Изучение механизмов возникновения сердечных аритмий под воздействием химических веществ in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Подгурская Алиса Дмитриевна

• Подгурская Алиса Дмитриевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Подгурская Алиса Дмитриевна

Введение

Актуальность и разработанность темы исследования

Цель и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации

Структура и объем работы

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Основы работы сердца

1.2. Исследование сердечной активности на многоклеточном уровне

1.3. Кардиотоксичность лекарственных средств, существующие методы тестирования in vitro

1.4. Оптическое картирование

1.4.5. Скорость проводимости, калиевые и натриевые каналы, щелевые контакты

1.5. Сердечные аритмии и функциональное ре-ентри

1.6. Невозбудимые препятствия. Критический радиус кривизны фронта волны возбуждения

1.7. Этанол и гептанол

1.8. Ацетальдегид

1.9. Возникновение аритмий под влиянием эритромицина в клинике. Влияние эритромицина на ионные каналы

1.10. Существующие клеточные системы для исследования кардиотоксичности эритромицина in vitro

1.10.1. Тестирования кардиотоксичности на человеческих кардиомиоцитах, полученных из коммерческих ИПСК

1.10.2. Тестирования кардиотоксичности на человеческих кардиомиоцитах, полученных из ИПСК пациентов

1.10.3. Сравнение тестирований на кардиомиоцитах, полученных из ИПСК. Кардиотоксичность эритромицина

1.10.4. Возникновение аритмий под влиянием дифенгидрамина в клинике. Исследования дифенгидрамина in vitro. Влияние дифенгидрамина на ионные каналы

1.11. Возникновение аритмий под влиянием противоопухолевого препарата циклофосфамида в клинике. Метаболизм циклофосфамида и роль метаболитов в индуцировании кардиотоксичности. Исследования циклофосфамида in vitro

1.12. Рефралон

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Список реактивов для выделения и ведения культуры первичных

неонатальных кардиомиоцитов крыс

2.1.2. Список реактивов и рабочих растворов для проведения экспериментов по оптическому картированию

2.1.3. Список реактивов и рабочих растворов для иммуноцитохимии и конфокальной микроскопии

2.1.4. Список исследуемых лекарственных средств

2.1.5. Приготовление рабочих растворов лекарственных средств:

2.2. Оборудование

2.2.1 Оборудование для выделения и ведения культуры первичных неонатальных кардиомиоцитов крыс

2.2.2 Оборудование для экспериментов по оптическому картированию и конфокальной микроскопии

2.3. Методы и протоколы выделения клеток, оптического картирования, иммуноцитохимии и конфокальной микроскопии

2.3.1. Подготовка образцов

2.3.2. Выделение кардиомиоцитов из неонатальных крыс

2.3.3. Ведение первичной клеточной культуры неонатальных кардиомиоцитов крыс

2.3.4. Кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток здорового донора

2.3.5. Оптическое картирование

2.3.5.1. Окрашивание флуоресцентным кальций-зависимым красителем

2.3.5.2. Протокол проведения экспериментов по измерению скорости распространения волны возбуждения в монослое кардиомиоцитов

2.3.5.3. Протокол проведения экспериментов по измерению максимальной усваиваемой частоты монослоя кардиомиоцитов

2.3.5.4. Измерение критического радиуса кривизны фронта волны возбуждения

2.3.5.5. Экспериментальное моделирование отрыва волны возбуждения от острого конца препятствия

2.3.6. Протокол фиксации, иммунофлуоресцентного окрашивания и конфокальной микроскопии

2.4. Обработка данных и статистика

Глава 3. Влияние гептанола, этанола и ацетальдегида на распространение волн

возбуждения

3.1. Влияние гептанола, этанола на распространение волн возбуждения

3.2. Влияние ацетальдегида на распространение волн возбуждения

Глава 4. Влияние лекарственных веществ, ингибирующих потенциал-зависимые ионные токи, на скорость проводимости, максимальную усваиваемую частоту и формирование ре-ентри в монослоях кардиомиоцитов, полученных из ИПСК здорового донора, и монослоях неонатальных крысиных кардиомиоцитов

4.1. Эффективность направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток линии m34Sk3 в кардиомиоциты

4.2. Негативный контроль

4.3. Оптическое картирование монослоев человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 здорового донора, и монослоев неонатальных крысиных кардиомиоцитов под действием эритромицина

4.4. Оптическое картирование монослоев кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 и линии ISMA6L от здоровых доноров, под действием дифенгидрамина

4.5. Оптическое картирование монослоев кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 от здорового донора, и монослоев неонатальных крысиных кардиомиоцитов под действием рефралона

Глава 5. Механизм возникновения аритмии in vitro при влиянии циклофосфамида с использованием кардиомиоцитов, полученных из ИПСК здорового донора линии m34sk3, и неонатальных крысиных кардиомиоцитов

5.1. Оптическое картирование монослоев человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 здорового донора, и монослоев неонатальных крысиных кардиомиоцитов под действием циклофосфамида

Глава 6. Обсуждение результатов

6.1. Гептанол, этанол и ацетальдегид

6.2. Эритромицин

6.3. Дифенгидрамин

6.4. Рефралон

6.5. Циклофосфамид

Выводы

Заключение

Публикации автора

Благодарности

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов возникновения сердечных аритмий под воздействием химических веществ in vitro»

Введение

Актуальность и разработанность темы исследования

Ведущей причиной смертности за 2020 год в России выступают болезни системы кровообращения, в том числе сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). Одной из основных причин возникновения ССЗ является аритмия. Данный диагноз может быть поставлен врачом при возникновении любого, отличного от нормального, сердечного ритма. Потому диагноз «аритмия» включает в себя целый ряд патологий, различных по клиническим проявлениям и механизмам образования. Часть данных патологий может быть смертельно опасна.

Лечение и, главным образом, предотвращение аритмий осложняется тем, что данное заболевание могут провоцировать те препараты, которые не имеют прямого отношения к работе сердца - антибиотики, антидепрессанты и др., что носит название кардиотоксичности лекарственных средств. В связи с этим управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (англ. Food and Drug Administration, FDA) в 2005 году были введены руководства ICH S7B и E14 для предотвращения появления на рынке потенциально аритмогенных препаратов. Данные руководства также ограничили разработку лекарств, сосредоточив внимание на блокаде hERG и удлинении интервала QT in vivo как основных критериев для развития аритмии. В 2013 году была выдвинута инициатива комплексного анализа проаритмии in vitro (англ. «CiPA»), призванная оценивать наличие кардиотоксичности лекарственного средства на основе электрофизиологического понимания про-аритмии. Она состоит из двух основных компонент: 1. Изучение эффектов лекарств in vitro, оказываемых на различные ионные каналы кардиомиоцитов, с дальнейшим их учетом для реконструкции желудочкового потенциала действия in silico, 2. Подтверждение найденных при помощи п.1 негативных эффектов на кардиомиоцитах, полученных из ИПСК человека. Также в 2013 году в Японии был собран консорциум по оценке сердечного риска с использованием человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) (англ. «CSAHi») [1]. По результатам

консорциума были проведены исследования и в 2019 году было показано, что тестирования на кардиомиоцитах, получаемых из ИПСК, с применением микроэлектродных матриц, анализа импеданса, визуализации движения клеток с помощью микроскопа (англ. Motion Field Imaging), визуализации транзиторного изменения внутриклеточного уровня кальция более релевантны по отношению к человеку, чем тестирования с оценкой ингибирования каналов hERG, изменения длительности потенциала действия или использованием препаратов Лангендорфа. Также на основании нескольких консорциумов, в том числе CiPA и the Japanese iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA), в 2019 году была показана применимость кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, с применением микроэлектродных матриц для оценки торзадогенного потенциала разрабатываемых лекарственных средств. Кроме того, было подчеркнуто, что сократительная способность является ключевым вопросом безопасности при разработке лекарств, и были предприняты усилия по измерению сократительной способности с помощью различных методов визуализации с использованием кардиомиоцитов, полученных из ИПСК. Таким образом, кардиомиоциты, полученные из ИПСК, могут представлять собой стандартный инструмент тестирования для оценки проаритмического и сократительного потенциалов.

При должном учете особенностей клеток данного типа (необходимо подтверждать их зрелость, а также приближать существующие модели к реальной человеческой ткани посредством смешения различных типов сердечных клеток в правильных пропорциях и создания тканево-инженерных конструктов), кардиомиоциты, получаемые из ИПСК, с 2013 года являются главной потенциальной моделью для доклинического тестирования кардиотоксичности лекарственных средств.

Наряду с выбором клеточного материала, необходимым этапом в решении проблемы кардиотоксичности лекарственных средств остается разработка достоверных и полноценных методов тестирования.

Тестирования кардиотоксичности in vitro, разрабатываемые различными группами исследователей, на данный момент включают в себя оценку действия

лекарств на ионные токи и проведение возбуждения в многоклеточных системах с помощью микроэлектродных матриц, измерений импеданса, оптических меток изменения мембранного потенциала и концентрации ионов кальция, оценки изменения длительности полевого потенциала, а также оптогенетических методов. Открытие ИПСК дало существенный прорыв в данной области. Теперь подобные системы используются с применением человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, что значительно приблизило изучаемые эффекты веществ in vitro к эффектам на реальных человеческих живых системах.

Для изучения механизмов возникновения сердечных аритмий используются методы электрофизиологии, оптическое картирование, также изучается связь (англ. «coupling») между возбуждением и сокращением. Данная связь критична для правильной работы сердца, и она подвергается воздействию при патологиях. Центральным компонентом в поддержании этой связи является кальций, вторичный мессенджер. При нарушении клеточного кальциевого гомеостаза возникают нарушение сократимости и аритмии. Изменение уровня кальция изучают с помощью флуоресцентных кальций-зависимых красителей, а также генетически кодируемых встроенных кальциевых индикаторов, но последние имеют медленный отклик и их использование в оптическом картировании на данный момент ограничено.

Оптическое картирование сердца базировано на оптической детекции флуоресценции. Метод позволяет визуализировать электрические функции сердца/многоклеточных систем из сердечных клеток с высоким пространственно-временным разрешением, которое превосходит разрешение электродных методов. За счет этого оптическое картирование позволяет визуализировать волну возбуждения и видеть отклик возбудимой системы (например, монослоя кардиомиоцитов) в реальном времени. Таким образом, данный метод с использованием кальций-зависимого красителя занимает определенное место в изучении кардиотоксичности лекарственных средств и может быть использован для 1. Оценки воздействия химических веществ на потенциал-зависимые ионные каналы и щелевые контакты; 2. Для изучения и управления фронтом волны

возбуждения, в том числе для изучения спиральных волн (ре-ентри), появление которых является достаточным условием для возникновения аритмий; 3. Для моделирования аритмий. Первые два пункта реализованы в данной работе для изучения влияния химических веществ гептанола, этанола и ацетальдегида, и лекарственных средств антибиотика эритромицина, антигистаминного препарата дифенгидрамина, антиаритмического препарата рефралона и противоопухолевого препарата циклофосфамида на характеристики проводимости.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучить характеристики проводимости in vitro под воздействием гептанола, этанола, эритромицина, дифенгидрамина, циклофосфамида методом оптического картирования, а также установить связь с их влиянием на потенциал-зависимые ионные каналы и щелевые контакты.

Задачи исследования:

• С использованием гептанола и этанола, ввести критерий для оценки воздействия на потенциал-зависимые ионные каналы и щелевые контакты на основании данных о скорости проводимости и значении критического радиуса кривизны фронта волны возбуждения в монослое неонатальных крысиных кардиомиоцитов

• Сравнить воздействие лекарственных веществ разных терапевтических групп (эритромицина, дифенгидрамина и циклофосфамида) на скорость проводимости, максимальную усваиваемую частоту монослоя человеческих КМ, полученных из ИПСК здорового донора линии m34sk3, валидировать полученные эффекты на модели неонатальных крысиных кардиомиоцитов или на модели человеческих КМ, полученных из ИПСК здорового донора другой клеточной линии

• Оценить вероятность возникновения ре-ентри на остром конце линейного препятствия под действием эритромицина, дифенгидрамина и циклофосфамида в монослое человеческих КМ, полученных из ИПСК здорового донора

• Объяснить связь между полученными изменениями характеристик проводимости и ингибированием потенциал-зависимых ионных каналов и щелевых контактов под влиянием эритромицина, дифенгидрамина и циклофосфамида

Научная новизна

Впервые оценен дозозависимый относительный вклад межклеточного разобщения и увеличения порога активации в модуляцию скорости проводимости под влиянием гептанола и показана дозозависимая модуляция скорости проводимости под влиянием этанола.

Впервые оценены следующие характеристики проводимости: скорость, максимальная усваиваемая частота, формирование ре-ентри на остром конце линейного препятствия под влиянием эритромицина, дифенгидрамина и циклофосфамида в зависимости от дозы in vitro. Показана применимость данного метода для оценки влияния данных веществ на потенциал-зависимые каналы и щелевые контакты с использованием двух клеточных экспериментальных моделей: монослоя кардиомиоцитов, полученных из ИПСК здорового донора, и монослоя неонатальных крысиных кардиомиоцитов. Впервые показано разрушительное воздействие циклофосфамида на цитоскелет кардиомиоцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данная работа позволила выявить ранее неизвестные зависимости скорости проводимости от концентраций гептанола и этанола. Используемый метод оценки критического радиуса кривизны фронта волны возбуждения позволяет определять относительный вклад воздействия химического вещества на щелевые контакты и потенциал-зависимые ионные каналы, что позволит моделировать аритмии in vitro.

Работа позволила выявить ранее неизвестные значения характеристик проводимости (скорость, максимальная усваиваемая частота, вероятность формирования ре-ентри на остром конце линейного препятствия) под влиянием эритромицина, дифенгидрамина и циклофосфамида. Двумерная

экспериментальная модель - монослой кардиомиоцитов, полученных из ИПСК здорового донора, приближена к реальной сердечной ткани пациента, что позволило дополнить известные данные о кардиотоксичности данных лекарственных средств и раскрыть механизм образования аритмий под их воздействием in vitro. Данному исследованию можно найти применение в медицине и разработке лекарственных средств.

Методология и методы исследования

Основным методом, использованным в данной работе, является метод оптического картирования монослоя кардиомиоцитов с флуоресцентным кальций-зависимым красителем Fluo-4. Для исследования использовались пациент-специфичные кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) здоровых доноров, а также неонатальные крысиные кардиомиоциты. Основной моделью являлся монослой кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 от здорового донора, и показана применимость метода оптического картирования для получения следующих характеристик: скорость проводимости, максимальная усваиваемая частота, вероятность возникновения ре-ентри (спиральных волн) на остром конце линейного препятствия на данной модели для изучения механизмов возникновения аритмий при воздействии лекарственных веществ in vitro. Также использовался метод оценки критического радиуса кривизны фронта волны возбуждения на основе модели с препятствиями в виде узких «воротец». Две упомянутых модели оптического картирования с препятствиями основаны на исследованиях Fast и соавт. [2], Kleber и соавт. [3] и Kadota и соавт. [4].

Получаемые данные (видео оптического картирования) обрабатывались вручную в программах ImageJ, Exel для получения значений скоростей проводимости и максимальных усваиваемых частот. Программное обеспечение Wolfram Mathematica использовалось для построения активационных карт и изучения наличия волн ре-ентри. Статистическая обработка осуществлялась с

помощью одностороннего ANOVA, с последующим методом группирования выборок с наименее значимой разницей Фишера для межгрупповых сравнений. Результаты считались статистически значимыми приp < 0,05.

Для раскрытия механизма нарушения проводимости при влиянии циклофосфамидом использовались методы иммуноцитохимии, конфокальной микроскопии.

Положения, выносимые на публичное представление

1. Гептанол (0,1-0,9 мМ) и этанол (17-614 мМ) дозозависимо уменьшают скорость проводимости и различно действуют на величину критического радиуса кривизны фронта волны возбуждения в монослое неонатальных крысиных кардиомиоцитов.

2. Эритромицин (15-45 цМ) уменьшает скорость проводимости незначительно, максимально на 12±9%, уменьшает максимальную усваиваемую частоту максимально на 28±12% и вызывает ре-ентри на остром конце линейного препятствия в 33% случаев в монослое человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК здорового донора линии m34Sk3. Обнаружено отсутствие перечисленных эффектов эритромицина при воздействии на монослой неонатальных крысиных кардиомиоцитов.

3. Дифенгидрамин (0,3-16 цМ) уменьшает скорость проводимости максимально на 47±18%, уменьшает максимальную усваиваемую частоту максимально на 48±12% и вызывает ре-ентри на остром конце линейного препятствия в 50% случаев в монослое человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК здорового донора линии m34Sk3.

4. Циклофосфамид (213-852 цМ) не влияет на скорость проводимости в пределах погрешности, уменьшает максимальную усваиваемую частоту максимально на 25±7%, не вызывает ре-ентри на остром конце линейного препятствия в монослое человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК здорового донора линии m34Sk3. Циклофосфамид не влияет на

скорость проводимости в пределах погрешности, уменьшает максимальную усваиваемую частоту максимально на 33±9% на модели неонатальных крысиных кардиомиоцитов. Обнаружено дозозависимое уменьшение площади проводимости монослоя кардиомиоцитов при влиянии (213-852 цМ) циклофосфамида и разрушение а-актинина при воздействии 213 цМ циклофосфамида на изолированные ИПСК-КМ линии m34Sk3 и НККМ до 30 минут.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов подтверждается их получением на современном сертифицированном оборудовании. Результаты получены согласно адаптированным международным протоколам, сравнены с литературными данными. Полученные результаты прошли рецензирование в международных журналах, докладывались на российских и международных конференциях:

1. II Международная конференция ФизтехМед 2015;

2. 58-я научная конференция МФТИ (Долгопрудный 2015);

3. Российская конференция с международным участием «Экспериментальная и компьютерная биомедицина», Екатеринбург, Россия 2016;

4. Форум Биомедицина-2016, Новосибирск, Россия;

5. II Всероссийский форум «Наука будущего - наука молодых» (Россия Казань 2016);

6. 59-я научная конференция МФТИ (Долгопрудный 2016);

7. StemCellBio 2018: фундаментальная наука как основа трансляционной медицины, г. Санкт-Петербург;

8. Форум «Наука будущего - наука молодых 2019», г. Сочи;

9. Cardiac Mechano-Electric Coupling and Arrhythmias 2019, Freiburg, Germany;

10. Ежегодный саммит молодых ученых и инженеров «Большие вызовы для общества, государства и науки» (28.10.2019 - 03.11.2019), г. Сочи;

11. Конференция 62 МФТИ (18.11.2019-24.11.2019), г. Долгопрудный;

12. Научно-практическая конференция ученых России и Хорватии 2020, г. Москва, МИСиС;

13. Научная конференция "OpenBio 2020", г. Новосибирск, наукоград Кольцово.

Публикации

Результаты диссертации опубликованы в 18 печатных работах, 5 из которых — статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus, 13 из которых — тезисы докладов российских и международных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, изложенных в трех главах, обсуждения результатов исследований, выводов, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков, 5 таблиц. Список литературы состоит из 135 источников.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Основы работы сердца

Основой работы сердца является его ритмичное сокращение. Его обеспечивает волна возбуждения (ВВ). При нарушении распространения ВВ по сердцу предсердия и желудочки начинают сокращаться несогласованно, что приводит к возникновению аритмии. Подобные изменения ритма можно увидеть на ЭКГ, которая позволяет оценить работу человеческого сердца в норме и патологии.

На клеточном уровне, сердечное возбуждение включает в себя два процесса: формирование потенциала действия (ПД) отдельными сердечными клетками (кардиомиоцитами) и распространение ПД от клетки к клетке через щелевые контакты.

В покое внутренняя поверхность мембраны кардиомиоцита заряжена отрицательно. При подводе к клетке электрического заряда извне (например, от соседних клеток) в виде поступающих в кардиомиоцит положительно заряженных ионов натрия, заряд мембраны резко меняется на положительный (рис. 1, фаза 0) -этот процесс носит название деполяризации. Натриевые каналы временно переходят в инактивированное состояние, и клетка находится в периоде абсолютной рефрактерности, когда исключено возникновение повторного возбуждения в ответ на внешние раздражители. Далее из клетки выходят ионы калия, приводя к быстрой начальной реполяризации (рис. 1, фаза 1). Уравновешивая ток ионов калия, входящий в клетку кальций запускает процесс высвобождения связанного кальция из саркоплазматического ретикулума клетки. Формируется так называемое кальциевое плато на ПД (рис. 1, фаза 2). По мере инактивации кальциевых каналов баланс сдвигается в сторону доминирования выходящего калия из клетки, и наступает фаза быстрой конечной реполяризации (рис. 1 , фаза 3). Таким образом, заряд мембраны возвращается к изначальному значению (потенциалу покоя), а клетка находится в состоянии относительной

рефрактерности, когда возникновение повторного возбуждения возможно лишь в ответ на сверхпороговые раздражители. Это обусловлено переходом натриевых каналов из инактивированного в закрытое состояние. При достижении мембранного потенциала покоя наступает фаза 4 (рис. 1).

Рисунок 1. Потенциал действия рабочего кардиомиоцита желудочков. Кривая показывает зависимость значения потенциала мембраны от времени. Цифрами вдоль кривой обозначены фазы ПД. Ниже показаны входящие и выходящие из клетки ионы в соответствии с фазами ПД [5].

Комбинация генерации ПД и его передачи с помощью потока электрических зарядов относится к классу реакционно-диффузионных процессов [6]. Генерация ПД осуществляется за счет нелинейных ионных токов в мембране сердечной клетки и ее ионного окружения. Основной упор в исследовании электрофизиологии сердца делается на исследование структуры, кинетики и регуляции ионных каналов, проводящих вышеуказанные токи. Важным является изучение распространения ПД на многоклеточном уровне в физиологических и патофизиологических условиях.

А

Внеклеточная среда

Ма+ Са2+

Внутриклеточная среда

1.2. Исследование сердечной активности на многоклеточном уровне

Для изучения функционирования сердца в физиологических и патофизиологических условиях важным является исследование распространения ВВ на многоклеточном уровне.

Одна из трехмерных моделей, разработанная еще в 1895 году — это препарат Лангендорфа [7], который представляет собой изолированное сердце, как правило, животных - крысы или курицы, через которое прокачивают перфузионную жидкость и наблюдают изменение сократительной активности, снимают ЭКГ.

Важным открытием в данной области явилось использование конфлюэнтных монослоев сердечных клеток, двумерная модель сердечной ткани. Эта модель была открыта Вильгемом Роу в 1885 году. Выделение клеток и ведение клеточной культуры является трудоемким процессом, при котором необходимо создать условия, максимально приближенные к реальным, естественным для данного типа клеток условиям окружающей среды. Так, клетки, выделенные непосредственно из живого организма (органов), называют первичными. Клетки, полученные из опухолей, и клетки живых организмов, модифицированные методами генной инженерии так, чтобы непрерывно пролиферировать, называют иммортализованными. Культура первичных клеток ограничена в использовании, когда как иммортализованные клеточные линии способны жить «бесконечно» при создании необходимых для них условий (температура, питательная среда и т. п.).

Для исследования сердечной активности in vitro широкое распространение получили монослои крысиных кардиомиоцитов. Однако данная модель обладает существенным недостатком, который заключается в низкой плотности тока IKr, что позволяет использовать данную модель с существенными ограничениями. Для приближения биологических моделей in vitro к реальному человеческому сердцу используются: 1. Изолированные кардиомиоциты взрослого человека; 2. Клетки, трансфецированные необходимыми для исследования белками (в т.ч. присущими

сердечным клеткам человека); 3. Срезы сердца реальных пациентов; 4. Кардиомиоциты, полученные из ИПСК человека.

1.3. Кардиотоксичность лекарственных средств, существующие методы

тестирования in vitro

Методы тестирования кардиотоксичности с использованием клеток животных не дают полного представления о фундаментальных биологических процессах и откликах сердечных клеток миокарда человека. В связи с этим в США, Европе и Японии разрабатываются методы тестирования с использованием КМ, полученных из ИПСК. Такие модели могут позволить оценить сократительные и электрофизиологические дисфункции, структурные изменения, и сделать возможной разработку лекарств без побочных эффектов и приблизить методы лечения к персонализированным [8].

Существует ряд платформ, основанных на регистрации полевых потенциалов и клеточного импеданса КМ, получаемых из ИПСК. Особенностью данного типа клеток является стабильная спонтанная активность, которую изучают данными методами. Изменение длительности полевого потенциала дает косвенную оценку длительности потенциала действия и пролонгации интервала QT, а амплитуда «спайка» полевого потенциала — это показатель ингибирования канала Nav1.5. Импедансные измерения клеток позволяют оценить: частоту сокращений, аритмичные биения, ранние постдеполяризации, появление пиков «notch». Суммарный импедансный сигнал дает «клеточный индекс», который может служить оценкой исходного качества получаемых клеток, дает возможность оценить общие повреждения клеток (без определения структурных клеточных элементов) под воздействием лекарственных веществ. По форме сигнала импеданса можно оценить сократимость кардиомиоцитов [9].

1.4. Оптическое картирование

Оптические методы широко распространены и в основном применяются на клеточном и субклеточном уровнях и значительно в меньшей степени к физиологии целого сердца. Для динамического отображения физиологических процессов в неповрежденных сердцах оптическими методами существуют многочисленные технические трудности. Проблемы артефактов сокращения, клеточных неоднородностей, пространственного и временного разрешения, ограничений глубины резкости и др. [10].

Из-за своей актуальности в кардиологических исследованиях эта технология визуализации развивается быстрыми темпами. Ключевые компоненты современной системы оптического картирования in vitro, которые развиваются по сей день: (1) камера; (2) светодиоды и источники света; (3) оптические фильтры; (4) флуоресцентные метки (Рисунок 2) [11].

Образец

Рисунок 2. Принципиальная схема оптического картирования монослоя кардиомиоцитов. Оптический сигнал, зарегистрированный при помощи матрицы высокочувствительной камеры, выводится на компьютер.

1.4.5. Скорость проводимости, калиевые и натриевые каналы, щелевые контакты

В 1875 году Теодор Вильгельм Энгельманн установил, что в полосах атриальной мыщцы лягушки распространяется электрический импульс [12]. Только через 39 лет после этого доктором Томасом Льюисом впервые была измерена скорость проводимости в сердце [13]. Скорость проводимости -первичная характеристика, которая говорит о распространении электрических импульсов в сердечной мышце. Скорость проводимости в сердце имеет различные значения в зависимости от того, распространяется ли импульс вдоль или поперек волокон сердечной ткани.

Калиевые ионные каналы отвечают за установление мембранного потенциала покоя и реполяризацию мембраны, когда она деполяризована. Изменения калиевых токов в кардиомиоцитах могут оказывать эффект на скорость проводимости и ее зависимость от натриевого тока, независимо от изменений мембранного потенциала покоя. Так, частичное ингибирование IK1 может увеличить скорость проводимости при нормальных физиологических условиях, если при этом не нарушена доступность натриевых каналов [14]. С другой стороны, фармакологическая активация токов IKatp и IKs уменьшает скорость проводимости при нормальных физиологических условиях. Активация только IKs уменьшает скорость проводимости только если доступность натриевых каналов уменьшена [15]. Таким образом, модуляция независимых от потенциала калиевых токов влияет на проводимость только тогда, когда доступность натриевых каналов сохранена. Модуляция потенциал-зависимых калиевых токов влияет на значение скорости проводимости независимо от доступности натриевых каналов. Кроме того, исследования говорят о созависимости экспрессии калиевых каналов Kir 2.1 и натриевых каналов Nav 1.5 [16].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Подгурская Алиса Дмитриевна, 2021 год

Список литературы

1. Takasuna K., Kazusa K., Hayakawa T. Comprehensive Cardiac Safety Assessment using hiPS-cardiomyocytes (Consortium for Safety Assessment using Human iPS Cells: CSAHi) // Curr. Pharm. Biotechnol. 2019. Vol. 21, № 9.

2. Fast V.G., Kleber A.G. Role of wavefront curvature in propagation of cardiac impulse // Cardiovasc. Res. Oxford Academic, 1997. Vol. 33, № 2. P. 258-271.

3. Kleber A.G., Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias // Physiol. Rev. 2004. Vol. 84, № 2. P. 431-488.

4. Kadota S. et al. Curvature-dependent excitation propagation in cultured cardiac tissue // J Exp Theor Phys. 2011. Vol. 94, № 11. P. 824-830.

5. Рис. 230.2(Harrison). Ионные токи в разные фазы потенциала действия [Electronic resource]. URL: http://humbio.ru/humbio/har3/002cd364.htm (accessed: 26.06.2017).

6. Winfree A.T., Tyson J.J. When Time Breaks Down: The Three-Dimensional Dynamics of Electrochemical Waves and Cardiac Arrhythmias // Phys. Today. 1988. Vol. 41, № 12. P. 107-109.

7. Döring H.J. The isolated perfused heart according to Langendorff technique--function--application. // Physiol. Bohemoslov. 1990. Vol. 39, № 6. P. 481-504.

8. Gintant G. et al. Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Preclinical Cancer Drug Cardiotoxicity Testing: A Scientific Statement From the American Heart Association // Circulation research. NLM (Medline), 2019. Vol. 125, № 10. P. e75-e92.

9. Zhang X. et al. Multi-parametric assessment of cardiomyocyte excitation-contraction coupling using impedance and field potential recording: A tool for cardiac safety assessment // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. Elsevier Inc., 2016. Vol. 81. P. 201-216.

10. Efimov I.R., Nikolski V.P., Salama G. Optical Imaging of the Heart // Circ. Res. Lippincott Williams & Wilkins, 2004. Vol. 95, № 1. P. 21-33.

11. Herron T.J., Lee P., Jalife J. Optical Imaging of Voltage and Calcium in Cardiac

Cells & Tissues // Circ. Res. Lippincott Williams & WilkinsHagerstown, MD, 2012. Vol. 110, № 4. P. 609-623.

12. Th Wilh Engelmann Y. Ueber die Leitung der Erregung im Herzmuskel. Ueber die Leitung 4er Erregung im Herzmuskel ~).

13. The Excitatory Process in the Dog's Heart. Part I. The Auricles on JSTOR [Electronic resource]. URL: https://www.jstor.org/stable/92042 (accessed: 05.09.2021).

14. Veeraraghavan R. et al. Potassium channel activators differentially modulate the effect of sodium channel blockade on cardiac conduction // Acta Physiol. John Wiley & Sons, Ltd, 2013. Vol. 207, № 2. P. 280-289.

15. Veeraraghavan R., Poelzing S. Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge // Cardiovasc. Res. Oxford Academic, 2008. Vol. 77, № 4. P. 749-756.

16. Milstein M.L. et al. Dynamic reciprocity of sodium and potassium channel expression in a macromolecular complex controls cardiac excitability and arrhythmia // Proc. Natl. Acad. Sci. National Academy of Sciences, 2012. Vol. 109, № 31. P. E2134-E2143.

17. Vreeker A. et al. Assembly of the Cardiac Intercalated Disk during Pre- and Postnatal Development of the Human Heart // PLoS One. Public Library of Science, 2014. Vol. 9, № 4. P. e94722.

18. King J.H., Huang C.L.-H., Fraser J.A. Determinants of myocardial conduction velocity: implications for arrhythmogenesis // Front. Physiol. Frontiers, 2013. Vol. 0. P. 154.

19. Gutstein D.E. et al. Conduction Slowing and Sudden Arrhythmic Death in Mice With Cardiac-Restricted Inactivation of Connexin43 // Circ. Res. Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Vol. 88, № 3. P. 333-339.

20. Lu H.R. et al. Predicting drug-induced slowing of conduction and pro-arrhythmia: identifying the 'bad' sodium current blockers // Br. J. Pharmacol. John Wiley & Sons, Ltd, 2010. Vol. 160, № 1. P. 60-76.

21. Yan J. et al. Molecular remodeling of Cx43, but not structural remodeling,

promotes arrhythmias in an arrhythmogenic canine model of nonischemic heart failure // J. Mol. Cell. Cardiol. Academic Press, 2021. Vol. 158. P. 72-81.

22. Campos F.O. et al. Factors Promoting Conduction Slowing as Substrates for Block and Reentry in Infarcted Hearts // Biophys. J. Cell Press, 2019. Vol. 117, № 12. P. 2361-2374.

23. Garrey W.E. AURICULAR FIBRILLATION // Physiol. Rev. 1924. Vol. 4, № 2. P. 215-250.

24. Allessie M.A., Bonke F.I.M., Schopman F.J.G. Circus Movement in Rabbitt Atrial Muscle as a Mechanism of Tachycardia // Circ Res. 1973. Vol. 39, No.2, № July. P. 168-177.

25. Hansen B.J. et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts // Eur. Heart J. 2015. Vol. 36, № 35. P. 2390-2401.

26. de Bakker J. et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. // Circulation. 1988. Vol. 77, № 3. P. 589-606.

27. Winfree A.T. Spiral Waves of Chemical Activity // Science (80-. ). 1972. Vol. 175, № 4022. P. 634-636.

28. Kléber A.G., Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias. // Physiol. Rev. 2004. Vol. 84, № 2. P. 431-488.

29. Cabo C. et al. Wave-front curvature as a cause of slow conduction and block in isolated cardiac muscle. // Circulation. 1994.

30. Aaseb0 W. ECG-voltage in alcoholics and non-alcoholics with acute alcohol intoxication // J. Forensic Leg. Med. 2009. Vol. 16, № 7. P. 381-384.

31. Aaseb0 W. et al. ECG changes in patients with acute ethanol intoxication. // Scand. Cardiovasc. J. 2007. Vol. 41, № October 2006. P. 79-84.

32. Rossinen J. et al. Effects of acute alcohol ingestion on heart rate variability in patients with documented coronary artery disease and stable angina pectoris // Am J Cardiol. 1997. Vol. 79, № 4. P. 487-491.

33. Samokhvalov A. V, Irving H.M., Rehm J. Alcohol consumption as a risk factor

for atrial fibrillation: a systematic review and meta-analysis // Eur. J. Cardiovasc. Prev. Rehabil. Off. J. Eur. Soc. Cardiol. Work. Groups Epidemiol. Prev. Card. Rehabil. Exerc. Physiol. 2010. Vol. 17, № 6. P. 706-712.

34. George A., Figueredo V.M. Alcohol and arrhythmias: a comprehensive review. // J. Cardiovasc. Med. (Hagerstown). 2010. Vol. 11, № 4. P. 221-228.

35. Bébarova M., Horakova Z., Kula R. Addictive drugs, arrhythmias, and cardiac inward rectifiers // Europace. 2016. P. euw071.

36. Deitrich R.A. et al. Mechanism of action of ethanol: initial central nervous system actions. // Pharmacol. Rev. 1989. Vol. 41, № 4.

37. Crews F.T. et al. Effects of Ethanol on Ion Channels. 1996. P. 283-367.

38. Lindemeyer A.K. et al. Alpha 2 subunit-containing GABAA receptor subtypes are up-regulated and contribute to alcohol-induced functional plasticity in rat hippocampus // Mol. Pharmacol. 2017.

39. Laszlo R. et al. Alcohol-induced electrical remodeling: Effects of sustained short-term ethanol infusion on ion currents in rabbit atrium // Alcohol. Clin. Exp. Res. Blackwell Publishing Ltd, 2009. Vol. 33, № 10. P. 1697-1703.

40. Klein G. et al. Effect of ethanol on cardiac single sodium channel gating // Forensic Sci. Int. 2007. Vol. 171, № 2-3. P. 131-135.

41. Habuchi Y. et al. Ethanol inhibition of Ca2+ and Na+ currents in the guinea-pig heart // Eur. J. Pharmacol. Environ. Toxicol. 1995. Vol. 292, № 2. P. 143-149.

42. Himmel H.M. Suitability of commonly used excipients for electrophysiological in-vitro safety pharmacology assessment of effects on hERG potassium current and on rabbit Purkinje fiber action potential // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2007. Vol. 56, № 2. P. 145-158.

43. O'Leary M.E. Inhibition of HERG potassium channels by cocaethylene: A metabolite of cocaine and ethanol // Cardiovasc. Res. 2002. Vol. 53, № 1. P. 5967.

44. Hu H. et al. [Effects of ethanol on action potential of rat myocardium and human Kv1.5 channel] // Sheng Li Xue Bao. 2011. Vol. 63, № 3. P. 219-224.

45. Chen Y. et al. Ethanol Enhances Human Hyperpolarization-Activated Cyclic

Nucleotide-Gated Currents // Alcohol. Clin. Exp. Res. 2012. Vol. 36, № 12. P. 2036-2046.

46. Bébarova M. et al. Effect of ethanol on action potential and ionic membrane currents in rat ventricular myocytes // Acta Physiol. Blackwell Publishing Ltd, 2010. Vol. 200, № 4. P. 301-314.

47. Bebarova M. et al. Effect of ethanol at clinically relevant concentrations on atrial inward rectifier potassium current sensitive to acetylcholine. // Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. 2016. Vol. 389, № 10. P. 1049-1058.

48. Horakova Z. et al. Effect of ethanol and acetaldehyde at clinically relevant concentrations on atrial inward rectifier potassium current IK1: separate and combined effect. // J. Physiol. Pharmacol. 2016. Vol. 67, № 3. P. 339-351.

49. Bebarova M., Matejovic P., Pasek M. Dual Effect of Ethanol on Inward Rectifier Potassium Current I K1 in Rat Ventricular Myocytes // Jpp. 2014. Vol. 1, № 28. P. 497-509.

50. Zhao Y. et al. [Effect of ethanol and its metabolites on acetylcholine-sensitive K(+) channel Kir3.1 protein expression of neonatal rat primary atrial cardiomyocytes]. // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2015. Vol. 43, № 7. P. 609-613.

51. Kamkin A. et al. Electrical interaction of mechanosensitive fibroblasts and myocytes in the heart // Basic Res. Cardiol. Steinkopff-Verlag, 2005. Vol. 100, № 4. P. 337-345.

52. Rozental R., Srinivas M., Spray D.C. How to Close a Gap Junction Channel // Connexin Methods Protoc. New Jersey: Humana Press, 2001. Vol. 154. P. 447476.

53. Garcia-Dorado D. et al. Gap junction uncoupler heptanol prevents cell-to-cell progression of hypercontracture and limits necrosis during myocardial reperfusion // Circulation. 1997. Vol. 96, № 10. P. 3579-3586.

54. Paternostre M., Pichon Y. Effects of N-alcohols on potassium conductance in squid giant axons // Eur. Biophys. J. Springer-Verlag, 1987. Vol. 14, № 5. P. 279288.

55. Peracchia C. Effects of the anesthetics heptanol, halothane and isoflurane on gap junction conductance in crayfish septate axons: A calcium- and hydrogen-independent phenomenon potentiated by caffeine and theophylline, and inhibited by 4-aminopyridine // J. Membr. Biol. Springer-Verlag, 1991. Vol. 121, № 1. P. 67-78.

56. Rudisuli A., Weingart R. Electrical properties of gap junction channels in guinea-pig ventricular cell pairs revealed by exposure to heptanol // Pflugers Arch. Springer-Verlag, 1989. Vol. 415, № 1. P. 12-21.

57. Niggli E. et al. Effects of general anesthetics on current flow across membranes in guinea pig myocytes. // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 256, № 2 Pt 1. P. C273-81.

58. Nelson W.L., Makielski J.C. Block of sodium current by heptanol in voltage-clamped canine cardiac Purkinje cells. // Circ. Res. 1991. Vol. 68, № 4. P. 977983.

59. Takens-Kwak B.R. et al. Mechanism of heptanol-induced uncoupling of cardiac gap junctions: a perforated patch-clamp study. // Am. J. Physiol. 1992. Vol. 262, № 6 Pt 1. P. C1531-C1538.

60. Kimura H. et al. Reversible inhibition of gap junctional intercellular communication, synchronous contraction, and synchronism of intracellular Ca2+ fluctuation in cultured neonatal rat cardiac myocytes by heptanol. // Exp. Cell Res. 1995. Vol. 220, № 2. P. 348-356.

61. Tse G. et al. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts // PLoS One. 2016. Vol. 11, № 2.

62. Saltman A.E. et al. Gap junction uncoupling protects the heart against ischemia // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2002. Vol. 124, № 2. P. 371-376.

63. Brien J.F., Loomis C.W. Pharmacology of acetaldehyde. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1983. Vol. 61, № 1. P. 1-22.

64. Bebarova M., Matejovic P., Simurdova M. Acetaldehyde at Clinically Relevant Concentrations Inhibits Inward Rectifier Potassium Current IA sub K1A in Rat Ventricular Myocytes // Physiological. 2015.

65. Chen F., Momose Y., Yamamura S. Effects of acetaldehyde on membrane

potentials and ionic currents in single cardiac myocytes // Pharm. 1999.

66. Chen F.S. et al. Effects of acetaldehyde on action potentials and ca2+ currents in single atrial myocytes from the bullfrog // Pharmacology. Karger Publishers, 2012. Vol. 90, № 3-4. P. 216-222.

67. Zhao Y. et al. Effect of ethanol and its metabolites on acetylcholine-sensitive K (+) channel Kir3. 1 protein expression of neonatal rat primary atrial cardiomyocytes // Zhonghua xin xue guan bing za. 2015.

68. De Ponti F., Poluzzi E., Montanaro N. QT-interval prolongation by non-cardiac drugs: lessons to be learned from recent experience // Eur. J. Clin. Pharmacol. 2000 561. Springer, 2000. Vol. 56, № 1. P. 1-18.

69. Gibson J.K. et al. Human stem cell-derived cardiomyocytes detect drug-mediated changes in action potentials and ion currents // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. Elsevier, 2014. Vol. 70, № 3. P. 255-267.

70. Guo L. et al. Refining the Human iPSC-Cardiomyocyte Arrhythmic Risk Assessment Model // Toxicol. Sci. 2013. Vol. 136, № 2. P. 581-594.

71. Ray W.A. et al. Oral Erythromycin and the Risk of Sudden Death from Cardiac Causes // N. Engl. J. Med. Massachusetts Medical Society , 2004. Vol. 351, № 11. P. 1089-1096.

72. Itoh H. et al. Latent Genetic Backgrounds and Molecular Pathogenesis in Drug-Induced Long-QT Syndrome // Circ. Arrhythmia Electrophysiol. 2009. Vol. 2, № 5. P. 511-523.

73. Duncan R.S. et al. Erythromycin block of the HERG K+ channel: Accessibility to F656 and Y652 // Biochem. Biophys. Res. Commun. Academic Press, 2006. Vol. 341, № 2. P. 500-506.

74. Antzelevitch C. et al. Cellular and Ionic Mechanisms Underlying Erythromycin-Induced Long QT Intervals and Torsade de Pointes // J. Am. Coll. Cardiol. Journal of the American College of Cardiology, 1996. Vol. 28, № 7. P. 1836-1848.

75. Smits J.P. et al. Cardiac sodium channels and inherited electrophysiologic disorders: a pharmacogenetic overview // Expert Opin. Pharmacother. 2008. Vol. 9, № 4. P. 537-549.

76. Lazzerini P.E. et al. Arrhythmogenicity of Anti-Ro/SSA Antibodies in Patients With Torsades de Pointes // Circ. Arrhythmia Electrophysiol. 2016. Vol. 9, № 4. P. e003419.

77. Yang T. et al. Screening for Acute IKr Block Is Insufficient to Detect Torsades de Pointes Liability: Role of Late Sodium Current // Circulation. 2014. Vol. 130, № 3. P. 224-234.

78. Schulz M., Schmoldt A. Therapeutic and toxic blood concentrations of more than 800 drugs and other xenobiotics. // Pharmazie. 2003. Vol. 58, № 7. P. 447-474.

79. Stanat S.J.C. et al. Characterization of the inhibitory effects of erythromycin and clarithromycin on the HERG potassium channel // Mol. Cell. Biochem. Kluwer Academic Publishers, 2003. Vol. 254, № 1/2. P. 1-7.

80. Guo J. et al. Exaggerated block of hERG (KCNH2) and prolongation of action potential duration by erythromycin at temperatures between 37°C and 42°C // Hear. Rhythm. Elsevier, 2005. Vol. 2, № 8. P. 860-866.

81. Ando H. et al. A new paradigm for drug-induced torsadogenic risk assessment using human iPS cell-derived cardiomyocytes // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2017. Vol. 84. P. 111-127.

82. Huo J. et al. Sex-Related Differences in Drug-Induced QT Prolongation and Torsades de Pointes: A New Model System with Human iPSC-CMs // Toxicol. Sci. 2019. Vol. 167, № 2. P. 360-374.

83. McKeithan W.L. et al. An Automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes // Front. Physiol. Frontiers Media S.A., 2017. Vol. 8, № OCT. P. 766.

84. Lahti A. et al. Model for long QT syndrome type 2 using human iPS cells demonstrates arrhythmogenic characteristics in cell culture // dmm.biologists.org. 2012.

85. Takaki T. et al. Optical Recording of Action Potentials in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Single Cells and Monolayers Generated from Long QT Syndrome Type 1 Patients // Stem Cells Int. Hindawi Limited, 2019. Vol. 2019.

86. Kuusela J. et al. Effects of cardioactive drugs on human induced pluripotent stem cell derived long QT syndrome cardiomyocytes // Springerplus. Springer International Publishing, 2016. Vol. 5, № 1. P. 234.

87. Liu Y. et al. Micropatterned co-culture of cardiac myocytes on fibrous scaffolds for predictive screening of drug cardiotoxicities // Nanoscale. The Royal Society of Chemistry, 2017. Vol. 9, № 15. P. 4950-4962.

88. Shaheen N. et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Cell Sheets Expressing Genetically Encoded Voltage Indicator for Pharmacological and Arrhythmia Studies // Stem Cell Reports. 2018. Vol. 10, № 6. P. 1879-1894.

89. Klimas A. et al. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes // Prog. Biophys. Mol. Biol. Pergamon, 2019.

90. Kuo C.C., Huang R.C., Lou B.S. Inhibition of Na(+) current by diphenhydramine and other diphenyl compounds: molecular determinants of selective binding to the inactivated channels. // Mol. Pharmacol. 2000. Vol. 57, № 1. P. 135-143.

91. Snyder R.D., Ewing D., Hendry L.B. DNA intercalative potential of marketed drugs testing positive in in vitro cytogenetics assays // Mutat. Res. - Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. Elsevier, 2006. Vol. 609, № 1. P. 47-59.

92. Husain Z. et al. Diphenhydramine induced QT prolongation and torsade de pointes: An uncommon effect of a common drug // CASE Rep. Cardiol. J. 2010. Vol. 17, № 5. P. 509-511.

93. JOSHI A.K. et al. Case of Polymorphic Ventricular Tachycardia in Diphenhydramine Poisoning // J. Cardiovasc. Electrophysiol. Blackwell Publishing Inc., 2004. Vol. 15, № 5. P. 591-593.

94. Nishino T. et al. Cardiac arrest caused by diphenhydramine overdose // Acute Med. Surg. Wiley, 2018. Vol. 5, № 4. P. 380-383.

95. Galán Martínez L., Emilio Curbelo González G. Cardiotoxicity of H1-antihistamines // J. Anal. Pharm. Res. MedCrave Group, LLC, 2018. Vol. 7, № 2.

96. Hausmann E. et al. Lethal intoxication with diphenhydramine - Report of a case with analytical follow-up // Arch. Toxicol. Springer-Verlag, 1983. Vol. 53, № 1.

P. 33-39.

97. Sube R., Ertel E.A. Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs // J. Biomed. Sci. Eng. 2017. Vol. 10, № 11. P. 527-549.

98. Kirsch G.E. et al. Variability in the measurement of hERG potassium channel inhibition: Effects of temperature and stimulus pattern // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. Elsevier, 2004. Vol. 50, № 2. P. 93-101.

99. Khalifa M. et al. Block of potassium currents in guinea pig ventricular myocytes and lengthening of cardiac repolarization in man by the histamine H1 receptor antagonist diphenhydramine. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999. Vol. 288, № 2. P. 858-865.

100. Priest B.T., McDermott J.S. Cardiac ion channels // Channels. Taylor & Francis Group, LLC, 2015. Vol. 9, № 6. P. 352-359.

101. Kägström J., Sjögren E.L., Ericson A.C. Evaluation of the guinea pig monophasic action potential (MAP) assay in predicting drug-induced delay of ventricular repolarisation using 12 clinically documented drugs // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. Elsevier Inc., 2007. Vol. 56, № 2. P. 186-193.

102. Harmer A.R. et al. Optimisation and validation of a medium-throughput electrophysiology-based hNav1.5 assay using IonWorks™ // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. Elsevier, 2008. Vol. 57, № 1. P. 30-41.

103. Burnham M.P. et al. Investigation of connexin 43 uncoupling and prolongation of the cardiac QRS complex in preclinical and marketed drugs // Br. J. Pharmacol. John Wiley and Sons Inc., 2014. Vol. 171, № 21. P. 4808-4819.

104. Rodrigues W.C. et al. Immunoassay Screening of Diphenhydramine (Benadryl(R)) in Urine and Blood Using a Newly Developed Assay // J. Anal. Toxicol. Society of Forensic Toxicologists, 2012. Vol. 36, № 2. P. 123-129.

105. Wible B.A. et al. HERG-Lite®: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. Elsevier, 2005. Vol. 52, № 1. P. 136-145.

106. Aikawa N. The utility of human iPS cell-derived cardiomyocytes in predicting the

clinical risk of drugs that display discordance of cardiotoxicity by species // Fundam. Toxicol. Sci. Japanese Society of Toxicology, 2017. Vol. 4, № 3. P. 127-136.

107. Dhesi S. et al. Cyclophosphamide-Induced Cardiomyopathy: A Case Report, Review, and Recommendations for Management. // J. Investig. Med. high impact case reports. SAGE Publications, 2013. Vol. 1, № 1. P. 2324709613480346.

108. Iqubal A. et al. CLINICAL UPDATES ON DRUG - INDUCED CARDIOTOXICITY and INTRODUCTION: Cardiotoxicity is the common side effect of many drugs 1 among which anticancer drugs , specifically anthracycline class of drugs exert severe cardiotoxicity 2 . Other drugs that cause m. 2018. Vol. 9, № 1. P. 16-26.

109. Nakamae H. et al. QT dispersion as a predictor of acute heart failure after highdose cyclophosphamide. // Lancet (London, England). Elsevier, 2000. Vol. 355, № 9206. P. 805-806.

110. Senkus E., Jassem J. Cardiovascular effects of systemic cancer treatment // Cancer Treat. Rev. 2011. Vol. 37, № 4. P. 300-311.

111. Steingo L. Cardiovascular complications of chemotherapy: A synopsis // SA Hear. 2017. Vol. 9, № 3.

112. Tamargo J., Caballero R., Delpón E. Cancer Chemotherapy and Cardiac Arrhythmias: A Review // Drug Saf. 2015. Vol. 38, № 2. P. 129-152.

113. Katayama M. et al. Fulminant fatal cardiotoxicity following cyclophosphamide therapy // J. Cardiol. Elsevier, 2009. Vol. 54, № 2. P. 330-334.

114. Iqubal A. et al. Molecular mechanism involved in cyclophosphamide-induced cardiotoxicity: Old drug with a new vision // Life Sci. Pergamon, 2019. Vol. 218. P. 112-131.

115. Morandi P. et al. Serum cardiac troponin I levels and ECG/Echo monitoring in breast cancer patients undergoing high-dose (7 g/m2) cyclophosphamide // Bone Marrow Transplant. 2001. Vol. 28, № 3. P. 277-282.

116. Kurauchi K. et al. Role of metabolites of cyclophosphamide in cardiotoxicity // BMC Res. Notes. BioMed Central, 2017. Vol. 10, № 1. P. 406.

117. Lushnikova E.L. et al. Ultrastructural signs of cyclophosphamide-induced damage to cardiomyocytes. // Bull. Exp. Biol. Med. 2008. Vol. 146, № 3. P. 366-371.

118. Zhu M.-X. et al. Early embryonic sensitivity to cyclophosphamide in cardiac differentiation from human embryonic stem cells. // Cell Biol. Int. 2011. Vol. 35, № 9. P. 927-938.

119. Эффективность и безопасность нового антиаритмического препарата III класса ниферидила в купировании персистирующей формы фибрилляции и трепетания предсердий [Electronic resource]. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=20519694 (accessed: 20.07.2021).

120. Abramochkin D. V., Kuzmin V.S., Rosenshtraukh L. V. Effects of new class III antiarrhythmic drug niferidil on electrical activity in murine ventricular myocardium and their ionic mechanisms // Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 2015 38810. Springer, 2015. Vol. 388, № 10. P. 1105-1112.

121. Podgurskaya A.D. et al. The Use of iPSC-Derived Cardiomyocytes and Optical Mapping for Erythromycin Arrhythmogenicity Testing // Cardiovasc. Toxicol. 2019.

122. Balashov V.A. et al. Muscular Thin Films for Label-Free Mapping of Excitation Propagation in Cardiac Tissue. 1422. P. 129110.

123. Tse G. Mechanisms of cardiac arrhythmias // Journal of Arrhythmia. 2016. Vol. 32, № 2. P. 75-81.

124. Magome N., Agladze K. Patterning and excitability control in cardiomyocyte tissue culture // Phys. D Nonlinear Phenom. 2010. Vol. 239, № 16. P. 1560-1566.

125. Podgurskaya A.D. et al. Effect of heptanol and ethanol on excitation wave propagation in a neonatal rat ventricular myocyte monolayer // Toxicol. Vitr. 2018.

126. Pond A.L. et al. Expression of distinct ERG proteins in rat, mouse, and human heart. Relation to functional I(Kr) channels. // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 8. P. 5997-6006.

127. Pandit S. V. et al. A Mathematical Model of Action Potential Heterogeneity in Adult Rat Left Ventricular Myocytes // Biophys. J. 2001. Vol. 81, № 6. P. 3029-

3051.

128. Prudat Y., Kucera J.P. Nonlinear behaviour of conduction and block in cardiac tissue with heterogeneous expression of connexin 43 // Curr. Ther. Res. - Clin. Exp. Excerpta Medica Inc., 2014. Vol. 76. P. 46-54.

129. Namdaroglu S. et al. Impacts of post-transplantation cyclophosphamide treatment after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in acute myeloid leukemia // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 9, № 1. P. 2046.

130. Thomas S.P. et al. Impulse propagation in synthetic strands of neonatal cardiac myocytes with genetically reduced levels of connexin43 // Circ. Res. Lippincott Williams & Wilkins, 2003. Vol. 92, № 11. P. 1209-1216.

131. Kanno S., Saffitz J.E. The role of myocardial gap junctions in electrical conduction and arrhythmogenesis // Cardiovascular Pathology. Elsevier, 2001. Vol. 10, № 4. P. 169-177.

132. Podgurskaya A.D. et al. Cyclophosphamide arrhythmogenicitytesting using human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes // Sci. Rep. Nature Research, 2021. Vol. 11, № 1.

133. Bagnes C., Panchuk P., Recondo G. Antineoplastic Chemotherapy Induced QTc Prolongation // Curr. Drug Saf. 2010. Vol. 5, № 1. P. 93-96.

134. Song Z., Qu Z., Karma A. Stochastic initiation and termination of calciummediated triggered activity in cardiac myocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2017. Vol. 114, № 3. P. E270-E279.

135. Ponard J.G.C., Kondratyev A.A., Kucera J.P. Mechanisms of intrinsic beating variability in cardiac cell cultures and model pacemaker networks // Biophys. J. Biophysical Society, 2007. Vol. 92, № 10. P. 3734-3752.