Исследование электрофизиологической активности кардиомиоцитов разных типов и их применение для изучения про- и антиаритмических свойств используемых и перспективных фармпрепаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Коваленко Сандаара Георгиевна

• Коваленко Сандаара Георгиевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Коваленко Сандаара Георгиевна

Основные понятия и обозначения

Введение

Актуальность темы исследования

Цели и задачи диссертационной работы

Научная новизна

Научно - практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации

Структура и объем работы

Личный вклад автора

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Проводящая система сердца

1.2. Потенциал действия

1.3. Клеточная электрофизиология

1.4. Общее строение потенциалзависимого ионного канала

1.5. Потенциалзависимые натриевые каналы

1.6. Потенциалзависимые кальциевые каналы

1.7. Потенциалзависимые калиевые каналы

1.8. Электрофизиологический метод пэтч-кламп

1.9. Особенности электрофизиологии кардиомиоцитов различных типов

1.10. Ботулотоксин типа А и новохитозоль

1.11. Соединение нитроксисукцината 3 -гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния

1.12. Бета-адреностимуляция

1.13. Кардиоплегические растворы Кустодиол и Нормакор

Глава 2. Методы и материалы

2.1. Получение кардиомиоцитов

2.1.1. Подготовка образцов

2.1.2. Метод выделения неонатальных кардиомиоцитов крыс

2.1.3. Дифференцировка из ИПСК в человеческие кардиомиоциты

2.1.4. Забор биоптата и транспортировка

2.1.5. Выделение человеческих кардиомиоцитов из биоптата

2.2. Растворы для исследования клеточной электрофизиологии

2.3. Установка пэтч-кламп

2.4. Протоколы стимуляции

2.5. Состав кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор

2.6. Остальные реактивы и реагенты

2.8. Обработка и анализ данных

Глава 3. Исследование влияния новых соединений на неонатальных кардиомиоцитах крыс

3.1. Действие смеси ботулотокшна типа А и новохитозоля

3.2. Исследование действия нитроксиcукцината этилметилгидроксипиридиния на неонатальных кардиомиоцитах

3.3. Выводы и обсуждение к главе

Глава 4. Исследование электрофизиологической активности человеческих кардиомиоцитов из ИПСК линии здорового донора

4.1. Исследование работы быстрых натриевых каналов человеческих

кардиомиоцитов при физиологической температуре

4.2. Действие изопреналина на человеческие кардиомиоциты

4.3. Выводы и обсуждения к главе

Глава 5. Исследование электрофизиологии зрелых человеческих кардиомиоцитов, выделенных из биоптата

5.1. Оптимизация протокола выделения человеческих кардиомиоцитов из биоптата

5.1.1. Вариации протокола выделения из биоптата

5.1.2. ^руктура выделенных кардиомиоцитов

5.2. Влияние отособа отмыва кардиоплегического раствора на электрофизиологию кардиомиоцитов из биоптата

5.3. Восстановление потенциалзависимых ионных каналов после операций с использованием кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор

5.4. Выводы и обсуждения к главе

Заключение

Список публикаций по теме диссертации

Список цитируемой литературы

Основные понятия и обозначения

ПД - потенциал действия ПЗИК - потенциалзависимые ионные каналы INav - ток быстрых натриевых каналов 1Са, Ь - ток кальциевых каналов L-типа

1К - ток медленных калиевых каналов задержанного выпрямления ЭМГПС-ЫО - нитропроизводное сукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния G - энергия Гиббса Т - температура

Я - универсальная газовая постоянная (8,31 Дж к)

Е - мембранный равновесный потенциал ъ - степень окисления иона

Б - постоянная Фарадея (9,65 ■ 104 -Кл-)

моль

I - ток

V - напряжение Ст - емкость клетки

Gi - максимальная проводимость для иона ^ - мембранный потенциал ^^ - равновесный потенциал

V1/2 - потенциал полувысоты кривой активации/инактивации к - наклон кривой активации/инактивации

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование электрофизиологической активности кардиомиоцитов разных типов и их применение для изучения про- и антиаритмических свойств используемых и перспективных фармпрепаратов»

Введение Актуальность темы исследования

Во всем мире сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются лидирующей причиной смертности - почти 18 млн смертей в год [1]. Несмотря на то, что в некоторых европейских странах смертность от рака превысила смертность от сердечно-сосудистых заболеваний, ССЗ остаются наиболее распространенной причиной смерти в Европе [2]. Согласно данным Росстата за 2022 год из 900 000 случаев смертности из-за ССЗ, более половины из них были связаны с ишемической болезнью сердца (ИБС) [3].

Исследование механизмов возникновения ССЗ у человека и тестирование лекарств от ССЗ являются фундаментальной и практической задачей для ученых во всем мире. Согласованная механическая работа сердца, как органа, зависит от распространения в нем электрического возбуждения, возникающее вследствие генерации потенциала действия (ПД) на мембране кардиомиоцитов. Таким образом, мишени для перспективных антиаритмических препаратов находятся на молекулярно-клеточном уровне, на уровне потенциалзависимых ионных каналов (ПЗИК). Для понимания возникновения ССЗ на таком уровне наиболее мощным инструментом является электрофизиологический метод пэтч-кламп [4].

В качестве экспериментальной модели для изучения активности сердечных трансмембранных ионных каналов служат изолированные кардиомиоциты. В данной работе использовались кардиомиоциты трех типов: неонатальные кардиомиоциты крыс; человеческие кардиомиоциты, получаемые направленной дифференцировкой из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК); человеческие кардиомиоциты, получаемые из биоптата, иссеченного во время операции. Каждый из типов имеет свои преимущества и недостатки. Крысиная клеточная модель не вполне соответствует человеческой, так как в них

иначе устроены калиевые каналы [5]. Выбор же между крысиными и человеческими клетками определяется меньшей стоимостью первых. Поэтому при необходимости изучения свойств новых веществ начальные исследования проводятся именно на крысиных кардиомиоцитах. В настоящее время человеческие клетки из ИПСК, активно замещают животную клеточную модель [6]—[10]. В то время, как получаемые из биоптата зрелые кардиомиоциты человека дают возможность наиболее полно охарактеризовать активность ионных каналов в норме и патологии, они не дают возможности исследовать распространение возбуждения в многоклеточном ансамбле, так как теряют способность образовывать электрические связи. Этих недостатков лишены неонатальные крысиные и дифференцированные из ИПСК человеческие кардиомиоциты, однако, стоит отметить, что их фенотип несет явные черты незрелости [11], [12]. Таким образом, использование тех или иных типов кардиомиоцитов зависит от постановки задачи.

Для изучения про- и антиаритмических эффектов различных веществ необходимо исследовать их действие на уровне потенциалзависимых ионных каналов в кардиомиоцитах методом пэтч-кламп. В рамках данного исследования были изучены эффекты ботулотоксина типа А и новохитозоля, нитропроизводного сукцината этилметилгидроксипиридиния, изопреналина, кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор.

Ботулотоксин типа А является нейротоксином, который начали применять практически во всех областях современной медицины. Существует несколько клинических исследований, где показано перспективное применение ботулинического токсина при нарушениях сердечного ритма [13]. Антиаритмический эффект ботулотоксина был показан на экспериментах с животными in vivo [14], [15] и в клинических исследованиях [16], [17]. В настоящей работе было проведено исследование механизма антиаритмического действия ботулотоксина в чистом виде и при добавлении вещества, продлевающего действие

ботулотоксина, глобулярного хитозана (новохитозоль) на неонатальных кардиомиоцитах. Результаты при концентрации смеси веществ 0,01 Ед. были показаны в другой работе [18]. В рамках продолжения данного исследования необходимо фундаментальное изучение действия смеси ботулотоксина типа А с новохитозолем на потенциалзависимые ионные каналы при меньших и больших концентрациях.

Для профилактики заболеваний, связанных с оксидативным стрессом, используются препараты с антиоксидантной активностью. Новое соединение, синтезированное в Федеральном исследовательском центре проблем химической физики и медицинской химии РАН, нитропроизводное сукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния (ЭМГПС-ЫС) [19] обладает антиоксидантными свойствами, а также способно защищать железосерные центры дыхательной цепи митохондрий сердца, мозга и печени в тканях животных от окислительного стресса [20]. Изучение влияния данного нового соединения на ПЗИК кардиомиоцитов в терапевтических дозах (20-160 мкМ) является актуальной задачей.

Изопреналин, бета-адреномиметик, может быть использован для исследования влияния бета-адреностимуляции на сердечную деятельность. Адреностимуляция ткани желудочков приводит к изменению частоты сокращений сердца, скорости проведения возбуждения и изменению силы мышечных сокращений [21]. С другой стороны, при патологических условиях адреностимуляция может привести к возникновению аритмий. Подавляющее большинство работ использует в качестве экспериментальных моделей кардиомиоциты различных животных, в то время как вклад и динамика различных ионных токов может существенно отличаться от таковой у человека [22]. Таким образом, необходимо исследовать действие изопреналина на человеческие кардиомиоциты, в частности, полученные путем дифференцировки из ИПСК.

Помимо изучения про- и антиаритмических эффектов различных веществ, также вызывает интерес исследование работы быстрых натриевых каналов при

физиологической температуре (37° С). Высокая амплитуда и малое характерное время активации Ыа^каналов представляет определенные сложности для измерения, так как трансмембранный потенциал неконтролируем. Согласно литературным данным, большинство исследований INav проводят при пониженной, комнатной температуре или на животных моделях [23]-[25]. Предполагается, ввиду того, что активность натриевых каналов ранее исследовалась при температурах ниже физиологической, в математических моделях существуют определенные пробелы описания работы сердца, например, условие гиперкалиемии, при которой в широко используемой модели О'Хара-Руди распространения возбуждения не наблюдается [26]. Тем самым, для модификации модели проведения волны возбуждения необходимо получить активационные характеристики токов быстрых натриевых каналов при 37° С.

В России ранее не практиковалась работа со зрелыми человеческими кардиомиоцитами, выделенными из биоптата. Выделение кардиомиоцитов из биоптата сердца человека является нетривиальной задачей. В международной практике был разработан ряд протоколов выделения зрелых кардиомиоцитов [27]-[30]. При этом выход кардиомиоцитов и их выживаемость сильно варьируется [31]. На основе опыта зарубежных коллег был оптимизирован собственный протокол выделения изолированных кардиомиоцитов из биоптата сердца человека, который в результате был запатентован [32].

Экспериментальные данные работы ПЗИК зрелых человеческих кардиомиоцитов, выделенных из биоптата, можно использовать для построения математической модели работы сердца в норме и при патологии. Это позволило бы спрогнозировать возможные изменения в проводимости сердца на уровне ионных каналов [33]. Помимо этого, благодаря особенности получения зрелых кардиомиоцитов, можно изучать состояние сердца до и после операции. Как известно, изучение возникновения послеоперационных аритмий у пациентов является актуальным вопросом [34]. Один из возможных факторов таких

послеоперационных осложнений - это остаточное влияние кардиоплегического раствора (Кустодиол и Нормакор) при восстановлении ПЗИК кардиомиоцитов человека после операции. Фактически, ранее влияние Кустодиола было исследовано только на ионных каналах животных клеточных моделей [35]-[37]. Более того, действие кардиоплегического раствора Нормакор на ионные каналы кардиомиоцитов человека ранее не было изучено.

Цели и задачи диссертационной работы

Цель работы - исследовать электрофизиологические характеристики потенциалзависимых ионных каналов человеческих кардиомиоцитов, выделенных из биоптата и дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также установить влияние про- и антиаритмических свойств используемых и перспективных фармпрепаратов на активность потенциалзависимых ионных каналов человеческих кардиомиоцитов и неонатальных кардиомиоцитов крыс.

Задачи:

1. Исследовать действие смеси ботулотоксина типа А и новохитозоля в концентрациях 0,001 и 0,1 Ед. на потенциалзависимые ионные каналы неонатальных желудочковых кардиомиоцитов крыс.

2. Исследовать действие нитроксисукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния на потенциалзависимые ионные каналы неонатальных желудочковых кардиомиоцитов крыс.

3. Исследовать при физиологической температуре условия для получения нормальных электрофизиологических свойств быстрых натриевых каналов человеческих желудочковых кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК линии от здорового донора.

4. Исследовать влияние изопреналина на потенциалзависимые ионные каналы человеческих желудочковых кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК линии от здорового донора.

5. Оптимизировать протокол выделения зрелых человеческих кардиомиоцитов из биоптата ушка правого предсердия.

6. Исследовать восстановление потенциалзависимых ионных каналов зрелых человеческих кардиомиоцитов, выделенных из биоптата, после операции с использованием кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор.

Научная новизна

• Впервые показано антиаритмическое свойство смеси ботулотоксина типа А и новохитозоля при концентрациях 0,001 и 0,1 Ед. на неонатальных кардиомиоцитах крыс.

• Впервые исследовано влияние нитроксисукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния, обладающего антиоксидантными свойствами, на работу потенциалзависимых ионных каналов неонатальных кардиомиоцитов крыс.

• Полученные при физиологической температуре экспериментальные данные использованы коллегами в модификации математической модели работы желудочковых кардиомиоцитов.

• Установлено действие бета-адреномиметика изопреналина на потенциалзависимые ионные каналы человеческих кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК, полученных от здорового донора.

• Оптимизирован и запатентован метод выделения зрелых человеческих кардиомиоцитов из биоптата ушка правого предсердия.

• Проведено сравнение влияния кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор на восстановление потенциалзависимых ионных каналов зрелых кардиомиоцитов человека после операции in vitro.

Научно - практическая значимость работы

Практическая ценность результатов диссертации заключается в том, что на их основании возможно дальнейшее развитие исследований механизмов возникновения сердечно-сосудистых заболеваний у человека и дальнейшее доклиническое тестирование перспективных фармпрепаратов.

Результаты, полученные в рамках исследования, связаны с изучением про- и антиаритмической активности разных веществ. Данное исследование позволило установить антиаритмический характер действия смеси ботулотоксина типа А и новохитозоля при концентрациях 0,001 и 0,1 Ед. Полученный эффект нитроксисукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния на работу ионных каналов кардиомиоцитов предполагают перспективное его использование как антиоксидантного вещества в терапевтических дозах. Установлено проаритмическое действие изопреналина на человеческих кардиомиоцитах.

Регистрация токов быстрых натриевых каналов кардиомиоцитов человека, полученных из ИПСК, при физиологической температуре позволило модифицировать математическую модель, которую в дальнейшем предполагается использовать для моделирования экспериментов и оптимизации экспериментальных записей токов INav при нагреве. Более того, благодаря экспериментально полученным параметрам, модифицированная модель описывает проведение волны возбуждения в условиях гиперкалиемии.

По результатам данной работы был запатентован метод выделения кардиомиоцитов из биоптата ушка правого предсердия [32]. Оптимизация протокола выделения кардиомиоцитов из биоптата позволила получить экспериментальные данные со зрелых человеческих кардиомиоцитов. Такие данные необходимы для создания математической модели работы сердца человека в норме и при патологии. Более того, в рамках данного исследования изучался возможный фактор послеоперационных аритмий - остаточное действие

кардиоплегического раствора на работу ионных каналов после отмыва. Результаты по восстановлению конкретных ионных каналов кардиомиоцитов после операций могут быть учтены при послеоперационной восстановительной терапии пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Установлено, что смесь ботулотоксина типа А и новохитозоля при концентрации 0,001 Ед. частично уменьшает амплитуду токов быстрых натриевых каналов и кальциевых каналов L-типа. При концентрации данной смеси 0,1 Ед. активность калиевых каналов практически не меняется.

2) Выявлено, что нитроксисукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиний не изменяет электрофизиологическую активность быстрых натриевых, медленных калиевых каналов и кальциевых каналов L-типа при концентрации менее 1 мМ.

3) Показано, что при регистрации токов быстрых натриевых каналов Ша при физиологической температуре в человеческих кардиомиоцитах, дифференцированных из ИПСК, полувысота и наклон кривой активации равны -

45.6 ± 4,9 мВ и 4,4 ± 3,4 мВ, полувысота и наклон кривой инактивации составили -

69.7 ± 7,3 мВ и 11,6 ± 6,5 мВ. Эти данные позволили модифицировать математическую модель, описывающую работу желудочковых миоцитов.

4) Выявлено, что в человече^их желудочковых кардиомиоцитах, дифференцированных из ИПСК линии от здорового донора, изопреналин увеличивает токи быстрых натриевых каналов на 73%, кальциевых каналов L-типа на 120% и медленных калиевых каналов на 98%. Таким образом, показано, что изопреналин в концентрации 1 мкМ обладает проаритмическими свойствами.

5) Установлено, что оптимизированный протокол выделения человеческих кардиомиоцитов из биоптата позволяет получить на выходе живые зрелые кардиомиоциты предсердия человека

6) Выявлено, что после операций с использованием кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор в предсердных кардиомиоцитах человека: кальциевые каналы L-типа восстанавливаются на 70% и 75% соответственно; быстрые натриевые каналы восстанавливаются практически полностью, однако, после Нормакора кривая активации смещена на 13 мВ направо; медленные калиевые каналы восстанавливаются на 69% и 94% соответственно.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов диссертационной работы основана на применении широко используемых во всем мире общепризнанных методик и использовании сертифицированных специализированных научных оборудований. Теоретическую и методологическую основу проведенных разработок и исследований составили труды отечественных и зарубежных авторов. Для анализа полученных результатов использовались методы статистической обработки данных и специализированные программные обеспечения. Сформулированные выводы полностью основаны на полученном фактическом материале.

Апробация результатов произведена за счет их представления сообществу коллег на профильных научных мероприятиях.

Основные результаты работы были представлены на 1 4 российских и международных конференциях, на двух из которых доклады были отмечены наградами:

1. 2nd Scientific-practical conference of Russian and Croatian scientists in Dubrovnik, 2020

2. 63-я Всероссийская научная конференция МФТИ, 2020

3. 64-я Всероссийская научная конференция МФТИ, 2021

4. Международный молодежный научный форум «Ломоносов 2021», XXVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 2021 - 3 место в конкурсе за лучший устный доклад

5. XXIV Ежегодная Сессия НМИЦ ССХ им. А.Н. Бакулева Всероссийская конференция молодых ученых, 2021

6. Russian Conference with International Participation "Experimental and computational biomedicine" in memory of Professor Vladimir S. Markhasin, Ekaterinburg, 2021

7. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, 2021

8. VIII Международная научная конференция молодых ученых: биотехнологов, вирусологов, молекулярных биологов и биофизиков в рамках Площадки открытых коммуникаций OpenBio, Кольцово, 2021

9. V Инновационный Петербургский медицинский форум, Санкт-Петербург, 2022

10.VII Всероссийский молодежный форум «Наука будущего - наука молодых», Новосибирск, 2022 - 2 место в конкурсе научно-исследовательских работ студентов и аспирантов российских вузов

11. IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков, Кольцово, 2022

12. II Международная научно-практическая конференция «Клеточные технологии в экспериментальной медицине», Курск, 2022

13. 65-я Всероссийская научная конференция МФТИ, 2023

14. VII Съезд биофизиков России, Краснодар, 2023

Публикации

По итогам исследования подготовлено 21 печатная работа. Результаты исследования отражены в 5 публикациях в рецензируемых научных изданиях, индексируемых базами Scopus, Web of Science и RSCI. Подготовлен препринт по результатам исследования, приведенного в главе 4, о регистрации тока быстрых натриевых каналов при физиологической температуре, который в настоящий момент находится на рассмотрении в научном издании. Метод выделения, описанный в главе 5, запатентован. Помимо указанных публикаций, результаты работ также были опубликованы в 7 сборниках тезисов докладов конференций (индексируются РИНЦ).

Список публикаций приведён в конце диссертации.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, списка публикаций, списка цитируемой литературы, благодарностей. Объем работы составляет 134 страницы, включая 39 рисунков и 9 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 245 источников.

Личный вклад автора

Все использованные в диссертации экспериментальные и теоретические результаты получены автором лично или при определяющем его участии.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Проводящая система сердца

Сердце обладает автоматией, возбудимостью, проводимостью, сократимостью и рефрактерностью [38]. По строению сердце представляет собой две полые мышечные половины, каждая половина состоит из предсердия и желудочка.

Деполяризация желудочков следует за деполяризацией предсердий, так называемый комплекс QRS после PQ на электрокардиограмме (ЭКГ). Желудочковая мышца сокращается (систола) за счет повышения концентрации ионов цитозольного кальция. Давление внутри желудочков закрывает атриовентрикулярные клапаны, и когда оно превысит артериальное давление, открываются клапаны аорты и легочные клапаны. Это позволяет выбросить кровь в легочную и системную циркуляцию. Желудочковая реполяризация происходит во время систолы (зубец Т на ЭКГ), при этом концентрация ионов кальция в цитозоле уменьшаются и расслабляются желудочковые кардиомиоциты (диастола).

Импульс возникает в синоатриальном узле, затем он распространяется по миокарду предсердий и проходит к атриовентрикулярному узлу (АВУ). В АВУ скорость проведения самая низкая во всей проводящей системе сердца, поэтому предсердия сокращаются раньше, чем желудочки. После этого импульс быстро направляется по пучку Гиса к волокнам Пуркинье, далее в рабочий миокард желудочков. Это вызывает их сокращение, то есть скоординированную сердечную насосную деятельность [39]-[42]. Распространение электрической активности по сердечной ткани зависит от электрической связи между клетками, осуществляемой за счет щелевых контактов [43].

Так как сердечная ткань обладает свойством возбудимости, ееволокна обладают потенциалом покоя (ПП) и реагируют на стимулы формированием потенциала действия (ПД).

1.2. Потенциал действия

Термин потенциал действия (ПД) был придуман Юлием Бернштейном в его работах о мембранной гипотезе [44]. Различные участки сердца характеризуются уникальной формой и продолжительностью ПД, что объясняется особенностью состава и соотношения ионных каналов на мембране клеток. (Рис. 1)

Рис. 1. Разнообразие форм потенциала действия в отделах сердца по Моргану (с изменениями) [45]. А) схема структуры сердца и ПД соответствующих участков. Б) Формирование потенциала действия в волокне синоатриального узла (САУ) и желудочка

Форма ПД у синоатриального узла (САУ) без явного пика и с участком гиперполяризации, у АВУ также без выраженного пика. Предсердие, пучки Гиса (общий и ножки), волокна Пуркинье, желудочек - ПД у этих участков имеет явно выраженный пик.

Потенциал покоя возникает благодаря избирательной проницаемости мембраны, которая хорошо пропускает ионы калия, проницаемость меньше для ионов хлора и еще меньше для ионов натрия. ПП у кардиомиоцитов может иметь значение в диапазоне от -40 мВ до -95 мВ. В предсердиях и желудочках ток внутреннего выпрямления 1К1 участвует в установлении потенциала покоя (Рис. 2).

1К1 1К1

Рис. 2. Фазы ПД желудочкового кардиомиоцита и основные потенциалзависимые ионные каналы. Фаза 0 (Na-каналы); фаза 1 (Ito); фаза 2 (ICa); фаза 3 (семейство калиевых каналов);

фаза 4 (Ж1)

Формы ПД в отдельных сердечных клетках отражают скоординированную активацию и инактивацию входящих и выходящих каналов (Рис. 2). Быстрый рост ПД в миоцитах предсердий и желудочков связан с входящими токами через потенциалзависимые №-каналы (фаза 0), далее следует ранняя реполяризация (фаза 1), фаза плато (фаза 2) и более медленная реполяризация (фаза 3), отражающие повышение выходящих токов калиевых каналов и входящих токов через кальциевые потенциалзависимые каналы [46].

Форма ПД в сердце определяется сложным взаимодействием потенциалзависимых ионных каналов. Неправильная работа этих каналов может привести к изменению формы ПД, что нарушает распространение волны возбуждения по сердечной ткани, а подобные нарушения могут стать причиной возникновения аритмии.

1.3. Клеточная электрофизиология

Биологические мембраны включают в себя огромное разнообразие белков, липиды (фосфолипиды, сфинго- и гликолипиды, стероиды) и углеводы, которые представляются в связанном виде типа гликопротеинов или гликолипидов. Среди моделей мембраны клетки наиболее широкое распространение получила «жидко-мозаичная модель» Сеймура Джонатана Зингера (1924-2017) и Николсона Гарта (1943), разработанная в 1972 году [47]. Клеточная мембрана, состоящая из двойного липидного слоя со множеством различных включений, не является проницаемой для ионов. Для их транспорта используются ионные каналы.

Ионные каналы - это комплекс интегральных мембранных белков, которые генерируют электрическую активность, открывая и закрывая поры в своих центрах, чтобы контролировать поток ионов в клетки и из них [48]. Они активируются и инактивируются различной стимуляцией, например, нейротрансмиттерами, температурой, трансмембранным потенциалом, также существуют механочувствительные каналы. Для каждого иона существует свой канал (свойство селективности). Когда развились ионные каналы и какую роль они могли играть в самых ранних формах жизни, мы до сих пор не знаем, но сегодня ионные каналы наиболее известны как основные элементы в мембранах возбудимых клеток [49].

Разность концентраций ионов между внутренней и внешней средой клетки приводит к градиенту концентрации. Такие градиенты вызывают диффузию

частиц, спонтанный процесс, что увеличивает энтропию. Энергия Гиббса в данном случае может быть выражена по формуле [4] :

G = -RTln[-^?^ (1)

[ion]in

где [ion]out и [ion]in - внеклеточные и внутриклеточные концентрации иона, cоответственно.

С другой стороны, при перемещении заряда в электрическом потенциале мембраны Е может быть высвобождена энергия:

G = -EzF (2)

-RT = -EzF (3)

Известное уравнение Нернста получается, если из условия баланса энергий (3) выразить электрический равновесный потенциал Е:

Е = - (4)

zF [ion]in

Большим прорывом для понимания электрофизиологии клетки стал метод управления напряжением (или током) на небольшой поверхности мембраны. Метод voltage clamp разработали Алан Ходжкин (1914-1998), Эндрю Хаксли (19172012) и Бернард Катц (1911-2003). Ученые смогли разделить токи натриевых и калиевых каналов на гиганстком аксоне кальмара с помощью разных протоколов стимуляции. Временная зависимость эволюции проводимости при подаче разных потенциалов позволила посчитать воротные переменные m3h и n4 в математической интерпретации работы ионных каналов. Была сформулирована ионная теория [50]:

I = Cm^ + Gkn4(V - Vk) + GNam3h(V - VNa)+Gl(V - V{) (5)

где I - ток, V - потенциал на мембране, Cm - мембранная емкость, Gi и Vi -максимальная проводимость и равновесный потенциал для соответствующего иона, n - воротная переменная для калиевого канала, m, h - активационная и инактивационная воротная переменная для натриевого канала.

Их фундаментальная работа была удостоена Нобелевской премией 1963 года. Модель Ходжкина-Хаксли-Катца описывает работу натриевых и калиевых каналов в аксоне кальмара и является базовым описанием для работы потенциалзависимых ионных каналов в возбудимых мембранах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Коваленко Сандаара Георгиевна, 2023 год

KCl - - -

CaCl2 - 2 2

CsCl 145 135 135

EGTA - 5 5

HEPES 5 10 10

MgATP - 5 5

pH 7,2 (CsOH) рИ 7,2 (СБОИ) рИ 7,2 (СБОИ)

Для остальных задач для регистрации токов Ша использовались растворы «Раствор 20 мМ» из Таблиц 2 и 3 (с добавлением 0.003 мМ 1уаЬгаёте во внеклеточный раствор). Для регистрации токов других каналов использовались растворы, описанные в Таблицах 4 и 5.

Таблица 4.

^став внеклеточных растворов для человеческих кардиомиоцтов

Реактивы ICa, L, мМ IKs, мМ ПД, мМ

NaCl - 150 150

CaCl2 5 1,8 1,8

KCl - 5,4 5,4

MgCl2 1 1 1

TEA-Cl 160 - -

HEPES 10 15 15

Glucose 10 15 15

Na-пируват - 1 1

Nisoldipine - 0,001 -

E-4031 - 0,001 -

7,4 (CsOH) 7,4 (NaOH) 7,4 (NaOH)

Таблица 5.

Состав внутриклеточных растворов для человеческих кардиомиоцитов

Реактивы ICa, L, мМ IKs, мМ ПД, мМ

NaCl 5 - 5

CaCl2 - - 2

KCl - 20 150

MgCl2 5 1 -

CsCl 145 - -

HEPES 10 5 10

MgATP 5 5 5

EGTA 5 10 5

K-aspartate - 125 -

Na2-Phosphocreatine 2

Na2-GTP - 2 -

7,2 (CsOH) 7,2 (KOH) 7,2 (KOH)

2.3. Установка пэтч-кламп

Для экспериментов использовалась установка patch-clamp, которая состояла из следующих основных компонентов: цифровой преобразователь Digidata 1440A (Axon Instruments, Inc., США); усилитель Axopatch 200B (Axon Instruments, Inc., США); микроманипулятор MP-285 (Sutter Instrument); инвертированный

микроскоп Olympus IX71; шумоподавитель HumBug изолятор (A-M-Systems); антивибрационная платформа (AVTT75).

Температуру внеклеточного раствора поддерживали в камере с помощью автоматического регулятора температуры TC-324C (Warner Instruments). Для задач с неонатальными кардиомиоцитами исследование проводилось при комнатной температуре (24-25° С), для человеческих кардиомиоцитов при физиологической температуре 37° С.

Для изготовления пипеток был использован пуллер микропипеток P-97 (Sutter Instrument), заготовки из боросиликатного стекла (BF150-86-10, Sutter Instrument), микрокузница (Micro forge, MF-900, Narishige). Из боросиликатных заготовок вытягивали пипетки на пуллере с сопротивлением в среднем 3 MQ. С помощью данного пуллера можно изготавливать пипетки с различным диаметром кончика микропипетки, варьируя параметры в программе (температура, время нагрева и вытягивания стеклянных заготовок, количество подходов). Данный метод позволяет изготовлять пипетки с диаметром конца, например, в 2 мкм {3}.

Пипетку заполняли внутриклеточным раствором с содержанием Амфотерицина В (Sigma Aldrich) в качестве перфорирующего агента в концентрации 0,24 мг/мл. Смещение пипетки было отрегулировано до нуля перед формированием гигаомного контакта. Далее с помощью настроек усилителя емкостные компоненты были скомпенсированы. Окончание перфорации мембраны определяли по изменению емкостных токов, приблизительное время перфорации антибиотиком составило около 5 минут.

Емкость мембран измеряли с помощью программного обеспечения pCLAMP10.2. Для неонатальных кардиомиоцитов Cm был в диапазоне от 10 до 20 пФ; для человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, от 20 до 40 пФ; для человеческих кардиомиоцитов, выделенных из биоптата от 30 до 80 пФ.

2.4. Протоколы стимуляции

Для регистрации токов применялись протоколы, которые описаны в Таблица 6.

Таблица 6. Протоколы стимуляции

Тип протокола Диапазон, мВ Длительность Комментарии

Ramp от -120 до +50 200 мс Поддерживающий потенциал -80мВ

Ступенчатый для INa (I-V) от -80 до +15, шаг 5 мВ 100 мс

Ступенчатый для INa (инактивация) от -140 до 0, шаг 5 мВ 500 мс запись после этого импульса при -20 мВ (50 мс); потенциал поддержания -120 мВ

Ступенчатый для ICa, L (I-V) от -40 до +50, шаг 10 мВ 300 мс препульс при -40 мВ (100 мс)

ICa, L (step) 0 мВ 200 мс поддерживающий потенциал -40 мВ

IKs (step) +60 мВ 5 с поддерживающий потенциал -40 мВ

Ступенчатый для IKs (I-V) от -40 до +50, шаг 15 мВ 5 с поддерживающий потенциал -70 мВ

В следующих главах с результатами протоколы стимуляции описываются и уточняются еще раз, так как были вариации шагов ступеней в мВ, либо менялись

другие параметры. ПД был записан с помощью стимула током в 1 нА при длительности 2,5 мс.

2.5. Состав кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор

В состав раствора Кустодиол (Dr. Franz Kohler Chemie GmbH, Германия) входит: 180 мМ L-гистидина, 18 мМ L-гистидинхлорид моногидрата, 2 мМ L-триптофана, 9 мМ KCl, 0,015 мМ CaCl2, 1 мМ K-кетоглутарата, 4 мМ MgCl2, 30 мМ маннитола, 15 мМ NaCl.

Нормакор (КардиоСистемФарма, Россия) состоит из двух растворов: раствор № 1 (с высоким содержанием калия) содержит 100 мМ KCl, 19 мМ MgSO4, 197 мМ маннитола, 0,004 мМ трометамола; раствор №. 2 (с низким содержанием калия) содержит 28 мМ KCl, 19 мМ MgSO4, 320 мМ маннитола, 0,004 мМ трометамола.

2.6. Остальные реактивы и реагенты

Ботулотоксин типа А и новохитозоль были предоставлены коллегами из НИИ им. ак. И. Н. Мешалкина. Нитроксисукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина (ЭМГПС-NO) был синтезирован в ИПХФ РАН. В работе был исследован также изопреналин (isoprenaline hydrochloride, Sigma Aldrich). Помимо уже упомянутых реактивов, эксперименты проводились с использованием следующих: тетраэтиламмоний (Sigma Aldrich), среда DMEM, пенициллин/стрептомицин, солевой раствор HBSS фирмы ПанЭко, L-глутамин и L15 от Gibco. Остальные реагенты получены от компаний Helicon и Панэко.

2.7. Дополнительные исследования

Для анализа структуры полученных кардиомиоцитов был использован метод иммуноцитохимии. Образцы были фиксированы в 4% параформальдегиде (Sigma -Aldrich, 158127) в течение 10 минут, а затем пермеабилизированы в 0,4% Triton-X100 в течение 10 минут. Затем использовался блок-буфер (физиологический раствор с фосфатным буфером и 1% бычьего сывороточного альбумина), в нем клетки инкубировали 30 минут при 4°C с первичными антителами и 1 час при комнатной температуре со вторичными антителами. В качестве первичного антитела использовали мышиные антитела против а-актинина (Abcam, ab9465, рабочее разведение — 1:100), а в качестве вторичного антитела — Alexa Fluor 568 козий анти-мышиный IgG (H^l) с высокой перекрестной адсорбцией (Thermo Fisher Scientific, A11031, рабочее разведение — 1:400). Ядра окрашивались с помощью DAPI (Vector Laboratories, Inc., Канада). Кардиомиоциты из биоптата предсердия были окрашены и исследованы на конфокальном микроскопе Zeiss модели LSM 710 с использованием программы Zen black 3.0 (Carl Zeiss, Германия).

2.8. Обработка и анализ данных

Были использованы программы Clampfit 10.2 (Molecular Devices) и Origin Pro 8.1 (Originlab Corporation). Экспериментальные данные с пэтч-клампа представлены в виде зависимости амплитуды токов, нормированных на ёмкости клеток, от потенциала - средние значения со стандартным отклонением. Усреднение идёт минимум от трех разных кардиомиоцитов. Статистическая обработка в случае сравнения двух групп проводилась с помощью t-test (two sample-test), при сравнении трех групп использовался однофакторный

дисперсионный анализ (one-way ANOVA). Для всех результатов различия были на уровне р <0,05.

Аппроксимация кривой для вольтамперной зависимости для быстрых натриевых каналов INa и кальциевых каналов L-типа ICa, L была построена по формуле:

т _ (Ут— ^rev)• Gmgx

1 = 1 + e(Vm-Vl/2)/k (6)

Здесь I - ток канала, Cm - емкость клетки, Gmax - максимальная проводимость для иона, Vm - мембранный потенциал, Vrev - равновесный потенциал, V1/2 - потенциал полувысоты кривой активации/инактивации, k - наклон кривой активации/инактивации.

Аппроксимация экспериментальных кривых активации и для вольтамперной зависимости IKs была выполнена функцией:

у = 1/(1 + (7)

Глава 3. ^следование влияния новых соединений на неонатальных

кардиомиоцитах крыс

В данной главе представлены результаты по исследованию влияния смеси ботулотоксина типа А с новохитозолем и нового соединения, нитроксисукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния, на быстрые натриевые каналы, кальциевые каналы Ь-типа и медленные калиевые каналы неонатальных кардиомиоцитов крыс при комнатной температуре (24-25° С).

Результаты, представленные в данной главе, были опубликованы автором в работах {1}, {18}, {19}.

3.1. Действие смеси ботулотоксина типа А и новохитозоля

В разделе 1.4 было представлено действие чистого ботулотоксина типа А, смеси ботулотоксина с новохитозолем на некоторые потенциалзависимые каналы при концентрации 0,01 Ед, а также было показан эффект чистого новохитозоля на быстрые натриевые каналы. В данном разделе приведены результаты исследования действия смеси ботулотоксина типа А и новохитозоля на быстрый натриевый канал (INav), кальциевый канал L-типа (ICa, L) и медленный калиевый канал (IKs) желудочковых неонатальных кардиомиоцитов крыс при концентрациях 0,001 Ед. и 0,1 Ед. А также показано действие чистого новохитозоля на токи ICa, L и IKs.

Протоколы стимуляции для регистрации тока ICa, L (step) и IKs (step) описаны в параграфе 2.5 в Таблице 6, с оговоркой, что для IKs длительность протокола составляла 400 мс. Было показано, что сам по себе новохитозоль без ботулотоксина не влияет на амплитуду кальциевого тока L-типа ICa, L и медленного калиевого тока IKs (Рис. 14).

Рис. 14. А. Влияние 0,001 Ед. новохитозоля на кальциевые токи Ь-типа, 1Са, Ь в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс. Б. Калиевые токи 1К в контроле (розовая кривая) и под действием новохитозоля (синяя кривая)

Далее было показано влияние смеси ботулотокcина с новохитозолем в концентрации 0,001 Ед. Для регистрации тока быстрого натриевого канала был применен ступенчатый протокол для Ша (1-У) из Таблицы 6 при этом шаг составлял 10 мВ, диапазон стимуляции был до +25 мВ и длительность 50 мс. Для 1Са, Ь был использован описанный ступенчатый протокол (1-У) с длительностью 500 мс. Были построены вольтамперные зависимости, график тока, полученного при каждом подаваемом потенциале, нормированном к емкости клетки (плотности тока), относительно мембранного потенциала. Вольтамперные кривые для Шау и 1Са, Ь показаны на Рис. 15 А, В. Натриевый ток ШаУ в присутствии 0,001 Ед.

ботулотоксина с новохитозолем уменьшается на ~40% (Рис. 15Б). 1Са, L после действия данной смеси в концентрации 0,001 Ед. подавлялся на ~50% (Рис. 15Г).

Рис. 15. Влияние ботулинического токсина с новохитозолем на ионные токи потенциалзависимых каналов неонатальных желудочковых кардиомиоцитов крыс. А. Соотношение плотности тока и напряжения (1-У) для INav в контроле (розовая кривая, п=6) и после добавления 0,001 Ед. ботулинического токсина с новохитозолем (синяя кривая, п=6). Б Столбчатая диаграмма процента подавления амплитуды INav (р<0,03). В. ICa, L в контроле (розовая кривая, п=6) и в присутствии 0,001 Ед. ботулинического токсина с новохитозолем (синяя кривая, п=6). Нормированные соотношения тока и напряжения (I-V) для ICa, L. Г. Гистограмма в процентах подавления амплитуды ICa, L (р<0,02).

Также было протестировано влияние 0,1 Ед. смеси ботулинического токсина с новохитозолем (Рис. 16) на ГК^. Протокол стимуляции представлен на рисунке.

Существенных изменений в калиевом токе 1Кб, в амплитуде не наблюдалось.

Рис. 16. Медленный калиевый ток в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс в контроле (розовая кривая) и под действием 0,1 Ед. смеси ботулотоксина и новохитозоля

(синяя кривая)

3.2. Исследование действия нитроксиcукцината этилметилгидроксипиридиния

на неонатальных кардиомиоцитах

Для выявления действия нитропроизводного сукцината этилметилгидроксипиридиния (ЭМГПС-ЫО) на электрофизиологию желудочковых кардиомиоцитов были проведены измерения токов ГЫаУ, ICa, Ь и 1Ку (ГК^) методом пэтч-кламп.

Известно, что данное производное витамина В6 обладает антиоксидантными свойствами в концентрациях 20-160 мкМ. Была рассмотрена концентрация ЭМГПС-ЫО 200мкМ, как верхнее пороговое значение близкое к рабочей концентрации. Однако, не обнаружив эффекта при 200 мкМ, концентрация была увеличена вплоть до 1мМ. При 1мМ наблюдался видимый эффект ЭМГПС-ЫО на потенциалзависимые ионные каналы.

Пример действия ЭМГПС-NO в концентрациях 200мкМ и 1мМ на быстрые натриевые каналы протоколом ramp представлен на Рис. 17. В результате, ЭМГПС-NO в концентрации 200 мкМ не имел значительного влияния на изменение INav.

Рис. 17. Влияние ЭМГПС-NO на токи быстрых натриевых каналов INav в кардиомиоцитах

желудочков новорожденных крыс. Натриевый ток INa в контроле (черная кривая), под действием 200 мкМ ЭМГПС-NO (синяя кривая) и под действием 1 мМ ЭМГПС-NO (розовая

кривая). Протокол стимуляции ramp

При этом 1 мМ вещества заметно уменьшил амплитуду тока (Рис. 17), поэтому

далее было исследовано действие ЭМГПС-NO при концентрации 1 мМ. Для

построения вольтамперной зависимости INa был использован ступенчатый

протокол (I-V), как в Таблице 6. Была построена вольтамперная кривая для INav в

контрольных значениях и после добавления 1 мМ ЭМГПС-NO. Из Рис. 18 видно,

что нормированная на емкость амплитуда INav в контроле была равна -47,48 ± 4,18

пА/пФ, а после добавления ЭМГПС-NO стала -31,18 ± 2,89 пА/пФ, то есть

уменьшение примерно на 35%.

Ша

Рис. 18. Влияние 1 мМ ЭМГПС-ЫО на быстрые натриевые каналы !Ыа\ в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс. А. Вольтамперная характеристика Шау в контроле (черная

кривая, п=8) и с ЭМГПС-ЫО (розовая кривая, п=10); Б. Сравнительная диаграмма максимальных амплитуд Шау в контроле (черный столбик, п=8) и под действием ЭМГПС-ЫО

(розовый столбик, п=10, р < 0,005)

Аналогично мы изучили эффект ЭМГПС-ЫО в концентрациях 200мкМ и

1мМ на кальциевые каналы каналы Ь-типа. Протокол стимуляции для регистрации

ГСа, Ь из Таблицы 6. ЭМГПС-ЫО при концентрации 200 мкМ практически не

изменил ГСа, Ь, что нельзя сказать о концентрации 1 мМ (Рис. 19).

Рис. 19. Влияние ЭМГПС-ЫО на токи кальциевых каналов Ь-типа в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс. 1Са, Ь в контроле (черная кривая), под действием 200 мкМ ЭМГПС-ЫО (синяя кривая) и под действием 1 мМ ЭМГПС-ЫО (розовая кривая)

Для подробного изучения действия ЭМГПС-ЫС с концентрацией 1 мМ были построены вольтамперные кривые и сравнительные диаграммы для ICa, Ь (Рис. 20). Для построения вольтамперной зависимости был использован ступенчатый протокол, как в Таблице 6, но с шагом в 5 мВ и длительностью в 200мс.

Контроль ЭМГПС-NO

Рис. 20. Влияние 1 мМ ЭМГПС-NO на кальциевые каналы L-типа в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс. А. Вольтамперная характеристика ICa, L в контроле (черная кривая, n=4) и с ЭМГПС-NO (розовая кривая, n=3); Б. Сравнительная диаграмма максимальных амплитуд ICa, L в контроле (черный столбик, n=4) и под действием ЭМГПС-NO

(розовый столбик, n=3), p < 0,045

На Рис. 20 показано, что нормированная на емкость амплитуда ICa, L в контроле

составляла -16,87 ± 1,86 пА/пФ, а после добавления ЭМГПС-NO стала -11,69 ± 1,22

пА/пФ. Более того, наблюдается смещение кривой направо на ~15 мВ после

добавления вещества. Из сравнительной диаграммы максимальных амплитуд

можно сказать, что амплитуда уменьшилась на ~31%.

По аналогии были исследованы калиевые каналы IKs под влияием ЭМГПС-NO в концентрациях 200 мкМ и 1 мМ (Рис. 21). Протокол стимуляции для регистрации IKs представлял собой step из Таблицы 6. ЭМГПС-NO при концентрации 200 мкМ практически не изменил IKs, при концентрации 1 мМ есть видимый эффект.

60 мВ

1 Кб

5с -40 мВ

Контроль

■ 200мкМ ЭМГПС-1\Ю

■ 1 мМ ЭМГПС-ЫО

300 пА

1 с

Рис. 21. Влияние ЭМГПС-ЫО на токикалиевых каналов 1К в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс. 1К в контроле (черная кривая), под действием 200 мкМ ЭМГПС-ЫО (синяя кривая) и под действием 1 мМ ЭМГПС-ЫО (розовая кривая); протокол стимуляции

представлен в виде вставки

Для построения вольтамперных кривых 1Кб был использован протокол 1-У как в

Таблице 6. Из Рис. 22 видно, что нормированная на емкость амплитуда 1Кб

уменьшилась примерно на 40%.

Рис. 22. Влияние 1 мМ ЭМГПС-ЫО на калиевые каналы 1К в кардиомиоцитах желудочков новорожденных крыс. А. Вольтамперная характеристика 1Са, Ь в контроле (черная кривая, п=4) и с ЭМГПС-ЫО (розовая кривая, п=6); Б. Сравнительная диаграмма максимальных амплитуд 1Са, Ь в контроле (черный столбик, п=4) и под действием ЭМГПС-ЫО (розовый

столбик, п=6), р < 0,04

3.3. Выводы и обсуждение к главе

В данной главе было установлено действие смеси ботулотоксина типа А с новохитозолем на быстрые натриевые каналы, кальциевые каналы L-типа и медленные калиевые каналы неонатальных кардиомиоцитов крыс, а также изучено влияние нового соединения, нитроксисукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния, на электрофизиологию неонатальных кардиомиоцитов крыс при комнатной температуре.

В параграфе 3.1 приведены результаты по исследованию действия ботулотоксина типа А и новохитозоля на ПЗИК неонатальных кардиомиоцитов при различных концентрациях.

Коллеги из НМИЦ им. академика И. Н. Мешалкина провели исследования на животных, которые показали уникальные терапевтические свойства комбинации ботулотоксина с новохитозолем [16], [17], [142]. Результаты предыдущего исследования в нашей лаборатории свидетельствуют о том, что чистый ботулотоксин типа А при концентрации 0,01 Ед подавляет INav и 1Са, L практически полностью, при этом не оказывая значительного влияния на ГК^з. Кроме того, использование новохитозоля в сочетании с 0,01 Ед ботулотоксина также приводит к подавлению INav и ICa, L [18].

Согласно полученным результатам в рамках данной работы, под воздействием смеси ботулинического токсина с новохитозолем в концентрации 0,001 Ед. происходит частичная блокада быстрых натриевых каналов и кальциевых каналов L-типа. До этого исследования с использованием пэтч-кламп изучение ботулинического токсина проводились исключительно на нейронах, однако эффект подавления натриевого тока также присутствовал [140]. Новохитозоль, который усиливает действие ботулинического токсина и снижает его эффективную концентрацию, не влияет на кальциевые каналы L-типа и медленные калиевые каналы. Примечательно, что медленные калиевые каналы Ж^ не меняют характер

своей работы даже при концентрации смеси ботулотоксина и новохитозоля в 0,1 Ед.

Представленные в рамках исследования факты объясняют и подтверждают действие ботулинического токсина как антиаритмического средства, как показано в клинических исследованиях [15], [138]. Более того, было показано в рамках данного проекта, что ботулинический токсин полностью вымывается, и культура ткани полностью восстанавливает свои функции в течение нескольких дней [143]. То есть данную смесь веществ можно использовать для временного купирования приступов аритмии без последующих нарушений сердечной проводимости.

В параграфе 3.2 представлены результаты по тестированию действия нового соединения, нитроксисукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина, при различных концентрациях на ПЗИК неонатальных кардиомиоцитах крыс.

В рамках данной задачи было показано, что при концентрации 200 мкМ ЭМГПС-NO не влияет на токи ГЫа^ ICa, L и 1Кб. Данная концентрация в 200 мкМ было выбрано в качестве верхнего порогового значения, близкого к рабочей концентрации (20-160 мкМ). Однако, не обнаружив эффекта при 200 мкМ, концентрация соединения была увеличена вплоть до 1 мМ, в этом случае наблюдался видимый эффект ЭМГПС-ЫО на активность ПЗИК.

При 1мМ ЭМГПС-ЫО амплитуда токов быстрых натриевых каналов ГNav уменьшилась на 35%, токи кальциевых каналов L-типа 1Са, L подавлены на 31%, в случае медленных калиевых каналов ток ГКб уменьшился на 40%.

Институтом проблем химической физики РАН было синтезировано ЭМГПС-ЫО, и было показано, что данное вещество обладает антиоксидантными свойствами, что подразумевает его кардиопротекторное действие [20], [144].

На примере предшественника ЭМГПС-ЫО, Мексидола, было показано снижение амплитуды быстрого натриевого тока и медленного калиевого тока у нейронов моллюсков в концентрации 1 мМ [186]. Кроме того, исследование

воздействия другого кардиопротекторного вещества, нирингенина, показало подавление кальциевого тока L-типа на ~75% на крысиных кардиомиоцитах, правда, при концентрации 100 мкМ [187].

Благодаря выявленным свойствам, ЭМГПС-NO может быть безопасно использован в качестве кардиопротекторного препарата в терапевтических дозах (менее 1 мМ) без побочных действий на ПЗИК кардиомиоцитов.

Глава 4. Исследование электрофизиологической активности человеческих кардиомиоцитов из ИПСК линии здорового донора

В данной главе изучена электрофизиология человеческих кардиомиоцитов, полученных путем дифференцировки из ИПСК линии здорового человека m34sk3. В первой части главы рассмотрена фундаментальная задача регистрации токов быстрых натриевых каналов при физиологической температуре. Во второй части главы представлено исследование бета-адреностимуляции, вызванной добавлением 1 мкМ изопреналина, на человеческих кардиомиоцитах так же при физиологической температуре.

Быстрые натриевые каналы INav имеют решающее значение в генерации ПД в возбудимых тканях. Свойства Ша^ лежащие в основе его функции, делают его чрезвычайно сложным для измерения и характеристики. Из-за высокой амплитуды и быстрой кинетики натриевого тока Ша мембранный потенциал неконтролируем [188]. Это побудило проводить эксперименты при температуре ниже физиологической [129], [188]—[191]. Математические модели ПД экстраполируют данные до 37°С, используя оценку Q10 для постоянных времени или линейную экстраполяцию для кривых активации/инактивации в стационарном состоянии [26], [132]. Однако имеются ограничения этого подхода: например, широко используемая модель О'Хары-Руди склонна к блокаде проводимости при условиях легкой гиперкалиемии [26]. Таким образом, для модификации математической модели сердечной ткани необходимо получить активационные и инактивационные характеристики токов быстрых натриевых каналов при физиологической температуре.

Изопреналин может быть использован для исследования влияния бета-адреностимуляции на сердечную деятельность. Стимуляция адренорецепторов в желудочковой ткани приводит к изменению частоты сердечных сокращений, скорости передачи сигналов и силы сокращений мышц [21]. При патологических

условиях адреностимуляция может вызывать аритмии. Обычно в экспериментах используют кардиомиоциты животных в качестве моделей, однако у человека динамика и вклад различных ионных токов могут значительно отличаться [22]. Следовательно, требуется изучить влияние изопреналина на кардиомиоциты человека, полученные из ИПСК путём дифференцировки.

Результаты, представленные в данной главе, были опубликованы автором в работах {6}-{9}.

4.1. Исследование работы быстрых натриевых каналов человеческих кардиомиоцитов при физиологической температуре

В рамках данной задачи была исследована электрофизиологическая активность быстрых натриевых каналов человеческих кардиомиоцитов при 37°С.

После дифференцировки ИПСК в человеческие желудочковые кардиомиоциты в первую очередь был проверен общий фенотип полученных клеток. Были записаны ПД для данных кардиомиоцитов. Длительность ПД при 80% реполяризации (APD80) была равна 350 ± 14 мс (п=7). Пример записи ПД представлен на Рис. 23.

100 мс

Рис. 23. Пример формы ПД желудочковых кардиомиоцитов человека, дифференцированных из ИПСК линии здорового донора

Далее для того, чтобы измерять токи Ша методом пэтч-кламп при температуре 37°С было необходимо уменьшить амплитуду тока. Согласно уравнению Нернста, представленного в параграфе 1.3, амплитуда тока зависит от концентрации ионов вне и внутри клетки. Поэтому было предварительно отобрано несколько внеклеточных растворов с разной уменьшенной концентрацией ионов натрия в составе. Подробный состав растворов приведен в параграфе 2.2.

Амплитуды токов Шау при использовании данных растворов были записаны методом пэтч-кламп (Рис. 24).

—*—

_м_

—■—

—*—

■

5 мМ 20 мМ 50 мМ

Рис. 24. Амплитуды INa в человеческих кардиомиоцитах из ИПСК при использовании внеклеточного раствора с содержанием ионов натрия в 5 мМ (зеленый), 20 мМ (голубой) и 50 мМ (розовый)

В результате в растворе с концентрацией 50 мМ ионов натрия амплитуда Ша

составляла более чем 2,5 нА. При использовании раствора Сакакибары с 5 мМ

натрия токов вовсе не наблюдалось. Во внеклеточном растворе с 20 мМ ионов

натрия амплитуда тока Ша достигала не более 1 нА при 37 °С. Таким образом, в

дальнейших экспериментах использовался внеклеточный раствор с 20 мМ ионов

Протоколы стимуляции для получения активационных и инактивационных параметров представлены на Рис. 25 (А, Б). Пример токов при этим протоколам показаны на Рис. 25 (В, Г).

Рис. 25. Б) Протокол стимуляции, используемый для измерения активации и инактивации; (В, Г) примеры записей быстрого натриевого тока во время протокола активации и

инактивации

Результирующие кривые активации и инактивации были получены путем аппроксимации нормированного пикового тока к модели натриевого тока (Рис. 26А, Б). Напряжение полуактивации и коэффициент наклона были равны -45,6 ± 4,9 мВ и 4,4 ± 3,4 мВ соответственно (п = 13). Напряжение полуинактивации было равно -69,7 ± 7,3 мВ, наклон кривой инактивации составил 11,6 ± 6,5 мВ (п = 13).

Рис. 26. Кривые активации (А) и инактивации (Б), построенные из экспериментальных данных (черный), сравнивались с моделью (Tusscher et а1., 2004) (зеленый); (О'Нага et а1., 2011) (синий)

4.2. Действие изопреналина на человеческие кардиомиоциты

В рамках данной задачи были записаны токи быстрого натриевого канала Ша, кальциевого канала L-типа 1Са, Ь и медленного калиевого канала 1К человеческих кардиомиоцитов, полученных путем дифференцировки из ИПСК здоровой линии ш34вк3, в контрольных значениях и после добавления 1мкМ изопреналина (ИЗО).

Протокол стимуляции для Шау 1-У как в Таблице 6, при длительности 50 мс. Пример токов в контроле и после действия ИЗО представлен на Рис. 27А (взяты записи максимумов тока с каждой записи в одной клетке).

Рис. 27. А. Токи быстрого натриевого канала Ша человеческих кардиомиоцитов из ИПСК в контроле (черная кривая) и после действия ИЗО (синяя кривая); Б. Вольтамперные кривые 1-У для Ша в контроле (черная кривая, п=12), после добавления ИЗО (синяя кривая, п=9); В. Кривая активации т кардиомиоцитов человека, дифференцированных из ИПСК (черная кривая, п=12), после ИЗО (синяя кривая, п=9); Г. Гистограмма изменения амплитуды кардиомиоцитов в процентах в контроле (черная колонка, п=12) и после ИЗО (синяя колонка, п=9), р<0,009

Нормировав амплитуду токов на емкости клеток, после усреднения была построена вольтамперная кривая (Рис. 27Б). Амплитуда Ша после действия ИЗО увеличилась на ~73% по сравнению с контролем (р < 0,009) (Рис. 27Г). Кривые активации т для контроля и вещества представлены на Рис. 27В. Полувысота У1/2 для контроля составляла -41,04 ± 1,15 мВ, после добавления ИЗО -46,05 ± 1,33 мВ. После действия ИЗО наблюдается смещение кривой т влево на ~ 5 мВ.

Протокол стимуляции для 1Са^ представлен в виде вставки Рис. 28. Из вольтамперных кривых видно, что амплитуда тока 1Са, L после действия ИЗО увеличилась на 120 % по сравнению с контролем (р < 0,004). Значения амплитуд: в контроле -18,78±4,32 пА/пФ, после ИЗО -41,47±3,43 пА/пФ. После добавления ИЗО наблюдается смещение кривой влево на ~6 мВ.

контроль ИЗО

Рис. 28. А. Запись токов кальциевого канала L-типа 1Са, L человеческих кардиомиоцитов из ИПСК в контроле (черная кривая) и после действия ИЗО (синяя кривая); Б. Вольтамперные кривые I-V для 1Са, L в контроле (черная кривая, п=6), после добавления ИЗО (синяя кривая, п=4); В. Гистограмма изменения амплитуды в процентах в контроле (черная колонка, п=6) и

после ИЗО (синяя колонка, п=4), р<0,004

По аналогии изучили 1Кб под действием ИЗО. Протокол стимуляции от -30 до +60 мВ с шагом в 15 мВ и длительностью 2,5 с. Пример токов показан на Рис. 29А. Нормированная на емкость амплитуда тока при +60 мВ составил в контроле 3,50 ± 0,49 пА/пФ, после ИЗО 6,94 ± 0,42 пА/пФ (Рис. 29Б). Получено, что амплитуда 1кб увеличилась на ~98% после введения ИЗО (Рис. 29В).

Рис. 29. А. Токи медленного калиевого канала 1К человеческих кардиомиоцитов из ИПСК в контроле (черная кривая) и после действия ИЗО (синяя кривая); Б. Вольтамперные кривые 1-У для 1К в контроле (черная кривая, п=3), после добавления ИЗО (синяя кривая, п=3); В. Гистограмма изменения амплитуды в процентах в контроле (черная колонка, п=3) и после

ИЗО (синяя колонка, п=3), р<0,008

4.3. Выводы и обсуждения к главе

Данная глава посвящена изучению электрофизиологии кардиомиоцитов человека, полученных из ИПСК линии здорового человека: получены электрофизиологические параметры быстрых натриевых каналов при физиологической температуре и результаты исследования воздействия изопреналина на токи INav, ICa, L и ГКб.

В параграфе 4.1. представлены результаты по исследованию активационных и инактивационных параметров быстрых натриевых каналов человеческих кардиомиоцитов при 37°С.

Предварительно были изучены ПД у продифференцированных клеток. Длительность ПД при 80% реполяризации (APD80) была равна 350 ± 14 мс (п=7), что соответствовало как первичным кардиомиоцитам, выделенным из желудочков человека 372 ± 16 мс [192], так и миоцитам желудочкового типа, полученным из ИПСК (332 ± 38 мс) [193]. Общий фенотип сходен с нативными желудочковыми миоцитами. Как известно, кардиомиоциты, полученные путем дифференцировки из ИПСК, могут быть незрелыми, в частности, существуют проблемы со значением 1111 (в данном случае около -65 мВ, при стандартных для желудочка -80 мВ). Это может быть вызвано за счёт фактического отсутствия тока 1К1, существуют работы по достижению ПП и ПД как у взрослых кардиомиоцитов, благодаря модуляции Ю с помощью динамического пэтч-клампа [194], либо за счет оверэкспрессии [195].

Также был подобран оптимальный раствор для измерений с внеклеточной концентрацией натрия 20 мМ. При использовании данного раствора амплитуда Г№ не превышала 1 нА, что гипотетически позволило бы уменьшить артефакты при записи Г№.

Из экспериментальных данных были построены кривые активации и инактивации. У1/2 и коэффициент наклона кривой активации были равны -45,6 ± 4,9 мВ и 4,4 ± 3,4 мВ соответственно. Это аналогично данным Сакакибары в нативных миоцитах желудочков (-42,3 ± 1,7 мВ полуактивации) [129], однако в других работах наблюдается смещение [196], [197]. У1/2 инактивации в нашем случае было равно -69,7 ± 7,3 мВ, наклон кривой инактивации составил 11,6 ± 6,5 мВ. Показатели полуинактивации в нативных миоцитах желудочков находятся в диапазоне от -90 до -100 мВ, однако измерения в кардиомиоцитах из ИПСК близки к нашим измерениям [121], [198]. Параметры активации и инактивации натриевого тока у человека, указанные в литературе, весьма противоречивы. Например, измерения У1/2 активации находятся в диапазоне от -25 мВ [198] до -53 мВ [197]. Эти расхождения могут быть объяснены тем, что клетки из ИПСК, НЕК-клетки, а также нативные кардиомиоциты от больных пациентов могут не соответствовать реальным натриевым каналам сердца. Другим фактором является то, что кинетика потенциалзависимых ионных каналов изменяются в зависимости от температуры [188]. Метод экстраполяции данных с комнатной температуры на физиологическую температуру приводит к неточным прогнозам.

Экспериментальные данные пэтч-клампа с параграфа 4.1 были обработаны коллегами путем оптимизации модели с учетом артефактов эксперимента по аналогии работы на НЕЯО- каналах [114], это выявило существенную разницу между видимыми параметрами натриевого тока и результатами оптимизации.

Гиперкалиемия может быть системной или интерстициальной (локализованной в сердечной или другой ткани в результате острой глобальной или регионарной ишемии). Оба параметра сопряжены с высоким риском возникновения аритмии. Повышенная концентрация внеклеточного калия деполяризует потенциал покоя, частично инактивируя натриевый ток. Это, в свою очередь, снижает скорость проводимости или, при более высоких концентрациях, приводит к невосприимчивости тканей [199]. Классические математические

модели ткани желудочков демонстрируют нарушение распространения даже при незначительном повышении концентрации внеклеточного калия: в случае модели О'Хары-Руди [26] нарушение распространения происходит при концентрации внеклеточного калия выше 6 мМ, что не соответствует экспериментальным данным - при данной концентрации внеклеточного калия ПД распространяется по сердечной ткани [199]. В случае модели Grandi-Pasqualini-Bers [116], в которой используется описание натриевого тока из более ранней модели TenTusscher-Panfilov [132], блокада распространения возникает при концентрации внеклеточного [К+] выше 8 мМ [200]. В случае использования нового описания работы натриевых токов при физиологической температуре было показано, что ПД распространяется в условиях гиперкалиемии вплоть до концентрации внеклеточного калия 14 мМ.

В параграфе 4.2 было показано проаритмическое действие изопреналина, наблюдалось увеличение токов потенциалзависимых каналов человеческих кардиомиоцитов в условиях бета-адреностимуляции.

Модуляция кальциевых каналов L-типа после добавления изопреналина увеличила амплитуду тока 1Са, L на 120%, максимум вольтамперной кривой сместился влево на 6 мВ. Подобное увеличение тока 1Са, L в совокупности с другими факторами вызывают увеличение ионов кальция в цитозоле, что повышает сократительную способность миокарда [156]. Реактивация ICaL повышает склонность к ранней постдеполяризации, которая является важной причиной летальных желудочковых аритмий при синдромах удлиненного интервала QT и сердечной недостаточности [201].

Ток быстрых натриевых каналов INav под влиянием изопреналина увеличился на ~ 73%, при этом кривая активации сместилась влево на 5 мВ. В момент бета-адреностимуляции зависимое от протеинкиназы А фосфорилирование усиливает ток Ша как за счет изменения стробирования [202], так и за счет усиления трафика по каналам [203]. Это может способствовать симпатически

опосредованному увеличению скорости проводимости и формированию повторных аритмий после инфаркта миокарда, что часто характеризуется деполяризацией миокарда [204].

Медленные калиевые каналы IKs увеличили амплитуду тока на 98% после добавления изопреналина. В обычных условиях плотность медленной компоненты калиевых каналов IKs ниже, чем быстрого компонента IKr у людей и других крупных млекопитающих [205]. Однако, известно, что стимуляция Р-адренорецепторов увеличивает IKs больше, чем IKr [206], и это противодействует увеличению ICaL, предотвращая увеличение длины ПД. Действительно, физическая нагрузка и стресс являются типичными триггерами аритмии при врожденном синдроме удлиненного интервала QT 1 типа (LQTS), связанном с потерей функции IKs [207], и могут быть предотвращены блокадой Р-адренорецепторов [208]. С помощью компьютерного моделирования было показало, что увеличение отношения IKs/IKr без изменения длины ПД ограничивает возникновение ранних постдеполяризаций. Возможно, IKs более эффективен в стабилизации длительности ПД и подавлении ранних постдеполяризаций, чем IKr [209].

Заметим, что разница в кинетике между более быстрой активацией ICa, L и более медленным увеличением IKs при активации Р-адренорецепторов временно нарушает баланс входящих и исходящих токов [210]. Наблюдаемый дисбаланс может временно пролонгировать ПД и благоприятствовать ранним постдеполяризациям, что было показано с помощью компьютерного моделирования [211]. Более того, более быстрая активация ICa, L (по сравнению с IKs) при быстрой стимуляции Р-адренорецепторов кратковременно увеличивает реституцию ПД, что приводит к распаду реентри и ускоряет переход желудочковой тахикардии в фибрилляцию желудочков [212].

Глава 5. Исследование электрофизиологии зрелых человеческих кардиомиоцитов, выделенных из биоптата

В данной главе представлены результаты работы по оптимизации собственного протокола выделения зрелых человеческих кардиомиоцитов из биоптата, иссеченного во время операции по аортокоронарному шунтированию. На данных человеческих кардиомиоцитах исследуется влияние кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор на восстановление потенциалзависимых ионных каналов после операции, что может быть одним из факторов, способствующих послеоперационным аритмиям.

Результаты, представленные в данной главе, были опубликованы автором в работах {2}, {4}, {5}, {10}-{17}, {20}, {21}.

5.1. Оптимизация протокола выделения человеческих кардиомиоцитов из

биоптата

5.1.1. Вариации протокола выделения из биоптата

В ходе отработки и оптимизации протокола выделения зрелых кардиомиоцитов человека было использовано более 100 биоптатов, также на них проводились вариации некоторых этапов протокола. Основной протокол выделения описан в параграфе 2.2.5.

В данном параграфе успешным выделением считается то выделение, после которого количество стержнеобразных предсердных кардиомиоцитов составляла не менее 1,5 106 на грамм биоптата, что являлось средним показателем для выделений по запатентованному протоколу. Пример выделенных кардиомиоцитов представлен на Рис. 30.

Рис. 30. Снимки выделенных предсердных кардиомиоцитов с разных биоптатов, шкала

соответствует 50 мкм

Был установлен оптимальный размер биоптата экспериментальным путем -кусок размером 1 см х 1 см х 0,5 см (длина х ширина х высота). Биоптаты большего размера зачастую подвергались ишемии, а при малом размере биоптата выход кардиомиоцитов также ограничен.

На Рис. 31 представлена общая схема этапов выделения и некоторые их вариации, которые были реализованы в ходе исследования.

Рис. 31. Общая схема протокола выделения кардиомиоцитов из биоптата ушка правого

предсердия с вариациями

Так как при операциях кардиоплегический раствор Нормакор смешивается с оксигенированной кровью, то этап транспортировки биоптата после таких операций был протестирован при разных вариациях соотношения крови и Нормакора (Таблица 7).

Таблица 7

Транспортировка в Нормакоре с кровью

Соотношение Количество Количество Соотношение

Нормакор : кровь выделений успешных выделений в % *

1:2 4 0 0 %

1:1 5 1 20 %

2:1 5 2 40 %

без крови 10 8 80 %

*процентное соотношение N2~.N1, где N1 - количество выделений, N2- количество успешных выделений

После транспортировки биоптата в Нормакоре с кровью в соотношении 1:2 не было успешных выделений клеток (0 из 4). При соотношении 1:1 было только одно успешное выделение из 5. При соотношении Нормакора к крови 2:1 успешных выделений составляло 40% от общего количества выделений. Лучший показатель успешных выделений был достигнут при использовании чистого Нормакора, где процентное соотношение успешных выделений клеток к общему количеству выделений составило 80%.

Кроме вариации способа транспортировки, изменялся также способ промыва фракций биоптата. Проведение промыва в три круга по пять минут в оксигенированном бескальциевом буфере привело к увеличению доли живых кардиомиоцитов, по сравнению с описанным в патенте методом промыва в три круга в течение трех минут [32].

Кроме того, был исследован другой тип фермента - коллагеназа II типа ^Ьсо), вместо коллагеназы IV типа, которая использовалась в описании метода в

патенте. Средняя концентрация коллагеназы IV типа составляла 1,2 мг/мл, в то время как активность коллагеназы II типа выше, ее концентрация равнялась 0,8 мг/мл. При использовании коллагеназы II типа оптимальная концентрация проназы составляла 0,2 мг/мл.

Кроме вариаций с транспортировкой и замены фермента, неоднократно изменялся состав бескальциевого буфера (Таблица 8).

Таблица 8.

Вариации реактивов и этапов протокола

Убрали Заменили Добавили Кол-во выделений Кол-во успешных выделений Соотношение в % *

Креатин Коллагеназа II типа 14 9 64%

Таурин Коллагеназа II типа 7 3 43%

Блеббистатин Коллагеназа II типа 6 3 50%

Креатин, таурин Коллагеназа II типа 5 2 40%

Креатин, блеббистатин Коллагеназа II типа 6 3 50%

Таурин, блеббистатин Коллагеназа II типа О2 5 4 80%

Блеббистатин Коллагеназа II типа О2 11 10 91%

Блеббистатин, БББ Коллагеназа II типа О2 17 15 88%

Блеббистатин, БББ, рекальцификация Коллагеназа II типа О2, раствор КВ 7 7 100%

*процентное соотношение N2.N1, где N1 - количество выделений, N2 - количество успешных

выделений

Качество выделения сильно ухудшилось без таурина, процент успешных выделений снизился до 43%. Без блеббистатина соотношение успешных выделений понизилось до 50%. Были также проведены выделения без креатина и таурина, а также без креатина и блеббистатина в составе бескальциевого раствора, где соотношение удачных выделений составило 40% и 50%, соответственно.

Добавление этапа оксигенации бескальциевого раствора позволило повысить соотношение успешных выделений даже при отсутствии таурина и блеббистатина, достигнув 80%.

Проведена еще одна серия экспериментов по выделению кардиомиоцитов из биоптата без добавления блеббистатина в бескальциевый буфер, однако сохранялся этап оксигенации буфера. Результаты показали, что в 10 из 11 случаев выделения прошли успешно. Далее был проведен ряд выделений, при которых исключалось добавление FBS в бескальциевый раствор, что привело к снижению доли выделений с живым выходом клеток до 88%. Для дальнейшего повышения доли успешных выделений с живым выходом клеток на последнем этапе, когда клетки отдыхают 30 минут и мембрана восстанавливается, был заменен бескальциевый раствор на холодный раствор Kraftbrühe (KB), содержащий глутамат К+ 50 мМ, HEPES 20 мМ, таурин 20 мМ, MgSO4 3 мМ, KCl 30 мМ, EGTA 0.5 мМ, KH2PO4 30 мМ и глюкоза 10 мМ (раствор KB был также насыщен кислородом).

5.1.2. Огруктура выделенных кардиомиоцитов

Иммуноцитохимическим методом на конфокальном сканирующем микроскопе была исследована структура зрелых кардиомиоцитов предсердий, выделенных из биоптата. На Рис. 32 приведен пример, демонстрирующий, что ядро (DAPI, синий), цитоскелет (f-актин) и поперечнополосатая структура (а-актинин) не повреждены.

А

В

Рис. 32. Исследование зрелых кардиомиоцитов, выделенных из биоптата правого предсердия человека, с использованием конфокального микроскопа методом иммуноцитохимии: А. DAPI (ядро) окрашено в синий цвет; Б. ^актин - в зеленый; В. а-актинин - в красный; Г. Наложение изображений, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Шкала

соответствует 20 мкм

5.2. Влияние способа отмыва кардиоплегического раствора на электрофизиологию кардиомиоцитов из биоптата

Было проведено сравнение электрофизиологической активности потенциалзависимых ионных каналов в предсердных кардиомиоцитах человека, выделенных из биоптатов в трёх группах (схема на Рис. 33):

1) забор биоптата до введения кардиоплегического раствора Кустодиол в сердце - контрольная группа «до операции»;

2) забор биоптата после введения кардиоплегического раствора Кустодиол в сердце, транспорт на холоде с последующим отмывом в лаборатории - «во время операции»;

3) забор биоптата после отмыва сердца от кардиоплегического раствора в операционной (после восстановления сердечного ритма) - «после операции».

предсердия человека операции операции операции

Изолированные первичные кардиомиоциты человека

Рис. 33. Схема забора биоптата Таким образом, были рассмотрены два способа вымывания кардиоплегического раствора: в лабораторных условиях (в бескальциевом буфере) и в операционной.

Во всех трех экспериментальных группах («до операции», «во время операции», «после операции») были записаны токи быстрых натриевых каналов с помощью метода пэтч-кламп (Рис. 34). Протокол стимуляции был ступенчатый для Ша (1-У) из таблицы 6, но длительность стимуляции составляла 50 мс.

Рис. 34. А. Вольтамперная кривая быстрых натриевых каналов INav предсердных кардиомиоцитов человека до операции (черная кривая, п=7), во время операции (фиолетовая

кривая, п=5) и после операции (розовая кривая, п=6); Б. Сравнение нормированных амплитуд

Шау в % до, во время и после операции (р<0,002)

Вольтамперная кривая (Рис. 34А) была построена, плотность тока до операции равна -46,89 ± 4,02 пА/пФ, во время операции -31,44 ± 2,23 пА/пФ, после операции -42,75 ± 2,71 пА/пФ.

Для ШаУ относительно контрольной группы «до операции» в группе «во время операции» наблюдается смещение кривой активации на ~10 мВ вправо и уменьшение амплитуды тока на ~33%. В группе «после операции» амплитуда быстрых натриевых токов ШаУ меньше контроля на ~9%, смещение активационной кривой составляет ~3 мВ вправо (Рис. 35).

т

80 -60 -40 -20 0

V, мВ

Рис. 35. Кривые активации т до операции (черная кривая, п=7), во время операции (фиолетовая

кривая, п=5) и после операции (розовая кривая, п=6)

Для медленных калиевых каналов была построена вольтамперная кривая (Рис. 36А). Протокол стимуляции от -40 до +50 мВ либо от -30 до +60 мВ с длительностью 5 с. Усредненные токи ГК^з, нормированные к емкости клетки (плотности тока), были равны до операции -14,49 ± 1,79 пА/пФ, во время операции -5,10 ± 1,11 пА/пФ, после операции -9,97 ± 1,37 пА/пФ (поскольку протокол отличается, он был пересчитан по аппроксимированной кривой при том же потенциале). На гистограмме амплитуды 1К (Рис. 36Б) показано снижение на 65% и 31% во время и после операции соответственно.

Рис. 36. А. Вольтамперная кривая медленных калиевых каналов 1К кардиомиоцитов предсердий человека до операции (черная кривая, п=7), во время операции (фиолетовая кривая, п=5) и после операции (розовая кривая, п=6); Б. Сравнение нормированных амплитуд 1К в %

до, во время и после операции (р < 2*10-6)

5.3. Восстановление потенциалзависимых ионных каналов после операций с использованием кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор

Были исследованы быстрый натриевый канал, кальциевый канал L-типа и медленный калиевый канал предсердных кардиомиоцитов человека, выделенных из трех типов биоптата: 1) иссеченных до применения кардиоплегического раствора (контрольная группа); 2) полученных после восстановления сердечного ритма на операции с использованием кардиоплегического раствора Кустодиол и 3) полученных после восстановления сердечного ритма на операции с использованием кардиоплегического раствора Нормакор. Далее, когда говорится «после Кустодиола» или «после Нормакора», это будет означать после отмыва соответствующего кардиоплегического раствора из сердца пациента в конце операции, когда сердечный ритм пациента был восстановлен.

Все клетки, выделенные из этих трех типов хирургических образцов и отобранные для записи токов методом пэтч-кламп, имели форму стержня и поперечнополосатую структуру.

Быстрый натриевый ток Ша был зарегистрирован методом пэтч-кламп. Типичные трейсы тока изолированного зрелого миоцита предсердия человека показаны на Рис. 37А. Кривая 1-У (Рис. 37Б) была получена с использованием тестовых импульсов от -80 до +15 мВ в серии шагов по 5 мВ, деполяризующихся с удерживающего потенциала -80 мВ, указанного на рисунке во вставке (Рис. 37А). Усредненные максимальные пики Шау, нормированные на емкости клеток (плотность тока), составили в контроле -46,89 ± 4,02 пА/пФ, после Кустодиола -42,75 ± 2,71 пА/пФ и после Нормакора -45,39 ± 4,86 пА/пФ. Зависимость кривой активации Шау до и после операций с кардиоплегическими растворами показана на Рис. 37В. Сдвиг кривых активации на полувысотах У1/2 составил 2,4 мВ и 12,7 мВ после Кустодиола и Нормакора соответственно. На гистограмме амплитуды Шау (Рис. 37Г) было показано снижение на 9% и 3 % после Кустодиола и Нормакора соответственно.

Рис. 37. А. Исходные записи INa в изолированных кардиомиоцитах предсердий человека в контроле и после применения Кустодиола и Нормакора; Б. Нормированные кривые I- V быстрого натриевого тока INav предсердий человека кардиомиоциты в контроле (черная кривая, п=7), после Кустодиола (розовая кривая, п=6) и после Нормакора (оранжевая кривая, п=6); В. Активационная кривая m кардиомиоцитов человека в контроле (черная кривая, п=7),

после Кустодиола (розовая кривая, п=6) и после Нормакора (оранжевая кривая, п=6); Г. Гистограмма амплитуды INav предсердных кардиомиоцитов человека в процентах в контроле

(черная кривая колонка, п=7), после Кустодиола (розовая колонка, п=6) и после Нормакора

(оранжевая колонка, п=6)

Оригинальные записи тока 1Са, Ь зрелых кардиомиоцитов предсердий человека контрольной группы и после применения кардиоплегических растворов показаны на Рис. 38А. Кривая 1-У (Рис. 38Б) была построена с использованием тестовых импульсов от -50 мВ до +40 мВ в несколько этапов. Средние максимальные пики 1Са, Ь были все при 0 мВ и с амплитудой, нормированной к емкости клетки (плотности тока) в контроле -15,74 ± 2,53 пА/пФ, после Кустодиола -10,88 ± 2,26 пА/пФ и после Нормакора -11,74 ± 1,34 пА/пФ. На гистограмме амплитуды 1Са, Ь (Рис. 38В) было показано снижение на 32% и 26 % после Кустодиола и Нормакора соответственно.

А

□ мВ

О _20 J

з: Контроль Кустодиол Нормакор

Рис. 38. А. Записи 1Са, Ь в изолированных кардиомиоцитах предсердий человека в контроле, после Кустодиола и Нормакора; Б. Нормированные кривые I-V для 1Са, Ь в кардиомиоцитах предсердий человека в контрольной группе (черная кривая, п=7), после Кустодиола (розовая кривая, п=6) и после Нормакора (оранжевая кривая, п=6); В. Гистограмма амплитуды тока в процентах в контроле (черная колонка, п=7), после Кустодиола (розовая колонка, п=6, р<0,03) и после Нормакора (оранжевая колонка, п=6, р<0,03)

Оригинальные трейсы токов медленных калиевых каналов в

кардиомиоцитах предсердий человека, выделенных из биоптата в контрольной группе и после кардиоплегических растворов показаны на Рис. 39А. Кривая 1-У (Рис. 39Б) была получена с использованием тестовых импульсов от -40 до + 50 мВ либо от -30 до +60 мВ длительностью 5 с. Средние максимальные токи 1Кб, нормированные к емкости клетки (плотности тока), были в контроле -14,49 ± 1,79 пА/пФ, после Кустодиола -9,97 ± 1,37 пА/пФ и после Нормакора -13,48 ± 1,56 пА/пФ (поскольку протокол отличается, он был пересчитан по аппроксимированной кривой при том же потенциале). На гистограмме амплитуды 1Кб (Рис. 39В) было показано снижение на 31% и 6 % после Кустодиола и Нормакора соответственно.

60 мВ

Контроль Кустодиол Нормакор

Рис. 39. А. Исходные токи 1^, выявленные в изолированных кардиомиоцитах предсердий человека из контрольной группы, после Кустодиола и Нормакора; Б. Нормированные кривые IV для 1К медленных калиевых каналов кардиомиоцитов предсердий человека в контроле (черная кривая, п=7), после Кустодиола (розовая кривая, п=6) и после Нормакора (оранжевая кривая, п=6); В. Гистограмма амплитуды 1К кардиомиоцитов предсердий человека в процентах в контроле (черная колонка, п=7), после Кустодиола (розовая колонка, п=6, р<0,003)

и после Нормакора (оранжевая колонка, п=6)

Затем был проведен анализ наличия послеоперационных осложнений у пациентов в группах, где биоптат был иссечен после отмыва от Кустодиола и Нормакора. Общее количество операций, когда образцы были иссечены для изучения восстановления ионных каналов после операций с Кустодиолом, равно 7. Влияние Нормакора на восстановление ионных каналов также рассматривалось в 7 операциях. Наблюдались три типа осложнений - фибрилляция предсердий, удлинение интервала PQ, предсердная экстрасистола. Результаты приведены в Таблица 9.

Таблица 9. Послеоперационное восстановление пациентов

Без

Кардиоплег. Кол-во Фибрилляция Удлинение Экстрасистола изменений,

раствор операции предсердия, % РО, % предсердия, % %

Кустодиол 7 14 0 43 43

Нормакор 7 14 72 14 0

В обеих группах зафиксировано по одному случаю фибрилляции предсердий, что составило ~14% от всех операций в каждой группе. Удлинение PQ наблюдалось у 5 пациентов из группы операций после Нормакора (~72%). Предсердные экстрасистолы были зарегистрированы в обеих группах: после Кустодиола - у ~43% (3 пациента из 7) и после Нормакора - у ~14% (1 пациент из 7). У 3 из 7 пациентов в группе после Кустодиола никаких изменений или осложнений после операций не наблюдалось.

5.4. Выводы и обсуждения к главе

Данная глава посвящена работе со зрелыми человеческими кардиомоцитами, выделенными из биоптата предсердия.

В параграфе 5.1.1 для увеличения выхода кардиомиоцитов, получаемых методом выделения изолированных кардиомиоцитов из биоптата [32], и

увеличения их выживаемости была проведена исследовательская работа по оптимизации данного метода. ^гласно полученным результатам, необходимо обязательно включать креатин, блеббистатин и таурин в буферный раствор для изоляции кардиомиоцитов из биоптата сердца человека, по дольку это более важный фактор, чем оксигенация растворов.

Было показано, что важную роль играет этап транспортировки биоптата из операционной в лабораторию. В параграфе 1.13 было сказано про смешивание Нормакора с кровью, насыщенной кислородом, во время операции. Было установлено, что эффективнее проводить транспортировку биоптата в чистом Нормакоре без примеси крови, при этом транспортировка проводилась при 4°С для замедления всех внутриклеточных процессов жизнедеятельности.

Были протестированы вариации бе^альциевого раствора с отсутствием таких реактивов как креатин, блеббистатин и таурин, что оказалось критичным фактором для выживаемости клеток. Это обусловлено тем, что отсутствовавшие компоненты отвечают за энергетический обмен в клетках, за подавление шкратимости кардиомиоцитов для уменьшения энергозатрат клеток. Например, креатин играет ключевую роль в шкращении сердца и энергетическом обмене [213], [214], играет защитную роль против ишемических инсультов [215]. Таурин обладает антиоксидантным, противовоспалительным и стабилизирующим мембрану свойствами [216], [217]. Дефицит таурина вызывает ремоделирование желудочковых кардиомиоцитов, ультраструктурные повреждения миофиламентов и митохондрий и сверхэкспрессию маркеров сердечной недостаточности [218]. Блеббистатин подавляет взаимодействия актина и миозина в сократительной системе сердечной мышцы [219], его используют часто, так как он минимально воздействует на электрофизиологию сердца [220]. Отсутствие данных реактивов при разных композициях показывали худшую выживаемость кардиомиоцитов. Изначально в составе бескальциевого буфера был другой разобщающий агент bdm-2,3 по Guo et а1 [184]. Однако bdm-2,3 уменьшает кальциевый ток L-типа и

уменьшает кальциевые переходные процессы [221], [222]. Поэтому была произведена замена с bdm-2,3 на блеббистатин. Считается, что насыщение растворов кислородом при выделении клеток необходимо для их выживаемости [223], [224], однако это не самый важный фактор при выделении кардиомиоцитов [31]. В данной работе было показано, что кислород позволяет увеличить выход живых кардиомиоцитов даже при отсутствии некоторых реактивов, отвечающих за энергетический обмен.

В параграфе 5.2 был рассмотрен эффект отмыва кардиоплегического раствора Кустодиол двумя разными способами: в лаборатории и в операционной. Как выяснилось, электрофизиология ионных каналов отличается в зависимости от того, как отмывали биоптат от кардиоплегического раствора. Токи в кардиомиоцитах, выделенных из биоптатов, иссеченных «во время операции», то есть с отмывом в бескальциевом буфере в лаборатории, были сильно меньше, чем при отмыве в операционной. Предполагается, что возможно недостаточно отмывать биоптат от кардиоплегического раствора в лабораторных условиях. Скорее всего отмыв через сосуды имеет больший эффект, нежели внешняя перфузия фракций биоптата. Тем самым, в дальнейшем для изучения восстановления потенциалзависимых ионных каналов после операций были взяты биоптаты до введения кардиоплегического раствора в сердце и после восстановления сердечного ритма пациентов.

В параграфе 5.3 было проведено сравнение восстановления потенциалзависимых ионных каналов первичных кардиомиоцитов человека после операции с использованием кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор. Экспериментальные данные при физиологической температуре получали с помощью метода пэтч-кламп. Было показано, что ток быстрого натриевого канала восстанавливался после операций с Кустодиолом на 91%, а после операций с Нормакором - на 97%. В случае последнего наблюдается сдвиг кривой активации вправо почти на ~13 мВ. Кальциевый канал L-типа был восстановлен в одинаковой

степени: на 69% после Кустодиола и на 74% после Нормакора. Что касается медленных калиевых каналов, то после Кустодиола 1К частично восстанавливается на 69%, однако после Нормакора 1К почти достигает контрольных значений (94%).

Все записи токов, характеризующие восстановление каналов, были сделаны в среднем через 7 часов после операций. Особенности кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор были описаны в параграфе 1.13. Это два принципиально разных по составу и применяемой температуре кардиоплегических раствора.

Изучая восстановление пациентов после операции в рамках настоящего исследования, мы наблюдали три типа послеоперационных осложнений (Таблица 9). Несколько раз регистрировались удлинение интервала PQ, маркер атриовентрикулярной блокады [225], и предсердные экстрасистолы, которые могут указывать на более тяжелые предсердные тахиаритмии у пациентов с заболеваниями сердца [226]. Однако наибольший интерес представляла фибрилляция предсердий (ФП). В обеих группах был зарегистрирован один случай ФП. Фибрилляция предсердий является распространенной аритмией, особенно у пожилых людей, и связана с повышенным риском смертности, инсульта и периферической эмболии [227]-[230]. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что это опасное послеоперационное осложнение может возникнуть после операций с использованием как Кустодиола, так и Нормакора.

Восстановление кальциевых каналов L-типа, которые поддерживают фазу плато, было одинаковым после операции с использованием как Кустодиола, так и Нормакора. Уменьшение амплитуды примерно на 30% может повлиять на генерацию ПД, поскольку инактивация 1Са, L играет решающую роль в контроле связи возбуждения и сокращения в кардиомиоцитах [231]. Дисфункция и плотность кальциевых каналов L-типа являются значимыми факторами при сердечной недостаточности со сниженной фракцией выброса [232] Подавление кальциевых

каналов L-типа, которое сокращает продолжительность ПД, может привести к увеличению вероятности возникновения фибрилляции пердсердия. Дополнительно, амплитуда ГСа, L может быть понижена из-за гипоксии [233],

[234].

Кардиоплегический раствор Кустодиол содержит высокую концентрацию гистидина. Гистидин может восстанавливать эффективность активации бета-адренорецепторов. Индуцированное L-гистидином усиленное пространственное взаимодействие рецептора, чувствительного к кальцию, с потенциалзависимым кальциевым каналом, может уменьшать активность данного кальциевого канала

[235]. Таким образом, повышение уровня гистидина в крови не остается бесследным - изменяется деятельность сердца, кровеносных сосудов и коры головного мозга [236].

Нормакор содержит большое количество ионов калия. Возможно, гиперкалиемия индуцирует ацидоз [237]. Изменения рН и АТФ также могут привести к снижению кальциевого тока. То есть повышенная активность внутриклеточных протонов будет способствовать снижению 1Са, L [238]. Концентрация АТФ остается неизменной в течение первых 10 мин ишемии [239], а дозозависимое снижение I Са, L происходит только в том случае, если внутренняя концентрация [АТФ^ снизилась до уровня менее 5 мМ [240]. Увеличение внеклеточной концентрации ионов калия К+ приводит к сокращению ПД из-за уменьшения поступления Са2+ в клетку [241].

Восстановление быстрого натриевого канала, ответственного за фазу деполяризации, было практически полным по амплитуде как после Кустодиола, так и после Нормакора. Однако кривая активации в группе Нормакора показала сдвиг вправо на 12,7 мВ по сравнению с контролем. При этом кривые 1-У натриевых каналов в контроле и после Кустодиола имели тенденцию к гиперполяризации, вопреки литературным данным, указывающим на стандартный максимальный пик Ша при -30 мВ [242], [243]. Однако стоит отметить, что в других исследованиях

сообщалось о максимальной активации приблизительно при -40 мВ в первичных кардиомиоцитах человека, выделенных из биоптата, иссеченного во время операции по аортокоронарному шунтированию [177]. Эти изменения электрофизиологических параметров натриевых каналов могут быть объяснены условиями регистрации во время нагревания и временем транспортировки хирургических образцов, которые, возможно, вызвали ишемию. Как известно, ишемия приводит к ацидозу, а ацидоз, в свою очередь, может вызвать сдвиг в механизме активации быстрых натриевых токов [244].

Полученные результаты показывают, что после введения Нормакора медленные калиевые каналы 1Кб восстанавливались лучше по сравнению с Кустодиолом, почти достигнув контрольных значений (94%), в то время как после Кустодиола 1К восстановился частично (69%). Уменьшение амплитуды 1К способствует задержкам деполяризации, что приводит к удлинению ПД и уменьшению распространения импульса через сердце. При многих нарушениях сердечного ритма, таких как фибрилляция желудочков и предсердий, фаза реполяризации играет важную роль [245]. В будущем требуется изучить другие компоненты калиевых каналов 1Киг, 1Кг, а также проанализировать восстановление медленного калиевого тока 1К кардиомиоцитов предсердий через сутки после операции.

По результатам данного исследования восстановление кальциевого канала L-типа (после обоих кардиоплегических растворов) и медленного калиевого канала (после Кустодиола) происходит после операций не сразу, и полученные факты следует учитывать в ходе послеоперационной терапии пациентов.

Заключение

Данная работа посвящена исследованию электрофизиологической активности кардиомиоцитов разных типов и тестированию на них соединений с про- и антиаритмическими свойствами методом пэтч-кламп.

Было установлено антиаритмическое действие смеси ботулотоксина типа А и новохитозоля на быстрые натриевые каналы, кальциевые каналы L-типа и медленные калиевые каналы при концентрациях 0,001 и 0,1 Ед. в неонатальных кардиомиоцитах крыс. Также на кардиомиоцитах этого типа было доказано, что новое соединение нитроксисукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиний может безопасно использоваться в терапевтических дозах.

В другом типе кардиомиоцитов - человеческих желудочковых, дифференцированных из ИПСК, - получены активационные и инактивационные параметры быстрых натриевых каналов при физиологической температуре, что в дальнейшем позволило модифицировать математическую модель, описывающую работу желудочковых миоцитов. Помимо этого, на данном типе человеческих кардиомиоцитов показано проаритмическое действие изопреналина при 37° С.

В исследовании особое внимание уделено изучению электрофизиологии при физиологической температуре человеческих предсердных кардиомиоцитов, выделенных из биоптата. Был оптимизирован протокол выделения в условиях лаборатории и выявлен характер восстановления быстрых натриевых, медленных калиевых и кальциевых каналов L-типа после операций с использованием кардиоплегических растворов Кустодиол и Нормакор. Полученные экспериментальные данные могут стать базой для построения математической модели сердца человека, что позволит более глубоко понимать механизмы возникновения сердечно-сосудистых заболеваний и прогнозировать поведение сердца при различных условиях.

Список публикаций по теме диссертации Статьи в журналах

{1}. Aygul Nizamieva, Sheida Frolova, Mihail Slotvitsky, Sandaara Kovalenko, Valeriya Tsvelaya, Anna Nikitina, David Sergeevichev & Konstantin Agladze. Cellular electrophysiological effects of botulinum toxin A on neonatal rat cardiomyocytes and on cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells // Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. - 2023 - 396 (3) - P. 513-524. (Scopus, WoS) {2}. Шумаков Д.В., Агладзе К.И., Зыбин Д.И., Агафонов Е.Г., Попов М. А., Романова С.Г., Фролова Ш.Р., Слотвицкий М.М., Бережной А.К., Цвелая В.А. Состояние INav предсердных кардиомиоцитов после кардиоплегии // Клиническая и экспериментальная хирургия. - 2022. -Т. 10. - № 2 (36). - С. 26-32. (Scopus) {3}. A.A. Zhukov, S.G. Romanova. On the possibility of using glass capillaries as probes of an atomic-force microscope operating in a hybrid mode // Instruments and Experimental Techniques. - 2022 - Vol. 65, No. 3 - P. 514518. (Scopus, WoS)

{4}. С.Г. Коваленко, Ш.Р. Фролова, В.К. Крамкова, А.К. Березовский, М.А. Попов, Д.В. Шумаков, Д.И. Зыбин, Е.Г. Агафонов, В.В. Донцов, К. И. Агладзе. Развитие метода выделения зрелых человеческих кардиомиоцитов из биоптата сердца человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2023. - № 2. - С. 136-143. (RSCI, Scopus) {5}. Aleksey Kalinin, Vadim Naumov, Sandaara Kovalenko, Andrey Berezhnoy, Mihail Slotvitsky, Serafima Scherbina, Aleria Aitova, Vladimir Syrovnev, Mikhail Popov, Andrey Kalemberg, Sheyda Rauf kizi Frolova, Konstantin Agladze, Valeriya Tsvelaya. Modeling the functional heterogeneity and conditions for the occurrence of microreentry in procedurally created atrial fibrous tissue // Journal of Applied Physics. -2023. - 134 (5): 054702. (Scopus, WoS)

Публикации в трудах конференций

{6}. Фролова Ш.Р., Романова С.Г., Абрашева В.О., Сюняев Р.А. Активность потенциал-зависимых ионных каналов при бета-адреностимуляции //Тезисы докладов 2-ой научно-практической конференции учёных России и Хорватии в Дубровнике. - 2020 - с.45-46. (РИНЦ)

{7}. С.Г. Романова, В.О. Абрашева, Ш.Р. Фролова, Р.А. Сюняев. Измерение активационных характеристик быстрых натриевых каналов кардиомиоцита человека при физиологической температуре //Труды 63-й Всероссийской научной конференции МФТИ. - 2020 - С. 55-56.

{8}. В.О. Абрашева, С.Г. Романова, Р.А. Сюняев, Ш.Р. Фролова. Уточнение формулировки быстрого натриевого тока в математической модели кардиомиоцитов желудочков человека //Труды 63-й Всероссийской научной конференции МФТИ. - 2020 - С. 48 - 50.

{9}. В.О. Абрашева, С.Г. Романова, Ш.Р. Фролова, М.М. Слотвицкий, В.А. Цвелая, Р.А. Сюняев. Оптимизация параметров модели ионного тока с учетом экспериментальных артефактов //Труды 64-й Всероссийской научной конференции МФТИ. - 2021 - С. 52-53.

{10}. Романова С.Г., Бережной А.К. Влияние кардиоплегического раствора Кустодиол на быстрые натриевые каналы человеческих кардиомиоцитов //Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2021» - 2021.

{11}. Попов М.А., Шумаков Д.В., Зыбин Д.И., Фролова Ш.Р., Романова С.Г., Цвелая В.А., Агладзе К.И. Влияние кардиоплегического раствора Кустодиол на INav у пациентов с ИБС // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. - 2021 - Т.10 - №S2 - C. 158. (РИНЦ)

{12}. Романова С. Г., Фролова Ш. Р., Слотвицкий М. М., Бережной А. К., Цвелая В. А., Попов М. А., Шумаков Д. В., Зыбин Д. И., Агладзе К. И.

Влияние кардиоплегического раствора «Кустодиол» на быстрые натриевые каналы человеческих кардиомиоцитов // VIII международная научно-практическая конференция молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов -2021. (РИНЦ)

{13}. Коваленко С. Г., Фролова Ш. Р., Попов М. А., Шумаков Д. В., Зыбин Д. И., Агладзе К. И. Исследование влияния ишемии на электрофизиологию быстрых натриевых и медленных калиевых каналов человеческих кардиомиоцитов в послеоперационный период при коронарном шунтировании // IX международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков. - 2022 - C. 346-347. (РИНЦ)

{14}. Романова С.Г., Фролова Ш.Р., Калинин А.И., Слотвицкий М.М., Цвелая В.А., Попов М.А., Шумаков Д.В., Зыбин Д.И., Агладзе К.И. Активность быстрых натриевых каналов человеческих кардиомиоцитов до и после введения кардиоплегического раствора Кустодиол // V Инновационный Петербургский медицинский форум. -2022 - С. 163.

{15}. Коваленко С.Г. Активность быстрых натриевых каналов первичных кардиомиоцитов человека после отмыва от кардиоплегического раствора // Сборник тезисов докладов участников седьмого всероссийского молодежного научного форума «Наука будущего -наука молодых». - 2022 - С. 116.

{16}. Коваленко С.Г., Фролова Ш.Р., Попов М.А., Агладзе К.И. Восстановление ионных каналов зрелых человеческих кардиомиоцитов в послеоперационный период// Клеточные технологии в экспериментальной медицине/ - 2022 - C. 13-16. (РИНЦ)

{17}. А.В. Березовский, С.Г. Коваленко, Ш.Р. Фролова, К.И. Агладзе. Сравнение восстановления работы ионных каналов в кардиомиоцитах человека после операций с кардиоплегическими растворами Нормакор и Кустодиол // Материалы 65-й Всероссийской научной конференции МФТИ в честь 115-летия Л.Д. Ландау. - 2023 - а 254- 256. {18}. В.К. Крамкова, С.Г. Коваленко, Ш.Р. Фролова, Д.В. Мищенко, А.А. Балакина, К.И. Агладзе. Изучение влияния нового кардиопротекторного соединения нитропроизводного сукцината этилметилгидроксипиридиния на ионные каналы кардиомиоцитов // Материалы 65-й Всероссийской научной конференции МФТИ в честь 115-летия Л.Д. Ландау. - 2023 - С. 249 - 251. {19}. Фролова Ш.Р., Коваленко С.Г., Крамкова В.К., Мищенко Д.В., Агладзе К.И. Изучение влияния нового кардиопротекторного соединения нитроксисукцината 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридиния на ионные каналы кардиомиоцитов // Сборник научных трудов VII Съезда биофизиков России. - 2023 - С. 158-159. (РИНЦ) {20}. Коваленко С.Г., Фролова Ш.Р., Березовский А.В., Агладзе К.И. Восстановление работы ионных каналов в кардиомиоцитах человека после операций с кардиоплегическими растворами Нормакор и Кустодиол // Сборник научных трудов VII Съезда биофизиков России. - 2023 - С. 152-153. (РИНЦ) По результатам исследования зарегистрирован патент:

{21}. Д. В. Шумаков, К. И. Агладзе, Д. И. Зыбин, М. А. Попов, Ш. Р. Фролова, С. Г. Романова «Способ выделения кардиомиоцитов из ткани сердца человека» Патент ЯШ749986С1, 2020.

Список цитируемой литературы

[1] GBD 2017 Causes of Death Collaborators, «Global, regional, and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017», Lancet, т. 392, вып. 10159, сс. 1736-1788, ноя. 2018, doi: 10.1016/S0140-6736(18)32203-7.

[2] N. Townsend и др., «Epidemiology of cardiovascular disease in Europe», Nat Rev Cardiol, т. 19, вып. 2, сс. 133-143, фев. 2022, doi: 10.1038/s41569-021 -00607-3.

[3] Российский статистический ежегодник. 2022: Стат.сб./Росстат. Р76 М., 2022 -691 с.

[4] O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, и F. J. Sigworth, «Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches», Pflugers Arch, т. 391, вып. 2, сс. 85-100, авг. 1981, doi: 10.1007/BF00656997.

[5] A. L. Pond и др., «Expression of distinct ERG proteins in rat, mouse, and human heart. Relation to functional I(Kr) channels», J Biol Chem, т. 275, вып. 8, сс. 59976006, фев. 2000, doi: 10.1074/jbc.275.8.5997.

[6] J. Oh, C. Kho, R. Hajjar, и K. Ishikawa, «Experimental models of cardiac physiology and pathology», Heart Failure Reviews, т. 24, сс. 1-15, июл. 2019, doi: 10.1007/s 10741 -019-09769-2.

[7] I. Karalikes, M. Ameen, V. Termglinchan, и J. C. Wu, «Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes», Circ. Res, т. 117, сс. 80-88, 2015.

[8] Y. Yoshida и S. Yamanaka, «Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications», Circulation research, т. 120, вып. 12, сс. 1958-1968, 2017.

[9] S. I. Protze, J. H. Lee, и G. M. Keller, «Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications», Cell Stem Cell, т. 25, вып. 3, сс. 311-327, 2019.

[10] K. Andrysiak, J. St<?pniewski, и J. Dulak, «Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, 3D cardiac structures, and heart-on-a-chip as tools for drug

research», Pflugers Arch, т. 473, вып. 7, сс. 1061-1085, июл. 2021, doi: 10.1007/s00424-021-02536-z.

[11] K. Ronaldson-Bouchard и др., «Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells», Nature, т. 556, вып. 7700, сс. 239-243, апр. 2018, doi: 10.1038/s41586-018-0016-3.

[12] E. Karbassi и др., «Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine», Nat Rev Cardiol, т. 17, вып. 6, сс. 341-359, июн. 2020, doi: 10.1038/s41569-019-0331-x.

[13] A. Cocco и A. Albanese, «Recent developments in clinical trials of botulinum neurotoxins», Toxicon, т. 147, сс. 77-83, июн. 2018, doi: 10.1016/j.toxicon.2017.08.014.

[14] M. Tsuboi, Y. Furukawa, F. Kurogouchi, K. Nakajima, M. Hirose, и S. Chiba, «Botulinum neurotoxin A blocks cholinergic ganglionic neurotransmission in the dog heart», Jpn J Pharmacol, т. 89, вып. 3, сс. 249-254, июл. 2002, doi: 10.1254/jjp.89.249.

[15] S. Oh, E.-K. Choi, и Y.-S. Choi, «Short-term autonomic denervation of the atria using botulinum toxin», Korean Circ J, т. 40, вып. 8, сс. 387-390, авг. 2010, doi: 10.4070/kcj.2010.40.8.387.

[16] E. Pokushalov и др., «Botulinum toxin injection in epicardial fat pads can prevent recurrences of atrial fibrillation after cardiac surgery: results of a randomized pilot study», J Am Coll Cardiol, т. 64, вып. 6, сс. 628-629, авг. 2014, doi: 10.1016/j.jacc.2014.04.062.

[17] E. Pokushalov и др., «Long-Term Suppression of Atrial Fibrillation by Botulinum Toxin Injection Into Epicardial Fat Pads in Patients Undergoing Cardiac Surgery: One-Year Follow-Up of a Randomized Pilot Study», Circ Arrhythm Electrophysiol, т. 8, вып. 6, сс. 1334-1341, дек. 2015, doi: 10.1161/CIRCEP.115.003199.

[18] Ш. Р. Фролова, "Исследование модуляции активности потенциалзависимых ионных каналов человеческих кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК пациент-специфичных линий, и неонатальных желудочковых

кардиомиоцитов крыс с помощью электрофизиологического метода пэтч-кламп": дис. канд. биол. наук: 03.01.02: защищена 23.12.19 / Автор Шейда Рауф кызы Фролова. - Долгопрудный, 2019.

[19] RU2394815C2 - нитроксисукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина (варианты использования) и способ его получения.

[20] Т. Н. Богатыренко, З. В. Куроптева, Л. М. Байдер, В. Р. Богатыренко, и Д. В. Мищенко, «Нитроксисукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина -гибридная структура с полифункциональным действием», Известия Академии Наук. Серия Химическая, вып. 10, 2020.

[21] F. G. Akar и D. S. Rosenbaum, «Transmural electrophysiological heterogeneities underlying arrhythmogenesis in heart failure», Circ Res, т. 93, вып. 7, сс. 638-645, окт. 2003, doi: 10.1161/01.RES.0000092248.59479.AE.

[22] N. Jost и др., «Ionic mechanisms limiting cardiac repolarization reserve in humans compared to dogs», J Physiol, т. 591, вып. 17, сс. 4189-4206, сен. 2013, doi: 10.1113/j physiol .2013.261198.

[23] Y. Sakakibara и др., «Characterization of the sodium current in single human atrial myocytes.», Circ Res, т. 71, вып. 3, сс. 535-546, сен. 1992, doi: 10.1161/01.RES.71.3.535.

[24] E. Wettwer и др., «The new antiarrhythmic drug vernakalant: ex vivo study of human atrial tissue from sinus rhythm and chronic atrial fibrillation», Cardiovasc Res, т. 98, вып. 1, сс. 145-154, апр. 2013, doi: 10.1093/cvr/cvt006.

[25] S. Blechschmidt, V. Haufe, K. Benndorf, и T. Zimmer, «Voltage-gated Na+ channel transcript patterns in the mammalian heart are species-dependent», Progress in biophysics and molecular biology, т. 98, вып. 2-3, сс. 309-318, 2008.

[26] T. O'Hara, L. Virag, A. Varro, и Y. Rudy, «Simulation of the undiseased human cardiac ventricular action potential: model formulation and experimental validation», PLoS Comput Biol, т. 7, вып. 5, с. e1002061, май 2011, doi: 10.1371/journal.pcbi. 1002061.

[27] G. A. Peeters и др., «Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies», American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, т. 268, вып. 4, сс. H1757-H1764, апр. 1995, doi: 10.1152/ajpheart.1995.268.4.H1757.

[28] S. D. Bird и др., «The human adult cardiomyocyte phenotype», Cardiovasc Res, т. 58, вып. 2, сс. 423-434, май 2003, doi: 10.1016/s0008-6363(03)00253-0.

[29] V. Bistola и др., «Long-term primary cultures of human adult atrial cardiac myocytes: Cell viability, structural properties and BNP secretion in vitro», International Journal of Cardiology, т. 131, вып. 1, сс. 113-122, дек. 2008, doi: 10.1016/j.ijcard.2007.10.058.

[30] N. Voigt, C. M. Pearman, D. Dobrev, и K. M. Dibb, «Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans», Journal of Molecular and Cellular Cardiology, т. 86, сс. 187-198, сен. 2015, doi: 10.1016/j.yjmcc.2015.07.006.

[31] B. Zhou и др., «Functional isolation, culture and cryopreservation of adult human primary cardiomyocytes», Sig Transduct Target Ther, т. 7, вып. 1, Art. вып. 1, июл. 2022, doi: 10.1038/s41392-022-01044-5.

[32] RU2749986C1 - Д. В. Шумаков, К. И. Агладзе, Д. И. Зыбин, М. А. Попов, Ш. Р. кызы Фролова, и С. Г. Романова, «Method for isolation of cardiomyocytes from human heart tissue», 21 июнь 2021 г.

[33] N. Jimenez-Tellez и S. C. Greenway, «Cellular models for human cardiomyopathy: What is the best option?», World J Cardiol, т. 11, вып. 10, сс. 221-235, окт. 2019, doi: 10.4330/wjc.v11.i10.221.

[34] Z. G. Ferguson, D. E. Yarborough, B. L. Jarvis, и J. J. Sistino, «Evidence-based medicine and myocardial protection—where is the evidence?», Perfusion, т. 30, вып. 5, сс. 415-422, июл. 2015, doi: 10.1177/0267659114551856.

[35] B. Stinner, E. Krohn, M. M. Gebhard, и H. J. Bretschneider, «Intracellular sodium activity and Bretschneider's cardioplegia: continuous measurement by ion-selective microelectrodes at initial equilibration», Basic Res Cardiol, т. 84, вып. 2, сс. 197207, 1989, doi: 10.1007/BF01907929.

[36] E. Krohn, B. Stinner, M. Fleckenstein, M. M. Gebhard, и H. J. Bretschneider, «The cardioplegia solution HTK: effects on membrane potential, intracellular K+ and Na+ activities in sheep cardiac Purkinje fibres», Pflugers Arch, т. 415, вып. 3, сс. 269275, дек. 1989, doi: 10.1007/BF00370876.

[37] J. Pignac, J. Bourgouin, и L. Dumont, «Cold cardioplegia and the K+ channel modulator aprikalim (RP 52891): improved cardioprotection in isolated ischemic rabbit hearts», Can J Physiol Pharmacol, т. 72, вып. 2, сс. 126-132, фев. 1994, doi: 10.1139/y94-020.

[38] Дудель Й., Рюэгг Й., Шмидт Р. и др. Физиология человека: в 3-х томах. Пер. с англ = Human Physiology / Под ред. Р. Шмидта, Г. Тевса. — 3-е изд.. — М.: Мир, 2005. — Т. 2. — 314 с. — 1000 экз. — ISBN 5-03-003576-1.

[39] Чазов Е.И. Болезни сердца и сосудов. Руководство для врачей в четырех томах. Том 3.

[40] J. M. Nerbonne и R. S. Kass, «Molecular physiology of cardiac repolarization», Physiol Rev, т. 85, вып. 4, сс. 1205-1253, окт. 2005, doi: 10.1152/physrev.00002.2005.