Фотополимеризуемые пленки на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина для регенерации кожи тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Котлярова Мария Сергеевна

• Котлярова Мария Сергеевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Котлярова Мария Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регенерация кожи и заживление ран

1.1.1. Воспаление

1.1.2. Восстановление эпидермиса

1.1.3. Формирование грануляционной ткани

1.1.4. Восстановление сосудистой сети

1.1.5. Контракция раны

1.1.6. Ремоделирование ткани

1.2. Методы лечения повреждений кожи

1.2.1. Кожные трансплантаты

1.2.2. Тканеинженерные конструкции для восстановления кожи

1.2.3. Раневые покрытия

1.3. Биосовместимые материалы как основа конструкций для восстановления кожи

1.3.1. Материалы для тканевой инженерии и регенеративной медицины

1.3.2. Влияние ВКМ и биосовместимых материалов на функции клеток

32

1.3.3. Фиброин

1.3.4. Метакрилированный желатин

1.4. Мышиная модель полнослойной раны кожи

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Клеточные линии

2.1.2. Лабораторные животные

2.2. Методы

2.2.1. Синтез метакрилированного желатина

2.2.2. Получение водного раствора фиброина шёлка

2.2.3. Получение раствора ЖМА и фиброина в смеси вода/ДМСО

2.2.4. Получение раствора ЖМА и фиброина в смеси вода/пропиленгликоль

2.2.5. Получение водного раствора ЖМА и фиброина

2.2.6. Формирование фотополимеризуемых пленок

2.2.7. Получение микроструктурированных поверхностей

2.2.8. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

2.2.9. Изучение механических свойств фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина

2.2.10. Исследование биодеградации фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина в модельной системе in vitro

2.2.11. Культивирование клеток на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина

2.2.12. Изучение адгезии и пролиферации фибробластов на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина

2.2.13. МТТ-тест

2.2.14. Определение количества живых и мертвых фибробластов при культивировании на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина

2.2.15. Исследование организации цитоскелета фибробластов на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина53

2.2.16. Изучение подвижности клеток на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина в модели «рана»

53

2.2.17. Модель полнослойнойраны кожи мыши

2.2.18. Морфометрический анализ скорости затягивания раны и площади сформированного рубца

2.2.19. Проведение гистологических исследований

2.2.20. Статистическая обработка экспериментальный данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Получение и характеристика фотоотверждаемых пленок на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина

3.2. Культивирование клеток, участвующих в регенерации кожи, на фотополимеризуемых пленках на основе фиброина и метакрилированного желатина

3.3. Исследование влияния фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина на регенерацию в мышиной модели полнослойной раны кожи72

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Получение и характеристика фотополимеризуемых пленок на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка

4.2. Культивирование клеток, участвующих в регенерации кожи, на фотополимеризуемых пленках на основе фиброина и метакрилированного желатина

4.3. Исследование влияния фотоотверждаемых пленок из метакрилированного желатина и фиброина на регенерацию кожи в мышиной модели полнослойной раны кожи

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Кожа является самым большим по площади органом человека. Ее расположение на границе внешней и внутренней среды обусловливает ее барьерные функции. Кожа защищает организм от неблагоприятных воздействий внешней среды и проникновения патогенов, способствует поддержанию гомеостаза, а также позволяет получать тактильную информацию, воспринимать механические и термические воздействия. Утрата или существенные повреждения фрагментов кожи при травмах или некоторых патологических состояниях могут приводить к тяжелым последствиям вплоть до летального исхода. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире регистрируется около 180 000 случаев смерти от обширных ожогов, в то время как несмертельные ожоги приводят к длительной госпитализации и являются одной из ведущих причин обезображивания и инвалидности, что часто сопровождается стигматизацией и неприятием [1].

Хронические раны, в том числе пролежни, трофические и диабетические язвы, ухудшают качество жизни миллионов людей, приводят к опасным осложнениям и являются причиной многомиллиардных потерь мировой экономики [2]. Таким образом, повреждения кожи различной этиологии и тяжести являются серьезной социально-экономической проблемой, а поиск эффективных методов их лечения - актуальной задачей современной медицины.

В связи с этим активно развиваются такие междисциплинарные направления науки, как тканевая инженерия и регенеративная медицина, целью которых является разработка новых способов восстановления поврежденных тканей и органов, в том числе кожи. Один из современных подходов предполагает создание искусственных конструкций из биосовместимых материалов, которые могут выступать в качестве раневых покрытий нового поколения, а также служить основой для получения эквивалентов кожи, которые способны замещать повреждённые участки ткани.

Материалы, из которых изготавливают подобные конструкции, должны обладать рядом характеристик, ключевой из которых является биосовместимость. Многие полимеры природного происхождения обладают также собственной биологической активностью, способствующей быстрому заживлению и регенерации ран без появления гиперпластических изменений соединительной ткани в области повреждения [3]. Для создания эквивалентов кожи часто используют коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ), характеризующиеся высокой биосовместимостью и способностью оказывать регуляторные эффекты на взаимодействующие с ними клетки [4]. К их недостаткам относятся высокая и почти неконтролируемая скорость биодеградации, низкая механическая прочность [4], вероятность иммунного отторжения, а также ограниченные возможности для формирования структур с заданной топологией.

Фиброин - структурный белок шелка тутового шелкопряда Bombyx mori -является природным полимером и характеризуется высокой биосовместимостью. На его основе могут быть сформированы конструкции для восстановления различных тканей, при этом их физико-механические свойства можно варьировать в процессе изготовления, что позволяет получать оптимальные характеристики. Фиброин обладает способностью к биодеградации. Продукты его расщепления нетоксичны и представлены пептидами и аминокислотами [5]. При имплантации скаффолды на основе этого полимера замещаются окружающей их тканью при участии иммунокомпетентных клеток [6].

В данной работе в качестве основы для формирования раневых покрытий использовали смесь из фиброина и метакрилированного желатина. Наличие метакрилированного желатина обуславливает способность полученного материла к фотополимеризации, что открывает большие возможности для использования такой фиброин-содержащей смеси в тканевой инженерии, например, она может быть адаптирована для современных аддитивных технологий, включая 3Э-печать, что крайне важно для реализации задач персонализированной медицины. Кроме того желатин - продукт денатурации коллагена, содержащий биологически активные последовательности в своей структуре.

На основе фиброина и метакрилированного желатина были сформированы фотополимеризуемые пленки. Они могут быть рассмотрены как прототипы раневых покрытий, а также как основа для получения тканеинженерных конструкций. Были изучены их механические свойства, стабильность и способность к биодеградации. В работе также исследовано взаимодействие фотоотверждаемых фиброин-содержащих пленок с клетками, вовлеченными в заживление ран. Влияние фотоотверждаемых пленок на процессы регенерации изучено в модельной системе полнослойной раны кожи мыши.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотополимеризуемые пленки на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина для регенерации кожи»

Цель работы:

Создание фотополимеризуемых пленок на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка и изучение их влияния на регенерацию кожи.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику получения фотоотверждаемых материалов на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка и изучить их механические свойства.

2. Изучить взаимодействия фотополимеризуемых пленок на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка с клетками, участвующими в регенерации кожи in vitro.

3. Оценить влияние полученных фотополимеризуемых пленок на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка на регенерацию кожи в мышиной модели полнослойной раны кожи.

Научная новизна и практическая значимость:

1. Разработана методика формирования фотоотверждаемых материалов на основе природных полимеров: фиброина шелка и метакрилированного желатина, которая может быть использована для получения прототипов медицинских изделий, в качестве которых в данной работе были получены фотополимеризуемые пленки.

2. Изучены структура и физико-механические свойства полученных фотополимеризуемых пленок. Было выявлено, что в зависимости от условий получения могут быть изготовлены пленки с различными характеристиками.

3. Оценка биологических свойств полученных пленок в модельных системах in vitro показала, что они создают условия, способствующие активации процессов регенерации.

4. В модели полнослойной раны кожи мыши показано активирующее и модулирующее влияние фотополимеризуемых пленок на регенерацию кожи.

Методология и методы диссертационного исследования

В ходе выполнения диссертационной работы исследования проводились как в модельных системах in vitro, так и с использованием лабораторных животных in vivo. Были использованы микроскопические, физико-химические методы исследований, также применялись гистологические техники.

Положения, выносимые на защиту

1. Фотополимеризуемые пленки на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина характеризуются высокой биосовместимостью и стабильностью, а также способствуют поддержанию миграции клеток, участвующих в регенерации кожи.

2. Фотополимеризуемый материал на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина обладает способностью поддерживать адгезию и пролиферацию клеток.

3. Фотополимеризуемый материал на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина позволяет формировать из него структуры с заданной архитектурой.

4. Фотополимеризуемые пленки на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина, используемые в качестве раневых покрытий в модельной системе полнослойной раны кожи мыши, способствуют подавлению формирования рубцовой ткани и более полной регенерации кожи.

Степень достоверности

Достоверность результатов, представленных в диссертационной работе, определяется репрезентативным объемом проведенных экспериментальных исследований, комплексным применением современных методов исследования и подтверждается статистической обработкой полученных данных.

Апробация результатов

Материалы и результаты диссертационной работы были представлены на 2 российских и 1 международной конференциях. Были опубликованы в 11 статьях, из них 9 в российских журналах, входящих в список ВАК и переводимых на английский язык, и 2 статьи в высокорейтинговых зарубежных научных журналах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Регенерация кожи и заживление ран

Кожа выполняет множество функций, ключевой из которых является защита организма от инфекций и поддержание гомеостаза. Повреждения кожи ведут к нарушению ее целостности и могут приводить к местным и системных инфекциям, представляющим опасность для жизни [7]. Восстановление повреждений кожи может быть достигнуто путем регенерации или заживления с формированием рубца.

Регенерация приводит к восстановлению ткани с ее исходной структурой и функциями. У беспозвоночных, а также амфибий, рыб и некоторых других животных, способность к регенерации хорошо развита и позволяет восстанавливать целые органы, в то время как у человека и других млекопитающих она существенно ограничена, а наиболее частым исходом заживления является формирование рубца [8]. Регенерация повреждений кожи может происходить у млекопитающих в ходе эмбрионального развития [9]. В постнатальном периоде результат заживления ран может быть различным.

Формирование эпидермиса над поверхностью повреждения обеспечивает восстановление барьерных функций кожи, что является необходимым критерием заживления [10]. В затягивание раны вносят вклад эпителизация и контракция [11]. Невозможность осуществления этого процесса приводит к образованию хронических ран, которые наблюдаются при таких метаболических состояниях, как диабет, а также при нарушениях кровоснабжения [12].

Результат заживления, то есть «качество» восстановленной ткани, определяется, главным образом, глубиной повреждения. Выделяют эпидермальные раны, раны частичной толщины и полнослойные раны [7].

Эпидермальные раны, затрагивающие только верхний, эпителиальный слой кожи, заживают путем эпителизации, без образования рубцовой ткани. In vitro была показана возможность получения из небольшого участка кожи эпителиальных пластов, площадь которых способна полностью покрыть тело человека, что

свидетельствует о высоком регенеративном потенциале этих клеток [10]. Однако скорость, как и сама возможность эпителизации, во многом определяются подлежащей тканью: она должна обеспечивать субстрат для миграции клеток, поддерживать их питание и оказывать регуляторное воздействие [11]. Также важны факторы внешней среды: инфекции и повторные механические повреждения приводят к отсроченной эпителизации.

При ранах частичной толщины оказывается разрушен эпидермис и часть дермы. Такие повреждения, в зависимости от количества потерянной дермы, далее можно разделить на поверхностные и глубокие раны частичной толщины. И в том и в другом случае, как правило, эпителиальные придаточные структуры, такие как волосяные фолликулы, сальные и потовые железы, разрушены, по крайней мере, не полностью, что дает возможность восстановления кожи преимущественно путем эпителизации [7]. Кератиноциты мигрируют из краев раны, а также придатков кожи, которые лежат в слоях дермы, незатронутых повреждением [13]. Выраженность рубца после заживления ран частичной толщины зависит от глубины повреждения [14].

Полнослойные раны кожи приводят к полному разрушению дермы, а иногда и более глубоких тканей, поэтому их заживление требует образования грануляционной ткани, которая заполняет пространство раны [7]. Разрушение всех придатков кожи приводит к тому, что эпителизация может происходить только от краев раны, что значительно осложняет прохождение процесса заживления и снижает его скорость. В результате заживления полнослойных ран формируются рубцы, что приводит к косметическим и функциональным дефектам [7].

Таким образом, способность к регенерации в значительной мере выражена для эпидермиса, так как она существенно влияет на выживаемость, и ограничена для нижележащих слоев кожи, поэтому дерма и гиподерма в большинстве случаев замещаются рубцом. При этом восстановление эпителиальных и мезенхимальных тканей кожи - неразрывно связанные и взаиморегулируемые процессы, прохождение которых определяется последовательностью клеточных и молекулярных событий, понимание которых позволяет оказывать влияние на их

прохождение и может быть использовано для достижения оптимального, с клинической точки зрения, результата.

Заживление повреждений кожи осуществляется в ходе сложного динамического процесса, включающего взаимодействия между растворимыми медиаторами, клетками крови, компонентами ВКМ и резидентными клетками ткани [15]. При рассмотрении общего механизма заживления ран этот процесс можно разделить на три следующие друг за другом, но перекрывающиеся по времени стадии: воспаление, формирование ткани, ее ремоделирование.

Репаративный процесс начинается с остановки кровоизлияния (иногда выделяется в отдельную стадию), что происходит в течение часов после повреждения. Следующее затем воспаление обеспечивает защиту организма от проникновения патогенов [16]. Вторая стадия заживления ран - образование новой ткани - характеризуется пролиферацией и миграцией клеток различных типов. Во время этой фазы происходит эпителизация, образование новых сосудов (ангиогенез) и формирование грануляционной ткани [12]. Наиболее продолжительной фазой является ремоделирование, которое приводит к установлению стабильной структуры и возрастанию механической прочности соединительной ткани [17]. Первым ее этапом, перекрывающимся с образованием новой ткани, является контракция [18].

1.1.1. Воспаление

Повреждение кожи вызывает нарушение целостности кровеносных сосудов, что приводит к кровоизлиянию. Восстановление гемостаза происходит за счет образования тромба, который также обеспечивает временный матрикс для миграции клеток. Тромбоциты, участвующие в этом процессе, выделяют некоторые важные для регенерации медиаторы, такие как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), привлекающий и активирующий макрофаги и фибробласты. Тем не менее, при отсутствии кровотечения заживление раны происходит без участия тромбоцитов [15].

В результате травмы резидентные клетки кожи, такие как кератиноциты, макрофаги, дендритные и тучные клетки, подвергаются воздействию сигналов опасности, которые можно разделить на две основные категории: к первой относятся молекулярные структуры, ассоциированные с повреждением (DAMP), т.е. молекулы, высвобождаемые клетками, подвергающимися некрозу, например, внутриклеточные белки ДНК и РНК; а вторая включает связанные с патогенами молекулярные структуры (PAMP), патоген-специфические молекулы, отсутствующие в организме хозяина, в том числе, бактериальные полисахариды и полинуклеотиды [19]. Эти сигналы распознаются рецепторами иммунокомпетентных клеток, например toll-подобными рецепторами (TLR), что приводит к активации внутриклеточных каскадов, ведущих к экспрессии цитокинов и антимикробных полипептидов и, как следствие, инициирует воспалительный ответ [16].

На ранней стадии воспаления в ответ на выделяемые хемокины, факторы комплемента и продукты деградации бактерий в область раны рекрутируются нейтрофилы [20]. Хемокины индуцируют экспрессию молекул адгезии, например, молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM1), молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM1) и Е-селектинов, на эндотелиальных клетках, которые опосредуют присоединение нейтрофилов к стенке кровеносных сосудов. Адгезия к эндотелиальным клеткам и воздействие хемокинов приводят к изменению цитоскелета нейтрофилов, вследствие чего происходит просачивание нейтрофилов через стенку сосуда. Далее клетки мигрируют по градиенту хемокинов, то есть в область раны [21].

Нейтрофилы поглощают бактерии и разрушенные клетки, а также продуцируют провоспалительные цитокины, например, фактор некроза опухоли а (TNF -а), интерлейкины (IL), в частности, IL-1ß и IL-6. Кроме того, они очищают рану путем высвобождения различных противомикробных веществ [22]. При отсутствии инфекции нейтрофилы остаются в ране в течение 2 - 5 дней.

Как инфильтрирующие, так и резидентные макрофаги активируются локальными сигналами микросреды и далее дифференцируются в различные

субпопуляции, отличающиеся функциональными фенотипами [23]. PAMP, выделяемые микроорганизмами, и DAMP, продуцируемыми при клеточном стрессе, в синергии с IFNy, секретируемым натуральными киллерами, определяют формирование классически активированных макрофагов (популяция M1), которые способствуют активации иммунитета, защите организма и противоопухолевой активности [24]. Напротив, такие цитокины, как IL-4 и IL-13, приводят к образованию альтернативно активированных макрофагов (популяция M2), которые подавляют воспаление и противоопухолевый иммунитет, регулируют метаболизм глюкозы, а также стимулируют заживление [25]. TLR-лиганды вместе с комплексами иммуноглобулинов G вызывают развитие регуляторных макрофагов, которые продуцируют IL-10 и TGF-01 и играют иммуносупрессивную роль [16]. Важно отметить, что макрофаги обладают значительной пластичностью в своих фенотипах и функциях, то есть они могут легко переключиться с одного функционального фенотипа на другой в ответ на различные стимулы микроокружения [26].

На ранней стадии заживления инфильтрирующие моноциты и резидентные макрофаги в основном приобретают фенотип M1, обусловленный воздействием провоспалительных цитокинов, IFN, микробных продуктов или DAMP [27]. Они фагоцитируют микроорганизмы, очищают раневое ложе от мертвых клеток и продуктов их распада и продуцируют медиаторы воспаления, такие как IL-1, IL-6, IL-12, TNF-a, индуцибельную NO-синтетазу (iNOS), а также хемокины для привлечения дополнительных лейкоцитов [28].

Переход макрофагов из воспалительного фенотипа (M1) в репаративный (M2) ассоциирован с завершением воспаления и началом восстановления ткани [24]. М2-макрофаги начинают экспрессировать противовоспалительные медиаторы, например антагонист рецептора IL-1, рецептор-ловушку - IL-1 и IL-10 и факторы роста, например, TGF-P, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и IGF-1, способствующие пролиферации фибробластов, синтезу ВКМ и ангиогенезу [29].

Макрофаги индуцируют апоптоз нейтрофилов, затем поглощают мертвые клетки в ходе процесса, называемого эффероцитозом [30]. Нарушение эффероцитоза наблюдается при хронических ранах [16]. Также при исследовании на мышах было выявлено снижение фагоцитарной функции макрофагов, наблюдаемое при старении, ассоциированное с уменьшением заживления [31].

1.1.2. Восстановление эпидермиса

Эпителизация в значительной степени перекрывается с воспалительной фазой: первые признаки миграции эпителиальных клеток наблюдаются уже через несколько часов после повреждения. Базальные кератиноциты на краях раны и стволовые клетки эпителия из окружающих волосяных фолликулов или потовых желез начинают активно пролиферировать примерно через 2-3 дня после травмы [15]. Этот процесс активируется и контролируется большим числом факторов роста и цитокинов, например, EGF, KGF, и ЮЕ-1, которые высвобождаются клетками в области раны [20].

Заполнения дефекта осуществляется за счет миграции кератиноцитов, которая начинается с ослабления межклеточных связей и контактов с базальной мембраной, вследствие воздействия ферментов на десмосомы и гемидесмосомы [32]. Индуцируется экспрессия интегриновых рецепторов, позволяющих кератиноцитам взаимодействовать с различными белками ВКМ, например, фибронектином и витронектином, которые перемежаются со стромальным коллагеном типа I на краю раны и переплетаются с фибрином в пространстве раны [15]. Также эпителиальные клетки претерпевают ряд фенотипических изменений, включая реорганизацию тонофиламентов, а также актинового цитоскелета клеток, формирование ламеллоподий для осуществления миграции, направление которой определяется градиентом таких хемоаттрактанов, как ГЬ-1 [20].

Клетки эпидермиса мигрируют в плоскости между живой и нежизнеспособной тканью, отделяя их друг от друга. В открытой ране эта плоскость находится между грануляционной тканью и фибриновым сгустком, а

при ожогах или обезвоженных ранах - под слоем некротической дермы [11]. Этот процесс активируется такими медиаторами, как фактор роста гепатоцитов (HGF), семейство факторов роста фибробластов (FGF) и эпидермальный фактор роста (БОЕ) [12].

После того как кератиноциты создают монослой на поверхности раны, они начинают формировать многослойный эпителий. Ключевыми медиаторами этого процесса являются ТОБ-р1 и ТОБ- р2 [33].

1.1.3. Формирование грануляционной ткани

Формирование грануляционной ткани в пространстве раны обычно начинается через четыре дня после травмы. Грануляционная ткань обеспечивает временную подложку, на которой происходит эпителизация кератиноцитами [15].

Выделение некоторых факторов роста, таких как РВОБ-4 и ТОБ-р1, стимулирует фибробласты в окружающих рану тканях к пролиферации, экспрессии интегриновых рецепторов и миграции в пространство раны [28]. Фибробласты играют важную роль в заживлении ран: они формируют ВКМ, что приводит к восстановлению структурной целостности ткани, а кроме того являются источником некоторых факторов роста, способствующих репарации, в том числе БОБ, УБОБ, НОР [34].

Недавнее исследование показало, что в дерме существуют две популяции мезенхимальных клеток: одна поверхностная, участвующая в развитии волос, и одна более глубокая, образующая нижнюю дерму, которая является, как полагают, основным источником ранних фибробластов грануляционной ткани [35]. В первых этапах заживления преимущественно задействованы фибробласты глубоких слоев дермы, в то время как клетки верхней дермы участвуют в процессе уже после завершения эпителизации. Это может быть фактором, в результате которого происходит развитие богатой коллагеном фиброзной ткани, лишенной волосяных фолликулов [35]. Также представляется вероятным, что, по крайней мере,

некоторая часть фибробластов грануляционной ткани происходит из пула мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга [12].

Фибробласты колонизируют временный матрикс, сформированный на ранних стадиях восстановления раны и состоящий в основном из фибрина, фибронектина и гиалуроновой кислоты [8], и начинают формировать грануляционную ткань, богатую коллагеном и клеточным фибронектином. Во время роста грануляционной ткани коллагеновые волокна и фибробласты выстраиваются параллельно дермально-эпидермальному соединению и вдоль ожидаемых линий напряжения [11].

1.1.4. Восстановление сосудистой сети

Восстановление сосудистой сети имеет важное значение для поддержания активности клеток в раневом ложе и обеспечения их кислородом и питательными веществами [15].

При активации эндотелиальных клеток макрофагами происходит ослабление связей между клетками, что необходимо для их миграции. Этому процессу так же, как и пролиферации эндотелиальных клеток, способствует создание гипоксической и кислотной среды, которая обычно встречается в ранах. Ангиогенез происходит под действием таких веществ как: FGF, VEGF и TGF-P, которые выделяются клетками на месте повреждения. При формировании необходимого количества и размера сосудов этот процесс ингибируется ангиостатином и стероидами [36, 37].

Образовавшиеся сосуды организуются в капиллярные сети, что приводит к восстановлению кровоснабжения. Вызванное этим увеличение концентрации кислорода и нейтрализация кислотной среды приводит к снижению продукции ангиогенных факторов и, как следствие, к уменьшению миграции и пролиферации эндотелиальных клеток [38].

1.1.5. Контракция раны

Контракция раны включает в себя сложное и хорошо организованное взаимодействие клеток, ВКМ и цитокинов, в ходе которого генерируется сокращение и происходит сближение краев раны. В течение второй недели заживления часть фибробластов приобретает фенотип миофибробластов, характеризующихся развитым сократительным аппаратом, который представлен толстыми пучками актиновых микрофиламентов, связанных с сократительными белками, такими как немышечная форма миозина [18].

Дифференцировка миофибробластов регулируется, главным образом, членами семейства TGF-ß, которые выделяются тромбоцитами в начальной стадии заживления [18]. Также стимулируют образование этих клеточных компонентов другие факторы роста, например фактор роста соединительной ткани (CTGF), и особая форма эктодомена фибронектина - ED-A, которая является продуктом альтернативного сплайсинга, характерным для этих клеток [39]. Кроме того, в регуляции этого процесса значительную роль играют биомеханические сигналы. Изменение состава ВКМ в ходе репаративного процесса приводит к изменению его жесткости: в ранах крыс она увеличивается с течением времени от 0,01-10 кПа для фибринового сгустка до примерно 18 кПа в 7-дневной грануляционной ткани и около 50 кПа в 12-дневной грануляционной ткани [40]. Эти значения соответствуют жесткости, необходимой для индукции фенотипа миофибробластов в культуре [40].

После завершения контракции миофибробласты элиминируются путем апоптоза, а если этого не происходит, то как правило образуются гипертрофические рубцы с избыточным отложением соединительной ткани [39]. Известно, что миофибробласты являются одним из ключевых клеточных компонентов, задействованных в формировании фиброзов различных тканей, а стимулирующий их образование TGF-ß - один из главных индукторов [40].

1.1.6. Ремоделирование ткани

После того, как богатый коллагеном матрикс депонируется в ране, фибробласты прекращают его синтез, и грануляционная ткань заменяется сравнительно бесклеточным шрамом. Большая часть клеток при этом подвергается апоптозу [17].

Ремоделирование коллагена при переходе от грануляционной ткани к рубцу контролируется матриксными металлопротеиназами, секретируемыми макрофагами, клетками эпидермиса, эндотелиальными клетками, а также фибробластами. Каждая фаза заживления раны характеризуется соответствующей комбинацией матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов [41].

Образование более крупных коллагеновых волокон и увеличение числа межмолекулярных перекрестных сшивок в ходе ремоделирования приводит к увеличению прочности сформированной ткани. Тем не менее ее величина никогда не достигает исходных значений: максимальная прочность рубца составляет только 70% от прочности нормальной кожи [15].

Формирующиеся в ходе заживления рубцы состоят из фибрилл коллагена, депонированного в толстых ориентированных пучках, а не в виде «плетеных корзин», которые наблюдаются в нормальной дерме. При заживлении ран кожи у людей может наблюдаться избыточное образование фиброзной ткани, выражающееся в формировании гипертрофических или келоидных рубцов [12].

Гипертрофические рубцы характеризуется избыточным отложением коллагена, что приводит к тому, что они выступают над поверхностью кожи. Келоидные рубцы выходят за пределы исходного края, они характеризуются более толстыми коллагеновыми пучкам, почти полным отсутствием миофибробластов, присутствующих в гипертрофических рубцах; также могут наблюдаться закупоренные кровеносные сосуды [12,42].

1.2. Методы лечения повреждений кожи

Ограниченная способность кожи к регенерации, а также опасность для жизни, возникающая при ее серьезных повреждениях, приводят к необходимости медицинского вмешательства. Обширные и глубокие поражения кожи представляют непосредственную угрозу для жизни пациента, главным образом из-за риска инфицирования и возможности развития сепсиса [43]. Даже небольшие повреждения могут приводить к осложнениям, что особенно часто происходит при нарушении нормального процесса заживления. Выделяют острые раны, которые полностью затягиваются в течение двенадцати недель, и хронические - не заживающие в течение более длительного времени [44]. Последние задерживаются в стадии воспаления и характеризуются большим количеством цитотоксических ферментов, свободных радикалов кислорода, медиаторов воспаления и матричных металлопротеаз, высвобождаемых полиморфноядерными лейкоцитами [45].

Лечение повреждений кожи направлено в первую очередь на то, чтобы не допустить инфицирования и ускорить процесс заживления. При обширных полнослойных ранах требуется замещение утраченного участка кожи, в то время как менее тяжелые повреждения, как правило, могут заживать без хирургического вмешательства. Во втором случае открытые, острые раны закрывают подходящими повязками до того момента, пока не произойдет эпителизация. Чтобы ускорить процесс заживления применяют различные биологически активные вещества: витамины, гормоны, растительные экстракты и экстракты из тканей животных, факторы роста и прочее [46, 47] В случае инфицированных ран проводят терапию антибиотиками или антисептиками [48]. Лечение хронических ран, как правило, осуществляется путем удаления нежизнеспособных тканей и перевода их таким образом в острые, что, однако, не всегда может быть достигнуто ввиду инфекционных осложнений и трофических нарушений, которые часто и вызывают их формирование [49].

1.2.1. Кожные трансплантаты

Терапия обширных и глубоких повреждений кожи, как правило, вызванных ожогами, включает в себя хирургическую обработку раны и использование аутологичных кожных трансплантатов [43]. Расщепленный кожный пласт, считающийся «золотым стандартом» для лечения полнослойных ран кожи, представляет собой эпидермис с поверхностной частью дермы, отделенный от здорового участка кожи с использованием специального приспособления -дерматома. Капилляры трансплантата соединяются с капиллярной сетью в области раны, образуя анастомозы, что обеспечивает его выживание [7]. Донорский участок заживает путем миграции кератиноцитов из волосяных фолликулов, потовых желез и краев раны, после чего может быть использован для повторного сбора материала [50].

При обширных повреждениях могут быть использованы сетчатые кожные трансплантаты - равномерно перфорированные и растянутые кожные пласты [10]. Применение такого метода позволяет снизить уровень смертности, когда площадь участков здоровой кожи существенно ограничена. Хотя этот метод обеспечивает больший охват поврежденной поверхности для покрытия, косметические и функциональные результаты такого лечения существенно хуже, чем при применении стандартных кожных пластов. Это связано с отсутствием дермы в междоузлиях сетчатого трансплантата и замедленной эпителизацией, что приводит к отсроченному заживлению и выраженному образованию рубцовой ткани, которое проявляется в виде «крокодиловой кожи» [7].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Котлярова Мария Сергеевна, 2020 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Информационные бюллетени ВОЗ. Ожоги // Центр СМИ Всемирной организации здравоохранения [Электронный ресурс] URL: https: //www. who. int/ru/news-room/fact-sheets/detail/burns. 2018. (дата обращения 24.02.2019).

2. Sen C.K., Gordillo G.M., Roy S., Kirsner R., Lambert L., Hunt T.K., Gottrup F., Gurtner G.C., Longaker M.T. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy // Wound Repair Regen. 2009. Vol. 17, № 6. P. 763771.

3. Mogo§anu G.D., Grumezescu A.M. Natural and synthetic polymers for wounds and burns dressing // Int. J. Pharm. 2014. Vol. 463, № 2. P. 127-136.

4. Powell H.M., Boyce S.T. EDC cross-linking improves skin substitute strength and stability. // Biomaterials. 2006. Vol. 27, № 34. P. 5821-5827.

5. Tsubouchi K., Takasu Y., Yamada H., Igarashi Y., Saito H. Identification of fibroin-derived peptides enhancing the proliferation of cultured human skin fibroblasts // Biomaterials. 2003. Vol. 25, № 3. P. 467-472.

6. Thurber A.E., Omenetto F.G., Kaplan D.L. In vivo bioresponses to silk proteins // Biomaterials. 2015. Vol. 71. P. 145-157.

7. Shevchenko R. V., James S.L., James S.E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction // J. R. Soc. Interface. 2010. Vol. 7, № 43. P. 229-258.

8. Gurtner G.C., Werner S., Barrandon Y., Longaker M.T. Wound repair and regeneration // Nature. 2008. Vol. 453, № 7193. P. 314-321.

9. Wilgus T.A., Ferreira A.M., Oberyszyn T.M., Bergdall V.K., DiPietro L.A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor // Lab. Investig. 2008. Vol. 88, № 6. P. 579-590.

10. ter Horst B., Chouhan G., Moiemen N.S., Grover L.M. Advances in keratinocyte delivery in burn wound care // Adv. Drug Deliv. Rev. 2018. Vol. 123. P. 1832.

11. Rittié L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals // J. Cell Commun. Signal. 2016. Vol. 10, № 2. P. 103-120.

12. Martin P., Nunan R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing // Br. J. Dermatol. 2015. Vol. 173, № 2. P. 370-378.

13. Miller S.J., Burke E.M., Rader M.D., Coulombe P.A., Lavker R.M. Re-epithelialization of Porcine Skin By The Sweat Apparatus // J. Invest. Dermatol. 1998. Vol. 110, № 1. P. 13-19.

14. Dunkin C.S.J., Pleat J.M., Gillespie P.H., Tyler M.P.H., Roberts A.H.N., McGrouther D.A. Scarring occurs at a critical depth of skin injury: Precise measurement in a graduated dermal scratch in human volunteers // Plast. Reconstr. Surg. 2007. Vol. 119, № 6. P. 1722-1732.

15. Singer A.J., Clark R.A.F. Cutaneous Wound Healing // N. Engl. J. Med. 1999. Vol. 341, № 10. P. 738-746.

16. Landén N.X., Li D., Stâhle M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing // Cell. Mol. Life Sci. 2016. Vol. 73, № 20. P. 38613885.

17. Desmoulière A., Redard M., Darby I., Gabbiani G. Apoptosis mediates the decrease in cellularity during the transition between granulation tissue and scar. // Am. J. Pathol. 1995. Vol. 146, № 1. P. 56-66.

18. Vedrenne N., Coulomb B., Danigo A., Bonté F., Desmoulière A. The complex dialogue between (myo)fibroblasts and the extracellular matrix during skin repair processes and ageing // Pathol. Biol. 2012. Vol. 60, № 1. P. 20-27.

19. Strbo N., Yin N., Stojadinovic O. Innate and Adaptive Immune Responses in Wound Epithelialization // Adv. Wound Care. 2014. Vol. 3, № 7. P. 492-501.

20. Reinke J.M., Sorg H. Wound Repair and Regeneration // Eur. Surg. Res. 2012. Vol. 49, № 1. P. 35-43.

21. Vestweber D. How leukocytes cross the vascular endothelium // Nat. Rev. Immunol. 2015. Vol. 15. P. 692-704

22. Eming S.A., Martin P., Tomic-Canic M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation // Sci. Transl. Med. 2014. Vol. 6, № 265. P. 265sr6-265sr6.

23. Galli S.J., Borregaard N., Wynn T.A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils // Nat. Immunol. 2011. Vol. 12. P. 1035-1044.

24. Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of macrophage activation // Nat. Rev. Immunol. 2008. Vol. 8. P. 958-969.

25. Gordon S., Taylor P.R. Monocyte and macrophage heterogeneity // Nat. Rev. Immunol. 2005. Vol. 5. P. 953-964.

26. Kulbe H., McNeish I., Robinson S.C., Charles K.A., Hagemann T., Thompson R.G., Lawrence T., Balkwill F.R. "Re-educating" tumor-associated macrophages by targeting NF-kB // J. ExP. Med. 2008. Vol. 205, № 6. P. 1261-1268.

27. Mosser D.M. The many faces of macrophage activation // J. Leukoc. Biol. 2003. Vol. 73, № 2. P. 209-212.

28. Barrientos S., Stojadinovic O., Golinko M.S., Brem H., Tomic-Canic M. Growth factors and cytokines in wound healing // Wound Repair Regen. 2008. Vol. 16, № 5. P. 585-601.

29. Brancato S.K., Albina J.E. Wound macrophages as key regulators of repair: Origin, phenotype, and function // Am. J. Pathol. 2011. Vol. 178, № 1. P. 19-25.

30. Khanna S., Biswas S., Shang Y., Collard E., Azad A., Kauh C., Bhasker V., Gordillo G.M., Sen C.K., Roy S. Macrophage Dysfunction Impairs Resolution of Inflammation in the Wounds of Diabetic Mice // PLoS One. 2010. Vol. 5, № 3. P. e9539.

31. Swift M.E., Burns A.L., Gray K.L., DiPietro L.A. Age-related alterations in the inflammatory response to dermal injury // J. Invest. Dermatol. 2001. Vol. 117, № 5. P. 1027-1035.

32. Pastar I., Stojadinovic O., Yin N.C., Ramirez H., Nusbaum A.G., Sawaya A., Patel S.B., Khalid L., Isseroff R.R., Tomic-Canic M. Epithelialization in Wound Healing: A Comprehensive Review // Adv. Wound Care. 2014. Vol. 3, № 7. P. 445-464.

33. Jiang C.-K., Tomic-Canic M., Lucas D.J., Simon M., Blumenberg M. TGFß Promotes the Basal Phenotype of Epidermal Keratinocytes: Transcriptional Induction of K#5 and K#14 Keratin Genes // Growth Factors. 1995. Vol. 12, № 2. P. 87-97.

34. Thangapazham R., Darling T., Meyerle J. Alteration of Skin Properties with Autologous Dermal Fibroblasts // Int. J. Mol. Sci. 2014. Vol. 15, № 5. P. 8407-8427.

35. Driskell R.R., Lichtenberger B.M., Hoste E., Kretzschmar K., Simons B.D., Charalambous M., Ferron S.R., Herault Y., Pavlovic G., Ferguson-Smith A.C., Watt F.M. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair // Nature. 2013. Vol. 504, № 7479. P. 277-281.

36. Elnar T. V, Ailey T.B. The Wound Healing Process : an Overview of the Cellular and Molecular Mechanisms. 2016. Vol. 37, № 5. P. 1528-1542.

37. Oike Y., Ito Y., Maekawa H., Morisada T., Kubota Y., Akao M., Urano T. Angiopoietin-related growth factor (AGF) promotes angiogenesis. 2016. Vol. 103, № 10. P. 3760-3766.

38. Takeo M.M. Wound Healing and Skin Regeneration // Cold Spring Harb. SymP. Perspect. Med. 2015. Vol. 5, № 1. P. a023267.

39. Darby I.A., Zakuan N., Billet F., Desmouliere A. The myofibroblast, a key cell in normal and pathological tissue repair // Cell. Mol. Life Sci. 2016. Vol. 73, № 6. P. 1145-1157.

40. Hinz B. The myofibroblast: Paradigm for a mechanically active cell // J. Biomech. 2010. Vol. 43, № 1. P. 146-155.

41. Madlener M., Parks W.C., Werner S. Matrix Metalloproteinases (MMPs) and Their Physiological Inhibitors (TIMPs) Are Differentially Expressed during Excisional Skin Wound Repair // ExP. Cell Res. 1998. Vol. 242, № 1. P. 201-210.

42. Mogili N.S., Krishnaswamy V.R., Jayaraman M., Rajaram R., Venkatraman A., Korrapati P.S. Altered angiogenic balance in keloids: a key to therapeutic intervention // Transl. Res. 2012. Vol. 159, № 3. P. 182-189.

43. Kowalczewski C.J., Christy R.J., Carlsson A.H., Mangum L.H., Stone II R., Tassin D.H., Natesan S., Chan R.K., Clay N.E., Clohessy R.M., Rizzo J.A. Advancements

in Regenerative Strategies Through the Continuum of Burn Care // Front. Pharmacol. 2018. Vol. 9, № 672

44. Parani M., Lokhande G., Singh A., Gaharwar A.K. Engineered Nanomaterials for Infection Control and Healing Acute and Chronic Wounds // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2016. Vol. 8, № 16. P. 10049-10069.

45. Wong S.Y., Manikam R., Muniandy S. Prevalence and antibiotic susceptibility of bacteria from acute and chronic wounds in Malaysian subjects // J. Infect. Dev. Ctries. 2015. Vol. 9, № 09. P. 936.

46. Park J., Hwang S., Yoon I.-S. Advanced Growth Factor Delivery Systems in Wound Management and Skin Regeneration // Molecules. 2017. Vol. 22, № 8. P. 1259.

47. Pereira R.F., Bártolo P.J. Traditional Therapies for Skin Wound Healing // Adv. Wound Care. 2016. Vol. 5, № 5. P. 208-229.

48. Sevgi M., Toklu A., Vecchio D., Hamblin M.R. Topical antimicrobials for burn infections - an update. // Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 2013. Vol. 8, № 3. P. 161-197.

49. Nunan R., Harding K.G., Martin P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity // Dis. Model. Mech. 2014. Vol. 7, № 11. P. 1205-1213.

50. Schulz A., Depner C., Lefering R., Kricheldorff J., Kästner S., Fuchs P.C., Demir E. A prospective clinical trial comparing Biobrane® Dressilk® and PolyMem® dressings on partial-thickness skin graft donor sites // Burns. 2016. Vol. 42, № 2. P. 345355.

51. Papini R. Management of burn injuries of various depths // BMJ. 2004. Vol. 329, № 7458. P. 158 - 160.

52. Chen F.-M., Liu X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering // Prog. Polym. Sci. 2016. Vol. 53. P. 86-168.

53. Anthony E.T., Syed M., Myers S., Moir G., Navsaria H. The development of novel dermal matrices for cutaneous wound repair // Drug Discov. Today Ther. Strateg. 2006. Vol. 3, № 1. P. 81-86.

54 Heimbach D.M., Warden G.D., Luterman A., Jordan M.H., Ozobia N., Ryan C.M., Voigt D.W., Hickerson W.L., Saffle J.R., DeClement F.A., Sheridan R.L., Dimick A.R. Multicenter Postapproval Clinical Trial of Integra® Dermal Regeneration Template for Burn Treatment // J. Burn Care Rehabil. 2003. Vol. 24, № 1. P. 42-48.

55. Wood F. Tissue Engineering of Skin // Princ. Regen. Med. 2011. Vol. 36, № 4. P. 1063-1078.

56. Clark R.A.F., Ghosh K., Tonnesen M.G. Tissue engineering for cutaneous wounds // J. Invest. Dermatol. 2007. Vol. 127, № 5. P. 1018-1029.

57. Griffiths M., Ojeh N., Livingstone R., Price R., Navsaria H. Survival of Apligraf in Acute Human Wounds // Tissue Eng. 2004. Vol. 10, № 7-8. P. 1180-1195.

58. Dickinson L.E., Gerecht S. Engineered Biopolymeric Scaffolds for Chronic Wound Healing // Front. Physiol. 2016. Vol. 7. P. 341

59. Augustine R. Skin bioprinting: a novel approach for creating artificial skin from synthetic and natural building blocks // Prog. Biomater. 2018. Vol. 7, № 2. P. 7792.

60. Groeber F., Holeiter M., Hampel M., Hinderer S., Schenke-Layland K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications // Adv. Drug Deliv. Rev. 2011. Vol. 63, № 4. P. 352-366.

61. Wang H.M., Chou Y.T., Wen Z.H., Wang Z.R., Chen C.H., Ho M.L. Novel Biodegradable Porous Scaffold Applied to Skin Regeneration // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 6. P. 2-12.

62. Wang T.W., Sun J.S., Wu H.C., Tsuang Y.H., Wang W.H., Lin F.H. The effect of gelatin-chondroitin sulfate-hyaluronic acid skin substitute on wound healing in SCID mice // Biomaterials. 2006. Vol. 27, № 33. P. 5689-569763. Winter G.D. Formation of the Scab and the Rate of Epithelization of Superficial Wounds in the Skin of the Young Domestic Pig. 1962. № 4. P. 293-294.

64. Wu P., Fisher A.C., Foo P.P., Queen D., Gaylor J.D.S. In vitro assessment of water vapour transmission of synthetic wound dressings // Biomaterials. 1995. Vol. 16, № 3. P. 171-175.

65. Fan Z., Liu B., Wang J., Zhang S., Lin Q., Gong P., Ma L., Yang S. A Novel Wound Dressing Based on Ag/Graphene Polymer Hydrogel: Effectively Kill Bacteria and Accelerate Wound Healing // Adv. Funct. Mater. 2014. Vol. 24, №№ 25. P. 3933-3943.

66. Choi H.J., Thambi T., Yang Y.H., Bang S.I., Kim B.S., Pyun D.G., Lee D.S. AgNP and rhEGF-incorporating synergistic polyurethane foam as a dressing material for scar-free healing of diabetic wounds // RSC Adv. 2017. Vol. 7, № 23. P. 13714-13725.

67. Powers J.G., Morton L.M., Phillips T.J. Dressings for chronic wounds // Dermatol. Ther. 2013. Vol. 26, № 3. P. 197-206.

68. Dabiri G., Damstetter E., Phillips T. Choosing a Wound Dressing Based on Common Wound Characteristics // Adv. Wound Care. 2016. Vol. 5, № 1. P. 32-41.

69. Fonder M.A., Lazarus G.S., Cowan D.A., Aronson-Cook B., Kohli A.R., Mamelak A.J. Treating the chronic wound: A practical approach to the care of nonhealing wounds and wound care dressings // J. Am. Acad. Dermatol. 2008. Vol. 58, №2 2. P. 185206.

70. Park Y.-H., Kwon Y.-B., Lee J.-H., Kim J.-Y., Choe J., Baek R.-M., Heo C.Y., Lee K.-G., Kang S.-Y., Roh D.-H., Young Kweon H. Wound healing effect of silk fibroin/alginate-blended sponge in full thickness skin defect of rat // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2006. Vol. 17, № 6. P. 547-552.

71. Zilberman M., Elsner J. Antibiotic-eluting medical devices for various applications // J. Control. Release. 2008. Vol. 130, № 3. P. 202-215.

72. Zhou X., Wang H., Zhang J., Li X., Wu Y., Wei Y., Ji S., Kong D., Zhao Q. Functional poly(e-caprolactone)/chitosan dressings with nitric oxide-releasing property improve wound healing // Acta Biomater. 2017. Vol. 54. P. 128-137.

73. Williams D.F. On the mechanisms of biocompatibility // Biomaterials. 2008. Vol. 29, № 20. P. 2941-2953.

74. Zheng A., Xue Y., Wei D., Li S., Xiao H., Guan Y. Synthesis and characterization of antimicrobial polyvinyl pyrrolidone hydrogel as wound dressing // Soft Mater. 2014. Vol. 12, № 3. P. 297-305.

75. Huang S., Fu X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration // J. Control. Release. 2010. Vol. 142, № 2. P. 149-159.

76. Malafaya P.B., Silva G.A., Reis R.L. Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications // Adv. Drug Deliv. Rev. 2007. Vol. 59, № 4-5. P. 207-233.

77. Muhonen V., Salonius E., Haaparanta A. -M., Järvinen E., Paatela T., Meller A., Hannula M., Björkman M., Pyhältö T., Ellä V., Vasara A., Töyräs J., Kellomäki M., Kiviranta I. Articular cartilage repair with recombinant human type II collagen/polylactide scaffold in a preliminary porcine study // J. OrthoP. Res. 2016. Vol. 34, № 5. P. 745-753.

78. Xu W., Shen R., Yan Y., Gao J. Preparation and characterization of electrospun alginate/PLA nanofibers as tissue engineering material by emulsion eletrospinning // J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2017. Vol. 65. P. 428-438.

79. Nori A., Yim E.K.F., Chen S., Leong K.W. Cell-Substrate Interactions // Principles of Regenerative Medicine. Academic Press, 2008. P. 666-685.

80. Sipilä K.H., Drushinin K., Rappu P., Jokinen J., Salminen T.A., Salo A.M., Käpylä J., Myllyharju J., Heino J. Proline hydroxylation in collagen supports integrin binding by two distinct mechanisms // J. Biol. Chem. 2018. Vol. 293, № 20. P. 76457658.

81. Cen L., Liu W., Cui L., Zhang W., Cao Y. Collagen Tissue Engineering: Development of Novel Biomaterials and Applications // Pediatr. Res. 2008. Vol. 63, №2 5. P. 492-496.

82. Law J.X., Liau L.L., Saim A., Yang Y., Idrus R. Electrospun Collagen Nanofibers and Their Applications in Skin Tissue Engineering // Tissue Eng. Regen. Med. 2017. Vol. 14, № 6. P. 699-718.

83. Howe A., Aplin A.E., Alahari S.K., Juliano R. Integrin signaling and cell growth control // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. Vol. 10, № 2. P. 220-231.

84. Mukherjee S., Darzi S., Paul K., Werkmeister J.A., Gargett C.E. Mesenchymal stem cell-based bioengineered constructs: Foreign body response, crosstalk with macrophages and impact of biomaterial design strategies for pelvic floor disorders // Interface Focus. 2019. Vol. 9, № 4. P. 20180089.

85. Chang D.T., Jones J.A., Meyerson H., Colton E., Kwon I.K., Matsuda T., Anderson J.M. Lymphocyte/macrophage interactions: Biomaterial surface-dependent cytokine, chemokine, and matrix protein production // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2008. Vol. 87A, № 3. P. 676-687.

86. Bhattacharjee M., Schultz-Thater E., Trella E., Miot S., Das S., Loparic M., Ray A.R., Martin I., Spagnoli G.C., Ghosh S. The role of 3D structure and protein conformation on the innate andadaptive immune responses to silk-based biomaterials // Biomaterials. 2013. Vol. 34, № 33. P. 8161-8171.

87. Julier Z., Park A.J., Briquez P.S., Martino M.M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system // Acta Biomater. 2017. Vol. 53. P. 1328.

88. Maquart F.X., Monboisse J.C. Extracellular matrix and wound healing // Pathol. Biol. 2014. Vol. 62, № 2. P. 91-95.

89. Akhmanova M., Osidak E., Domogatsky S., Rodin S., Domogatskaya A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research // Stem Cells Int. 2015. Vol. 2015. P. 1-35.

90. Sun Z., Guo S.S., Fässler R. Integrin-mediated mechanotransduction // J. Cell Biol. 2016. Vol. 215, № 4. P. 445-456.

91. Fusco S., Panzetta V., Netti P.A. Mechanosensing of substrate stiffness regulates focal adhesions dynamics in cell // Meccanica. 2017. Vol. 52, № 14. P. 33893398.

92. Dubin-Thaler B.J., Giannone G., Döbereiner H.G., Sheetz M.P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs // Biophys. J. 2004. Vol. 86, № 3. P. 1794-1806.

93. Schwartz M.A. Integrin signaling revisited // Trends Cell Biol. 2001. Vol. 11, № 12. P. 466-470.

94. Yeung T., Georges P.C., Flanagan L.A., Marg B., Ortiz M., Funaki M., Zahir N., Ming W., Weaver V., Janmey P.A. Effects of substrate stiffness on cell morphology,

cytoskeletal structure, and adhesion // Cell Motil. Cytoskeleton. 2005. Vol. 60, № 1. P. 24-34.

95. Anselme K. Osteoblast adhesion on biomaterials // Biomaterials. 2000. Vol. 21, № 7. P. 667-681.

96. Maheshwari G., Brown G., Lauffenburger D. a, Wells a, Griffith L.G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. // J. Cell Sci. 2000. Vol. 113 Pt 1. P. 1677-1686.

97. Ricard-Blum S., Vallet S.D. Fragments generated upon extracellular matrix remodeling: Biological regulators and potential drugs // Matrix Biol. 2019. Vol. 75-76. P. 170-189.

98. Bini E., Knight D.P., Kaplan D.L. Mapping Domain Structures in Silks from Insects and Spiders Related to Protein Assembly // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 335, № 1. P. 27-40.

99. Bhardwaj N., Singh Y.P., Devi D., Kandimalla R., Kotoky J., Mandal B.B. Potential of silk fibroin/chondrocyte constructs of muga silkworm Antheraea assamensis for cartilage tissue engineering // J. Mater. Chem. B. 2016. Vol. 4, № 21. P. 3670-3684.

100. Mehrotra S., Nandi S.K., Mandal B.B. Stacked silk-cell monolayers as a biomimetic three dimensional construct for cardiac tissue reconstruction // J. Mater. Chem. B. 2017. Vol. 5, № 31. P. 6325-6338.

101. Shang K., Rnjak-Kovacina J., Lin Y., Hayden R.S., Tao H., Kaplan D.L. Accelerated In Vitro Degradation of Optically Clear Low P -Sheet Silk Films by EnzymeMediated Pretreatment // Translational Vision Science & Technology. 2013. Vol. 2, № 3. P. 2.

102. Kundu B., Rajkhowa R., Kundu S.C., Wang X. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations // Adv. Drug Deliv. Rev. 2013. Vol. 65, № 4. P. 457-470.

103. Lu Q., Zhang X., Hu X., Kaplan D.L. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds // Macromol. Biosci. 2010. Vol. 10, № 3. P. 289298.

104. Minoura N., Aiba S. -I, Gotoh Y., Tsukada M., Imai Y. Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matrices // J. Biomed. Mater. Res. 1995. Vol. 29, № 10. P. 1215-1221.

105. Chiarini A., Petrini P., Bozzini S., Dal I., Armato U. Silk fibroinpoly(carbonate)-urethane as a substrate for cell growth // /Biomaterials. 2003. Vol. 24. P. 789-799.

106. Gil E.S., Panilaitis B., Bellas E., Kaplan D.L. Functionalized Silk Biomaterials for Wound Healing // Adv. Healthc. Mater. 2013. Vol. 2, № 1. P. 206-217.

107. Min S., Gao X., Han C., Chen Y., Yang M., Zhu L., Zhang H., Liu L., Yao J. Preparation of a silk fibroin spongy wound dressing and its therapeutic efficiency in skin defects // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2012. Vol. 23, № 1-4. P. 97-110.

108. Ju H.W., Lee O.J., Lee J.M., Moon B.M., Park H.J., Park Y.R., Lee M.C., Kim S.H., Chao J.R., Ki C.S., Park C.H. Wound healing effect of electrospun silk fibroin nanomatrix in burn-model // Int. J. Biol. Macromol. 2016. Vol. 85. P. 29-39.

109. Zhang W., Chen L., Chen J., Wang L., Gui X., Ran J., Xu G., Zhao H., Zeng M., Ji J., Qian L., Zhou J., Ouyang H., Zou X. Silk Fibroin Biomaterial Shows Safe and Effective Wound Healing in Animal Models and a Randomized Controlled Clinical Trial // Adv. Healthc. Mater. 2017. Vol. 6, № 10. P. 1700121.

110. Hasatsri S., Angspatt A., Aramwit P. Randomized Clinical Trial of the Innovative Bilayered Wound Dressing Made of Silk and Gelatin: Safety and Efficacy Tests Using a Split-Thickness Skin Graft Model // Evidence-based Complement. Altern. Med. 2015. Vol. 2015. P. 206871.

111. Sultan M.T., Lee D.J., Ju H.W., Park C.H., Lee O.J., Park H.J., Lee J.M., Kaplan D.L., Park Y.R. NF-kB signaling is key in the wound healing processes of silk fibroin // Acta Biomater. 2017. Vol. 67. P. 183-195.

112. Lawrence T., Fong C. The resolution of inflammation: Anti-inflammatory roles for NF-kB // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010. Vol. 42, № 4. P. 519-523.

113. Архипова А.Ю., Носенко M.A., Малюченко Н.В., Зварцев Р.В., Мойсенович А.М., Жданова А.С., Васильева Т.В., Горшкова Е.А., Агапов И.И., Друцкая М.С., Недоспасов С.А., Мойсенович М.М. Влияние фиброиновых

микроносителей на воспаление и регенерацию полнослойных ран кожи у мышей // Биохимия. 2016. Т. 81, № 11. С. 1494-1504.

114. Nosenko M.A., Moysenovich A.M., Zvartsev R. V., Arkhipova A.Y., Zhdanova A.S., Agapov I.I., Vasilieva T. V., Bogush V.G., Debabov V.G., Nedospasov S.A., Moisenovich M.M., Drutskaya M.S. Novel biodegradable polymeric microparticles facilitate scarless wound healing by promoting re-epithelialization and inhibiting fibrosis // Front. Immunol. 2018. Vol. 9, № December. P. 1-11.

115. Chomchalao P., Pongcharoen S., Sutheerawattananonda M., Tiyaboonchai W. Fibroin and fibroin blended three-dimensional scaffolds for rat chondrocyte culture. // Biomed. Eng. Online. 2013. Vol. 12, № 1. P. 28.

116. Rossi E., Gerges I., Tocchio A., Tamplenizza M., Aprile P., Recordati C., Martello F., Martin I., Milani P., Lenardi C. Biologically and mechanically driven design of an RGD-mimetic macroporous foam for adipose tissue engineering applications // Biomaterials. 2016. Vol. 104. P. 65-77.

117. Zhu A.P., Fang N., Chan-Park M.B., Chan V. Adhesion contact dynamics of 3T3 fibroblasts on poly (lactide-co-glycolide acid) surface modified by photochemical immobilization of biomacromolecules // Biomaterials. 2006. Vol. 27, № 12. P. 25662576.

118. Elzoghby A.O. Gelatin-based nanoparticles as drug and gene delivery systems: Reviewing three decades of research // J. Control. Release. 2013. Vol. 172, № 3. P. 1075-1091.

119. Giraudier S., Hellio D., Djabourov M., Larreta-Garde V. Influence of Weak and Covalent Bonds on Formation and Hydrolysis of Gelatin Networks // Biomacromolecules. 2004. Vol. 5, № 5. P. 1662-1666.

120. Klotz B.J., Gawlitta D., Rosenberg A.J.W.P., Malda J., Melchels F.P.W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair // Trends Biotechnol. 2016. Vol. 34, № 5. P. 394-407.

121. Yue K., Li X., Schrobback K., Sheikhi A., Annabi N., Leijten J., Zhang W., Zhang Y.S., Hutmacher D.W., Klein T.J., Khademhosseini A. Structural analysis of

photocrosslinkable methacryloyl-modified protein derivatives. // Biomaterials. 2017. Vol. 139. P. 163-171.

122. Yue K., Trujillo-de Santiago G., Alvarez M.M., Tamayol A., Annabi N., Khademhosseini A. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels // Biomaterials. 2015. Vol. 73. P. 254-271.

123. Mapili G., Lu Y., Chen S., Roy K. Laser-layered microfabrication of spatially patterned functionalized tissue-engineering scaffolds // J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 2005. Vol. 75B, № 2. P. 414-424.

124. Nikkhah M., Edalat F., Manoucheri S., Khademhosseini A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface // Biomaterials. 2012. Vol. 33, № 21. P. 5230-5246.

125. Skardal A., Murphy S. V., Crowell K., Mack D., Atala A., Soker S. A tunable hydrogel system for long-term release of cell-secreted cytokines and bioprinted in situ wound cell delivery // J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 2017. Vol. 105, № 7. P. 1986-2000.

126. Van Den Bulcke A.I., Bogdanov B., De Rooze N., Schacht E.H., Cornelissen M., Berghmans H. Structural and Rheological Properties of Methacrylamide Modified Gelatin Hydrogels // Biomacromolecules. 2000. Vol. 1, № 1. P. 31-38.

127. Nichol J.W., Koshy S.T., Bae H., Hwang C.M., Yamanlar S., Khademhosseini A. Cell-laden microengineered gelatin methacrylate hydrogels // Biomaterials. 2010. Vol. 31, № 21. P. 5536-5544.

128. Li P., Dou X., Feng C., Schönherr H. Enhanced cell adhesion on a bio-inspired hierarchically structured polyester modified with gelatin-methacrylate // Biomater. Sci. 2018. Vol. 6, № 4. P. 785-792.

129. Loessner D., Meinert C., Kaemmerer E., Martine L.C., Yue K., Levett P.A., Klein T.J., Melchels F.P.W., Khademhosseini A., Hutmacher D.W. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms // Nat. Protoc. 2016. Vol. 11, № 4. P. 727-746.

130. Vivian H.M.M., Ferry P.W.M., Jetze V., Wouter J.A.D., Debby G., Jos M., Mouser V.H., Melchels F.P., Visser J., Dhert W.J., Gawlitta D., Malda J. Yield stress

determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting // Biofabrication. 2016. Vol. 8, № 3. P. 35003.

131. Xiao W., He J., Nichol J.W., Wang L., Hutson C.B., Wang B., Du Y., Fan H., Khademhosseini A. Synthesis and characterization of photocrosslinkable gelatin and silk fibroin interpenetrating polymer network hydrogels // Acta Biomater. 2011. Vol. 7, № 6. P. 2384-2393.

132. Shin J., Hyun J., Baek J., Kwak H., Shin D., Na K., Shin S., Lee H., Park M. Effect of solution viscosity on retardation of cell sedimentation in DLP 3D printing of gelatin methacrylate/silk fibroin bioink // J. Ind. Eng. Chem. 2017. Vol. 61. P. 340-347.

133. Zhao X., Lang Q., Yildirimer L., Lin Z.Y., Cui W., Annabi N., Ng K.W., Dokmeci M.R., Ghaemmaghami A.M., Khademhosseini A. Photocrosslinkable Gelatin Hydrogel for Epidermal Tissue Engineering. // Adv. Healthc. Mater. 2016. Vol. 5, № 1. P. 108-118.

134. Wong V.W., Sorkin M., Glotzbach J.P., Longaker M.T., Gurtner G.C. Surgical Approaches to Create Murine Models of Human Wound Healing // J. Biomed. Biotechnol. 2011. Vol. 2011. P. 969618

135. Gerharz M., Baranowsky A., Siebolts U., Eming S., Nischt R., Krieg T., Wickenhauser C. Morphometric analysis of murine skin wound healing: Standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique // Wound Repair Regen. 2007. Vol. 15, № 1. P. 105-112.

136. Simons M., Alitalo K., Annex B.H., Augustin H.G., Beam C., Berk B.C., Byzova T., Carmeliet P., Chilian W., Cooke J.P., Davis G.E., Eichmann A., Iruela-Arispe M.L., Keshet E., Sinusas A.J., Ruhrberg C., Woo Y.J., Dimmeler S. State-of-the-art methods for evaluation of angiogenesis and tissue vascularization: A scientific statement from The American Heart Association // Circulation Research. 2015. Vol. 116, № 11. P. 99-132

137. Chantre C.O., Campbell P.H., Golecki H.M., Buganza A.T., Capulli A.K., Deravi L.F., Dauth S., Sheehy S.P., Paten J.A., Gledhill K., Doucet Y.S., Abaci H.E., Ahn S., Pope B.D., Ruberti J.W., Hoerstrup S.P., Christiano A.M., Parker K.K.

Production-scale fibronectin nanofibers promote wound closure and tissue repair in a dermal mouse model // Biomaterials. 2018. Vol. 166. P. 96-108.

138. Qi Y., Jiang D., Sindrilaru A., Stegemann A., Schatz S., Treiber N., Rojewski M., Schrezenmeier H., Vander Beken S., Wlaschek M., Böhm M., Seitz A., Scholz N., Dürselen L., Brinckmann J., Ignatius A., Scharffetter-Kochanek K. TSG-6 released from intradermally injected mesenchymal stem cells accelerates wound healing and reduces tissue fibrosis in murine full-thickness skin wounds // J. Invest. Dermatol. 2014. Vol. 134, № 2. P. 526-537.

139. Gomez L.A., Alekseev A.E., Aleksandrova L.A., Brady P.A., Terzic A. Use of the MTT Assay in Adult Ventricular Cardiomyocytes to Assess Viability: Effects of Adenosine and Potassium on Cellular Survival // J. Mol. Cell. Cardiol. 1997. Vol. 29, № 4. P. 1255-1266.

140. Tronci G., Grant C.A., Thomson N.H., Russell S.J., Wood D.J. Multi-scale mechanical characterization of highly swollen photo-activated collagen hydrogels // J. R. Soc. Interface. 2014. Vol. 12, № 102. P. 20141079-20141079.

141. Vepari C., Kaplan D.L. Silk as a Biomaterial // Prog. Polym. Sci. 2007. Vol. 32, № 8-9. P. 991-1007.

142. Altman G.H., Diaz F., Jakuba C., Calabro T., Horan R.L., Chen J., Lu H., Richmond J., Kaplan D.L. Silk-based biomaterials // Biomaterials. 2003. Vol. 24, № 3. P. 401-416.

143. Kim S.H., Yeon Y.K., Lee J.M., Chao J.R., Lee Y.J., Seo Y.B., Sultan M.T., Lee O.J., Lee J.S., Yoon S. Il, Hong I.S., Khang G., Lee S.J., Yoo J.J., Park C.H. Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing // Nat. Commun. 2018. Vol. 9, № 1. P. 1620

144. Yang L., Yaseen M., Zhao X., Coffey P., Pan F., Wang Y., Xu H., Webster J., Lu J.R. Gelatin modified ultrathin silk fibroin films for enhanced proliferation of cells // 2015. Vol. 10, № 2. P. 025003.

145. Rodriguez M.J., Brown J., Giordano J., Lin S.J., Omenetto F.G., Kaplan D.L. Silk based bioinks for soft tissue reconstruction using 3-dimensional (3D) printing with in vitro and in vivo assessments // Biomaterials. 2017. Vol. 117. P. 105-115.

146. Knowlton S., Yenilmez B., Anand S., Tasoglu S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes // Bioprinting. 2017. Vol. 5. P. 10-18.

147. Fairbanks B.D., Schwartz M.P., Bowman C.N., Anseth K.S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility // Biomaterials. 2009. Vol. 30, № 35. P. 6702-6707.

148. Lin H., Zhang D., Alexander P.G., Yang G., Tan J., Cheng A.W.-M., Tuan R.S. Application of visible light-based projection stereolithography for live cell-scaffold fabrication with designed architecture // Biomaterials. 2013. Vol. 34, № 2. P. 331-339.

149. Gruber H.F. Photoinitiators for free radical polymerization // Prog. Polym. Sci. 1992. Vol. 17, № 6. P. 953-1044.

150. Pawar A.A., Saada G., Cooperstein I., Larush L., Jackman J.A., Tabaei S.R., Cho N.J., Magdassi S. High-performance 3D printing of hydrogels by water-dispersible photoinitiator nanoparticles // Sci. Adv. 2016. Vol. 2, № 4. P. e1501381

151. Davidson R.S. The chemistry of photoinitiators — some recent developments // J. Photochem. Photobiol. A Chem. 1993. Vol. 73, № 2. P. 81-96.

152. Castelvetro V., Molesti M., Rolla P. UV-curing of acrylic formulations by means of polymeric photoinitiators with the active 2,6-dimethylbenzoylphosphine oxide moieties pendant from a tetramethylene side chain // Macromol. Chem. Phys. 2002. Vol. 203, № 10-11. P. 1486-1496.

153. Zar T., Graeber C., Perazella M.A. Recognition, treatment, and prevention of propylene glycol toxicity // Semin. Dial. 2007. Vol. 20, № 3. P. 217-219.

154. Brigham M.D., Bick A., Lo E., Bendali A., Burdick J.A., Khademhosseini A. Mechanically Robust and Bioadhesive Collagen and Photocrosslinkable Hyaluronic Acid Semi-Interpenetrating Networks // Tissue Eng. Part A. 2009. Vol. 15, № 7. P. 16451653.

155. Suri S., Schmidt C.E. Photopatterned collagen-hyaluronic acid interpenetrating polymer network hydrogels // Acta Biomater. 2009. Vol. 5, № 7. P. 2385-2397.

156. Xiao W., Li J., Qu X., Wang L., Tan Y., Li K., Li H., Yue X., Li B., Liao X. Cell-laden interpenetrating network hydrogels formed from methacrylated gelatin and silk fibroin via a combination of sonication and photocrosslinking approaches // Mater. Sci. Eng. C. 2019. Vol. 99, № October 2017. P. 57-67.

157. Nguyen A.T., Sathe S.R., Yim E.K.F. From nano to micro: topographical scale and its impact on cell adhesion, morphology and contact guidance // J. Phys. Condens. Matter. 2016. Vol. 28, № 18. P. 183001.

158. Qi Y., Wang H., Wei K., Yang Y., Zheng R.Y., Kim I.S., Zhang K.Q. A review of structure construction of silk fibroin biomaterials from single structures to multi-level structures // Int. J. Mol. Sci. 2017. Vol. 18, № 3.

159. Servoli E., Maniglio D., Motta A., Predazzer R., Migliaresi C. Surface properties of silk fibroin films and their interaction with fibroblasts // Macromol. Biosci. 2005. Vol. 5, № 12. P. 1175-1183.

160. Ni Annaidh A., Bruyère K., Destrade M., Gilchrist M.D., Otténio M. Characterization of the anisotropic mechanical properties of excised human skin // J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2012. Vol. 5, № 1. P. 139-148.

161. Wang Y., Wang G., Luo X., Qiu J., Tang C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells // Burns. 2012. Vol. 38, № 3. P. 414-420.

162. Numata K., Cebe P., Kaplan D.L. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals // Biomaterials. 2010. Vol. 31, № 10. P. 2926-2933.

163. Lai T.C., Yu J., Tsai W.B. Gelatin methacrylate/carboxybetaine methacrylate hydrogels with tunable crosslinking for controlled drug release // J. Mater. Chem. B. 2016. Vol. 4, № 13. P. 2304-2313.

164. Daniele M.A., Adams A.A., Naciri J., North S.H., Ligler F.S. Interpenetrating networks based on gelatin methacrylamide and PEG formed using concurrent thiol click chemistries for hydrogel tissue engineering scaffolds // Biomaterials. 2014. Vol. 35, № 6. P. 1845-1856.

165. Tsukeshiba H., Huang M., Na Y.H., Kurokawa T., Kuwabara R., Tanaka Y., Furukawa H., Osada Y., Gong J.P. Effect of polymer entanglement on the toughening of double network hydrogels // J. Phys. Chem. B. 2005. Vol. 109, № 34. P. 16304-16309.

166. Berrier A.L., Yamada K.M. Cell-matrix adhesion // J. Cell. Physiol. 2007. Vol. 213, № 3. P. 565-573.

167. Craig S.W., Matsuyama D., Ichikawa T., Kioka N., Yamashita H., Harada I., Ueda K., Kimura Y. The role of the interaction of the vinculin proline-rich linker region with vinexin in sensing the stiffness of the extracellular matrix // J. Cell Sci. 2014. Vol. 127, № 9. P. 1875-1886.

168. Yamamoto K., Tomita N., Fukuda Y., Suzuki S., Igarashi N., Suguro T., Tamada Y. Time-dependent changes in adhesive force between chondrocytes and silk fibroin substrate // Biomaterials. 2007. Vol. 28, № 10. P. 1838-1846.

169. Unger R.E., Wolf M., Peters K., Motta A., Migliaresi C., Kirkpatrick C.J. Growth of human cells on a non-woven silk fibroin net: a potential for use in tissue engineering. 2004. Vol. 25. P. 1069-1075.

170. Acharya C., Ghosh S.K., Kundu S.C. Silk fibroin film from non-mulberry tropical tasar silkworms: A novel substrate for in vitro fibroblast culture // Acta Biomater. 2009. Vol. 5, № 1. P. 429-437.

171. Kuphal S., Bosserhoff A. Recent progress in understanding the pathology // J. Pathol. 2009. Vol. 219. №. 4. P. 400-409.

172. Min B.-M., Lee G., Kim S.H., Nam Y.S., Lee T.S., Park W.H. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro // Biomaterials. 2004. Vol. 25, № 78. P. 1289-1297.

173. Lauffenburger D.A., Horwitz A.F. Cell migration: A physically integrated molecular process // Cell. 1996. Vol. 84, № 3. P. 359-369.

174. Moisenovich M.M., Pustovalova O., Shackelford J., Vasiljeva T. V., Druzhinina T. V., Kamenchuk Y.A., Guzeev V. V., Sokolova O.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P., Agapov I.I. Tissue regeneration in vivo within recombinant spidroin 1 scaffolds // Biomaterials. 2012. Vol. 33, № 15. P. 3887-3898.

175. Martínez-Mora C., Mrowiec A., García-Vizcaíno E.M., Alcaraz A., Cenis J.L., Nicolás F.J. Fibroin and sericin from Bombyx mori Silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun // PLoS One. 2012. Vol. 7, № 7. P. e42271.

176. Schunck M., Neumann C., Proksch E. Artificial barrier repair in wounds by semi-occlusive foils reduced wound contraction and enhanced cell migration and reepithelization in mouse skin // J. Invest. Dermatol. 2005. Vol. 125, №2 5. P. 1063-1071.

177. Ito M., Yang Z., Andl T., Cui C., Kim N., Millar S.E., Cotsarelis G. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding // Nature. 2007. Vol. 447, № 7142. P. 316-320.

178. Ferguson M.W.J., O'Kane S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention // Philos. Trans. R. Soc. London. Ser. B Biol. Sci. 2004. Vol. 359, № 1445. P. 839-850.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

В тексте использованы следующие обозначения и сокращения: ЭЭ-печать - группа технологий, используемых для формирования трехмерных объектов из полимеров

3Т3 - линия иммортализованных эмбриональных фибробластов мыши C57BL/6N- линия лабораторных мышей CXCL -группа хемокинов

DAMP - молекулярные структуры, ассоциированные с повреждением DLP-печати - ЭЭ-печать с использованием фотополимеризуемых материалов по технологии Digital Light Processing

FAK - киназа фокальных контактов FGF - факторы роста фибробластов

HaCaT - клеточная линия спонтанно иммортализованных кератиноцитов человека

HGF - фактор роста гепатоцитов ICAM - молекулы межклеточной адгезии IFN - интерфероны

IGF - инсулиноподобные факторы роста

IL -интерлейкины, группа цитокинов

iNOS - индуцибельная NO-синтетаза

MMP - матриксные металлопротеиназы

NF-kB - фактор транскрипции

PAMP - патоген-специфические молекулы

PDGF - тромбоцитарный фактор роста

PGA - полигликолевая кислота

PLA - полимолочная кислота

PLGA - поли (молочно-гликолевая) кислота

RGD - пептид из остатков аминокислот: аргинин - глицин - аспарагиновая кислота, с которым связываются интегрины

TGF - трансформирующие факторы роста TLR - toll-подобные рецепторы TNF - фактор некроза опухоли

TPO - фенилбис(2,4,6-триметил-бензоил)фосфин оксид, фотоинициатор VCAM - молекулы адгезии сосудистых клеток VEGF - фактор роста эндотелия сосудов ВКМ - внеклеточный матрикс

ДМЕМ - среда Игла, модифицированная Дульбекком, базовая среда для исследований in vitro широкого ряда типов клеток ДМСО -диметилсульфоксид ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЖМА - желатин метакрилированный

ЖМА-фиб-В - пленки на основе фиброина и ЖМА, полученные с использованием фотоиницитора Irgacure 2959 в воде

ЖМА-фиб-ДМСО - пленки на основе фиброина и ЖМА, полученные с использованием фотоиницитора TPO в системе растворителей вода/ДМСО

ЖМА-фиб-ПГ - пленки на основе фиброина и ЖМА, полученные с использованием фотоиницитора TPO в системе растворителей вода/пропиленгликоль

КЛСМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

МСК - мезенхимальные стволовые клетки

РНК - рибонуклеиновая кислота

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

УФ - ультрафиолетовый свет

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Рисунок 1. Схема реакции получения метакрилированного желатина

Рисунок 2. Пленки, сформированные из гидрогеля на основе ЖМА и фиброина в 96% спирте

Рисунок 3. Структура пленок на основе ЖМА и фиброина. Масштабные отрезки: верхний ряд - 30 мкм, нижний ряд -3 мкм

Рисунок 4. Кривые «напряжение-деформация» фотополимеризуемых пленок на основе фиброина и метакрилированного желатина

Рисунок 5. Биодеградация пленок на основе фиброина и метакрилированного или немодифицированного желатина в нейтральном растворе (ФСБ) и в растворе, содержащем протеазу XIV.

Рисунок 6. Микрорельефы, изготовленные на основе ЖМА и фиброина на поверхности стекла

Рисунок 7. Культивирование фибробластов линии 3Т3 на поверхности пленок на основе ЖМА и фиброина. Данные МТТ теста (* - р<0.05).

Рисунок 8. Фибробласты 3Т3 на поверхности пленок ЖМА-фб-ПГ и покровного стекла. Масштабный отрезок 100 мкм. Данные КЛСМ

Рисунок 9. Увеличение плотности фибробластов линии 3Т3 при культивировании на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе фиброина и ЖМА. Подсчет по данным КЛСМ.

Рисунок 10. Определение количества живых и мертвых фибробластов 3Т3 при их культивировании на поверхности пленок на основе фиброина и ЖМА.

Рисунок 11. Культивирование кератиноцитов линии НаСаТ на поверхности пленок ЖМА-фиб. Данные МТТ теста. (* - р<0.05)

Рисунок 12. Распластывание клеток на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина. Панель слева - морфология фибробластов. Линейка 100 мкм. Гистограмма справа - количественная оценка площади клеток (* - р<0.05)

Рисунок 13. Типичная морфология фибробластов линии 3Т3 на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина

Рисунок 14. Миграция фибробластов линии 3Т3 в модели экспериментальной «раны» (* - р<0.05)

Рисунок 15. Морфометрический анализ скорости затягивания ран при использовании ЖМА-фиб-ДМСО и марли (контроль) в качестве раневых покрытий (* - р<0,05%).

Рисунок 16. Оценка площади рубца, сформированного при заживлении полнослойной раны кожи мыши при использовании ЖМА-фиб-ДМСО и марли (контроль) в качестве раневых покрытий (* - р<0,05%).

Рисунок 17. Гистологический анализ тканей, сформированных на месте полнослойной раны кожи мыши через 28 дней после повреждения при использовании в качестве раневого покрытия марли (контроль) или фотополимеризуемой пленки ЖМА-фиб-ДМСО. Масштабный отрезок 200 мкм.

Рисунок 18. Восстановление волосяных фолликулов при использовании фотополимеризуемых пленок в качестве раневых покрытий. Окрашивание гематоксилином и эозином. Масштабный отрезок 50 мкм. (* - р<0,05%).).

Рисунок 19. Схема получения гидрогеля со структурой взаимопроникающих сетей на основе ЖМА и фиброина.

Таблица 1. Условия получения фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина.

Таблица 2. Механические характеристики фотополимеризуемых пленок на основе фиброина и метакрилированного желатина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность за постоянную и неоценимую помощь в проведении данной работы, важные рекомендации, поддержку и критику моему научному руководителю Мойсеновичу Михаилу Михайловичу.

Выражаю глубокую благодарность в.н.с. кафедры биоинженерии биологического факультета Д.В. Багрову и сотруднице ИСПМ им. Н.С. Еникополова РАН К.З. Монаховой за помощь в проведении механических испытаний.

Выражаю глубокую благодарность сотрудникам АО «Перспективные медицинские технологии», в особенности И.В. Бессонову, за помощь в синтезе метакрилированного желатина.

Выражаю признательность всем сотрудникам кафедры биоинженерии и лаборатории конфокальной микроскопии за доброжелательность и создание в коллективе дружеской атмосферы. Также благодарю коллектив лаборатории конфокальной микроскопии за методические рекомендации и продуктивные дискуссии, которые помогли мне при выполнении этой работы.

В работе использовали оборудование, приобретенное в рамках "Программы развития Московского Университета до 2020 года" и оборудование ЦКП МГУ имени М.В. Ломоносова.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ

1. Орлова А. А., Котлярова М. С., Лавренов В. С., Волкова С. В., Архипова А. Ю. Влияние концентрации желатина в составе композитных матриксов на основе фиброина шелка на адгезию и пролиферацию клеток линии мышиных эмбриональных фибробластов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, — 2014. — Т. 158. № 7. — С.98-102. (РИНЦ, Scopus, IF=0,666; 10 цитирований)

2. Мойсенович М. М., Малюченко Н. В., Архипова А. Ю., Котлярова М. С., Давыдова Л. И., Гончаренко А. В., Агапова О. И., Друцкая М. С., Богуш В. Г., Агапов И. И., Дебабов В. Г., и Кирпичников М. П. Новые ЭЭ-микроносители из рекомбинантного спидроина для использования в регенеративной медицине // Доклады Академии наук. — 2015. — Т. 463. — С. 479-479. (РИНЦ, WOS, Scopus, IF= 0.612; 13 цитирований)

3. Мойсенович М. М., Куликов Д. А., Архипова А. Ю., Малюченко Н. В., Котлярова М. С., Гончаренко АВ, Куликов А. В., Машков А. Е., Агапов И. И., Палеев Ф. П., Свистунов А. А., Кирпичников М. П. Фундаментальные основы использования биорезорбируемых микроносителей на основе фиброина шелка в терапевтической практике на примере регенерации кожи // Терапевтический архив. — 2015. — Т. 87, № 12. — С. 66-72 (РИНЦ, Scopus, IF=0,838; 6 цитирований)

4. Сафонова Л. А., Боброва М. М., Агапова О. И., Котлярова М. С., Архипова А. Ю., Мойсенович М. М., и Агапов И. И. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка. // Современные технологии в медицине. — 2015. — Т. 7, № 3. — С. 6-13. (РИНЦ, Scopus, IF=0,537; 5 цитирований)

5. Архипова А. Ю., Котлярова М. С., Новичкова С. Г., Агапова О. И., Куликов Д. А., Куликов А. В., Друцкая М. С., Агапов И. И., и Мойсенович М. М. Новые биорезорбируемые микроносители на основе фиброина шелка. // Бюллетень

экспериментальной биологии и медицины — 2015. — Т. 160, № 10. — С. 497-501. (РИНЦ, Scopus, IF=0,666; 5 цитирований)

6. Мойсенович М.М., Малюченко Н.В., Архипова А.Ю., Гончаренко А.В., Котлярова М.С., Давыдова Л.И., Васильева Т.В., Богуш В.Г., Агапов И.И., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П. Микрогели из рекомбинантного спидроина 1f9 для восстановления полнослойной кожной раны у мышей // Доклады Академии наук. — 2016. — Т. 466. — № 1 — С. 105-108. (РИНЦ, WOS, Scopus, IF= 0.612; 4 цитирования)

7. Багров Д. В., Жуйков В. А., Чудинова Ю. В., Ярышева А. Ю., Котляpова М. C., Архипова А. Ю., Хайдапова Д. Д., Мойсенович М. М., Шайтан К. В. Механические свойства пленок и трехмерных матриксов из фиброина шелка и желатина // Биофизика, — 2017. — Т. 62. № 1. — с. 23-30. (РИНЦ, Scopus, IF=0,999 2; 3 цитирования)

8. Мойсенович М. М., Куликов Д. А., Гончаренко А. В., Архипова А. Ю., Васильева Т. В., Филюшкин Ю. Н., Архипова Л. В., Котлярова М. С., Куликов А. В., Машков А. Е., Агапов И. И., и Кирпичников М. П. Регенерация дефекта стенки тощей кишки при использовании имплантата на основе фиброиновых волокон // Доклады Академии наук — 2017. — Т. 472, № 2. — С. 219-221. (РИНЦ, WOS, Scopus, IF=0.612)

9. Бессонов И. В., Котлярова М. С., Копицына М. Н., Федулов А. В., Мойсенович А. М., Архипова А. Ю., Богуш В. Г., Багров Д. В., Рамонова А. А., Машков А. Е., Шайтан К. В., Мойсенович М. М. Фотоотверждаемые гидрогели, содержащие спидроин или фиброин // Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. - 2018. - №. 1. — С. 29-33. (РИНЦ, Scopus, IF=0.62)

10. Bessonov I. V., Rochev Yu A., Arkhipova А. Yu, Kopitsyna M. N., Bagrov D. V., Karpushkin E. A., Bibikova T. N., Moysenovich A. M., Soldatenko A. S., Nikishin I. I., Kotliarova M. S., Bogush V. G., Shaitan K. V., Moisenovich M. M. Fabrication of hydrogel scaffolds via photocrosslinking of methacrylated silk fibroin // Biomedical materials (Bristol, England). — 2019. — Vol. 14. — P. 034102 (Scopus, IF=3.44)

11. Moisenovich M. M., Plotnikov E. Y., Moysenovich A. M., Silachev D. N., Danilina T. I., Savchenko E. S., Bobrova M. M., Safonova L. A., Tatarskiy V. V., Kotliarova M. S., Agapov I. I., Zorov D. B. Effect of silk fibroin on neuroregeneration after traumatic brain injury // Neurochemical research. - 2019. - Vol. 44(10). — P. 2261-2272. (РИНЦ, WOS, Scopus, IF=2.8).

Тезисы докладов и материалы конференций

1. Котлярова М.С., Бессонов И.И., Федулов А.В., Мойсенович А.М., Архипова А.Ю., Рамонова А.А., Богуш В.Г., Колосов А.С., Машков А.Е., Семенов Д.Ю., Шайтан К.В., Мойсенович М.М. Фотополимеризуемые гидрогели на основе метакрилированного желатина и структурных белков шелка // Сборник тезисов докладов Четвёртого Междисциплинарного Симпозиума по Медицинской, Органической и Биологической Химии и Фармацевтике, место издания "Перо" Москва, тезисы. — 2018. — С. 151-151

2. Бессонов И.И., Копицына М.Н., Котлярова М.С., Мойсенович А.М., Архипов А.Ю., Богуш В.Г., Багров Д.В., Колосов А.С., Шайтан К.В., Мойсенович М.М. Новые композитные гидрогели на основе метакрилированного желатина и структурных белков шелка // Гены и Клетки - Материалы III Национального Конгресса по Регенеративной Медицине, 2017. — Т. 13. №3. — С. 167-168

3. Bibikova T., Bessonov I., Kopitsyna M., Moysenovich A., Sivitskaya N., Bogush V., Kolosov A., Kotliarova M., Arkhipova A., Moisenovich M. Novel "photoinks" leading to photocrossHnked composites based on interpenetrating networks of methacryloyl gelatin and silk-like structural proteins // FEBS open bio — 2018. — Vol. 8, no. Suppl.S1. — P. 267-26

Интеллектуальная собственность

Патент на изобретение № RU2645200C1 Способ формирования биорезорбируемых фиброиновых пленок с использованием метакрилированного желатина. Авторы: М. М. Мойсенович, И. И. Агапов, А. Ю. Архипова, И. В. Бессонов, М. Н. Копицына, А. М. Мойсенович, А. В. Гончаренко, М. С. Котлярова