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании мембран. -М:Наука.-1989.-С. 9-25.

18. Владимиров Ю.А., Шерс~нев М.П., Пирязев А.П. // Биофизика. -1989. -№6. -С. 1051.

19. ВФС 42-2090-92 Экстракт элеутерококка сухой. Срок введения 15.01.92. Срок действия до 31.12.95.

20. Гаршев А.В., Еремин С.В., Наумова Е.Э., Гаршев А.В. и др. Применение ВЭЖХ для определения витамина Ki в таблетках крапивы // Международный медико-биологический конгресс: СПб., 25-30 мая, 1997г./СПб., 1997. С.26-27.

21. Гераськина М.А., Барнашова Г.С. Перекисное окисление липидов и активность КАТ тканей кроликов в условиях длительной гиподинамики // Медицина. Естественные и технические науки: Научные труды: в 3 ч. / -Саранск, -1999. -Ч. 2. -С. 4-8.

22. Головкин В.И., Алимова Л.И. Синдром хронической усталости // TERRA MEDICA журнал для врачей всех специальностей. -1996. -№ 2. -С. 1417.

23. Государственная фармакопея СССР, одиннадцатое изд. -М.: Медицина, 1990. -вып.

24. Гриневич М.А. Материалы по биологической оценке различных корней, препаратов и действующих веществ женьшеня. Автореф. дис. канд. мед. наук. Хабаровск, 1964, -24с.

25. Дардымов И.В. Женьшень, элеутерококк: (к механизму биологического действия), -М.: Наука, 1976. -184 с.

26. Дардымов И.В. Механизмы действия женьшеня и элеутерококка: Автореф. дис. д-ра. мед. наук. Л., 1987. -41 с.

27. Дардымов И.В., Хасина Э.И. Элеутерококк. Тайны панацеи, СПб.: Наука, 1993. -125 с.

28. Девяткина Т.А., Важничая Е.М., Луценко Р.В. Особенности процессов перекисного окисления липидов в различных тканях при остром стрессе и его коррекции пирацетамом и церебролизином // Эксперим. клин, и фармакол. -2000. -Т. 63. -№4. -С. 38-41.

29. Дурнев А.Д., Сазонтова Т.Г., Гусева Н.В., Середенин С.Б. Влияние диоксидина и циклофосфана на перекисное окисление липидов и активность супероксиддсмутазы и каталазы // Бюл. эксперим. биол. и мед., -1996. -№ 5. -С. 528-532.

30. Ефремова И.Н. Влияние фитопрепаратов женьшеня, солодки и эхинацеи на специфическую иммунореактивность // Тр. молодых уч.: Сб. науч. Работ / Под. общ. ред. С.Л. Кабака. -М.: МГМИ, 2000. -С. 242.

31. Жижина Т.В., Манохина Л.Б., Строжук П.Г. и соавт. О клинической оценке активности каталазы и карбоангидразы крови у детей // Вопр. ревматизма. -1979. -№ 2. -С. 36.

32. Клебанов Г.И., Туркменова Э.М. Иванова Л.И., Владимиров Ю.А.// Биофизика.-1986.-Т.31 .-№1 .-С.73-78.

33. Клебанова В.А. Синдром хронического утомления // Гигиена и санит. -1995. -№1. -С.35-37.

34. Колесниченко Л.С. Свойства и регуляция глутатионредуктазы и тиоредоксинредуктазы. // Тез.5 Всес. биохим. съезда. -М.: Наука, 1986. Т.2. -С. 198-199.

35. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы // Успехи современной биологии. -1989. -Т.107. -№2. -С. 184-185.

36. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. -М: Мир, 1979.-279с.

37. Королюк М.А., Иванова М.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. М.: Медицина. -1988. -№1. -С.1-8.

38. Кузнецов В.Ф., Черешнев В. А. Патофизиология дисфункций нейтрофилов. -Киров, 1998. -119с.

39. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи современной биологии. -1990. -Т. 110. -Вып. 1 (4). -С. 20-28.

40. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона // Успехи биологической химии. М.: Наука. -1990.- Т.31. -С. 157-179.

41. Куркин В.А., Авдеева Е.В., Запесочная Г.Г., Сенцов М.Ф. Контроль качества экстракта расторопши жидкого // Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях. М. -1997. -4.2. -С.88-95.

42. Кьосев П.А. Полный справочник лекарственных растений. -М.: ЭКСМО-Пресс, 2001.-992с.: ил.

43. Лежнева Л.П., Муравьев И.А., Череватый B.C. Антибактериальная активность листьев Urtica dioica L. // Раст. ресурсы.-1986. Вып2.-С.255-257.

44. Лекарственные растения Сибири / Минаева В.Г. 5-е изд., перераб. и доп. -Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1991.-431с.

45. Лекарственные растения: справочное пособие/ Баландина И.А., Гринкевич Н.И., Ермакова В.А. и др. -М.: Высшая школа, 1991. -С. 152-164.

46. Лякина М.Н., Горбусенко М.П. Определение суммы экдистероидов в экстракте левзеи жидком // Современные проблемы фармацевтической науки и практики. Науч.труды, М. -1999. Т. 38, -Ч. 2. -С. 246-250.

47. Максимова И. Целительная крапива. СПб.: ИК «Невский проспект»,2001. -128с.

48. Машковский М.Д. Лекарственные средства, -М.: Медицина, 1993. -736 с.

49. Можайский A.M., Севастьянова В.Л., Смирнова Т.В., Живлюк Ю.Н. и др. Применение гельхроматографии для оценки качества природного препарата мумие // Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях. М. -1997. -4.2. -С.95-100.

50. Мороз И.Н., Подколзин А.А. Новое в диагностике и лечении синдрома хронической усталости // Профилактика старения. -1998.-Вып.1.

51. Мукумов М.Р. Проблема проведения доклиничских испытаний лекарственных средств по требованиям GLP в России // Первый Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы. М.: -1992г. -С. 391

52. Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация/ Под ред. проф. В. Л. Багировой, проф. В. А. Северцева. -СПб.: СпецЛит, 2001.-223с.

53. Николаев С.М., Хобракова В.Б., Мондоедов А.Г., Абгалдаева Е.А. и др. Иммуномодулирующее действие многокомпонентных фитосредств в условиях вторичного иммунодефицита // Практическая фитотерапия.2002. -№4. -С. 18-20.

54. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. -М. -Витебский мединститут, 1996. -282 с.

55. Павлович С.А. Основы иммунологии. -Мн.: Вышейшая школа, 1998. 144 с.

56. Пасс Х.И. / Физ. Медицина. -1993.-T.3-№3-4.-C.5-12.

57. Патент № 2181890. Способ выявления веществ, обладающих адаптогенными свойствами, in vitro / Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В.А, Ребров Л.Б., Колхир В.К. 2001.

58. Патент № 2181891. Способ выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами, in vitro / Быков В.А., Минеева М.Ф., Дубинская В.А, Ребров Л.Б., Колхир В.К. 2001.

59. Патент № 2181892. Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro / Быков В.А., Дубинская В.А, Минеева М.Ф., Ребров Л.Б., Колхир В.К.

60. Патент № 218892. Способ выявления веществ с потенциальной иммуномодулирующей активностью in vitro с применением НАДФ Н-оксидазной тест-системы / Быков В.А., Минеева М.Ф., Попова Н.Б. -2002.

61. Попова Н.Б. Создание тест-системы для выявления иммуномодуляторов на основе НАДФ Н-оксидазы. Дис. канд. фарм. наук.-М., 2000.-100 с.

62. Попова Н.Б., Стихии В.А., Минеева М.Ф., Быков В.А. Применение ферментативной НАДФ-Н-оксидазной системы in vitro для первичного скрининга активаторов фагоцитоза среди растительных объектов // Биомедицинские технологии. -М.-1999. Вып. 11.-С.62-65.

63. Ратахина Л.В. Фармакологические свойства крапивы двудомной: Автрореф. дис. фарм. наук. -Томск, 1986. -25с.

64. Ратахина Л.В., Пашинский В.Г., Мизина Т.Ю. Адаптогенная активность настоя листьев Urtica dioica L. // Раст. ресурсы.-1993.Вып. 1.-С.44-49.

65. Реестр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. М.: «РЛС-2000». 1999 г., 1070с.

66. Российская Г.И., Лякина М.Н., Соколов С.Я. Разработка препарата тонизирующего и адаптогенного действия и его фитохимическое изучение // Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях. М. -1997. -4.2. -С.95-100.

67. Рубцов Б.В., Клебанов Г.И., Ружицкий А.О., Владимиров Ю.А. / Изв. АН СССР. Серия "Биология". 1994.-№2.-С.299.

68. Сафин В.А. Динамика извлечения экстрактивных веществ крапивы двудомной водно-спиртовыми смесями // Ученые записки, том VI, вып.1 Ставрополь, кн. изд. 1967.-С.296-301.

69. Сафин В.А. Изучение сырья, процесса экстракции биологически активных веществ и некоторых суммарных препаратов крапивы двудомной. Дисс. канд. фарм. наук. Пятигорск.-1966. -223с.

70. Сафин В. А. О влиянии крепости спирта на динамику экстракции каротина и хлорофилла из листьев крапивы двудомной // Ученые записки, том VI, вып. 1 Ставрополь, кн. изд. 1967.-С.285-291.

71. Серебряков, Р.В. Разработка и обоснование способа определения биологической активности фитоадаптогенов на модели одноклеточных эукариот. Автореф. дис. канд.биол. наук. М., 1997. -20 с.

72. Синтез и контроль качества лекарств: Сб. науч. Тр. под ред. А. А. Цуркана. Рязань.-1991.-С143.

73. Скулкова Р.С. Современное состояние и перспективы развития системы контроля качества лекарственных средств // Фармация. -1994. -Т. 43. -№ 6. -С. 27-32.

74. Скупченко В.В., Посвалюк Н.Э., Маховская Т.Г. Вегето-иммунотропный эффект гелий-неоновой лазеротерапии // Новое в лазерной медицине и хирургии: Тезисы междунар. Конф. Переславль-Залесский 17-19 октября. / -Переславль-Залесский, 1990. -Ч. 2. -С. 78-80.

75. Сокольская Т.А. Создание лекарственных средств из плодов расторопши пятнистой (получение, стандартизация и контроль качества) // Фармация. -2002. -№ 1. -С. 32.

76. Соодаева С.К. Активация НАДФН-оксидазы фагоцитов пылевыми частицами // Пульмонология. -1996. -№ 3. -С.65-66.

77. Супильникова А.В. Качественный и количественный анализ лекарственного сырья и настойки полыни эстрагон // Фармация. -2002. -Ч.51-№3.-С. 11-14.

78. Суслов Н.И., Скурихин Е.Г., Провалова Н.В. и др. Некоторые аспекты механизма действия адаптогенных препаратов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -2001. -№1. -С.6-9.

79. Танеева Г. В., Кислицын Ю.Н., Волошко Н.А. и др. Динамика каталзной активности крови у спортсменов под воздействием локальной декомпрессии // Физиология человека. -1979. -№ 3. -С. 564.

80. ТУ 64-4-119-95 Экстракт женьшеня сухой. Срок введения с 01.09.1995.

81. Ушанова В.А., Лебедева О.И., Репях С.М. Исследование влияния условий произрастания на химический состав крапивы двудомной / Химия раст. сырья. -2001. №3., - С.97-104.

82. ФС 42-2725-90 Корневище и корень элеутерококка колючего. Изменение №1. Срок введения изменения с 24.02.1992.

83. ФСП 42-0171174901 вместо ВФС 42-2733-96. Экстракт зверобоя сухой.

84. Фрейддин И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети // Иммунология. -1995. -№3.-С.45-48.

85. Фрустов Н.К. Лекарственные растения Дальнего Востока, -Хабаровск, 1987. -341 с.

86. Хаитов P.M., Гущин и.С., Пинегин Б.Л., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фармакологического комитета.-1999. -№1. -С.31-36.

87. Чалый Г.А., Яцкж В.Я., Сурнина Н.Т. Изучение биологической активности некоторых природных полиенов // Современные проблемы фармацевтической науки и практики. М. -1999. Т. 38, -Ч. 2. -С. 321-324.

88. Чернов Н.Н. Функциональные особенности обмена глутатиона в печени крыс // Тез. 5 Всес. биохим. съезда. -М.: Наука, 1986. -Т. 2. -с.236-237.

89. Шанько В.М. Зависимость изменения каталазной активности крови от интенсивности воспалительного процесса // Вопр. клин, и теор. мед. -1972. -№ 6. -С. 8-12.

90. Шифрин М.А., Заикин В.Н., Гармаш В.Я., Тихадзе А.К. Изменение активности ГР крови при неспецифических заболеваниях легких // Терапевт, архив. -1977. -№ 12. -С. 50-55.

91. Abella A., Clerc D., Chalas J. et al. Concentration en superoxyde, catalase at glutathione peroxidase dans les plaquettes et le plasma de sujets atteients de polyarthrite rheumatoide // Ann. Boil. Clin. -1987. Vol. 45. -P. 152-155.

92. Aebi H. Methods in enzymatic Analysis ed H. V. Bergmeyer S. P. -1974. -V. 2. -P. 673-678.

93. Akabay P., Basaran A.A., Undeger U., Basaran N. In vitro immunomodulatory activity of flavonoid glycosides from Urtica dioica L. // Phytother. Res. -2003. -№17(1). -P.34-37.

94. Artsimovich N., Komev A., Ivanova T. et al. // International Congress ISNIM, 2-nd: Abstracts. — Paestrum-Salerno, 1993. — P. 371.

95. Artsimovich N. G Current Problems of Clinical and Experimental Psychoneouroimmunology // Theses of Symposium with International Participation.—Tomsk, 1992.—Vol. 1.—P. 80—82.

96. Artsimovich N., Chugunav V., Komev A. et al. // International Conference on Immunorehabilitation, 1-st: Abstracts. —Tskhal-tubo, 1992.— P. 30.

97. Berghofer R., Holzl J. Isolation of 13, 118-biapigenin (amentoflavon) from Hypericum perfopatum // Planta med. -1989. -Vol.55, №1. -P.91.

98. Beuter E., Red cell metabolism. Ed. E. Beuter, Churchill, Livingsone. 1986. -P.69-71.

99. Buchwald D. II Post-viral Fatigue Syndrome /Eds R. Jenkins J.Mowbray. — 1991.—P. 117—136.

100. Buchwald D., Komaroff A. L. Symptoms and signs of chronic fatigue syndrome // Rev. infect. Dis.— 1991. — Vol. 13. — Siippl. 1. — P. 12—18.

101. Buchwald D., Cheney P. R., Peterson D.L. et al. A chronic illness characterized by fatigue, neurologic and immunologic disorders, and active human herpesvirus type 6 infection //Ann. intern Med.— 1992.—Vol. 116, № 2.— P. 103—113.

102. Calabrese L, Danoa P., Camara E., Wilke M // CFIDS Chron. J. CFIDS Ass.— 1992.— Sept.— P. 6—12.

103. Sloley BD, Urichuk LJ, Ling L, Gu LD, Coutts RT, Pang PK, Shan JJ. Chemical and pharmacological evaluation of Hypericum perforatum extracts // Acta Pharmacol. Sinica. -2000. Vol. 21. Iss. 12. -P. 1145-1152.

104. Chi J.D., Franklin M. Measurement of hyperforin a constituent of St.-John Wort in plasma by high-performance liquid-chromatography // J. Chromatogr. B. -1999. -Vol. 735. № 2. -P. 285-288.

105. Chugunav V. S., Artsimovich N. N., Komev A. V. el al. // J. Neuroimmunol.— 1991.— Suppl. 1.— P. 143.

106. Cotton P. Treatment proposed for chronic fatigue syndrome; research continues to compile data on disorder // J.A.M.A.— 1991.—Vol. 266, № 19.— P. 2667.

107. Daniels R.H., Elmore M.A., Hill M.E., Shimuzu Y. et al. // Immunology.-1994.-№4.-P.465-472.

108. Daudt R., Vonposer G.L., Neves G.et al. Screening for the antidepressant activity of some species of Hypericum from South Brazil // Phytother. Res. -2000. -Vol. 14. -Iss. 8. -P. 661-661.

109. Davydov M., Krikorian A.D. Eleutherococcus Senticosus (Rupr. and Maxim.) Maxim. (Araliaceae) as an adaptogen a closer look // J. Ethnopharmacol. -2000. -Vol. 72. -№ 3. -P. 345-393.

110. Draves A. H., Walker S. E. Determination of hypericin and pseudohypericin in pharmaceutical preparations by liquid-chromatography with fluorescence detection//J. Chromatogr B. -2000. -Vol.749, № 1, -P. 57-66.

111. Dubler R.E., Anderson E.M. Simultaneous inactivation of the catalytic activities of yeast glutathione reductase by N-alkylmaleimides // BBA. -1981. -V. 659, № 1. -P.70-85.

112. Goldenberg D. L. // Semin. Artlir. Rheum.— 1988.— Vol. 18.— P. Ill— 120.

113. GoldsteinJ.A. Cluonic Fatigue Syndromes: The Limbic Hypothesis.— Haworth, 1993.—Vol. 1.

114. Grau R., Blatterspiel R., Siegelk. The complete primary structure of glutathione reductase from humane erythrocytes // Flavines and flavoproteins. -N.Y., 1982. -P. 38-43.

115. Gupta S., Vayuvegula A. A comprehensive immunological analysis in chronic fatigue syndrome // Scand. J. Immunol.— 1991.—Vol. 33, №3.—P. 319—327.

116. HickieJ., Lloyd A., Wakerfield D., Parker C. The psychiatric status of patients with the chronic fatigue syndrome // Brit. J. Psychiat.— 1990.—Vol. 156.—P. 534—540.

117. Holmgren A. Pyridine nucleotide oxidoreductases // Dehydrogenese requiring nicotinamide coenzyme // Ed. leffens Im -Basel, 1980. -P. 149-180

118. Huesing J.E., Murdock L.L., Shade R.E. Rise and stining nettle lectins -insecticidal activity similar to wheat-germ-agglutinin // Phytochemistry. -1991. -Vol. 30. -Iss. 11. -P. 3565-3568.

119. Jones J. F. /1OTDS Chron. J. CFIDS Ass.— 1992.— P. 44-^6.

120. Komev A. V., Artsimovich N. G., Ivanovo T.M. et al. // Current Problems of Clinical and Experimental Psychoneuroimmunol-ogy: Theses of Symposium with International Participation.—Tomsk, 1992.—Vol. 1.—P. 83—85.

121. Konrad L., Muller H.H., Lenz C., Laubinger H. et al. Antiproliferative effect on human prostatecancer cells by a stinging Nettle Root (Urtica-Dioica) extract // Planta Med. -2000. -Vol. 66. №1. -P. 44-47.

122. LandayA.L., Jessop C., Lennette E.T., Levy J.A. Chronic fatigue syndrome: clinical condition associated with immune activation // Lancet.— 1991.—Vol. 338, № 8769.—P. 707—712.

123. Le Moal MA, Colle JH, Galelli A, et al. Mouse T-lymphocyte activation by Urtica dioica agglutinin. I. -Delineation of two lymphocyte subsets // Res. Immunol. -1992. -Vol. 143(7). -P.691-700.

124. Maisenbacher P., Kovar K.A. Analisis and stability of Hiperici oleum// Planta medica. -1992. -Vol. 58. -Iss. 4. -P. 351-354.

125. Miller N. A., Carmichael H. A., Hall F. C. et al. Antibody to Coxsackie В virus in diagnosing postviral fatigue syndrome // Brit. med. J.— 1991.—Vol. 302.—P. 140—143.

126. Mohandas G., Marshall G.G., Duggin G.I. Differential distrilution of glutathione- related enzymes in rabbit kidney // Biochem. Pharmacol. -1984. -V. 33, №11.-P. 1801-1807.

127. Muruganandam A.V., Ghosal S., Bhattacharya S.K. et al. The role of xanthones in the antidepressant activity of Hypericum-Perforatum involving dopaminergic and serotonergic systems // Biog. amine -2000. Vol. 15. -Iss. 5. -P. 553-567.

128. Ozturk Y., Aydin S., Baser K.H.C. et al. Hepatoprotective activity of Hipericum-perforatum L. Alclholic extract on rodents // Phitotherapy Res. -1992. -Vol. 6. -Iss. 1. -P. 44-46.

129. Pabst M., Hedegaard H., Johnston R. Cultured human monocytes require exposure to bacterial products to maintain an optimal oxygen radical response.// J. Immunol.-1982.-Vol.l28.№l.-P.123-128.

130. Park J.-W. // Biochemical and Biophisical Research Communications.-1996.-Vol.229.-P.758-765.

131. Rovira P., Bukle M., Abastado J.P. et al. Major histocompatibility class I malecules present Urtica dioica agglutinin, a superantigen of vegetal origin, to T-limphocytes // Eur. J. Immunol. -1999. -№29 (5). -P.1571-1580.

132. Sloley B.D., Urichuk L.J., Ling L., Gu L.D. et al. Chemical and pharmacological evaluation of Hypericum-perforatum extracts // Acta Pharmacol, sin. -2000. -Vol. 21. № 12. -P. 1145-1152.

133. Sloley B.D., Urichuk L.J., Ling L., Gu L.D. et al.Carlberg I., Pepierre I., Mannervik B. Effect of inducers of drug-metabolizing enzymes on glutathione peroxidase in rat liver. // BBA. -1981. V.677, №1. -P 140-145.

134. Southwell I.A., Campbell M.H. Hipericin content variation in Hipericum-perforatum in Australia // Phytochem. -1991. -Vol. 30. -Iss. 2. -P. 475-478.

135. Szolomicki S., Samochowiec L., Wojcicki J., Drozdzik M. The influence of active components of Eleutherococcus-Senticosus on cellular defense and physical-fitness in man // Phytother. Res. -2000. -Vol. 14. -№ 1. -P. 30-35.

136. Tahri A., Yamani S., Legssyer A., Aziz M. et al. Acute diuretic, natriuretic and hypotensive effects of a continuous perfusion of aqueous extract of Urtica Dioica in the Rat // J. Ethnopharmacol. -2000. -Vol.73. № 1-2. -P. 95-100.

137. Tanimura М., Kobuchi Н., Utsumi Т., et al. Neutrophil priming by granulocyte colony stimulating factor and its modulation by protein kinase inhibitors // Biochem. Pharmacol.-1992/-Vol.44.-№2.-P.1042-1051.

138. Volz H.P., Laux P. Potential treatment for subthreshold and mild depression a comparison of St.-John Wort Extracts and fluoxetine // Compr. Psychiat. -2000. -Vol. 41. № 2. -P. 133-137.

139. Wagner H., Wilier F., Kreher B. Biologically active cmpounds from the aqueous extract of Urtica dioica // Planta Med. -1989. -Vol. 55(5). -P.452-454.

140. Worthnington D.J., Rosemeyer M.A. The isolation and properties of glutathione reductase from human erythrocytes // Biochem. Soc. Trans. -1974. -Vol. 2. -P. 927-928.

141. Yagisawa M., Yuo A., Kitagawa S. Stimulation and priming of human neutrophils by IL-la antagonist and interaction with other cytokines // Exp. Hematol.-1995.-Vol. 23(7).-P.603-608.