Тканевая инженерия сердца как средство для исследования фундаментальных процессов возникновения реентри тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Цвелая Валерия Александровна

• Цвелая Валерия Александровна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Цвелая Валерия Александровна

2. Обзор литературы

2.1. Сердечная проводимость и потенциал действия

2.1.1. Структура сердца

2.1.2. Потенциал действия и клеточные токи

2.1.3. Проведение волны возбуждения и реентри

2.1.4. Математические модели распространения волны возбуждения по сердечной ткани

2.2. Экспериментальные методы изучения сердечной проводимости

2.2.1. Биофизические экспериментальные модели сердца

2.2.2. Клеточные культуры кардиомиоцитов

2.2.3. Оптические методы исследования волн возбуждения

2.2.4. Неинвазивные методы контроля возбудимости сердечной ткани

2.3. Тканевая инженерия сердца

2.3.1. Гетерогенность и однородность культуры

2.3.2. Методы совместного культивирования клеток

2.3.3. Стволовые клетки в тканевой инженерии

2.4. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

2.4.1. Виды стволовых клеток

2.4.2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и перспективы их использования

2.4.3. Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты

2.4.4. Проблема созревания кардиомиоцитов в процессе дифференцировки

2.5. Патологии проводимости сердца

2.5.1. Синдром удлиненного интервала ОТ

2.5.2. Влияние лекарственных препаратов на сердечную ткань

2.5.3. Платформы для исследования сердечных патологий и кардиотоксичности соединений

3. Материалы и методы

3.1. Получение линий ИПСК

3.1.1. Основные этапы и реагенты в процессе клеточного репрограммирования

3.1.2. Подготовительные этапы. Выделение фидерных клеток

3.1.3. Протокол выделения мононуклеаров

3.1.4. Репрограммирование полученного клеточного материала в ИПСК

3.2. Дифференцировка ИПСк в кардиомиоциты

3.3. Культура неонатальных клеток крысы

3.4. Иммортализованная клеточная линия кардиомиоцитов ИЬ-1

3.5. Подготовка образцов и стоковых растворов

3.5.1. Подготовка образцов человеческих кардиомиоцитов

3.5.2. Подготовка образцов для сокультурирования

3.5.3. Подготовка образцов неонатальных кардиомиоцитов крысы

3.5.4. Подготовка используемых растворов веществ

3.6. Оптическое картирование

3.7. Иммунофлюорисцентное окрашивание

4. Результаты

4.1. Влияние внешних факторов на проведение волны возбуждения на культуре кардиомиоцитов

4.1.1. Влияние гиперкалиемии

4.1.2. Моделирование влияния факторов, появляющихся при локальной ишемии

4.1.3. Влияние градиента возбудимости на проведение волны возбуждения и поведение спиральных волн (реентри)

4.2. Роль функциональной границы в проведении волны возбуждения на различных культурах кардиомиоцитов

4.2.1. Роль границы между областью, проводящей возбуждение и невозбудимой. Граничные условия

4.2.2. Роль границы в культуре с различной проводимостью. Модель однонаправленного блока проведения

4.3. Роль функционального препятствия в проведении волны возбуждения по культуре человеческих кардиомиоцитов

4.3.1. Процесс дифференцировки. Формирование функционального синцития в процессе дифференцировки

4.3.2. Сравнительный анализ проведения волны возбуждения в культуре человеческих кардиомиоцитов на разных этапах дифференцировки, полученных от пациента с синдромом удлиненного интервала QT, тип 2 (LQT2), и пациента без мутаций. Влияние анизотропии

4.3.3. Функциональное препятствие как средство для сравнительного исследования культур человеческих кардиомиоцитов с различными патологиями. Тест на аритмогенность

5. Обсуждение

6. Выводы

7. Благодарности

8. Список используемых сокращений

9. Список литературы

10. Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тканевая инженерия сердца как средство для исследования фундаментальных процессов возникновения реентри»

1. Введение

Согласно исследованию «Глобальное Бремя Болезней (ГББ или Global Burden of Disease (GBD))»: сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной глобальной смертности с 1980 года по сегодняшний день [1]. На долю ССЗ приходилось почти треть всех смертей в мире в 2015 году [1, 2]. На протяжении последних лет смертность от ССЗ только увеличивается. Значительная часть ССЗ приходится на нарушения ритма сердца, в частности, тахиаритмии. Наиболее опасны желудочковые тахиаритмии, часто приводящие к фибрилляции, манифестируемой как внезапная сердечная смерть. В настоящее время известно, что в основе большинства сердечных тахиаритмий лежат циркулирующие волны возбуждения - реентри. За последние 20 лет были созданы системы так называемого оптического картирования возбуждения в сердце, убедительно продемонстрировавшие роль реентри в возникновении тахиаритмий и переходе к режиму фибрилляции [3,4]. Несмотря на успешное применение оптического картирования целого сердца (обычно искусственно перфузируемого в так называемых препаратах Лангендорфа) для доказательства возникновения реентри как основы развивающейся тахиаритмии, конкретные биофизические механизмы возникновения реентри в препаратах целого сердца изучать затруднительно. Эта трудность обусловлена сложным строением сердца, а также его трехмерностью, затрудняющей использование методов оптического картирования для регистрации возбуждения, распространяющегося в толще миокарда.

Тканево-инженерные модели сердечной ткани при использовании оптического картирования позволяют интерактивно наблюдать распространение возбуждения, исследовать образование реентри в результате взаимодействия волн возбуждения с различными анатомическими препятствиями и видеть непосредственный ответ распространяющихся волн и реентри на фармакологические препараты. Открытие клеточного перепрограммирования и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), сделанное S Yamanaka в 2006 г., дало новые возможности для получения тканево-инженерных моделей сердечной ткани на основе дифференцированных из ИПСК человеческих кардиомиоцитов, которые уже демонстрируют свою эффективность [5]. Например, было продемонстрировано сравнение эффективности влияния различных антиаритмических препаратов на динамику реентри в монослое человеческих вентрикулярных кардиомиоцитов [6,7].

Более того, для ряда сердечных патологий, таких, например, как синдром удлиненного интервала QT (long QT syndrome - LQTS), не существует адекватных животных моделей, поэтому использование человеческих тканей становится незаменимым. Видовые и фенотипические различия являются актуальной проблемой, если используются кардиомиоциты лабораторных животных для моделирования особенностей ССЗ человека. Например, мышиные сердца бьются примерно в 6-10 раз быстрее, чем человеческие, также мышиные кардиомиоциты обладают заметно более короткими потенциалами действия, так как формируются другими ионными каналами. У людей мутации гена KCNQ1, кодирующего ионный канал, ответственный за ток IKs, могут вызывать синдром удлиненного QT интервала первого типа (LQTS1). Данное заболевание, характеризуется длительным интервалом QT в ЭКГ и склонностью к потенциально летальным аритмиям [8]. Однако генетическая абляция KCNQ1 у мышей не всегда приводила к фенотипу сердца как у пациентов с синдромом длительного QT [9, 10]. Наиболее вероятной причиной этих расхождений является факт, что реполяризация потенциала сердечного действия регулируется различными ионными токами у мышей и у человека. Например, основными токами реполяризации являются токи замедленного выпрямления IKr и IKs у человека, а у мыши а ток IKr отсутствует [11, 12]. Эти видовые различия имеют отношение не только к моделированию редкого заболевания, такого как врожденный синдром удлиненного интервала QT, но также ставят под сомнение достоверность моделей грызунов для прогнозирования пролонгированного интервала QT, вызванного лекарственными препаратами, что является основной проблемой в разработке лекарств, a также все модели грызунов используемые для определения кардиотоксичности. В совокупности существует неудовлетворенная потребность в более совершенных модельных и системах сердечных заболеваний человека. Поэтому изучение и устранение проблем данных моделей, в том числе и прогностических компьютерных, и создание на основе полученных данных адекватной тканевоинженерной модели для исследований врожденных и приобретенных патологий является актуальной задачей современной науки и главной целью данной работы.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) обладают потенциалом для создания подобной модели, предоставляя неограниченный источник пациент-специфичных кардиомиоцитов человека, от условно здоровых доноров и доноров с врожденными патологиями. В частности, есть как минимум три области, в которых кардиомиоциты, полученные из ИПСК, могут использоваться: фармакология

безопасности (кардиотоксичность), поиск новых мишеней для лекарственных средств, трансплантология, создание базы данных по лекарственным средствам по генетическим мутациям и др.. Особенно важно проверять лекарственные препараты-кандидаты на кардиотоксичность, в частности, в отношении их потенциала (но не ограничиваясь ими) пролонгировать интервал QT и вызвать torsades de pointes (пируэт), и, в конечном итоге, фибрилляцию желудочков. Фенотипические анализы, основанные на кардиомиоцитах, полученных из ИПСК, имеют большие перспективы дополнить или заменить используемые в настоящее время анализы, основанные либо на первичных кардиомиоцитах лабораторных животных, либо на линиях клеток со сверхэкспрессией ионных каналов. Однако, на данных момент тканево-инженерные модели начинают разрабатываться с использованием клеток грызунов, где отрабатываются протоколы и устраняются ошибки, так как наработка ИПСк и последующая дифференцировка достаточно дорогостоящий процесс. Представляемая работа посвящена нескольким задачам тканевой инженерии, в том числе и разработке тканевоинженерной экспериментальной модели для исследования риска возникновения аритмий на основе пациент-специфичных ИПСк человека. В задачи работы входило:

1. Исследование распространения волны возбуждения вдоль границы возбудимости или невозбудимого препятствия по культуре сердечных клеток

2. Исследование электромеханического взаимодействия клеток различных типов, в том числе клеток, полученных от разных животных.

3. Исследование возможностей создания неинвазивного метода стимуляции сердечной ткани и контроля возбудимости

4. Создание тканево-инженерной модели для исследования патологий сердца з человека, как врожденных, так и приобретенных

5. Проверка полученной тканево-инженерной модели при определении аритмогенности фармпрепаратов (?)

За несколько лет работы над проектом удалось исследовать образование волн реентри на разработанной тканево-инженерной модели, созданной на основе сердечных клеток, полученных методом клеточного репрограммирования от пациентов с синдромом удлиненного QT интервала второго типа и от пациентов без мутаций в ионных каналах сердечных клеток [13, 7]. Кроме того, было исследовано образование волн реентри под действием препаратов, вызывающих индуцированный LQTS [7,14]. Было проведено пациент-специфичное и видоспецифичное сравнение проведения волн

7

возбуждения [13,7]. Найдены граничные условия и усовершенствована предсказательная модель основанная на монослоях неонатальных кардиомиоцитов крыс [15]. Продемонстрирована возможность проведения кальциевых волн возбуждения [16]. Положено начало для создания неинвазивного оптического способа пейсмейкерной стимуляции сердечной ткани при подсадке кардиомиоцитов с канальным родопсином [17]. Полученные данные позволили предложить тканево-инженерную модель, как тест на аритмогенность, основанный на синцитиальном слое дифференцированных вентрикулярных кардиомиоцитов с созданным в нем стандартным невозбудимым препятствием. На основе экспериментальных данных был предложен механизм возникновения реентри при патологическом удлинении интервала QT, что представляет собой готовую модель для тестирования кардиотоксичности лекарственных средств.

2. Обзор литературы

2.1. Сердечная проводимость и потенциал действия 2.1.1. Структура сердца

Сердце представляет собой почти конусообразный орган с хорошо развитыми мышечными стенками. В наполненном кровью состоянии сердце по размеру примерно соответствует кулаку исследуемого человека. Длина сердца взрослого человека достигает 12-15 см, ширина 8-11 см, а толщина примерно 6-8 см. Масса его очень колеблется: у обычного человека сердце весит 220-300 г, в то время как у спортсмена 400-450 г [18].

Сердце изучали и в Древней Греции, и в Древнем Египте, однако, первый трактат, который наиболее полно описывал сердце сохранился для нас под авторством Гиппократа. Гиппократ описал сердце как пиромидальный орган с двумя желудочками, соединенными через межжелудочковую перегородку (Гиппократ, 1992; Бестетти и др., 2014) [19]. Далее наиболее подробно уже в Римской империи Гален описал сердце как конический орган с круглым основанием. Он отклонил предложение о том, что сердце - это мышца, оправдывающая его веру тем, что движения мышц являются произвольными, в то время как сердце работает автономно (Harris, 1993). Гален считал, что в сердце существует две камеры или 2 желудочка: тонкая правая камера, содержащая кровь и более толстая левая камера, содержащая воздух. Две камеры были связаны диафрагмой, межжелудочковой перегородка в современной терминологии. На протяжении многих лет, не смотря на очевидные противоречия считалось, что сердце имеет именно такую структуру, а трактат Галена господствовал над любыми теориями. Немного позже выяснилось, что еще

8

Леонардо да Винчи иллюстрировал правильные структурные особенности сердца и описывал его функционарирование, полные исследования которого были опубликованы с 2001 по 2013 год, когда все функциональные особенности сердца уже были описаны такими умами как: Лоуэр, Харви, Андерсон и другими (Рис.1) [19,20].

.""" -»'•'""Г'-г и««-^ "К-, л«-^ а .у й «^.Ь« Т5-Л „.¿Ж I

Рис.1. Историческое описание сердца (рисунок Леонардо да Винчи) [19]

Сердце человека состоит из четырёх камер, разделённых перегородками и клапанами. Все сосуды, ведущие кровь к сердцу, называются венами, а сосуды, отводящие кровь к другим органам, - артериями. Эритроциты с двуокисью углерода по верхней полой вене оказываются в правом предсердии, затем через трехстворчатый клапан (трикуспидальный) попадают в правый желудочек [18]. Через пульмональный клапан эритроциты направляются к легкому, оказываясь в легочной артерии. В легких эритроциты отдают двуокись углерода, насыщаясь кислородом, и по пульмональной вене вливаются в лекое предсердие, далее через третий митральный клапан, бикуспидальный, -в левый желудочек. Левый желудочек всегда превосходит другие полости по толщине мышечной стенке, так как должен производить самое сильное давление для доставки насыщенной крови по всему телу. Последний клапан- клапан аорты, которая образует вокруг сердца петлю. Правый желудочек и левое предсердие замыкают малый круг кровообращения, левый желудочек и правое предсердие — большой круг (рис. 2). Совместно с участками полых и лёгочных вен, а также выходящими из сердца аортой и лёгочным стволом оно покрыто сердечной сумкой или перикардом [18,21].

Трехстворчв клапан

От легких: правому предсердии

Пульмона ньш клал:

Верхняя полая вен

Правое предсерд!

К легким

Правый желудоче

Бедна! кислоро; кровь

Нижня полая вена

Нисходящая аорта

кислородом кров!

Аортальный

Левое предсердие

Левый желудочек

Аорта

Митральный клапан

К легким

От легких

клапан

Богатая

Миокард

Рис. 2. Система сосудов в сердце, описывающая насосную функцию сердца.

Таким образом, с точки зрения функции и строения, сердце представляет собой два последовательных насоса, один из них проталкивает через легкие кровь, обеспечивая ее обмен углекислого газа на кислород, а через другой эритроциты с кровью продвигаются по направлению ко всем остальным тканям тела, отдавая кислород. Исходя из этого, становится понятно, что сердце с помощью клапанов и их согласованной работы должно прокачивать кровь всегда в одном направлении [21,22]. Основную механическую работу насоса выполняют два желудочка, также называемые рабочим миокардом, а клетки, составляющие его основную массу, называются желудочковыми кардиомиоцитами, и представляют собой мышечные клетки, имеющие стадию сокращения и релаксации (Рис.3) [23]. Из-за особой организации содержащихся в кардиомиоцитах актиновых и миозиновых волокон в сердечной ткани, клетки вытягиваются и переплетаются, образуя характерные клеточные пучки, мышечные волокна. Характерный размер кардиомиоцита составляет примерно 20*100 мкм [21,22]. В структуре кардиомиоцтов существуют все виды органелл, необходимых для существования клетки, а повышенное содержание митохондрий помогает осуществлять энергозатратный процесс сокращения. Основной же функциональной единицей данного типа клеток является миофибрилла, представляющая собой нитевидную структуру из повторяющегося набора саркомер. Стадия синхронного сокращения желудочков называется систолой, а релаксации - диастолой.

Рис.3. Саркомер в расслабленном и напряженном состояниях.

Как известно, сердечный выброс имеет прерывистый, импульсный характер, а непрерывность подвода кислорода к тканям обеспечивается работой сосудистой системы. Благодаря тому, что во время систолы энергия накапливается в растяжимых стенках сосудистой системы, кровь не останавливается во время диастолы, такой процесс можно описать из аналогии с колебательной R-C цепочкой [21,22]. Как уже было сказано, миокард функционирует как синцитий рабочих (сократительных) клеток, другими словами, он является электрически, а, следовательно, и механически согласованным, что обеспечивает эффективную работу сердца в качестве механического насоса. Таким образом, важнейшим свойством сердечной ткани является электрическая согласованность происходящих в нем процессов, без которой невозможно правильным образом прокачивать кровь. Согласованность обеспечивается одним из основных механизмов передачи сигналов в живом организме - распространением волны возбуждения, где в качестве активной среды выступает, в частности, сам миокард. При этом согласованное сокращение сердца обеспечивается при правильном проведении волны от генерирующих импульс клеток водителей ритма (пейсмейкерных клеток), по всей проводящей системе до желудочков [21,24].

Нормальное механическое (насосное) функционирование сердце млекопитающего

зависит от правильного электрического функционирования и отражается в

11

последовательной активации клеток: с началом в специализированных областях сердца (пейсмейкеры) и с распространением активности через рабочие клетки миокарда (желудочки) [25, 26]. Регулярная активность пейсмейкерных клеток позволяет сердцу самостоятельно генерировать возбуждение и сокращаться даже в случае извлечения его из организма. Устойчивость системы электрического взаимодействия и автономности подкрепляется тем, что пейсмейкерная система является многоуровневой и иерархичной. То есть, если повреждается основной водитель ритма, задающий ритм для всех остальных участков (первичный пейсмейкер), то возбуждение задается тем участком, чья частота спонтанного возбуждения выше. Пейсмейкерную активность в той или иной степени проявляют клетки всех отделов сердца.

В бороздке между соединением верхней половой вены и правового предсердия находится синоатриальный узел (SA-узел) размером приблизительно 8 мм в длину и 2 мм в толщину (рис. 4) [27]. Часть его клеток (т.н. «круглые» по их внешнему строению, содержащие малое количество органелл и миофибрилл), по всей видимости, являются пейсмейкерными, а остальная часть клеток синоатриального узла имеет вытянутую форму и проводит возбуждение от пейсмейкерных. Из этого узла импульсы распространяются радиально по всему правому желудочку, со скорость порядка 1 м/с, пока не достигнет атриовентрикулярного узла (AV-узел) [28]. Его размеры составляют уже 22 мм в длину, 10 мм в ширину и 3 мм в толщину. Расположен AV-узел сзади, на правой стороне межпредсердной перегородки, и является единственным путем прохождение сердечного импульса к желудочкам. Впервые он был описан еще в 1906 Санье Таваро [28,29]. По клеточному составу практически идентичен SA-узлу, однако соотношение пейсмейкерных и проводящих клеток отличается в пользу последних. По функциям можно выделить три основные обалсти: atrium-nodus - переходная часть между предсердием и остальной частью узла, nodus - основная часть узла, nodus-His - в этой зоне происходит слияние волокон AV-узла со следующим отделом, пучками Гиса. Также последняя зона является часть проводящей системы желудочков [30,31,32]. Таким образом, это единственный путь, по которому импульсы распространяются в сердце от предсердий к желудочкам. Стоит отметить, что в областях atrium-nodus и nodus происходит основная задержка проведения импульса от предсердий к желудочкам, обусловленная разными скоростями проведения и размерами этих отделов. Значение этой задержки крайне велико с функциональной точки зрения: это время дает возможность оптимально заполнить желудочки кровью во время сокращения предсердий.

Далее волна распространяется по пучкам Гиса, имеющим разделение на правую (является прямым продолжением) и левую ножки пучка [31,32,33]. Разветвляясь от

12

межжелудочковой перегородки, ножки передают возбуждение желудочкам. Сеть волокон Пуркинье образованна слиянием правой ножки и двух ветвей левой ножки, а потенциалы действия этих клеток уже похожи на потенциалы действия обычных желудочковых кардиомиоцитов [31,32]. Соответственно, большая длительность потенциала действия (а, следовательно, и рефрактерного периода) этих клеток иногда приводит к блокированию части импульсов от AV-узла, клетки которого имеют менее длительный потенциал действия. Более того, рефрактерный период клеток AV-узла сильно увеличивается при высокой частоте стимуляции, этим способом осуществляется защита желудочков от чрезмерно высоких частот сокращений, если таковые возникают в предсердиях [30]. Первые области желудочков, принимающие возбуждение, это межжелудочковая перегородка и сосочковая мышца. Раннее сокращение перегородки делает ее к моменту сокращения остальных частей «более твердой», чтобы выполнять функцию некоторой опорной точки для всего остального сокращающегося миокарда. В свою очередь, сосочковая мышца берет на себя роль защиты AV-клапанов от выворачивания во время систолы желудочков. Возбуждение желудочков также делят на несколько этапов по времени, причем сокращение эпикарда правого желудочка начинается раньше, чем левого, из-за меньшей толщины его стенок. Эндокардиальные области возбуждаются быстро, но имеют невысокую скорость проведения (0.3-0.4 м/с) вплоть до эпикардиальных областей. Последними активируется задние базальные эпикардиальные области и малая зона в базальной части межжелудочковой перегородки [31-33].

Верхняя полая вена

Синоатриальный узеп Правое предсердие

Атриовентрикулярный узел

Рис.4. Проводящая система сердца. Иерархическая система проведения

возбуждения по сердечным волокнам от синотриального узла до волокон Пуркинье [21].

13

2.1.2. Потенциал действия и клеточные токи

Нормальное механическое (насосное) функционирование сердца млекопитающего зависит от правильного электрического функционирования, что отражается как последовательная активация клеток, берущая начало в специализированных пейсмейкерных областях сердца и распространяющая активность через желудочки (рис. 5). Электрическая активность миокарда является совокупностью генерации потенциалов действия в отдельных клетках сердца, и их нормальное согласованное электрическое функционирование. Активность сердца легко обнаруживается на электрокардиограммах (Рисунок 5), где P зубец обозначает работу предсердий, а зубцы от Q до T работу желудочков. Распространение активности или так называемой волны возбуждения и координации электромеханического функционирования желудочков также зависят от электрической связи между клетками, за что отвечают в том числе щелевые контакты. Потенциалы действия миокарда отражают последовательную активацию-инактивацию ионных каналов кардиомиоцитов, их взаимодействия друг с другом и межклеточной средой. Существует два основных вида ПД: быстрый ответ, который возникает в нормальных миоцитах предсердий и желудочков, и медленный ответ, который встречается в синоатриальном узле (клетки пейсмейкеры) и в области естественного водителя ритма [34, 35]. Генерация ПД осуществляется путем сложного взаимодействия между нелинейными мембранными ионными токами и ионной средой клетки и внеклеточного пространства [36]. Мембранные ионные токи, в свою очередь, появляются благодаря потенциал-зависимым ионным каналам, насосам и ионным обменникам [37, 38]. Ионные токи деполяризуют (входящие натриевые и кальциевые токи (№+ и Са2+) и реполяризуют мембрану клетки, (выходящие калиевые (К) токи). Формы ПД в разных областях сердца различны (Рис. 5), из-за различий в выражении и / или свойствах ионных каналов кардиомиоцитов в этой области сердца. Эти различия способствуют нормальному однонаправленному распространению возбуждения через миокард и генерации нормальных сердечных ритмов. Изменения в свойствах или функциональном выражении ионных каналов миокарда, полученных в результате наследственных мутации в генах, кодирующих эти каналы или заболевания миокарда, может привести к изменениям в осциллограмме потенциала действия, в синхронизацию и / или распространение возбуждения, тем самым становится предрасположенным к потенциально опасным для жизни аритмиям.

Поэтому существует значительный интерес к разграничению молекулярных, клеточных и системных механизмов, способствующих генерации и поддержания нормального сердечного ритма, а также представляется необходимым изучение изменений этих механизмов в миокарде больного пациента. Электрическая активность миокарда инициируется пейсмейкерными клетками в синоатриальном (SA) узле, а затем волна возбуждения проходит через предсердие к атриовентрикулярному (AV) узлу (Рисунок 5). После короткой паузы в AV-узле возбуждение распространяется по проводящим волоконам Пуркинье на вершину сердца и в рабочий, желудочковый миокард (Рисунок 5). Для каждой участвующей клетки в каждом из этих специализированных регионов возбуждение приводит к генерации потенциала действия, с последующим расслаблением и периодом рефрактерности, пока следующий импульс не настигнет клетку, чтобы сгенерировать ПД и распространятся далее по сердечной ткани [39].

SA Node

^^ ^ _____Atrium I

ИВЙ.-- АV Node

НВ^-Purkinje Fiber

QT

Рис. 5. Электрическая активность в миокарде. Схема сердца человека с иллюстрацией типичных сигналов потенциалов действия, записанных в разных его регионах. Внизу: схема ЭКГ [39].

Ионные каналы, их включение и выключение в зависимости от импульса меняют проницаемость мембраны. Но также проницаемость мембран для определенного иона возможно регулировать посредством открытия или закрытия специфичных для данных ионов каналов с помощью веществ - блокаторов. Например, тетродотоксин является самым известным блокатором натриевых каналов, тетраэтиламмоний - калиевых, нифидипин - медленных кальциевых [40, 39].

Потенциал внутри клетки примерно на 80-90 мВ ниже, чем в окружающей среде. Такой потенциал клетки без внешних раздражений называется потенциалом покоя. При возбуждении сердечной клетки приходящим электрическим стимулом мембрана быстро деполяризуется таким образом, что разность между внутриклеточным потенциалом и потенциалом окружающей среды становится равной примерно 20 мВ, что обусловлено открытием быстрых потенциал-зависимых натриевых каналов [40, 41-43]. Во время фазы деполяризации (фаза 0) активируются и другие каналы, которые зависят от типа клетки, но особенно важным будет активируемый кальциевый ток. Кальциевый ток может вывести клетку в фазу деполяризации даже при отсутствии натриевых токов, что критично для сердечных клеток с патологией натриевых каналов. Токи и Жг особенно важны для желудочковых кардиомиоцитов, в других типах сердечных клеток их экспрессии почти нет. Отличительной же чертой предсердных кардиомиоцитов является ток Жш, который активируется также в фазе деполяризации. За фазой быстрой деполяризации следует фаза ранней или быстрой начальной реполяризации (фаза 1), которая происходит за счет активации быстрых калиевых каналов. Затем следует плато (фаза 2), длительность которого зависит от типа кардиомиоцита [44, 41] (Рисунок 6). На рисунке 6 приведены примеры потенциалов действия желудочкового и предсердного кардиомиоцитов. Из рисунка видно, что фаза плато у желудочкового кардиомиоцита гораздо длиннее, чем у предсердного, в том числе из-за кальциевого тока L-типа. Затем мембрана полностью реполяризуется до достижения потенциала покоя (фаза 3).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Цвелая Валерия Александровна, 2019 год

— &к

40 + 3.5е0025У

При гипоксии происходит самое значительное укорочение ПД. На Рисунке 35 Представлена промоделированная зависимость ПД от процента активированных АТФ-зависимых калиевых каналов.

Рисунок 35 - Зависимость потенциала действия от различной степени гипоксии, отраженной с помощью процента активированных АТФ-зависимых калиевых каналов (fA.iT). По оси ОY - мембранный потенциал в мВ, по оси ОХ - время в секундах.

Таким образом, с помощью полученной модели можно соединить все эффекты локальной ишемии и получить графики сравнения потенциалов действия для нормальной сердечной ткани и при прогрессирующей ишемии (Рисунок 36) Для данной

стадии были взяты следующие коэффициенты: +] = 9, кса = 0.7, /катр = 0.2

Изменение потенциала действия при гипоксии

— <т> =о

--<ОТ = 0,1

--«иг-0.2

--¡дгр = 0.3

--<1711-0.4

--<(ТР = 0.5

— /лгр = 0.6

--(пр-0.7

— <от = 0.8

— <т. = 0.9 --и гр=1

ООО 0.05 010 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 Время, С

60 40 20

СО 0

г >

-20 -40 -60

-80 -I ~~

-1-1-1-1-1-Г-1-1-1-

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Время, с

Рисунок 36 - Сравнение потенциалов действия при нормальных и при условиях локальной ишемии. По оси ОY отложен мембранный потенциал в мВ, по оси ОХ -время в секундах.

Полученные результаты по влиянию локальной ишемии, в частности гиперкалиемии, а также данная модифицированная модель Корхонена для неонатальных кардиомиоцитов крысы опубликованы [16].

4.1.3. Влияние градиента возбудимости на проведение волны возбуждения и поведение спиральных волн (реентри).

Возбудимость сердечной ткани зависит не только от ионного состава среды. Различные вещества могут встраиваться и частично разрушать мембану в различных конформациях, сердечная ткань может снабжаться кровью с различной эффективностью, что может приводить к градиентам ишемического состояния ткани, что в свою очередь может приводить к различному проведению волны возбуждения. Экспериментальное моделирование возбудимости сердечного слоя было проведено в данной работе. Для влияния на возбудимость было взято светочувствительное вещество - азоТАБ. Для постановки эксперимента было определено соответствие концентрации азоТАБ и скорости проведения волны возбуждения, а также скорости при максимальном и минимальном значении интенсивности ультрафиолета. Была получена зависимость скорости проведения волны возбуждения в монослое кадиомиоцитов от интенсивности

- Нормальные условия

ультрафиолета в присутствии азоТАБ (120дМ) (рисунок 37). При засветке УФ 20% скорость проведения волны возбуждения падала в 1.7 раза относительно 100%-ой засветки. Далее наблюдался резкий спад скорости до нулевой, что соответствует существованию некоторого порога активации. Подобный спад позволяет моделировать градиент возбудимости на культуре ткани. Исходя из полученных результатов, можно утверждать о монотонной зависимости - при увеличении интенсивности засветки скорость волн увеличивается, характер зависимости близок к линейной на интервале от 20 до 100%-ой засветки.

V

Рисунок 37 - Зависимость скорости проведения волны возбуждения в монослое кадиомиоцитов от интенсивности ультрафиолета в присутствии азоТАБ (120дМ). Скорость нормирована на максимальную в эксперименте (при 100%-ой засветке); интенсивность приведена в мВт/см2.

Градиент возбудимости в котором изучалось поведение реентри создавался изменением интенсивности ультрафиолета в присутствие азоТАБ в концентрации 120 мкМ. На культуру ткани неонатальных кардиомиоцитов (в присутствие азоТАБ) была спроецирована картинка с линейным градиентом интенсивности УФ. Запуск спиральной волны осуществлялся по протоколу 81Б2, после чего отслеживалось дальнейшее поведение реентри. Каждый эксперимент длился 15 минут, смещение ядра спиральной волны измерялось в мм. Согласно результатам успешных экспериментов (п=21) была построена гистограмма смещения спиральной волны за вычетом миандринга и дрейфа в сторону закручивания (Рисунок 38 ).

Полученные результаты показали, что с большей вероятностью смещение

спиральной волны наблюдалось в сторону меньшей возбудимости, то есть в сторону

104

меньшей скорости распространения волны возбуждения: в 62% случаев (13 из 21 эксперимента). Смещение в сторону более возбудимой области наблюдалось с меньшей вероятность в 29% случаев, отсутствие перемещения в 9% (2/21) (Рисунок 38 ).

Рисунок 38 - Гистограмма смещения спиральной волны в градиенте возбудимости.

4.2. Роль функциональной границы в проведении волны возбуждения в различных культурах кардиомиоцитов

4.2.1. Роль границы, между областью, проводящей возбуждение и невозбудимой. Граничные условия.

Дефекты сердечной ткани являются одной из причин появления пространственно-временных структур, нарушающих нормальное проведение волны возбуждения и сердечный ритм. Дефекты приводят к разным типам реентри, чаще всего посредством однонаправленного блока проведения, который будет рассмотрен в следующем разделе, или за счет отрыва фронта волны от границы дефекта [129]. Желудочковая тахикардия вызвана таким отрывом, когда дефект становится центром закрепления спиральной волны [287]. Такой эффект закрепления помогает реентри стабилизироваться, что затрудняет приведение сердечного ритма в норму при помощи протокола низковольтной дефибрилляции. Дефекты чаще всего представляют собой натуральное сформированное образование невозбудимой ткани [288]. В моделировании дефекты называются неоднородностями, которые являются зонами невозбудимой среды не имеющей связи с проводящей частью, что представляет собой своего рода границу проведения. Поведению волны на такой границе возбудимости и посвящен данный раздел.

В моделях, присутствующих в литературе, для описания эффектов на границе проведния культуры принято ставить условия Неймана или бестоковые условия. Влияние

границы было рассмотрено только в классической работе Артура Винфри [52]. Но вопрос с токами на границе возбудимости среды не был изучен. Известно, что существуют токи, называемые демаркационными или травматическими токами (англ. demarcation current или injury current), направленные к травмированной, и уже не проводящей ткани [289]. Данный подраздел рассматривает зависимость данного тока через границу, для его учета при формировании граничных условий в компьютерном моделировании. Далее токи через границу по направлению от проводящей культуры к непроводящей будем называть токами утечки или утечкой. Принципиальная разница граничных условий с утечкой и бесстоковых представлена на Рисунке 39. Левая граница имеет граничные условия Дирихле (стоковые, с утечкой), а правая - Неймана (бесстоковые). В случае условий Дирихле показано не только отставание фронта волны, но и сокращение периода рефрактерности для культуры ткани (белый хвост меньше по длине).

Рисунок 39 - Принципиальная схема для двух разных граничных условий. Слева показаны граничные условия подразумевающие утечку, справа граничные условия без утечки. Компьютерное моделирование прохода плоского стимула. Оттенки серого показывают мембранный потенциал, светло-серый обозначает деполяризованную ткань.

В случае бесстоковых условий границу можно заменить зеркальной границей, что показывает неизмененную линию фронта у такой границы. В случае же границы, имеющей ток утечки, около границы будет определенная электротоническая нагрузка, которая будет увеличивать порог возбуждения и, как следствие, снижать скорость проведения волны возбуждения около границы. Для изучения поведения фронта у разного типа границ была использована следующая экспериментальная схема: высаженный монослой неонатальных крысиных кардиомиоцитов формировал полоску различной ширины, которая варьировалась с помощью полимера РБМБ. РБМБ также моделировал границу нетравматического дефекта (рис. 40). Граница травматического дефекта формировалась при помощи микроманипуляторной иглы.

Рисунок 40 - Принципиальная экспериментальная схема. Монослой кардиомиоцитов высаживается так, что правая граница при росте формируется вдоль блока PDMS, левая граница формируется при помощи иглы на микроманипуляторе. С помощью данной схемы варьируется ширина полоски (w). Искусственные стимулы прилагаются при помощи плоских электродов. Импульсы направлены вдоль смоделированных границ (v).

Таким образом, при помощи красителя чувствительного к концентрации кальция (Fluor 4) и оптического картирования, экспериментально наблюдается фронт волны возбуждения на 2 типах границ (рис. 41). Эксперимент продемонстрировал отставание линии фронта волны вдоль травматической границы.

надрез

PDMS

Электрод

Кардиальный слой

Рисунок 41 - Проведение возбуждения вдоль 2 типов границ, полученное с помощью оптического картирования. Фронт волны представлен в различные промежутки времени после запуска импульса. Зеленым обозначена граница вдоль PDMS, красным травматическая граница. Серым показано проведение волны возбуждения (градиентом от белого к черному).

Для того, чтобы получить реалистичные граничные условия была проведена серия экспериментов для характеризации величины потока через границу. Проводились измерения скорости распространения волн возбуждения в полосках с культурой кардиомиоцитов с различной шириной в экспериментах на культуре клеток (рис. 42). Наблюдаемая скорость распространяющейся волны уменьшалась для полос шириной менее 4 мм. Также была определена критическая минимальная ширина полосы, равная примерно 1 мм. Если полоса была слишком узкой, волна не могла распространяться. Всего было проведено ? 19, 22? 20 экспериментов.

о 40

100

20

60

80

о

2 4 6 8 10 12 Ширина, мм

Рисунок 42 - Зависимость нормированной скорости от ширины для 4 образцов, обозначенных разными цветами, полученная экспериментально.

Результаты компьютерного моделирования показаны на рисунке 43. В модели варьировались граничные условия для моделируемой полосы, они были заданы 3 способами: условиями фон Неймана (без потока), Дирихле (полный поток) и границей с присоединенным пассивным стоком. Таким образом, была получена зависимость скорости проведения волны от ширины полосы для каждого конкретного граничного условия. Затем были выбраны параметры граничных условий, которые были наиболее близки к наблюдаемому экспериментально замедлению волны в узких полосах культуры кардиомиоцитов. Оба варианта условий с током утечки показывают уменьшение скорости с уменьшением ширины. Однако критическая ширина в случае пассивной нагрузки довольно мала. Мы обнаружили, что повреждение может быть описано как падение скорости при фиксированном потенциале в диапазоне от -50 до -

72 мВ.

0 12 3 4

Ширина, мм

Рисунок 43 - Смоделированная зависимость скорости проведения волны возбуждения от ширины образцов с различными граничными условиями. Полученные зависимости представлены линиями различных цветов: граничные условия без утечки (Неймана) (красный, 1), граничные условия с утечкой (Дирихле) с фиксированным потенциалом -72 мВ (фиолетовый, 4) и -20 мВ (синий, 3), граничные условия с пассивной нагрузкой с общим размером 32 мм (если размер бассейна больше 5 мм, то нет разницы в профиле ширины скорости) (зеленый, 2)

Из моделирования был получен важный результат, что применение граничных условий Неймана не всегда является корректным, а учёт токов утечки необходим в случае наличия травматических дефектов, таких как: ишемические зоны, инфарктные рубцы или фибробласты имеющие щелевые контакты (англ. gap junctions) с кардиомиоцитами.

Также с помощью моделирования с применением феноменологических моделей ФитцХью-Нагумо и Алиева-Панфилова и модификации детальной (ионной) модели Корхонен на основе экспериментальных данных было показано, что:

1. Диффузия через границу дефекта приводит не только к изменению динамики мембранного потенциала («активатора»), но и к изменению динамики восстанавливающей переменной рефрактерности («ингибитора»). Подобное изменение может приводить не только к замедлению, но и к ускорению волн вблизи травматических дефектов.

2. Дефекты, оказывающие электротоническую нагрузку на окружающую сердечную ткань, становятся сильным проаритмическим фактором, дестабилизирующим картину проводимости. Данный эффект наблюдается из-за разности в периодах рефрактерности по культуре ткани, что является следствием действия токов утечки.

Полученные выводы в их математической формулировке могут быть применены и для других возбудимых сред, поскольку были получены на общих моделях. Результаты данного раздела подробнее опубликованы в работе Kachalov V. N., Tsvelaya V. A. et al. Success of spiral wave unpinning from heterogeneity in a cardiac tissue depends on its boundary conditions //JETP Letters. - 2017. - Т. 106. - №. 9. - С. 608-612 [15].

4.2.2. Роль границы в культуре с различной проводимостью. Модель однонаправленного блока проведения.

Одним из условий для появления спиральной волны является наличие однонаправленного блока проведения, то есть участка, проводимость которого различна для двух направлений. В случае гомогенной культуры волна возбуждения распространяется симметрично. В случае неоднородности сердечной ткани распростренение возбуждения приобретает ассимитричный характер, что является причиной отрыва волны и формирования нового направления распространения возбуждения, то есть формирование реентри. В данном параграфе будет рассмотрено влияние границы различных возбудимостей и моделирование на основе полученных данных простейшего однонаправленного блока проведения. Также согласно теории возбудимых сред, существуют устойчивые спиральные волны описываемые без предположения о неоднородностях. Подобные реентри называются свободными. Свободные реентри в ассиметричных условиях, таких как градиент возбудимости, описанный в параграфе 4.1.3., не поддаются экспериментальной характеризации и нуждаются в модельном представлении. Моделирование границ возбудимости было осуществлено в данной работе с помощью методов сокультурирования.

Для отработки методов сокультурирования были взяты крысята с разницей в один, два и три дня. Культура, состоящая из более молодых клеток, высаживалась первой (1). На следующий день к ним подсаживалась культура кардиомиоцитов (2), выделенных из крысят на более поздний день их жизни. Предварительно культура (2) помечалась с

помощью специального красителя cellTracker (Molecular Probes CellTracker Red, 577/602 нм), флуоресцирующего в красном диапазоне. В последствии можно было четко определить, где находятся клетки культуры (2) относительно клеток культуры (1) при сокультурировании, что показано на рисунке 44А. Оба типа клеточных культур покрашены на кардио-специфичный белок тропонин Т, свечение которого происходит на 488 нм. Наглядно продемонстрировано, что в процессе сокультурирования клетки не выходили из зоны их посадки, максимальная миграция была на границу сокультур для формирования межклеточных контактов.

Наблюдение за сокультурированными клетками показало, что после удаления перегородки (подробная схема сокультурирования описана в пункте 3.5.2.) в течение первых суток культуры (1) и (2) механически сокращались некогерентно друг с другом. На второй день культуры начали сокращаться синхронно, что показано на Рисунке 44 Б и В. В течение двух, трех дней сокультуры формировали функциональный синцитий, затем его формирование проверялось с помощью оптического картирования, то есть исследовалась возможность проведения электрического импульса по сокультуре разновозрастных кардиомиоцитов.

Импульс подавался точечно на одну из сокультурированных половин, после инициации возбуждения наблюдалось проведение волны через границу между культурами в противоположный конец сокультуры кардиомиоцитов (Рисунок 44 Г). Сигнал подавался в диапазоне частот от 2 до 0,5 Гц с амплитудой 7В. Для каждой половины маски, то есть для культур (1) и (2) были рассчитаны средние скорости распространения волны возбуждения: 7,5 мм/с для культуры (1) и 7,3 мм/с для культуры (2). Ряд экспериментов показал спонтанное проведение волны возбуждения по сукультуре кардиомиоцитов через границу между культурами.

2 4 6 8 10 12 1

Время (с)

Рисунок 44 - А) Иммуностэнинг клеточных культур (1) и (2). Справа находятся клетки культуры (2), высаженные вторыми и окрашенные с помощью флуоресцирующего красным красителя. Показано, что клетки присутствуют и в левой, и в правой половине маски с помощью покраски на тропонин (зеленый), Б), В) Временной контроль сокращений в различных областях вблизи границы разделения двух культур. Пики интенсивности указывают на сокращения кардиомиоцитов в указанной области сокультуры. Культура (2) была покрашена с помощью cellTracker (Molecular Probes CellTracker Red, 577/602 нм), флуоресцирующего в красном диапазоне. Г) Электрическая проводимость со-культуры, в которой справа находится покрашенная культура кардиомиоцитов. Сигнал подавался с частотой 0,5 Гц и амплитудой 7 В. Белыми линиями обозначен фронт волн, распространяющиеся в направлениях, указанных черными стрелками. Цифры у белых линий показывают время (мс) активации, отсчитывая от момента стимуляции. Прямоугольным импульсом отмечено место, в котором был установлен точечный электрод. Также справа представлена пространственно-временная развертка видеоряда в фазовом пространстве.

Отработанная методика сокультурирования была применена к иммортализованной культуре предсердных кардиомиоцитов мыши HL-1 и

неонатальным желудочковым кардиомиоцитам крысы. Аналогично разновозрастной сокультуре на 2-3 день совместного культивирования сокультура окончательно формировала граничный межклеточный контакт, то есть синцитий. Проведение волны через границу было как спонтанным, так и при точечной стимуляции одной из культур с помощью электрода. Данные культуры обладают существенными функциональными различиями, обусловленными их видами. Различия наглядно отражаются в возбудимости и проведении волны возбуждения по отдельным культурам: скорости распространения волнового фронта в культуре НЬ-1 на порядок меньше, а порог возбудимости выше (рис 45Б). Так скорость распространения в культуре НЬ-1 составляет всего 4,6 мм/с.

Далее представленная сокультура была модифицирована: аналогично использовались неонатальные кардиомиоциты крысы, но совместно с культурой НЬ-1 с трансфецированным канальным родопсином ChR2, что сделало одну из частей сокультуры светочувствительной. Таким образом, при помощи светового диода (480 нм) культура неинвазивно возбуждалась серией световых импульсов (длина импульса 20 мс). При этом наблюдался навязанный ритм. Благодаря сформированному контакту между частями сокультуры, волна возбуждения проходила через границу, возбуждая первичную культуру неонатальных куардиомиоцитов крысы. При помощи стимуляции также проверено распространение возбуждения в обратном направлении (от первичной культуры к культуре НЬ-1 СЬЯ2) без задержки на границе в месте контакта культур. На рисунке 45А показана серия кадров видеоряда, отображающая один период прохождения волны возбуждения при световой стимуляции сокультуры.

Рисунок 45 - Проведение возбуждения по сокультуре неонатальных кардиомиоцитов крысы (А) и культурой клеток ИЬ-1 (В). А) Стимуляция со-культуры неонатальных кардиомиоцитов крысы и светочувствительных кардиомиоцитов линии ИЬ-1 серией световых импульсов. Б) Пространственно-временная развертка распространения волны возбуждения в сокультуре клеток ККУСМ и клеток ИЬ-1. Электростимуляция применялась со стороны неонатальных кардиомиоцитов крысы (А) с амплитудой импульса 5 В и частотой 2 Гц. В) Пример блока проводимости в сокультуре: блок проведения каждой второй волны возбуждения

При повышении частоты стимуляции сокультуры электрическими импульсами наблюдался однонаправленный блок проведения волн возбуждения в направлении от первичной культуры к культуре ИЬ-1. В диапазоне частот 0.7-1.0 Гц наблюдалась блокировка каждой второй волны возбуждения (Рис. 45 В), так как линия НЬ-1 имеет более высокий порог возбуждения и низкую скорость проведения волны. При этом все еще наблюдался навязанный ритм с частотой вынуждающей стимуляции. В диапазоне частот 1,6-2,6 Гц иногда происходила блок проведения волн при распространении от ИЬ-1 к первичной культуре. Более высокие частоты не усваивались сокультурой с обеих сторон.

Для проверки полученной модели однонаправленного блока исследовалось влияние лидокаина на электрическую активность сокультур неонатальных клеток кардиомиоцитов и клеток линии HL-1 с транфецированным ChR2 или без него. При добавлении лидокаина в концентрации 30 цМ наблюдался однонаправленное блокирование проведения из культуры HL-1 к культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы. При концентрациях 50 цМ и выше порог возбудимости повышался, из-за чего не наблюдалась электрическая активность в культуре HL-1, скорость фронта волны в XRVCM снижалась до 20-30 %, что демонстрировало абсолютный блок проводимости.

В результате проделанной работы была создана экспериментальная техника сокультурирования по заданному двумерному трафарету для проверки способности двух различных типов возбудимых клеточных культур формировать единую функциональную систему. На основе сокультур был продемонстрирован и исследован неинвазивный способ стимуляции сердечной ткани, а также была создана модель однонаправленного блока проведения для исследования действия различных внешних факторов на простейшую модель реентри. Результаты данного раздела опубликованы Agladze N. N., Halaidych, O. V., Tsvelaya, V. A. et al. Synchronization of excitable cardiac cultures of different origin //Biomaterials science. - 2017. - Т. 5. - №. 9. - С. 1777-1785 [17].

4.3. Роль функционального препятствия в проведении волны возбуждения в культуре человеческих кардиомиоцитов.

4.3.1. Процесс дифференцировки. Формирование функционального синцития в процессе дифференцировки.

Всего в ходе репрограммирования было получено 27 линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСк), полученных от пациентов с мутацией T613M в гене KCNH2, указывающей на синдром удлиненного интервала QT у пациента, 4 из которых (if31-5, if31-8, if31-13, if31-36) были отобраны для дальнейшего культивирования и характеризации. Аналогично из клеток донора без мутаций, оказывающих влияние на сердце, были получены ИПСК: isma6Lи m34sk3.Полученные в результате репрограммирования линии клеток экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния (щелочную фосфатазу, транскрипционные факторы NANOG и OCT4, поверхностные антигены SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81) (рисунок 46,47). Для пациент-

специфичных линий клеток была также характерна транскрипция ряда генов (SOX2, KLF4, c-MYC, NODAL, EBAF, REX1, GDF3, FGF4, UTF1, GAL, GRB7, CD9, PODXL), экспрессирующихся в плюрипотентных клетках человека. Полученные клеточные линии были способны дифференцироваться в производные трех зародышевых листков (рисунок 48 ). Таким образом, анализ подтвердил плюрипотентный статус полученных линий ИПСк.

Рисунок 46 - Морфология линий клеток, полученных в результате репрограммирования фибробластов здорового донора к плюрипотентному состоянию (слева), и экспрессия щелочной фосфатазы в данных линиях (справа). Масштабная линейка - 200 мкм.

Рисунок 47 - Экспрессия транскрипционных факторов NANOG и ОСТ4, а также поверхностных антигенов SSEA4, ТЯА-1-60 и ТЯА-1-81 в линиях клеток, полученных в

результате репрограммирования фибробластов здорового донора к плюрипотентному состоянию. Ядра клеток окрашены DAPI. Масштабная линейка - 100 мкм.

у ' : ■ А^ -ч —■— - . ' л • тиввз ' »V -'/ '•» А'Ч Г г> . '• , ; . ' . • А 1 ' • у" - : . ~ ■ . - / - г, * , • „ ч> ..ч . СК18

СР90 аБМА

Рисунок 48 - Спонтанная дифференцировка линий клеток, полученных в результате репрограммирования фибробластов здорового донора к плюрипотентному состоянию. Экспрессия маркеров трех зародышевых листков в дифференцированных клетках: Р-Ш-тубулин (ТЦББ3, эктодерма), цитокератин 18 (СК18, энтодерма), СБ90 и гладкомышечный а-актин ^МА, мезодерма). Ядра клеток окрашены БАР!

После характеризации линий ИПСк были подобраны условия для осуществления направленной дифференцировки в кардиомиоциты для получения максимального выхода кардиомиоцитов. Подбор протоколов осуществлялся для следующих линий ИПСК: m34Sk3 и isma6L, а также еще одной линий ИПСК if31 -13 от пациента с мутацией Т613М в гене КСМН2, которые проходят в работе с маркировкой «!£». За исходный протокол был взяты протоколы, описанные в пункте 3.2, основанные на активации сигнального пути WNT/p-катенин путем ингибирования протеинкиназы GSK3p с помощью СНЖ99021 и его последующем ингибировании с помощью ^Р2 [220]. Однако выход кардиомицитов после окончания дифференцировки был не более 20 %, что было недостаточным для формирования дифференцированными клетками спустя 50 дней от начала дифференцировки функционального кардиального синцития с равномерным проведением волны возбуждения. Исходный протокол оказался оптимальным только для линии isma6L, где вариация концентраций ингибитора протеинкиназы GSK3p СНЛК99021 дала выход кардиомиоцитов более 40 %. Финальная концентрация СНЖ99021 составила 12 мкМ для этой линии (рисунок 49). Количество кардиомиоцитов позволяло уже на 12 день после

начала дифференцировки из клеток формировать функциональный и проводящий слой. Созревание кардиального слоя для линии isma6L заканчивалось на 50-56 сутки.

Более эффективным протоколом для остальных линий является протокол, в котором активация сигнального пути WNT/p-катенин с помощью СНГО99021 осуществлялась посредством добавления данного ингибитора на 48 ч. Данный вариант протокола был применен к линиям m34Sk3, if31-13, 1131-8, 1131-5. Были протестированы концентрации СНЖ99021 в диапазоне от 6 мкМ до 12 мкМ с шагом 1 мкМ. Клетки инкубировались с ингибитором 48 часов. Далее все манипуляции проходили по основному протоколу. СНЖ99021 играет основную роль в процессе дифференцировки, направляя клетки в мезодермальные. Решение о варьировании концентраций основано также на показателях смертности клеток после добавления ингибитора в течение 24 и 48 часов. При добавлении 12 мкМ СНЖ99021 к клеткам ИПСк, клетки погибали за первые сутки инкубирования с ним, при меньших концентрациях СНЖ99021 клетки выживали, но эффективность дифференцировки в кардиомиоциты была различной. Для линии m34Sk3 оптимальной оказалась финальная концентрация 9 мкМ СНЖ99021, а для линии if31-13 - 8 мкМ СНГО.99021. Конечные протоколы и их отличия наглядно продемонстрированы на рисунке . Для лини ¡131-8 для более успешной дифференцировки добавлялся СНГО.99021 в концентрациях от 6 до 7 мкМ в зависимости от пассажа. Для линии ¡131-5 концентрация составляла 8 - 9 мкМ в зависимости от пассажа.

Рисунок 49 - Конечные протоколы направленной дифференцировки ИПСк в кардиомиоциты, после процесса экспериментального подбора и вариаций концентраций СНГО99021 для линии isma6L (сверху) и для линии if31-13(снизу). На линии представлены

дни, верхними скобами представлено инкубирование клеток с подписанными веществами. (подробнее см. методы)

Проточная цитофлуорометрия выполнялась согласно протоколу, описанному в статье [220]. Присутствие кардиомиоцитов в популяции дифференцированных клеток детектировалось с помощью антител к кардиальному тропонину Т (АЬсат, аЬ8295) -саркомерному белку, специфичному для данного типа клеток. Было установлено, что доля кардиомиоцитов (экспрессирующих кардиальный тропонин Т клеток) составила 47 % для линии m34Sk3 и 30 % для линии if31-13. Выход кардиомиоцитов для линии ¡131-8 составлял порядка 33,1 % (рисунок 50). В процессе работы было установлено, что такой процент является достаточным для формирования однородного функционального проводящего синцития из дифференцирующихся в кардиомиоциты клеток. Первые сокращения клеток обнаруживались через 8 или 9 дней после начала дифференцировки ИПСК.

Alexa Fluor 488-А Alexa Fluor 488-А

Рисунок 50 - Оценка доли кардиомиоцитов (экспрессирующих кардиальный тропонин Т клеток) среди клеток, полученных при направленной дифференцировке линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток m34Sk3 (A) и if31-8 (Б). Оценка проводилась методом проточной цитофлуорометрии. Серым цветом обозначен изотипический контроль.

Данные по увеличению количества полученных кардиомиоцитов после дифференцировки получали также исходя из иммунноцитохимического окрашивания и конфокальных снимков, оценки формирования кардиального синцития с помощью маркеров и оптического картирования образца, которые проводились каждый день после начала дифференцировки. С помощью иммуноцитохимического окрашивания показано,

120

что полученные клетки экспрессируют основные маркеры кардиомиоцитов, например, сердечный тропонин T (cTnT), саркомерный альфа-актинин, тяжелую цепь миозина (MHC) и транскрипционный фактор NKX2.5 (Рисунок 51). На девятый день после начала дифференцировки в клетках наблюдалась экспрессия тяжелой цепи ß-миозина и слабо выраженная поперечнополосатая исчерченность а-актинина. К 28-му дню кардиомиоциты считались зрелыми на основе кардиомаркеров, выявленных с помощью иммунофуоресцентного анализа, и потенциала действия отдельных клеток, регистрируемого методом пэтч-кламп.

Рисунок 51 - Основные маркеры кардиомиоцитов: сердечный тропонин T (cTnT), саркомерный альфа-актинин, тяжелая цепь миозина (MHC) и транскрипционный фактор NKX2.5

В ходе работы был обнаружен эффект самоорганизации индуцированных сердечных клеток на нескольких этапах клеточного формирования. Начиная с девятого дня проводящие клетки организовывались в кластеры. С 12-го дня в монослое начинал экспрессироваться коннексин 43, и эксперименты по оптическому картированию

показывали проведение волны возбуждения. При формировании кластеров (начиная с девятого дня) клетки самоорганизовались так, чтобы проводящие клетки находились поверх многослойной структуры (Рисунок 52). Около 80 % кардиомиоцитов находилось в верхнем слое клеточной культуры (Рисунок 52А и Б). Клетки вели себя похожим образом при дезагрегации с помощью Tripple до 27 дня, о чем будет рассказано подробнее. Трехмерная конфокальная реконструкция показывает, что отмеченные красные кардиомиоциты расположены над другими клетками (Рисунок 52Г). Процесс самоорганизации клеток завершался примерно через 30 дней после начала дифференциации.

Рисунок 52 - Самоорганизованный монослой кардиомиоцитов (линия iSMA6L). Красный цвет отображает клетки экспрессирующие alpha-actinin, альфа-актинин (специфичный маркер кардиомиоцитов), зеленым - Б-асйп, 1-актин (белок цитоскелета, присущий любым типам клеток): а) вид на кусок образца в окрестности стандартного препятствия под углом сверху; б) вид снизу той же культуры снизу; в) боковая проекция; г) конец стандартного препятствия на снимке конфокальной микроскопии образца

Помимо кардиальных маркеров в дифференцирующейся культуре регистрировался коннексин, который активно экспрессировался до 25-ого дня. А его распределение в культуре ткани также говорит о самоорганизации кардиомиоцитов в проводящий монослой, что показано в 3Б на рисунке 53.

Рисунок 53 - Распределение коннексина в верхнем слое дифференцирующейся в кардиомиоциты клеточной культуры. Синим представлены клеточные ядра (ВЛР1), желтым - коннексин 43.

Начиная с 30ого дня, скорость проведения и максимальная усваиваемая частота клеточного слоя медленно возрастали и приближались к постоянным значениям. На 54 день достигалась максимальная зарегистрированная скорость распространения волны для сердечного слоя - 0,3 м/с, которая в дальнейшем оставалась стабильной в своем значении (Рисунок 54А). Между 12 и 20 днями культура усваивала частоты от 1,0 до 1,2 Гц. Соответствующая скорость проведения находилась в диапазоне от 0,05 до 0,1 м/с. Начиная с 20-го дня, тканевая культура усваивала частоты до 1,8 Гц. С 30-го дня культура устойчиво реагировала на импульсы с частотой до 2 Гц. На рисунке Б показано количество импульсов в течение фиксированного интервала времени (8 секунд), который может усвоить культура. После дня 56 распространение возбуждения поддерживало стабильную скорость от 0,2 до 0,3 м/с.

вне*

critical frequency V ( critical frequency }

Рисунок 54 - Характеризация созревания функционального кардиального синцития: а) лепестковая диаграмма скорости распространения волны в зависимости от дня дифференцировки; б) фазовые карты распространения волны возбуждения. Прохождение волны возбуждения показано градиентом от синего к красному. Место стимуляции

обозначено ступенькой импульса. Также представлена развертка возбуждения образца от времени (от 0 до 8 с)

Несмотря на то, что электрофизиологически кардиомиоциты уже созревают примерно к 28 дню, функциональный синцитий сердечной культуры из дифференцированных в кардиомиоциты клеток формируется лишь к 50-му дню, что показано на рисунке 54. Вследствие процессов самоорганизации ткани (Рисунок 54), кардиомиоциты в экспериментальной тканево-инженерной модели к этому времени образуют практически однородный проводящий синцитий на поверхности образца, что приводит к практически полному отсутствию случайных неоднородностей даже при невысоком выходе направленной дифференцировки в кардиомиоциты. То есть образец становится однородным и изотропным. Свойство культуры кардиомиоцитов к самоорганизации позволяет динамически наблюдать поведение волны возбуждения при различной степени неоднородности. В ходе эксперимента на различные дни направленной дифференцировки популяцию дифференцированных производных ИПСК (линия от донора без врожденных сердечно сосудистых заболеваний m34sk3) дезагрегировали с помощью TrypLETM Express до одноклеточного состояния. После удаления ферментирующего раствора из клеточной суспензии, клетки снова высаживались на адгезивную подложку со средой. Образование нового проводящего синцития с восстановлением клеточных контактов происходило постепенно и занимало порядка 7 дней. Далее, если образец был рассажен до 15-го или 20-го дня в зависимости от культуры его полное функциональное созревание происходило аналогично нерассаженным образцам и занимало порядка 50 дней. В течение этого времени посредством оптического картирования определялось наличие и количество спиральных волн в формирующихся образцах (Рисунок 55).

Рисунок 55 - Изменение количества спиральных волн на неоднородностях в процессе самоорганизации синцития. Прохождение волны возбуждения показано градиентом от синего к красному

В ходе эксперимента определен оптимальный день для эффективной пересадки кардиомиоцитов с целью образования однородного синцития. Пересадка от 15 до 20 дня (в зависимости от линии) позволяет получить однородный монослой, пригодный для исследования образования аритмий на стандартном препятствии (Рисунок 56), в то время как при более поздней рассадке после 20-го дня однородный монослой из дезагрегированных клеток уже не образуется.

Рисунок 56 - Оптическое картирование образцов, рассаженных на различные дни дифференцировки. Слева - после рассадки на 18-ый день: при оптическом картировании наблюдается устойчивая волна реентри. Справа - после рассадки на 12-ый день:

активационная карта на 50-ый после начала дифферецировки. Наблюдается однородное изотропное проведение волны возбуждения (градиент от синего к красному)

Способность кардиомиоцитов к самоорганизации в проводящий синцитий сохраняется вплоть до 25 дня дифференцировки (Рисунок 57). Данный факт использовался как тканево-инженерное решение в процессе создания однородных изотропных монослоев для исследовательской модели.

Рисунок 57 - Слои кардиомиоцитов, пересаженных на различные дни: а) и б) слои дифференцированных клеток, рассаженных на 21 день после начала дифференцировки (а -верхняя часть образца; б - нижняя). Показана самоорганизация кардиомиоцитов в верхний слой культуры после 21 -го дня дезагрегации; в) и г) слои клеточной культуры, рассаженной на 26-ой день. Самоорганизации в верхний монослой нет. Зеленый цвет - ф-актин, красный - а-актинин (маркер кардиомиоцитов)

4.3.2. Сравнительный анализ проведения волны возбуждения в культуре человеческих кардиомиоцитов на разных этапах дифференцировки, полученных от пациента с синдромом удлиненного интервала QT, тип 2 (LQT2), и пациента без мутаций. Влияние анизотропии.

На рисунках и показано проведение волн возбуждения на однородных

изотропных образцах, дифференцированных от линий без патологий, при стимуляции

126

точечным электродом (рисунок ) и без нее. Распространение волн возбуждения по дифференцированной сердечной культуре для линий iSMA6L приведен на рисунке 54, где показано проведение при небольших частотах спонтанного возбуждения. Волна распространяется от места стимула изотропно и без разрывов, динамика кальция, представленная на временной развертке от интенсивности флюоресценции (рисунок 58), показывает последовательное возбуждение и релаксацию монослоя. Частота спонтанной активности составляет порядка 40 уд/мин, что соответствует низким частотам сердечного сокращения у здорового человека в покое. Такой монослой способен проводить имульсы с высокой частотой при высокой частоте стимуляции (Рисунок 58). При этом не обнаружено нарушений в проведении даже при частоте от 3 до 5 Гц, и нет сбоев в периодах возбуждения и релаксации монослоя.

А Б

0 2 4 6 8

Время, с

Рисунок 58 - Волна возбуждения в монослое человеческих кардиомиоцитов линии iSMA6L; а) распространение спонтанного возбуждения по монослою кардиомиоцитов, диаметр образца - 15 мм. В левой верхней части - время. В прямоугольнике - область, на которой фиксировалась зависимость сигнала от времени; б) последовательное возбуждение клеток и их релаксация в выбранной области. Красными стрелочками показано направление передачи возбуждения соседним клеткам; в) графическая развертка

интенсивности сигнала возбуждения кардиомиоцитов линии iSMA6L с выбранного фрагмента ткани по времени. Пики интенсивности соответствуют максимальному возбуждению выбранного фрагмента

В случае дифференцировки в кардиомиоциты линии if31-5 (и других линий с данной маркировкой), имеющей врожденную мутацию, вызывающую синдром LQT2, усваиваемые культурой частоты стимуляции существенно отличаются от монослоя линии iSMA6L. Спонтанная активность, как и собственная спонтанная частота, у полученных сердечных клеток от этой линии гораздо ниже, так как клеткам требуется гораздо больше времени для релаксации или реполяризации, чем клеткам от линии iSMA6L. На рисунке представлено сравнения активности индуцированных кардиомиоцитов этих двух линий. Повышение частоты стимуляции таких образцов ведет к тому, что следующий возбуждающий импульс достигает клетки до того, как она полностью реполяризуется, что нарушает правильную проводимость возбуждения (рисунок 59), показанную на рисунке . Такого рода нереполяризованные клетки создают случайные неоднородности, которые приводят к циркуляции волны возбуждения вокруг них- реентри. Если частота циркуляции волны превышает частоту собственно частоты возбуждения, то происходит подавление последней. Исходя из полученных данных (рисунок 59) такой сценарий гораздо более вероятен у клеток линии if31 -5.

Рисунок 59 - Активность индуцированных кардиомиоцитов, полученных от разных линий: а) isma6L ; б) if31 -5

На линии if31 -5 с врожденным LQT2 изучена динамика кальция при высоких частотах стимуляции (Рисунок 60). Подобный образец является однородным лишь для определенного диапазона частот. Исследование и сравнение линий привело к созданию тканево-инженерной модели для исследования механизма образования реентри и для регистрации безопасного диапазона частот для линий с различными врожденными патологиями или при воздействии различных факторов.

Рисунок 60 - Активационная карта распространения волны возбуждения по образцу с врожденным LQT2. На графиках указана динамика флуоресценции кальций-зависимого

красителя при указанной частоте электродной стимуляции. Длительность записи кальциевой на всех представленных графиках 8 с. Прохождение волны возбуждения показано градиентом от синего к красному

Сравнительный анализ кардиальных синцитиев, полученных от линий с мутацией (11) и без мутации, показывает, что скорость у синцития с мутацией гораздо ниже, чем для синцитиев, полученных от ИПСк без мутаций. Распространение фронта волны также различно. Проведение для линий, полученных от пациентов без мутаций, изотропно, в то время как для кардиомиоцитов с мутациями самоорганизация занимает больше времени, а проведение можно считать изотропным только к 40-50 дню (рисунок 61).

Рисунок 61 - Фазовые карты распространения волны возбуждения по полученному в лунке диаметром 15 мм монослою клеток.

А. Фазовая карта для распространения возбуждения за время 50мс по монослою клеток iSMA6L на 30-й день дифференцировки, проведение изотропно, на графике слева показано значение интенсивности флуоресценции йио-4 (АМ), сопряженной с проходом волны ионов Са2+. Количество пиков на графике показывает, сколько раз культура успела возбудиться от электродного стимула за рассмотренный промежуток времени (8 секунд). На рисунке показано проведение при частоте стимула порядка 1.4Гц

Б. Фазовая карта для того же образца за 50мс, но при меньшей частоте, задаваемой электродом - 1Гц, заметно, что область распространения волны больше, следовательно, скорость проведения волны при такой частоте выше.

В. Фазовая карта построена для распространения возбуждения по монослою клеток if31-5 на 19-й день дифференцировки за время 1.2 сек. График слева показывает, что скорость распространения заметно ниже, реполяризация занимает значительно большее время, чем у линии без мутации в канале тока 1Кг.

Для создания экспериментальной модели влияния внешних факторов на сердечную ткань и подбора лекарственных средств были изучены модели анизотропных и изотропных образцов, смоделированных с помощью нановолокон (Рисунок 62) для поиска оптимальной подложки в процессе дифференцировки ИПСК в кардиомиоциты. Процесс поиска оптимальных условий был необходим для лучшего формирования функционального синцития в процессе дифференцировки, а также для исследования влияния анизотропии на проведение. Таким образом, было определено 3 типа подложек: 1) представляющие собой направленно ориентированные или выровненные волокна (Рисунок 62А); 2) хаотически расположенные волокна (Рисунок 62Б); 3) стекло; 4) адгезивный пластик. Все четыре вида подложек покрывались специальным матриксом для роста клеток Geltrex. Выше мы рассматривали только 4 вид подложки, на котором и было продемонстрированно наиболее однородное формирование сердечного монослоя. А скорости после 50-го дня соответствовали скоростям, полученным на срезах человеческого сердца.

Рисунок 62 - Различные типы волокон, полученных с помощью электроспиннинга; а) направленно ориентированные волокна, полученные с помощью щелевого коллектора. Или анизотропная нановолоконная подложка; б) хаотически расположенные волокна, полученные без щелевого коллектора. Изотропная нановолконная подложка

После посадки ИПСк на 2 тип подложки клеточные колонии располагались примерно также как и на пластике. Однако, при посадке ИПСк на направленные волокна (1 тип) колонии вытягивались вдоль волокон, что продемонстрировано на рисунке 63. На таких волокнах конфлюэнтный монослой формировался в 2 раза медленней, чем на подложках из пластика и стекла.

Рисунок 63- Колонии ИПСК, посаженные на направленно ориенированных (выровненных) волокнах; а) увеличение в 20 раз; б) увеличение в 10 раз

Если проводить рассадку кардиомиоцитов на выровненные волокна, то можно увидеть вытягивание их цитоскелета по волокну (Рисунок 64). Некоторые из кардиомиоцитов образуют кластеры, их калициевая активность и сокращения,также быстрее распространяются против направления волокон.

Рисунок 64- Кардиомиоциты, посаженные на направленные волокна: а) посадка 100 тысяч клеток; б) посадка 50 тысяч клеток. На рисунках представлены поликапролактоновые волокна. Синий - ядра клеток и волокна; зеленый - ф-актин у клеток

Формирование функционального проводящего протекало на всех подложках по-разному.

На изотропной подложке (хаотичных волокнах) формирование почти не происходило.

Клетки сбивались в кластеры и сокращались в них, не соединяясь друг с другом. Также

было проведено оптическое картирование образцов на разных подложках после 50ого дня

от начала дифференцировки (Рисунок 65). Как показано на рисунке в при точечной

стимуляции образца на изотропной подложке волна возбуждения не распространялась, а

происходило возбуждение лишь соседних с электродом клеток. На рисунке 65 а и б

показаны активационные карты образцов на анизотропной подложке, то есть на

направленных волокнах. Как показано возбуждение распространяется крайне

неравномерно. Быстрее волна возбуждения проходит против волокон. Наиболее

равномерно возбуждение распространялось на образцах с подложкой из стекла и

пластика. Сравнив активационные карты, обнаружилось, что самый однородный

133

монослой из дифференцированных в кардиомиоциты клеток формируется на пластике. Эксперименты были проделаны для линии isma6L

Рисунок 65 - Активационные карты оптического картирования дифференцированного из ипск монослоя кардиомиоцитов на различных подложках; а) и б) активационные карты образцов на анизотропных подложках; в) на изотропной подложке; г) на стекле, покрытой матриксом geltrex. звездочкой обозначены места стимуляции образцов точечным электродом. стрелочками указано направление волокон в случае их направленности.

Результаты данного раздела частично опубликованы совместно с институтом хирургии Петровского [13].

4.3.3. Функциональное препятствие как средство для сравнительного исследования культур человеческих кардиомиоцитов с различными патологиями. Тест на аритмогенность.

В подавляющем большинстве современных экспериментальных моделей, позволяющих изучать и анализировать случаи возникновения реентри на ткани из желудочковых кардиомиоцитов, разрывы волн могут возникать на случайных неоднородностях, хаотически расположенных по всему образцу. Такой случайный разброс неоднородностей был изучен в предыдущем разделе, на примере клеток, полученных от линий с врожденным синдромом удлиненного интервала QT. Абсолютная хаотичность разрывов волн не дает возможности анализировать данные о случаях нарушения проведения в образце, необходимые для определения механизма возникновения реентри, так как данные в подобных экспериментах являются случайными и бессистемными, а сам эксперимент невоспроизводимым. Для решения этой проблемы на данном этапе проекта была создана экспериментальная тканево-инженерная модель со стандартной неоднородностью, представляющей собой острый разрез на ткани со стандартной толщиной порядка 30 мкм (Рисунок 52). Данные из модели основываются на едином системном параметре, на мере аритмогенности. Мера аритмогенности, введенная для нашего теста, представляет собой вероятностное выражение (количество случаев) любого нарушения проведения на данном стандартном препятствии для различных частот на культуре клеток, полученных от различных пациентов. Одно такое значение высчитывается для каждой частоты стимуляции на нескольких образцах от одного пациента. Удобнее представлять меры аритмогенности в виде столбиковой диаграммы, в которой для разных частот электродной стимуляции фиксируется 3 случая проведения волны возбуждения на модели: 1) случаи нормального проведения (без разрывов волн); 2) собственно меры аритмогенности, как случаи возникновения реентри в окрестности стандартного препятствия; 3) случаи неусвоения электрического стимула тканью (ткань не отвечает на подаваемые импульсы с частотой их подачи). Во всех экспериментах фронт волны распространялся строго перпендикулярно стандартному препятствию. На рисунке 66 показаны фазовые карты части описанных режимов проведения на ткани и пограничных случаев между ними на модели с полностью заблокированным IKr (моделирование LQT2 с помощью блокатора E4031 на сердечных клетках, дифференцированных из линии от донора без врожденных сердечно-сосудистых заболеваний iSMA6L). Синим цветом выделены края образца (диаметр - 15 мм), серым -

стандартное препятствие, фазовые карты на образце показывают передний фронт волны в различные моменты времени. На рисунке 66а представлен случай распространения волны при частоте стимуляции 1 Гц, разрывы волн не наблюдаются. Это первый режим, режим нормального проведения. На рисунке 66б представлено проведение при частоте стимулчции 1,05 Гц. Из рисунка видно, что траектория фронта волны в окрестности препятствия меняется, наблюдается временный отрыв волны на конце острого препятствия. Это пограничный случай между первым и вторым режимом проведения, где происходит так называемый «подскок» волны на препятствии, при котором волна реентри не возникает. На рисунке 66в показана стимуляция с частотой 1,1 Гц, которая является критической для данного образца, происходит отрыв волны от препятствия с образованием устойчивой спиральной волны (реентри).

\ I» В

г*—11 т

п. 1 Л

Рисунок 66 - Фазовые карты распространения волны возбуждения по образцу с вызванным LQT2. Место стимуляции указано белой ступенькой: а) нормальное проведение; б) незначительный отрыв волны возбуждения от препятствия; в) образование реентри на препятствии. Прохождение волны возбуждения показано градиентом от синего к красному. Ступень импульса обозначает место точечной стимуляции образца

На рисунке 67 в виде такой столбиковой диаграммы приведены меры аритмогенности для контрольного образца (линия iSMA6L, рисунок 67а), и для культуры человеческих кардиомиоцитов с индуцированным LQT2, который был вызван путем добавления 1600 нМ специфичного блокатора 1Кг - Е4031 (рисунок 67б). Столбцы представляют собой меры аритмогенности: синими столбцами обозначены случаи возникновения реентри, серым - неусвоение ритма, на столбиках дробью отображена доля таких случаев во всех проведенных экспериментах. В случаях нормального проведения и когда в эксперименте на заданной частоте не наблюдалось ни разрывы волн, ни неусвоения частоты стимуляции столбики на диаграмму не наносились. Мера аритмогенности и стандартное препятствие были впервые введены нами впервые, и являются основой данной исследовательской стандартной тканево-инженерной модели.

Рисунок 67 - Мера аритмогенности для линии iSMA6L. Соответствующие частоты стимуляции указаны по горизонтальной оси в единицах импульс/м: а) контрольный случай (без добавления блокаторов); б) индуцированный LQT2 (1600 нМ Е4031)

С помощью меры аритмогенности стало возможно получать однозначно интерпретируемые и хорошо воспроизводимые данные о риске возникновении аритмии при различных частотах стимуляции. Такие данные могут быть перенесены в качестве рекомендательной информации при терапии пациентов. Для исследований и в перспективе подобной терапии наиболее важна возможность определения критической частоты возникновения реентри - минимальная частота электродной стимуляции, при которой возможны разрывы волн на стандартном препятствии. Значения критических частот и максимальных усваиваемых частот стимуляции хорошо согласуются с таковыми для взрослой сердечной ткани. Данные диаграммы позволяют количественно и качественно оценить различие риска возникновения реентри при увеличении частоты стимуляции, что приводит к предположению о ключевой роли неоднородностей в образовании реентри у пациентов с LQT2. Так, частоты от 1 Гц до 1,7 Гц являются безопасными для контрольной ткани. В том же коридоре частот встречаемость случаев нарушения проведения у образцов, соответствующих индуцированному LQT2 достигает максимально возможного значения. На рисунке 68 показано изменение контрольной диаграммы (Рисунок 68а) при добавлении различных концентраций лидокаина.

Рисунок 68- Мера аритмогенности ткани под действием различных концентраций лидокаина. Соответствующие частоты стимуляции указаны по горизонтальной оси в единицах импульс/мс: а) 100 мкМ; б) 200 мкМ

Важно отметить, что при концентрации лидокаина 100 мкМ риск возникновения реентри на препятствии еще существует, более того, в коридоре частот от 1,4 Гц до 1,7 Гц даже превышает таковой для контрольных образцов. Тогда как доза в 200 мкМ лидокаина полностью подавляет образование спиральных волн при любых частотах стимуляции. Таким образом, можно с высокой точностью определять влияние препаратов на образование реентри, а также специфично подбирать как оптимальные, так и критические концентрации действующего вещества.

Таким образом, моделирование процесса смены частоты стимуляции на слоях культивированных кардиомиоцитах показало несостоятельность гипотезы "уязвимого окна", то есть стимуляции в определенный диапазон частот. Была подтверждена роль неоднородностей в образовании реентри и переходе к хаотическому режиму распространения возбуждения. Полученная на базе этих экспериментальных исследований тканево-инженерная модель со стандартизованными параметрами и неоднородностью подходит для исследования базовых механизмов возникновения реентри. В том числе и для сравнительного анализа аритмогенного действия различных препаратов, также, как и для сравнения вероятности образования реентри в слоях здоровых клеток и сердечных клеток с каналопатией, возможно использовать взаимодействие волн возбуждения со стандартизированной неоднородностью, описанное в нашей модели как мера аритмогенности.

Меру аритмогенности можно определять не только с помощью кальциевых красителей, но и с помощью потенциал-зависимых красителей (рисунок 69). Данный метод будет характеризовать длительность потенциала действия и вероятность возникновения реентри. Также метод позволяет убедиться в превалирующем большинстве кардиомиоцитов желудочкового типа, что следует из характера ПД и его длительности в контроле, то есть без добавления веществ.

Рисунок 69 - Потенциал действия, зафиксированный оптическим картированием с помощью потенциал-зависимых красителей, в контроле (черный) и в присутствии 1 мкМ изопреналина (красный)

Результаты данного раздела опубликованы в статье Slotvitsky M., Tsvelaya V. et al. Arrhythmogenicity Test Based on a Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Cardiomyocyte Layer //Toxicological Sciences. - 2018.) [7]. С помощью данного теста были протестированы такие вещества как: ботулотоксин, эритромицин, эндоксан и другие. Исследование на основе предложенной модели будет рассмотрено на примере ботулотоксина

Согласно рисунку 70, возбудимость полученной культуры ткани под действием ботулотоксина типа А падает, однако, некоторое время скорость проведения волны возбуждения остается примерно одинаковой для разных концентраций. Касательно критических частот, как и в контроле, при добавлении 0,001 и 0,01 ед. ботокса культура ткани усваивала все частоты от 1 до 3,33 Гц. При добавлении 0,1 разведения вещества культура переставала усваивать частоту 3,33 Гц, но усваивала частоты от 1 до 2,86 Гц. При задаваемой частоте 3,33 Гц культура проводила с частотой 1,67 Гц, реентри при этом не возникало, что говорит об антиаритмических свойствах данного препарата.

1,2

0 0,001 0,01 0,1 Концентрация ботулотоксина, ед.

Рисунок 70— Падение скорости проведения волны возбуждения в монослое человеческих кардиомиоцитов в зависимости от концентрации ботулотоксина. Все скорости представлены в относительных единицах от максимальной скорости контроля

После добавления ботулотоксина постепенно падала скорость и постепенно терялась проводимость зон на культуре ткани человеческих кардиомиоцитов. Из рисунков 71 А и Б (контроль и с добавлением 0,01 ед.) видно уменьшение скорости проведения волны возбуждения, так как расстояние между фронтами волн уменьшилось. На рисунке 71В уже заметно уменьшилась площадь проведения волны возбуждения.

Риунок 71 — Активационные карта проведения волны возбуждения в контроле, при добавлении ботулотоксина и после отмывок: а) активационная карта контроля; б) активационная карта при добавлении 0,01 ед. ботулотоксина; в) активационная карта при

добавлении 0,1 ед. ботулотоксина; г) активационная карта после 20 минут отмывки;д) активационная карта через сутки после начала отмывки. Все карты - с шагом в 4 кадра (2 мс). Распространение волны возбуждения: от фиолетового к красному. Красная точка -

место стимула (8 мВ)

Концентрацию 0,1 ед. можно считать критической для добавления в культуру индуцированных человеческих кардиомиоцитов, так как после 20 минут инкубирования в ней образец стал стремительно терять способность к проведению волны возбуждения до полной потери проводимости и отсутствия реакции на внешний стимул. На рисунке 72 представлены данные по восстановлению образцов после действия ботулотоксина. Как видно из рисунка спустя некоторое время (12 суток) эффект ботулотоксина полностью исчезает, а образец усваивает все задаваемые частоты, чего не было спустя 24 часов после отмыва. После 24 часов монослой не усваивал частоты 2,5 Гц и более. Однако, реентри опять же не возникали ни при одной частоте. На рисунке 71 Г, Д показано восстановление проводимости образца после полного отсутствия проведения и реакции на стимул. Аналогичные экспериментыбыли проведены и на культуре неонатальных кардиомиоцитах крысы .

Рисунок 72 — Восстановление возбудимости монослоя человеческих индуцированных кардиомиоцитов до и после прекращения добавления ботулотоксина на разных временах. Все скорости представлены в относительных единицах от максимальной

скорости контроля

Полученных экспериментальных данных по исследованию различных типов веществ и их аритмогенности на базе представленной тканево-инженерной модели в будущем хватает для описания эффекта действия и проверки механизма, а также для подбора лекарственных средств и создания базы данных индивидуальных особенностей.

5. Обсуждение

Представленная работа состоит из 3 основных частей, заключающихся в исследовании: влияния внешних факторов на сердечную ткань, роли неоднородностей в сердечной ткани, врожденных или приобретенных патологий. На основе полученных данных была осуществлена основная цель работы по созданию тканевоинженерной исследовательской модели сердечных заболеваний человека. Обобщенно, можно сказать, что работа включала в себя исследование главных факторов развития сердечных аритмий на разрабатываемых в процессе работы компьютерных и экспериментальных моделях.

В качестве материала для создания модели использовалось несколько типов клеточных культур: неонатальные кардиомиоциты крысы, иммортализованная культура HL-1, в том числе и с трансфецированным канальным родопсином, пациент-специфичные линии человеческих ИПСк. Аритмией сердца называется любое отклонение частоты сердцебиения от нормального синусового ритма. Основной причиной возникновения аритмий в сердечной мышце является появление одностороннего блока с последующим образованием спиральной волны или реентри, которая представляет собой волну, вращающуюся по кругу с частотой, не зависящей от главного водителя ритма. Данная работа рассматривает одну за другой причины возникновения реентри для последующего моделирования данных процессов. Особый акцент в работе сделан на неоднородностях и их роли в возникновении реентри. Решающая роль неоднородностей отмечена после моделирования так называемых свободных реентри и регулирования возбудимости в получаемых моделях.

В исследованиях было обнаружено, что наиболее вероятным механизмом

возникновения реентри в сердечной ткани является взаимодействие распространяющихся

волн возбуждения с неоднородностью, при превышении критической частоты следования

волн. Было известно, что резкое увеличение частоты сокращений сердца может приводить

к эпизодам тахиаритмии, нередко переходящим в фибрилляцию. Высказывались

гипотезы, что образование реентри в такой системе может происходить из-за

неоднородностей рефрактерности сердечной ткани (Кринский ВИ, Биофизика1968, Jalife,

Circulation Res 2013) или из-за стимуляции в так называемое "уязвимое окно" (Starmer CF,

Biophys J 1993). Моделирование процесса смены ритма на слоях культивированных

кардиомиоцитах показало несостоятельность гипотезы "уязвимого окна", т.к. без внешней

стимуляции этого эффекта достичь не удается. Была подтверждена роль неоднородностей

142

в образовании реентри и переходе к хаотическому режиму распространения возбуждения. Таким образом, для сравнительного анализа аритмогенного действия различных препаратов, также, как и сравнения вероятности образования реентри в слоях здоровых клеток и сердечных клеток с каналопатией, было предложено использовать взаимодействие волн возбуждения со стандартизированной неоднородностью. Данная модель и была предложена, как итоговое тканевоинженерное решение для исследования аритмий. Модель представляет собой слой кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК и самоорганизующихся в подобие сердечной ткани (сердечный синцитий), со стандартизованными параметрами.

В подавляющем большинстве современных экспериментальных моделей, позволяющих изучать и анализировать случаи возникновения реентри на ткани из желудочковых кардиомиоцитов, разрывы волн могут возникать на случайных неоднородностях, хаотически расположенных по всему образцу. Это усложняет интерпретацию данных о случаях нарушения проведения в образце, необходимую для четкого определения механизма разрыва волн в случае с удлиненным QT интервалом. Для решения этой проблемы, созданная нами экспериментальная тканево-инженерная модель была дополнена стандартной неоднородностью, представляющей собой острый разрез на ткани со стандартной толщиной порядка 30 мкм. Важная роль стандартной неоднородности заключается в том, что именно в ее окрестности фиксировались и учитывались случаи возникновения реентри как у здоровой ткани, так и у ткани с индуцированным LQT2. Это позволило обобщать результаты экспериментов посредством вероятностной меры аритмогенности. Мера аритмогенности, введенная для нашего теста, представляет собой количество случаев любого нарушения проведения на данном стандартном препятствии для различных частот на культуре клеток, полученных от различных пациентов. Эффективность теста проверена как для сердечной ткани, содержащей наследуемые мутации, приводящие к синдрому LQT, так и для ряда фармпрепаратов(Е-4031, лидокаин, ботулотоксин), в качестве побочного действия вызывающих синдром LQT. Таким образом, созданная стандартная тканево-инженерная модель дает возможность тестирования различных лекарственных соединений на пациент-специфичном сердечном синцитии.

Стоит отметить, что данные полученные в работе могут быть использованы и для клеточной терапии. Так как в процессе работы были изучены важные этапы клеточной дифференцировки и выявлено временное окно, в котором дифференцирующиеся в кардиомиоциты из ИПСк клетки могут еще формировать межклеточные контакты и

образовывать функциональный синцитий. Также была проверена возможность формирования возникновения синцития при совместном культурировании клеток животных разных видов. На культуре ткани была протестирована возможность неинвазивного метода стимуляции после внедрения светочувствительных клеток в культуру ткани. Помимо этого, были смоделированы эффекты внешнего воздействия при факторах ишемии, что дало представление о существовании кальциевых волн возбуждения в сердечной ткани.

В заключении подведем общий итог по задачам работы:

1. Было проведено исследование и компьютерное моделирование факторов, участвующих в процессе ишемии. Найдены условия и параметры для проведения кальциевых волн возбуждения и возможности деполяризации кардиомиоцитов при различных концентрациях ионов во внешней среде. Полученные результаты по влиянию локальной ишемии, в частности гиперкалиемии, а также модифицированная модель Корхонена для неонатальных кардиомиоцитов крысы опубликованы [16].

2. Проведено исследование свободных реентри в анизотропной среде, при градиенте возбудимости. Создана модель однонаправленного блока проведения.

3. Исследовано распространение волны возбуждения вдоль границы возбудимости или невозбудимого препятствия по культуре сердечных клеток. Найдены граничные условия для травматических дефектов. Проведено моделирование данных условий. Полученные результаты опубликованы [15].

4. Исследовано электромеханическое взаимодействие клеток различных типов, в том числе клеток, полученных от разных животных. Полученные результаты опубликованы [17].

5. Исследованы условия создания неинвазивного метода стимуляции сердечной ткани и контроля возбудимости (метод оптической стимуляции)

6. Исследована роль неоднородностей при формировании реентри на культуре сердечной ткани.

На основе полученных данных была реализованы основная цель данной работы:

Была создана тканево-инженерная модель для исследования различных патологических сердечных заболеваний человека, как врожденных, так и преобретенных. Проверка полученной тканево-инженерной модели на нескольких блокаторах и лекарственных соединениях показала релевантность предлагаемой модели. Результаты опубликованы

в ряде работ [13, 14, 7]. В процессе работы также были опубликованы статьи, не вошедшие в основные результаты [198, 118, 75, 283, 284, 285, 286].

6. Выводы

Основным итогом работы является тканевоинженерная экспериментальная модель для исследования риска возникновения аритмий под воздействием как внешних факторов, так и врожденных пациент-специфичных патологий. Данная модель является на данный момент наиболее приближенной к человеческой сердечной ткани, так как исследована на предмет формирования функционального синцития, имеет биофизическое обоснование в качестве стандартной неоднородности и основана на человеческих пациент-специфичных каодиомиоцитах, полученных путем дифференцировки из ИПСк. Из исследований, проведенных в представленной работе можно сделать ряд выводов:

1. Существуют временные границы формирования межклеточных контактов у кардиомиоцитов в процессе дифференцировки. Этот факт позволяетполучить применение выявленной в работе самоорганизации слоя сердечных клеток как метода сортировки/изоляции hiPSC-CMs с определенными временными границами: от 8 до 20 дня от начала дифференцировки. Эти данные могут быть использованы для клеточной терапии.

2. На тканевоинженерной модели подтверждена ключевая роль неоднородностей и травматических дефектов в возникновении тахоаритмий..

3. Существует возможность межвидовой пересадки сердечных тканей с формированием электро-механического кардиального синцития.

4. Проведение тестирования фармпрепаратов на полученной модели показало перспективность индивидуального подбора лекарственных препаратов.

Результаты и выводы представлены автором в ряде публикаций [7, 13-17], часть из них не вошли в основные результаты работы [198, 118, 75, 283, 284, 285, 286].

7. Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Константину Игоревичу Агладзе за постановку задачи и обсуждение результатов. Также автор бесконечно признателен своему руководителю по экспериментальной работе с культурами клеток ИПСк Дементьевой Елене и руководителю по компьютерному моделированию Кудряшовой Нине за неоценимую помощь во всех аспектах подготовки данной работы.

Автор благодарит своих соавторов за огромный вклад в представленную работу:

Слотвицкого Михаила за помощь в получении и оформлении экспериментальных данных,

Валетдинову Камиллу за получение и ведение части линий ИПСк

Качалова Вячеслава за участие в компьютерном моделировании

Калиту Ирину за помощь в составлении компьютерного моделирования

Доронина Романа за помощь в компьютерном моделировании

Агладзе Надежду Николаевну за обучение конфокальной микроскопии

Галайдыча Олега за начальное руководство над проектом

Подгурскую Алису за помощь в обработке данных

Шейду Фролову за предоставление экспериментальных данных patch-clamp,

Низамиеву Айгуль, Павлову Софью и Балашова Виктора за содействие в выполнении экспериментов

Отдельную благодарность автор выражает клинике им. Мешалкина (Новосибирск), институту хирургии им. Петровского (Москва), а также группе профессора Закияна из ИЦИГ РАН (Новосибирск).

8. Список используемых сокращений

9. Список литературы

1. Wang H. et al. Global, regional, and national life expectancy, all-cause mortality, and cause-specific mortality for 249 causes of death, 1980-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015 //The lancet. - 2016. - Т. 388. - №. 10053. -С. 1459-1544

2. Roth, Gregory A., et al. "Global and regional patterns in cardiovascular mortality from 1990 to 2013." Circulation 132.17 (2015): 1667-1678

3. Cabo C. et al. Wave-front curvature as a cause of slow conduction and block in isolated cardiac muscle //Circulation research. - 1994. - Т. 75. - №. 6. - С. 1014-1028.

4. Gray R. A., Pertsov A. M., Jalife J. Spatial and temporal organization during cardiac fibrillation //Nature. - 1998. - Т. 392. - №. 6671. - С. 75.

5. Lahti A. L. et al. Model for long QT syndrome type 2 using human iPS cells demonstrates arrhythmogenic characteristics in cell culture //Disease models & mechanisms. - 2012. - Т. 5. -№. 2. - С. 220-230.

6. Kadota S. et al. Development of a reentrant arrhythmia model in human pluripotent stem cell-derived cardiac cell sheets //European heart journal. - 2012. - Т. 34. - №. 15. - С. 1147-1156.

7. Slotvitsky M., Tsvelaya V. et al. Arrhythmogenicity Test Based on a Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Cardiomyocyte Layer //Toxicological Sciences. -2018.)

8. Lehnart S. E. et al. Inherited arrhythmias: a National Heart, Lung, and Blood Institute and Office of Rare Diseases workshop consensus report about the diagnosis, phenotyping, molecular

9.

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

mechanisms, and therapeutic approaches for primary cardiomyopathies of gene mutations affecting ion channel function //Circulation. - 2007. - Т. 116. - №. 20. - С. 2325-2345. Lee M. P. et al. Targeted disruption of the Kvlqt1 gene causes deafness and gastric hyperplasia in mice //The Journal of clinical investigation. - 2000. - Т. 106. - №. 12. - С. 1447-1455. Casimiro M. C. et al. Targeted disruption of the Kcnq1 gene produces a mouse model of Jervell and Lange-Nielsen Syndrome //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - Т. 98. - №. 5. - С. 2526-2531.

Kaese S., Verheule S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size //Frontiers in physiology. - 2012. - Т. 3. - С. 345.

Nerbonne J. M. et al. Genetic manipulation of cardiac K+ channel function in mice: what have we learned, and where do we go from here? //Circulation research. - 2001. - Т. 89. - №. 11. - С. 944-956.

Цвелая В. А. и др. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК И ПРОВЕДЕНИЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ В ВЕНТРИКУЛЯРНЫХ КАРДИОМИОЦИТАХ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ ЗДОРОВОГО ИНДИВИДА И ПАЦИЕНТА С СИНДРОМОМ УДЛИНЕННОГО ИНТЕРВАЛА QT //Клиническая и экспериментальная хирургия. - 2018. - Т. 6. - №. 3.

Slotvitsky M. M., Tsvelaya V.A. et al. The study of the functionality of cardiomyocytes obtained from induced pluripotent stem cells for the modeling of cardiac arrhythmias based on long QT syndrome //Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii. - 2018. - Т. 22. - №. 2. - С. 187-195. Kachalov V. N., Tsvelaya V. A. et al. Success of spiral wave unpinning from heterogeneity in a cardiac tissue depends on its boundary conditions //JETP Letters. - 2017. - Т. 106. - №. 9. - С. 608-612.

Tsvelaya V. A. et al. Cardiac excitation waves under strong hyperkalemia condition //JETP Letters. - 2018. - Т. 108. - №. 8. - С. 548-552.

Agladze N. N., Halaidych, O. V., Tsvelaya, V. A. et al. Synchronization of excitable cardiac cultures of different origin //Biomaterials science. - 2017. - Т. 5. - №. 9. - С. 1777-1785. Синельников Р. Д., Синельников Я. Р. Атлас анатомии человека. Учебное пособие. Том 4. - М.: Медицина, 1996.

Loukas M. et al. History of cardiac anatomy: a comprehensive review from the Egyptians to today //Clinical Anatomy. - 2016. - Т. 29. - №. 3. - С. 270-284. Torrent-Guasp F. et al. The structure and function of the helical heart and its buttress wrapping. I. The normal macroscopic structure of the heart //Seminars in thoracic and cardiovascular surgery. - WB Saunders, 2001. - Т. 13. - №. 4. - С. 301-319.

Камкин А. Г., Каменский А. А. Фундаментальная и клиническая физиология //М.: Академия. - 2004. - С. 521-551

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Morgan D., Raff M., Roberts K., Walter P. «Molecular biology of the cell» // 6th edition - P. 25-1392

Фролов В.А., Дроздова Г.А., Казанская Т.А., Билибин Д.П., Демуров Е.А.

«Патологическая физиология»

Михайлов А. Волны в сердце //Квант. - 1987. - №. 9.

Fozzard H. A. Excitation-contraction coupling in the heart //Cellular and Molecular Mechanisms in Hypertension. - Springer, Boston, MA, 1991. - С. 135-142.

Bers D. Excitation-contraction coupling and cardiac contractile force. - Springer Science & Business Media, 2001. - Т. 237.

Noble D., Noble S. J. A model of sino-atrial node electrical activity based

on a modification of the DiFrancesco-Noble (1984) equations //Proc. R.

Soc. Lond. B. - 1984. - Т. 222. - №. 1228. - С. 295-304.

Watanabe Y., Dreifus L. S. Inhomogeneous conduction in the AV node: a

model for re-entry //American heart journal. - 1965. - Т. 70. - №. 4. - С.

505-514.

29. Tawara S. Das Reizleitungssystem des Säugetierherzens: eine anatomisch-histologische Studie über das Atrioventrikularbündel und die Purkinj eschen Fäden. - Fischer, 1906.

30. George S. A. et al. At the Atrioventricular Crossroads: Dual Pathway Electrophysiology in the Atrioventricular Node and its Underlying Heterogeneities //Arrhythmia & electrophysiology review. - 2017. - T. 6. -№. 4. - C. 179.

31. Moorman A. F. M. et al. Development of the cardiac conduction system //Circulation research. - 1998. - T. 82. - №. 6. - C. 629-644.

32. Torrent-Guasp F. et al. Towards new understanding of the heart structure and function //European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. - 2005. - C. 191-201.

33. Ten Tusscher K., Panfilov A. V. Modelling of the ventricular conduction system //Progress in biophysics and molecular biology. - 2008. - T. 96. -№. 1-3. - C. 152-170.

34. John G. Nicholls, A. Robert Martin, Bruce G. Wallace, Paul A. Fuchs «From Neuron to Brain»// 3 edition - 2012 - p. 34-123

35. Hille B. «Ionic channels in excitable membranes. Current problems and biophysical approaches» //Biophysical Journal. -1978. - T. 22. - №. 2. - C. 283.

36. G. Kleber and Y. Rudy, «Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias». //Physiological reviews. - Apr. 2004. - vol. 84, pp. 431-88.

37. Heath B., Gingrich K., Kass R. S. «Ion Channels in the Heart: Cellular and Molecular Properties of Cardiac Na, Ca, and K Channels» //Comprehensive Physiology. - 2002.

38. Brandt B. L. et al. «Action potentials in the rat chromaffin cell and effects of acetylcholine» //The Journal of physiology. - 1976. -T. 263. - №. 3. - C. 417

39. Nerbonne J. M., Kass R. S. Molecular physiology of cardiac repolarization //Physiological reviews. - 2005. - T. 85. - №. 4. - C. 1205-1253.

40. Hille B. et al. «Ion channels of excitable membranes».// Sunderland, MA : Sinauer, 2001. - T. 507.

41. Rudy Y. «The cardiac ventricular action potential» //Comprehensive physiology. - 2011.

42. Kaab S, Nuss HB, Chiamvimonvat N, O'Rourke B, Pak PH, Kass DA, Marban E, Tomaselli GF. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. // Circ Res. - 1996. - 78:262-273.

43. Li GR, Lau CP, Ducharme A, Tardif JC, Nattel S. Transmural action potential and ionic current remodeling in ventricles of failing canine hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2002. -283:H1031- H1041.

44. T. W. Engelmann «Базовые механизмы аритмий сердца». -1900.

45. Bouchard R. A., Clark R. B., Giles W. R. «Effects of action potential duration on excitation-contraction coupling in rat ventricular myocytes action potential voltage-clamp measurements» //Circulation Research. - 1995. - Т. 76. - №. 5. -С. 790-801.

46. Sah R., Ramirez R. J., Backx P. H. «Modulation of Ca2+ Release in Cardiac Myocytes by Changes in Repolarization Rate Role of Phase-1 Action Potential Repolarization in Excitation-Contraction Coupling» //Circulation research. - 2002. - Т. 90. - №. 2. - С. 165173.

47. Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling / D. M. Bers // Nature. - 2002. - Vol. 415. - P. 198-205.

48. ter Bekke R. M. A., Volders P. G. A. Arrhythmogenic mechano-electric heterogeneity in the long-QT syndrome //Progress in biophysics and molecular biology. - 2012. - Т. 110. - №. 2. - С. 347-358.

49. Antzelevitch, C., Sicouri, S., Litovsky, S.H., Lukas, A., Krishnan, S.C., Di Diego, J.M., Gintant, G.A., Liu, D.W., Heterogeneity within the ventricular wall. Elec- trophysiology and pharmacology of epicardial, endocardial, and M cells. //Circ. Res. - 1999. - 69, 1427-1449

50. Рубин А. Б. «Биофизика». // 1999.

51. Нормальная физиология человека // под ред. Б. И. Ткаченко. -М. : Медицина, 2005. - 928 с.

52. А. Т. Winfree «When time breaks down: The three-dimensional dynamics of electrochemical waves and cardiac arrhythmias». //Princeton University Press. - 1987

53. Anumonwo, J. M. B. Cellular and subcellular mechanisms of pacemaker activity initiation and synchronization in the heart / J. M. B. Anumonwo, J. Jalife // Cardiac Electrophysiology. - 1995. -№ 9. - Р. 151-163.

54. J. Keener , A Geometrical Theory For Spiral Waves in Excitable Media,// J. appl. Math. - 1986. - vol. 46, no. 6. - pp. 1039-1056.

55. M. Markus, "Isotropic cellular automaton for modelling excitable media,"// Nature. - 1990. - vol. 347. - pp. 56 - 58.

56. M. Gerhardt and H. Schuster, "A Cellular Automaton Model of Excitable Media Including Curvature and Dispersion,"// Science. -1990,vol. Mar 30. - 247, no. 4950. - pp. 15631566.

57. N. Zhabotinskv, A. M., Zaikin, "Spatial Phenomena in an Autooscillatorv Chemical System, in Oscillatory Processes in Biological and Chemical Systems,"// 1971. - vol. Vol.2. - pp. 279283.

58. T. Winfree, "Spiral Waves of Chemical Activity," //Science. - 1975.

- vol. Vol.175, no. 2. - pp. 634-636.

59. Pertsov A. M. et al. Spiral waves of excitation underlie reentrant activity in isolated cardiac muscle //Circulation research. - 1993. - T. 72. - №. 3. - C. 631-650.

60. Agladze K. et al. Rotating spiral waves created by geometry //Science. -1994. - T. 264. - №. 5166. - C. 1746-1748.

61. Efimov I. R., Krinsky V. I., Jalife J. Dynamics of rotating vortices in the Beeler-Reuter model of cardiac tissue //Chaos, Solitons & Fractals. - 1995.

- T. 5. - №. 3-4. - C. 513-526.

62. Weiss J. N. et al. Chaos and the transition to ventricular fibrillation: a new approach to antiarrhythmic drug evaluation //Circulation. - 1999. - T. 99. -№. 21. - C. 2819-2826.

63. Panfilov A. V. Spiral breakup as a model of ventricular fibrillation //Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. - 1998. - T. 8. - №. 1. - C. 57-64.

64. Panfilov A. V. Spiral Waves in the Heart //Spirals and Vortices. - Springer, Cham, 2019. - C. 209-215.

65. Fitzhugh R. Mathematical Models of Excitation and Propagation in Nerve. 1966.

66. Nagumo J, Arimoto S, Yoshizawa S. An Active Pulse Transmission Line Simulating Nerve Axon. Proceedings of the IRE. 1962;50: 2061-2070.

67. Aliev RR, Panfilov AV. A simple two-variable model of cardiac excitation. Chaos Solitons Fractals. 1996;7: 293-301.

68. Korhonen T, Hanninen SL, Tavi P. Model of excitation-contraction coupling of rat neonatal ventricular myocytes. Biophys J. 2009;96: 1189-1209.

69. Luo CH, Rudy Y. A model of the ventricular cardiac action potential. Depolarization, repolarization, and their interaction. Circ Res. 1991;68: 1501-1526.

70. Hodgkin AL, Huxley AF. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 1952;117: 500-544.

71. Majumder R. et al. Islands of spatially discordant APD alternans underlie arrhythmogenesis by promoting electrotonic dyssynchrony in models of fibrotic rat ventricular myocardium //Scientific reports. - 2016. - T. 6. - C. 24334.

72. Hou L. et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer //Circulation research. - 2010. - T. 107. - №. 12. - C. 1503-1511.

73. Huxley A. F. Hodgkin and the action potential 1935-1952 //The Journal of physiology. - 2002. -T. 538. - №. 1. - C. 2-2.

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

Pandit S. V. et al. A mathematical model of action potential heterogeneity in adult rat left ventricular myocytes //Biophysical journal. - 2001. - T. 81. - №. 6. - C. 3029-3051. Podgurskaya A. D., Tsvelaya V.A. et al. Effect of heptanol and ethanol on excitation wave propagation in a neonatal rat ventricular myocyte monolayer //Toxicology in Vitro. - 2018. - T. 51. - C. 136-144.

Linda G. Griffith, Gail Naughton «Tissue Engineering-Current Challenges and Expanding Opportunities» // Science - 08 Feb 2002 - Vol. 295, Issue 5557 - pp. 10091014

Akihiro Isomura, Marcel Horning, Konstantin Agladze «Eliminating spiral waves pinned to an anatomical obstacle in cardiac myocytes by high-frequency stimuli» // Physical Review - E. 2008. Dec. - T. 78 № 6. - c. 066216.

Rohr S., Scholly D. M., Kleber A. G. «Patterned growth of neonatal rat heart cells in culture. Morphological and electrophysiological characterization» // Circulation Research. - 1991 - Jan. Vol. 68, no. 1 - P. 114-130.

Alexandra Bussek, Erich Wettwer, Torsten Christ [h gp.] «Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing». // Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology - 2009. - Jan. T. 24, № 5-6 - C. 527-36. Rolf Bunger, Francis J. Haddy, Axel Querengasser [h gp.] «An isolated guinea pig heart preparation with in vivo like features». // Pflugers Archiv European Journal of Physiology - 1975. T. 353, № 4 - C. 317-326.

Neely JR, Liebermeister H, Morgan HE. «Effect of pressure development on membrane transport of glucose in isolated rat heart». // Am J Physiol - Legacy Content - 1967. Apr.. T. 212, № 4 - C. 815-822.

E. M. C. Hillman, O. Bernus, E. Pease et al. «Depth-resolved optical imaging of transmural electrical propagation in perfused heart». // Optics Express - 2007. Dec. Vol. 15, no. 26 - p. 17827.

Matiukas, B. G. Mitrea, M. Qin et al. «Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium». // Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society - 2007. - Nov.. Vol. 4 Hillman EM1, Bernus O, Pease E, Bouchard MB, Pertsov A.« Depth-resolved optical imaging of transmural electrical propagation in perfused heart» // Optics Express - 2007 - Vol. 15,Issue 26 - pp. 17827-17841

Esther Zoref-Shani, Gania Kessler-Icekson, Lina Wasserman [h gp.] «Characterization of purine nucleotide metabolism in primary rat cardiomyocyte cultures» // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. - 1984. Jun. - T. 804, № 2. - C.161-168.

Kang C. et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials //Scientific reports. - 2016. - T. 6. - C. 28798. W. C. Claycomb, N. A. Lanson, B. S. Stallworth [h gp.] «HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte» // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1998 Mar.. - T. 95, № 6 - C. 2979-2984

Zhan Yang Lim, Barun Maskara, Felipe Aguel [h gp.] «Spiral wave attachment to millimeter-sized obstacles» // Circulation. - 2006. Nov. - T. 114, № 20. C. 2113-21. Zimmermann W.-H., Eschenhagen T. «Cardiac tissue engineering for replacement therapy». // Heart failure reviews - 2003. - Vol. 8, no. 3. - P. 259-269. Mansor M. A., Ahmad M. R. «Single Cell Electrical Characterization Techniques» //International journal of molecular sciences. - 2015. - T. 16. - №. 6. - C. 12686-12712.

91. John G. Nicholls, A. Robert Martin, Bruce G. Wallace, Paul A. Fuchs «From Neuron to Brain»// 3 edition - 2012 - p. 34-123

92. Cathey B. et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography //Scientific reports. - 2019. - T. 9. - №. 1. - C. 721.

93. S. M. White, P. E. Constantin, and W. C. Clavcomb, "Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.," American journal ofphysiology. Heart and circulatory physiology, vol. 286, pp. 11*23 f). Mar. 2004.

94. L. Sartiani, P. Bochet, E. Cerbai, A. Mugelli, and R. Fischmeister, "Functional expression of the hvperpolarization-activated, non-selective cation current If in immortalized HL-1 cardiomyocytes," The Journal of Physiology, vol. 545, pp. 8192, Sept. 2002.

95. K. Agladze, M. W. Kay, V. Krinskv, and N. Sarvazvan «Interaction between spiral and paced waves in cardiac tissue».// American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. - July 2007. - vol. 293. - pp. H503-13.

96. J. P. Kucera, A. G. Kleber, and S. Rohr, «Slow conduction in cardiac tissue: Insights from optical mapping at the cellular level» //Journal of Electrocardiology - Oct. 2001 - vol. 34 - pp. 57-64.

97. V. G. Fast and R. E. Ideker, «Simultaneous optical mapping of transmembrane potential and intracellular calcium in myocyte cultures».// Journal of cardiovascular electrophysiology - May 2000 - vol. 11 - pp. 547-56.

98. N. Bursac, F. Aguel, and L. Tung, «Multiarm spirals in a two-dimensional cardiac substrate».// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - Oct. 2004- vol. 101-- pp. 15530-4.

99. E. Entcheva, S. N. Lu, R. H. Troppman, V. Sharma, and L. Tung «Contact fluorescence imaging of reentry in monolayers of cultured neonatal rat ventricular myocytes».// Journal of cardiovascular electrophysiology - June 2000. - vol. 11 - pp. 665-76

100. N. Bursac, F. Aguel, and L. Tung, «Multiarm spirals in a two-dimensional cardiac substrate».// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - Oct. 2004 - vol. 101 - pp. 15530-4.

101. E. Entcheva, S. N. Lu, R. H. Troppman, V. Sharma, and L. Tung «Contact fluorescence imaging of reentry in monolayers of cultured neonatal rat ventricular myocytes». //Journal of cardiovascular electrophysiology. - June 2000. - vol. 11. - pp. 665-76.

102. V. G. Fast, S. Rohr, a. M. Gillis, and a. G. Kleber, «Activation of Cardiac Tissue by Extracellular Electrical Shocks : Formation of 'Secondary Sources' at Intercellular Clefts in Monolayers of Cultured Myocytes».// Circulation Research. - Feb. 1998. - vol. 82. - pp. 375-385.

103. A. Arutunvan, A. Pumir, V. Krinskv, L. Swift, and N. Sarvazvan «Behavior of ectopic surface: effects of beta-adrenergic stimulation and uncoupling».//American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. - Dec. 2003. - vol. 285, pp. H2531-42.

104. A. Pumir, A. Arutunvan, V. Krinskiy, and N. Sarvazvan «Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticitv, and heterogeneity».// Biophysical journal. - Oct. 2005. - vol. 89, pp. 2332-49.

105. Yue L. et al. Retinal stimulation strategies to restore vision: Fundamentals and systems //Progress in Retinal and Eye Research. - 2016.

106. Vann K. T., Xiong Z. G. Optogenetics for neurodegenerative diseases //International journal of physiology, pathophysiology and pharmacology. - 2016. - T. 8.

- №. 1. - C. 1.

107. Abilez O. J. et al. Multiscale computational models for optogenetic control of cardiac function //Biophysical journal. - 2011. - T. 101. - №. 6. - C. 1326-1334.

108. Nagel G, Ollig D, Fuhrmann M, Kateriya S, Mus- ti AM, Bamberg E, Hegemann P. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. // Science. - 2002.

- 296: 2395-2398.

109. Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G and Deisseroth K. Millisecond-timescale, geneti- cally targeted optical control of neural activity. //Nat Neurosci. -2005. - 8: 1263-1268.

110. Ishizuka T, Kakuda M, Araki R and Yawo H. Ki- netic evaluation of photosensitivity in geneti- cally engineered neurons expressing green al- gae light-gated channels. // Neurosci Res. - 2006. - 54: 85-94.

111. Lanyi JK and Oesterhelt D. Identification of the retinal-binding protein in halorhodopsin. // J Biol Chem. - 1982. - 257: 2674-2677.