Разработка и унификация методик анализа и стандартизации препаратов инсулина с использованием обращенофазовой жидкостной хроматографии высокого давления (ОФ ЖХВД) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат фармацевтических наук Пихтарь, Анатолий Васильевич

• Пихтарь, Анатолий Васильевич
• кандидат фармацевтических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Пихтарь, Анатолий Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Роль инсулина в лечении сахарного диабета.

2. Биосинтез и биологическое действие инсулина.

3. Общая характеристика физико-химических и фармацевтических свойств инсулина.

4. Препараты инсулина.

5. Методы производства, стандартизации и контроля качества препаратов инсулина.

6. Применение ЖХВД в фармацевтическом анализе инсулина.

ГЛАВА 2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ ИНСУЛИНА В УСЛОВИЯХ ОФ ЖХВД

1. Методы и материалы.

2. Обсуждение результатов.

2.1. Влияние компонентного состава буферного раствора

2.2. Влияние концентрации натрия сульфата

2.3. Влияние температуры хроматографической колонки

2.4. Влияние органического модификатора

2.5. Влияние длины алкильного радикала привитой фазы

2.6. Влияние длины хроматографической колонки

3. Выводы.

ГЛАВА 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫХ МЕТОДИК АНАЛИЗА ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА, ОСНОВАННЫХ НА ПРИМЕНЕНИИ ОФ ЖХВД.

1. Выбор оптимальных условий хроматографического определения инсулина и его примесей в лекарственных препаратах.

2. Метрологические характеристики методики.

3. Применение разработанной методики для испытания официнальных препаратов инсулина.

4. Выводы.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА ИНЪЕКЦИОННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ИЗОФАН-ИНСУЛИНА НА ОСНОВЕ МЕТОДА ОФ ЖХВД.

1. Выбор условий хроматографического определения протамина в лекарственных формах изофан-инсулина.

2. Изучение хроматографических профилей протаминов, выделенных из различных видов рыб.

3. Методика определения протамина в препаратах изофан-инсулина.

4. Валидация разработанной методики.

5. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и унификация методик анализа и стандартизации препаратов инсулина с использованием обращенофазовой жидкостной хроматографии высокого давления (ОФ ЖХВД)»

Актуальность темы. В октябре 1996 г. постановлением Правительства Российской Федерации была принята федеральная целевая программа «Сахарный диабет», в которой предусмотрено проведение организационных, диагностических, лечебных и профилактических мероприятий, направленных на снижение распространенности сахарного диабета, уменьшение инвалидизации и летальности, обусловленных этим заболеванием [41]. В программе остро обозначена проблема обеспечения больных сахарным диабетом эффективными высококачественными препаратами инсулина.

Одним из важнейших факторов, способствующих улучшению качества лекарственных средств, является систематическое повышение эффективности методов их контроля и стандартизации.

Как известно, с 1 декабря 1990 г отечественной промышленностью было прекращено производство свиного инсулина. Главной причиной приостановки производства послужил низкий .уровень очистки субстанции инсулина и, как следствие, низкое качество его лекарственных форм [21, 37].

В связи с освоением отечественной промышленностью выпуска субстанций свиного и человеческого инсулина, а так же их лекарственных форм, отвечающих международным стандартам качества - проблема стандартизации названной группы препаратов в России стала особенно актуальна [37].

По данным Государственного реестра лекарственных средств на 1 января 2005 г. в России зарегистрировано свыше 98 препаратов инсулина отечественного и зарубежного производства [12, 13] .

На основании критического анализа и сравнительной оценки уровня требований и методик анализа, включенных в нормативные документы (НД) и ведущие зарубежные фармакопеи на лекарственные средства, содержащие инсулин, проведенных в ИГКЛС на стадии фармацевтической экспертизы НД и государственного контроля, установлено, что испытания препаратов данной группы по показателям «Количественное определение», «Родственные белки» и «Инсулин в растворе» в соответствии с различными НД выполняются по несколько отличающимся методикам. Отличия в методиках анализа касаются подготовки проб, типа хроматографических колонок (размер, химическая природа или торговая марка сорбента) , количества вещества наносимого на колонку, условий элюи-рования, состава подвижной фазы (ПФ), способа создания градиента и техники приготовления ПФ. Все эти обстоятельства создают затруднения при проведении государственного контроля препаратов инсулина: 1) увеличивают сроки проведения контроля; 2) повышают материальные затраты и стоимость анализа; 3) затрудняют сравнительную оценку препаратов различных производителей.

Анализ ныне действующих НД на препараты инсулина, содержащие протамин в качестве модификатора скорости его действия, выявил недостаточный уровень требований к данной группе препаратов. В НД практически отсутствуют требования и методы испытания подлинности и количественного определения протамина, что, учитывая высокую биологическую активность протаминов, отрицательно сказывается на уровне качества и безопасности препаратов изофан-инсулина.

Кроме того, в настоящее время, усилиями Фармакопейного и Фармакологического комитетов Российской Федерации проводится интенсивная работа по подготовке 12-го издания Государственной фармакопеи. Разработка и утверждение общегосударственных стандартов (фармакопейных статей) на препараты инсулина позволит достигнуть качественно нового уровня их стандартизации.

В связи с вышеизложенным, предпринятые в настоящей работе

- б исследования являются весьма актуальными и представляют несомненный интерес для теории и практики в области стандартизации лекарственных средств.

Цели и задачи исследования. Цель работы заключалась в проведении исследований, направленных на разработку унифицированных методик, основанных на применении жидкостной хроматографии высокого давления, для анализа и стандартизации препаратов свиного и человеческого инсулина.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

1) Провести всестороннее сравнительное изучение отечественного опыта стандартизации препаратов инсулина, опыта стандартизации ведущих зарубежных фармакопей и фирм-производителей.

2) Обобщить и дать критическую оценку результатам экспериментальной апробации методов контроля препаратов инсулина, включенных в ведущие фармакопеи и НД фирм-производителей.

3) Изучить влияние различных факторов на хроматографиче-ское поведение инсулина различной видовой принадлежности, ряда сопутствующих им примесей, а также фенола, м-крезола и нипаги-на в условиях обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления (ОФ ЖХВД).

4) Разработать унифицированную методику испытания субстанции и официнальных лекарственных форм инсулина по показателям «Подлинность», «Количественное определение», «Родственные белки» и «Инсулин в растворе».

5) Подобрать оптимальные условия хроматорграфического определения протамина в препаратах изофан-инсулина.

6) Провести экспериментальное исследование компонентного состава протаминов выделенных из различных пород рыб.

7) Разработать унифицированную методику анализа лекарственных форм изофан-инсулина по показателям «Подлинность», «Видовая принадлежность» и «Количественное определение протамина».

Научная новизна. Проведены многоплановые исследования по теоретическому и экспериментальному обоснованию разработки и унификации методик анализа и стандартизации препаратов инсулина с использованием ОФ ЖХВД.

Изучено влияние различных параметров хроматографического эксперимента на поведение инсулина и ряда его примесей в условиях ОФ ЖХВД в рамках существующих фармакопейных методик на современных хроматографических сорбентах отечественного производства .

На основании анализа метрологических характеристик и испытания препаратов инсулина различных производителей обоснована возможность унификации методики испытания препаратов свиного и человеческого инсулина по показателям «Подлинность», «Количественное определение», «Родственные белки» и «Инсулин в растворе».

Изучены хроматографические профили протамина различной видовой принадлежности.

Установлен факт деградации хроматографических пиков протамина (сальмина) при повышении температуры хроматографической колонки.

Разработана методика видовой идентификации протаминов и количественного определения протамина в инъекционных лекарственных формах изофан-инсулина. До этих исследований отсутствовали сведения о видовой принадлежности протамина в препаратах.

Практическая значимость. Методика анализа протамина в лекарственных формах изофан-инсулина использована отечественными производителями и включена в НД на препараты Инсуран НПХ, суспензия для подкожного введения 100 ЕД/мл (ФСП 42-0452591604, производитель - ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) и Ринсулин НПХ, суспензия для подкожного введения 100 ЕД/мл (ФСП 42-0434657405, производитель - ОАО «Национальные биотехнологии») .

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VIII Рос. Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001 г.), X Рос. Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003 г.), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005 г.), II Российском симпозиуме по химии и биохимии пептидов (Санкт-Петербург, 2005 г.), на межлабораторном коллоквиуме ИГКЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзо-ра (Москва, 2005 г.) .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Экспертиза и государственный контроль лекарственных средств», утвержденной Минздравом России (договор ГНИИСКЛС с Минздравом России № 607/063/004 от 27.05.98 г., договор ИГКЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» с Минздравом России № 033/210/001 от 02.07.2001 г.), и согласуется с планом научно-исследовательских работ ИГКЛС.

На защиту выносятся следующие положения.

- Результаты исследований по выбору оптимальных условий в разработке эффективных методик анализа препаратов инсулина.

- Унифицированная методика испытания препаратов инсулина по показателям «Подлинность», «Количественное определение», «Родственные белки» и «Инсулин в растворе».

- Исследования по оптимизации условий хроматографического определения протамина в составе суспензионных лекарственных форм изофан-инсулина.

- Унифицированная методика определения видовой принадлежности, подлинности и количественного содержания протамина в суспензионных препаратах изофан-инсулина.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах компьютерного текста в редакторе Microsoft Word и состоит из введения, обзора данных литературы, постановки задач, экспериментальной части, выводов, общих выводов, списка литературы. Диссертация содержит 22 рисунка и 32 таблицы. Список цитируемой литературы включает 152 источника, из них 101 на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Пихтарь, Анатолий Васильевич

- 136 -ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведены анализ литературных данных, критическая оценка уровня требований и методик контроля качества, включенных в отечественные и зарубежные НД на инсулины и его лекарственные формы для инъекций. Показана необходимость повышения уровня стандартизации и унификации методик анализа исследуемых препаратов .

2. Изучено влияние компонентного состава буферного раствора ПФ, концентрации натрия сульфата, температуры хроматографиче-ской колонки, длины алкильного радикала привитой фазы на селективность и эффективность разделения инсулинов различной видовой принадлежности и сопутствующих им примесей в условиях ОФ ЖХВД.

3. Выбраны оптимальные условия хроматографического разделения основных компонентов препаратов инсулина. Хроматографическая колонка: 100x4,0 мм, Диасфер-110-С18, 5 мкм. Буферный раствор: 0,1 М раствор натрия сульфата, содержащий кислоту фосфорную (0,045 М) и триэтиламин до рН 2,3. Элюент А: Ацетонитрил/Буферный раствор (18:82). Элюент Б: Ацетонитрил/ Буферный раствор (40:60). Режим элюирования: изократический при 40% Б в течение 40 мин, затем линейный градиент до 100% Б за 15 мин, далее изократический при 100% Б в течение 15 мин. Скорость потока: 0,76 мл/мин. Температура колонки: +50 °С. Детектирование: УФ-214 нм. Предложенные условия хроматографирования позволяют разделить инсулин говяжий, инсулин свиной, инсулин человеческий, ряд биосинтетических аналогов человеческого инсу

А21 лина, соответствующие им дезамидо-Асн -инсулины, ряд других примесей, а также фенол, нипагин и м-крезол.

4. Разработана унифицированная методика оценки качества лекарственных веществ - инсулина свиного и инсулина человеческого, а так же инъекционных лекарственных форм на их основе по показателям: «Подлинность», «Количественное определение», «Родственные белки» и «Инсулин в растворе».

5. Определены основные метрологические характеристики методики. ПО свиного и человеческого инсулина по разработанной методике равен 0,018 мкг, а ПКО равен 0,034 мкг. Диапазон определяемых содержаний соответствует концентрации инсулина в растворах от 0,0037 мг/мл (около 0,1 ЕД/мл) до 56 мг/мл (около 150 ЕД/мл).

6. Выбраны оптимальные условия хроматографирования для разделения пиков протамина (сальмина) с пиками фенола и м-крезола в препаратах изофан-инсулина.

7. Изучены хроматографические профили сальмина, клупеина и стурина. Показано, что с их помощью может быть определена видовая принадлежность протамина. Впервые на стадии государственного контроля установлено, что в состав препаратов изофан-инсулина, зарегистрированных в РФ входит сальмин.

8. Разработана методика определения подлинности, видовой принадлежности и количественного содержания протамина в препаратах изофан-инсулина. Разделение проводят на колонке размером 250x4,0 мм, заполненной сорбентом Lichrospher 60 RP-Select В, с размером частиц 5 мкм. Скорость потока 1,0 мл/мин. Элюирова-ние проводят смесью ацетонитрила и буферного раствора с рН 2,3 (ТФУ/ТЭА): градиент от 10,25 % до 19,0 % ацетонитрила за 40 мин. Температура колонки +25 °С. Детектирование пиков проводят с помощью СФ детектора при длине волны 205 нм. Объем пробы - 50 мкл.

9. В ходе валидации методики, оценены ее основные метрологические характеристики. Путем анализа данных по специфичности, точности, повторяемости и линейности установлено, что диапазон определяемых концентраций протамина находится в интервале от 0,02 мг/мл до 0,04 мг/мл.

10. Методика анализа протамина в лекарственных формах изофан-инсулина использована отечественными производителями и включена в НД на препараты Инсуран НПХ, суспензия для подкожного введения 100 ЕД/мл (ФСП 42-0452591604, производитель - ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) и Ринсулин НПХ, суспензия для подкожного введения 100 ЕД/мл (ФСП 42-0434657405, производитель - ОАО «Национальные биотехнологии»).

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Пихтарь, Анатолий Васильевич, 2005 год

1. Анциферов М.Б., Майоров А.Ю. Перспективы использования аналогов человеческого инсулина // Рус. мед. журнал. 1998.6(12). С.771-773.

2. Бабич П.А. Сравнительная характеристика активных и инактивных форм инсулина, процессов их образования и регенерации: Автореф-ферат дис. канд. биолог, наук. Москва, 1969.

3. Баирамашвили Д.И. Генноинженерный инсулин человека: успехи и перспективы // Рос. хим. журнал. (Журнал Российского химического об-ва им. Д.И. Мендилеева). 2005. - XLIX(l). - С.34-45.

4. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений: Учебное пособие. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 512 с.

5. Бектимиров Т.А. Безопасность биопрепаратов в перевиваемых клеточных культурах // Актуальные вопросы биотехнологии : Материалы Всесоюзн. научн. конф. 14-16 января в Ленинграде. М. : Центр НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 1987. - С.51-52.

6. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: Учебн. для фармацевт, ин-тов и фак. мед. ин-тов. В 2 ч. 4.1. Общая фармацевтическая химия. М.: Высшая школа, 1993, - 432 с.

7. Бергер М., Старостина Е.Г., Йоргенс В., Дедов И.И. Практика инсулинотерапии. Berkin Heidelberg: Springer-Verlag, 1995.365 С.

8. Буш Г. Гистоны и другие ядерные белки. М.: Мир. - 1967. -286 с.

9. Гауровиц Ф. Химия и функции белков М.: Мир., 1965. - 530 с.

10. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.1. М. : Мир, 2002. 589 с.

11. Государственная Фармакопея СССР. XI издание., доп. Выпуски 1 (1987) и 2 (1990). М.: Медицина, - 334 с. и - 398 с.

12. Государственный реестр лекарственных средств (по состоянию на 31 декабря 2004 г. VIII ежегодное периодическое издание). В 2 т. Том.1. - М.: Медицина, 2004. - 1404 с.

13. Государственный реестр лекарственных средств (по состоянию на 31 декабря 2004 г. VIII ежегодное периодическое издание). В 2 т. Том.1. - М.: Медицина, 2004. - 1404 с.

14. Гребенщиков Ю.Б., Мошковский Ю.Ш. Физико-химические свойства, структура и функциональная активность инсулина. М.: ВИНИТИ АН СССР, 1986. - 296 с. - (Итоги науки и техники. Серия Биоорганическая химия; Т.7).

15. Григорова Л.В. Разработка новых физико-химических методов определения антигепариновой активности протаминов (стеллинов А и В), выделенных из гонад Acipenser stellatus. Изучение влияния компонентного состава стеллина на антигепариновую активность:

16. Автореферат дис. канд. хим. наук. Москва. - 1993.

17. Гуров В.А. Производство органопрепаратов: Учебное пособие для подготовки рабочих на производстве: 2-е изд., перераб. и доп.

18. М.: Пищевая промышленность, 1976. 171 с.

19. Гуров В.А. Справочник по производству органопрепаратов: 2-е изд., перераб. и доп. М.: Пищевая промышленность, 1970. - 120 с.

20. Дедов И.И., Сунцов Ю.И., Кудрянова С.В., Рыжкова С.Г. Эпидемиология инсулиннезависимого сахарного диабета // Проблемы эн-докриналогии. 1998. - 3. - С.45-49.

21. Ефимов А.С., Скробонская Н.А., Ткач С.Н., Сакало Е.А. Инсулинотерапия больных сахарным диабетом.

22. Киев: Здоров'я, 2000. 248 с.

23. Каверзнева Е.Д. Рахматулина А.З. Выделение и характеристика протамина из Acipenser stellatus // Химия природных соединений. 1970. - 1. - С.119-123.

24. Ковалева С.В., Исаева И.В., Евтушенко Н.С. Пептидные лекарственные средства и их станадртизация. // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств Минздрава России. 2002. - 2(10). - С.83-94.

25. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. М. : Мир, 2000.469 с.

26. Копелович М.А. История открытия инсулина и его применения в клинике // Азербайджанский медицинский журнал. 1973. - 2.1. С.70-73.

27. Кучеренко Н.Е., Германюк Я.Л., Васильев А.Н. Молекулярные механизмы гормональной регуляции обмена веществ: Учебное пособие для биологических вузов. Киев.: Вища школа изд-во при Киев. Университете, 1986. - 246 с.

28. Мадьяр И. Пятидесятилетие открытия инсулина // Химико-фармацевтический журнал. 1973. - 2. - С.70-73.

29. Макаров Н.В., Яглицкая Н.Н., Рыбин В.К. Получение гомогенных протаминов фракционированием нуклеопротамина // Химия природных соединений. 1985. - 3. - С.378-381.

30. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. В 2 т. Т. 2. М.: Мир, 1993. - С.247-263.

31. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям : Методические указания. М. : Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. - 128 с.

32. НД 42-10883-00. Инсуман Базал ГТ, суспензия для инъекций100 МЕ/мл.

33. О результатах проверки выполнения Федеральной целевой программы «Сахарный диабет». Бюллетень Счетной палаты Российской Федерации №9/1999.

34. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. - С.247-249.

35. Ольбинский П.И., Маркине С.С. Рекомбинантный человеческий инсулин и его аналоги // В кн.: Доказательная медицина и молекулярная терапия в клинике внутренних болезней. Москва, 1999.1. С.213-240.

36. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М.: Наука, 1985. 390 с.

37. От запрещения производства инсулинов в СССР к первым российским инсулинам // Фармацевтический вестник. - 1995.16(16-31 августа). С.11-14.

38. ОФС 42-0009-02. Биологические испытания инсулина.

39. Пихтарь А.В., Евтушенко Н.С., Ковалева. С.В. Применение различных вариантов ВЭЖХ для видовой идентификации и количественного определения протаминов // В кн. : Тез. докл. X Рос. -национальный конгресс «Человек и лекарство». М., 2003. - С.743.

40. Плехан М.И. Химические свойства, методы выделения, очистки и анализа белковых гормонов. М.: Медицина, 1975, - 239 с.

41. Постановление Правительства Российской Федерации от 7 октября 1996 г. №1171 «О федеральной целевой программе «Сахарный Диабет».

42. Рыбин В.К., Яглицкая Н.Н., Матросович Т.Ю., Макаров Н.В. 06-ращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография протаминов // Химия природных соединений. -1986. 6. - С.744-748.

43. Саргин К.Д. Стандартизация инсулина // Химико-фармацевтический журнал. 1927. - 1(37). - С.8-19.

44. Сергеев Н.В. Использование инструментальных микрометодов анализа для постадийного контроля процесса получения рекомбинантного инсулина человека: Авторефферат дис. канд. хим. наук. -Москва, 2000.

45. Уоткинс П.Дж. Сахарный диабет. М. - СПб.: ЗАО «Издательство БИНОМ» - «Невский Диалект», 2000. - 96 с.

46. ФС 42-0090-02. Инсулин человеческий генно-инженерный, стандартный образец.

47. ФСП 42-04343065-02. Инсулин человеческий. АО «Национальные биотехнологии».

48. Хеншен А., Хупе К.П., Лотшпайх Ф., Вельтер В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М. : Мир, 1988. -688 с.

49. Шатц Г., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. Рига: Зинатне, 1988. - 390 с.

50. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа. М.: Мир, 1989. - 608 с.

51. Яшин Я.И., Яшин А.Я. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Состояние и перспективы // Рос. хим. журнал. (Журнал Российского химического об-ва им. Д.И. Мендилеева). —- 2003;1. XLVII(1). С.64-79.

52. Abel J.J. Crystalline insulin // Journal Pharmacol Exp. Ther. 1927. - 31. - P.65-85.

53. Amos A.F., McCarthy D.J., Zimmet P. The rising global burden of diabetes and its complications: estimates and projections to the year 2010 // Diabet Med. 1997. - 14(5). - P.S1-S85.

54. Andersen 0.0. Insulin antibody formation. II. The influence of cpecies difference and method of administration // Acta Endocrinol. 1973. - 72. - P.33-45.

55. Ando Т., Ishii S., Yamasaki M., Iwai K., Hashimoto C., Sawada F. Stadies on protamines. I. Amino acid composition and homogeneity of clupeine, salmine and iridine // J. Biochem. 1957. -44. - P. 275-278.

56. Ando Т., Sawada F. Stadies on protamines. IX. Fractionationof clupeine // J. Biochem. 1961. - 49. - P. 252-259.

57. Ando Т., Suzuki K. The amino acid sequence of the second component of clupeine // Biochem. Biophys. Acta. 1966. - 121. -P. 427-429.

58. Ando Т., Watanabe S. A new method for fractionation of protamines and the amino acid sequences of one component of salmine and three components of iridine // Int. J. Protein Res. 1969. - 1. - P. 221-224.

59. Baker E.N. The structure of 2Zn pig insulin crystals at 1.5 A resolution // Phil. Trans. Roy. Soc. ser. B. Biol. Sci. B.1988. 319. - P.369-456.

60. Balhorn R. The free amino acid group of insulin // J. Cell. Biol. 1982. - 83. - P. 293-305.

61. Barfoed H.C. Insulin Production Tecnology // Chem.Eng.Prog. -1987. 83(10). - P.49-54.

62. Blundell Т., Dodson G., Hodgkin D., Mercola D. Insulin: The structure in crystal and its reflection in chemistry and biology // Adv. Protein Chem. 1972. - 26. - P.279-402.

63. Bretzel G. Uber Thynnin das Protamin des Thunfisches. Die vollstandige Aminosauresequenz von Thunnin Y2 // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1972. - 353. - P. 933-943.

64. Brix R. From experimental design to uncertainty estimation for the European Pharmacopoeia HPLC analysis of human insulin // Analyst. 2002. - 127. - P. 1676-1681.

65. Brown H., Sanger F., Kitai R. The structure of sheep and pig insulins // Biochem. Journal. 1955. - 60. - P.556-565.

66. Calam D.H. Application of chromatography in the standardization and control of biological products // Journal of Chromatography. A. 1978. - 167. - P.91-108.

67. Chen H., Shi M., Guo Z.-Y., Tang Y.-H., Qiao Z.-S., Liang Z.-H., Feng Y.-M. Four new monomeric insulins obtained by alanine scanning the dimmer-forming surface of the insulin molecule // Protein Eng. Des. Sel. 2000. - 13(11). - P.779-782.

68. Chowdhury S.A., Dodson E.J., Dodson G.G., Dodson C.D., Reynolds C.D., Tulley S.P., Blundell T.L., Cleasby A., Pitts J.E., Tickle I.J., Wood S.P. The crystal structure of three nonpancreatic human insulins // Diabetologia. 1983. - 25.1. P.460-464.

69. Cohen K.A., Schellenberg K., Benedek K., Kager B.L., Grego. В., Hearn T.W. Mobile phase and temperature effects in the reversed phase chromatographic separation of proteins // Anal. Biochem. 1984. - 140. - P.223-235.

70. Conlon J.M., Basir Y., Joss J.M.P. Purification and characterization of Insulin from the Australian Lungfish, Neocerato-clus forsteri (Diploi) // General and Comparative Endocrinology. 1999. - 116. - P.1-9.

71. Conlon J.M., Fan H., Fritzsch B. Purification and characterization of Insulin and Glucagon from the Bichir Polypterys sens-galis (Actinopterygii: Polypteriformes) // General and Comparative Endocrinology. 1998. - 109. - P.86-93.

72. Conlon J.M., Trauth S.T., Sever D.M. Purification and characterization of Insulin and Glucagon from the Lesser Siren, Siren intermedia (Amphibia: Caudata) // General and Comparative Endocrinology. 1997. - 106. - P.295-300.

73. Cuhen K.A., Schellenberg K., Benedek K., Karger B.L., Grego В., Hearn M.T.W. Mobile-phase and temperature effects in the reversed-phase chromatographic separation of proteins // Anal. Biochem. 1984. - 140. - P. 223-235.

74. Diers J.V. In Drug Biotechnology Regulations (Scientific Basis and Practices)/ J.V. Diers, E. Rasmussen, P.H. Larsen,

75. J.L. Kjaersig; Y.H. Ghiu, D.L. Gueriguain, Eds. Mareel Dek-ker, Inc.: New York, 1991. - P.167-177.

76. Dinner A., Lorenz L. High-performance Liquid Chromatographic Determination of Bovine Insulin // Anal. Chem. 1979. -51.1. P.1872-1873.

77. Dorsey J.G., Cooper W.T. Liquid Chromatography. Theory and Methodology // Anal. Chem. 1998. - 70(12). - P.591-644.

78. Dorsey J.G., Cooper W.T., Siles B.A., Foley J.P., Barth H.G. Liquid chromatography: Theory and methodology // Anal. Chem. -1998. 70. - P.591-644.

79. European Pharmacopeia. 4th Edition. Strasbourg, France. 2002.

80. Fabris D., Fenselau C. Characterization of Allosteric Insulin Hexamers by Electrospray Ionization Mass Spectrometry // Anal. Chem. 1999. - 71. - P.384-387.

81. Fineberg S.E., Galloway G.A., Fineberg N.S., Goldman J. Effects of Species of Origin, Purification Levels, and Formulation on Insulin Immunogenicity // Diabetes. 1983. - 32.1. P.592-599.

82. Fisher B.V., Porter P.B. Stability of bovin Insulin // J. Pharm. Pharmacol. 1981. - 33. - P.203-206.

83. Galloway J.A. Chemistry and clinical use of Insulin // Diabetes Millitus. 1988. - P.106-137.

84. Galloway J.A., de Shazo R.D. Insulin Chemistry and Pharmacology; Insulin Allergy, Resistence, and Lipodystrophy // Diabetes Millitus. 1988. - P.106-137.

85. Gurley L.P., Prentice D.A., Valdez J.G., Spall W.D. HPLC of chromatine histone // J. Chromatogr. 1983. - 266. - P. 609

86. Harfenist E.J. The amino acid composition of insulins isolated from beef and sheep glands // Journal Am. Chem. Soc.1953. 75. - P.5528.

87. Hayakawa T. Scientific rationale for the replacement of an in vivo bioassay for protein drugs with a physico-chemical assay. [Japanese] // Eisei Shikenjo Hokoku Bulletin of National institute of Hygienic Sciences. - 1994. - 112. - P.202-203.

88. Hodgkin D.C. The structure of insulin // Diabetes. 1972.21. P.1131-1150.

89. International Conference on Harmonization (ICH), Q2A: Text on Validation of Analytical Procedures, US FDA Federal Register, Vol.60. March 1995, P.11260.

90. International Conference on Harmonization (ICH), Q2b: Validation of Analytical Procedures: Methodology, US FDA Federal Register, Vol.62. May 1997, p.27463.

91. Japanese Pharmacopoeia. 14th Edition English version., 2001.

92. Johnson I.S. Authenticity and Purity of Human Insulin (recombinant DNA) // Diabetes care. 1982. - 5(2). - P.4-12.

93. J0rgensen K.H., Hallund 0., Heding L.G., Tronier В., Falholt K., Damgaard U., Thim L., Brange J. Estimation of insulin purity in light of developments in analytical methods. In:

94. Gueriguian J.L., Bransome E.D., Outschoorn A.S. (eds).

95. Rockville, Maryland: United States Pharmacopeial Convention, Inc., 1982. P.139-147.

96. Karounos D.G., Bryson J.S., Cohen D.A. Comparative Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Studies of Human Insulin and Analogues in Chronic Diabetic Yucatan Minipigs // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998. - 286(2). - P.959-966.

97. Kroeff E.P., Chance R.E. Applications of high performance liquid chromatography for the analysis of insulins. In: Gueriguian JL, Bransome ED, Outschoorn AS (eds). - Rockville, Maryland: United States Pharmacopeial Convention, Inc., 1982.1. P.148-162.

98. Kroeff E.P., Owens R.A., Campebell E.L., Jonson R.D., Marks H.J. Production Scale Purification of Biosynthetic Human Insulin by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1989. - 461. - P.45-61.

99. Ladish M.K., Kohlmann K.L. Recombinant Human Insulin // Bio-technol. Prog. 1992. - 8. - P.469-478.

100. Liu H.-J., Strong R.-E., Krull I.S., Cohen S.A. Homogeneous preparation of fluorescent derivatized insulin and its application to competitive chromatographic immunoasseys // Analytical Biochemistry. 2001. - 298. - P. 103-111.

101. Lloyd L.F., Corran P.H. Analysis of insulin Preparations by

102. Reversed Phase High-performance Liquid Chromatography // J. Chromatogr. 1982. - 240. - P.445-454.

103. Mark A.E. Nicol L.W., Jeffrey P.D. The self-association of zinc-free bovine insulin. A single model based on interaction the crystal that describes the association pattern in solution at pH 2, 7 and 10// Biophys. Chem. 1987. - 27. - P.103-117.

104. Mark A.E. Nicol L.W., Jeffrey P.D. The self-association of zinc-free bovine insulin. A single model based■on interaction the crystal that describes the association pattern in solution at pH 2, 7 and 10// Biophys. Chem. 1987. - 27. - P.103-117.

105. Mark A.E., Jeffrey P.D. Self-association of zinc-free bovine insulin // Boil. Chem. Hoppe-Seyler. 1990. - 371. - P.1165-1174.

106. Markussen J. Human Insulin by tryptic transpeptidation of porcine Insulin and biosynthetic precursors. MTP. Lancaster.1987. 122 P.

107. Metods in enzimology. Volume 104. Enzyme purification and related techniques. Part C. / W.B. Jakoby (eds) Orlando, Florida, USA: Academic Press, INC., 1984. - 528 p.

108. Muggleton P.W., Melaren J.G., Dyke W.J. Effect of protamine sulfate on experimental tumours in mice // Lancet. 1964. -1(7370). - P.409-410.

109. Nathan D.M., Axelrod L., Flier J.S., Carr D.B. U-500 insulin in the treatment of antibody mediated insulin resistance // Ann. Int. Med. 1970. - 200. - P.33-45.

110. Nicol S., Smith L.F., Amino-acid sequence of human insulin. // Nature. 1960. - 187, P.483-485.

111. Nilsson J., Johansson P., Samuelson E., Stahl S., Uhlen M. Human Integrated production of human insulin and its C-peptide // J.Biotechnol. 1996. - 48. - P.241-250.

112. Ohta M., Tokunaga H., Kimura Т., Satoh H., Kawamura J. Analysis of insulins by High-performance Liquid Chromatography. II. Separation of various species of insulins // Chem. Pharm. Bull.- 1983. 31. - P.3566-3570.

113. Ollendorff P. The nature of anticoagulant effects of heparin, protamin, polybrene and toluidine blue // Scan. J. Clin. Invest. 1963. - 14(3). - P. 267-276.

114. Olsen H.B., Ludvigsen S., Kaarsholm N.C. Solution structure of an engineered insulin monomer at neutral pH // Biochemistry.- 1996. 35. - P.8836-8845.

115. Peter A., Szepesi G., Balaspiri L., Burger K. Coordinative interactions in the separation of insulin and its derivatives by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr.1987. 408. - P.43-52.

116. Plum A., Agers0 H., Andersen L., Pharmacokinetics of the Rapid Acting Insulin Analog, Insulin Aspart, in Rats, Dogs, and Pigs, and Pharmacodynamics of Insulin Aspart in Pigs // Drug Metab. Dispos. 2000. - 28(2). - P.155-160.

117. Rahuel-Clermont S., French C.A., Kaarsholm N.C., Dunn M.F. Mechanisms of Stabilization of the Insulin Hexamer Through Al-losteric Ligand Interactions // Biochemistry. 1997. - 36.1. P.5837-5845.

118. Ratner R.E., Phillips M.T., Steiner M. Effects of Species of Origin, Purification Levels, and Formulation on Insulin Immuno-genicity // Diabetes. 1983. - 32. - P.592-599.

119. Ratner R.E., Phillips M.T., Steiner M. Persistent Cutaneous Insulin Allergy Resulting From High-Molecular-Weight Insulin Aggregates // Diabetes. 1990. - 39. - P.728-733.

120. Rivier J., MeClintock R., Reversed phase high-performance liquid chromatography of insulins from different species // Journal Chromatogr. 1983. - 286. - P. 112-119.

121. Rolando R.L., Torroba D. Heterogeneity of the Fourth International Standard for insulin by gel-chromatography on Sephadex // Experimentia. 1972. - 28. - P.1169-1171.

122. Rubinstein M. Preparative high-performance liquid ppartition chromatography of proteins // Anal. Biochem. 1979. - 98.1. P.1-7.

123. Rubinstein M., Chen-Kiang S., Stein S., Udenfriend S. Characterization of proteins and peptides by high-performance liquid chromatography and fluorescence monitoring of their tryptic digests // Anal. Biochem. 1979. - 95. - P.117-121.

124. Ryle, A. The disulfide bonds of insulin // Biochem. Journal. 1955. - 60. - P.54.

125. Sanger F., Thompson E. The amino acid sequence in the glycyl chain of insulin. 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates // Biochem. Journal. 1953. - 53.1. P.353-365.

126. Sanger F., Thompson E. The amino acid sequence in the glycylchain of insulin. 2. The investigation of peptides from enzymatic hydrolysates // Biochem. Journal. 1953. - 53. - P.366.

127. Sanger F., Thompson E., Kitai R. The amid group of insulin // .Biochem. Journal. 1955. - 59. - P.509.

128. Sanger F., Tuppy H. The amino acid sequence in the phenyla-lanyl chain of insulin. 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates // Biochem. Journal. 1951. - 49.1. P.463-480.

129. Sanger F., Tuppy H. The amino acid sequence in the phenyla-lanyl chain of insulin. 2. The investigation of peptides from enzymatic hydrolysates // Biochem. Journal. 1951. - 49.1. P.481.

130. Schernthaner G. Immunogenicity and allergic Potencial of Animal and Human Insulins // Diabetes Care. 1993. - 16(3).1. P.155-165.

131. Schichtkrull J. Letter: Antigenicity of monocomponent insulins // Lancet. 1974. - 11. - P.1260-1261.

132. Schlichtkrull J. Purity and antigenicity of insulin preparations // Acta Paediatr. Scand. 1977. - 270. - P.37-40.

133. Simkin R.D., Cole S.A., Ozawa H., Magdoff-Fairchild В., Eg-gena P., Rudko A., Low B.W. Precipitation and crystallization of insulin in presence of lysozume and salmin // Biochem. Bio-phys. Acta. 1970. - 200. - P.34-42.

134. Steiner D.F. The Banting memorial lecture 1976. Insulin today // Diabetes. 1976. - 26. - P.322-340.

135. Stewart G.A. Historical review of the analytical control of insulin // Analyst. 1974. - 99. - P.913-928.

136. Szepesi G., Gazgad M. Separation of large polypeptide by HPLC// J. Chromatogr. 1981. - 218. - P.603-612.

137. Szepesi G., Gazgad M. Impruved high performance LC method for analisis of insulins and related compounds // J. Chromatogr.1979. 172. - P.163-177.

138. Taneja A.K., Lau S.Y.M., Hodges R.S. Separation of hydrophobic peptide polymers by size-exclusion and reversed-phase high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1984. -317. - P. 1-10.

139. Terabe S., Konaka R., Inouye K. Separation of some polypeptide hormones by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1979. - 172. - P.163-177.

140. The handbook of analysis and purification of peptide and proteins by reversed phase HPLC Vydac the Separation Group (Second Edition). - 1995. - 64 p.

141. Topp B. A Model of 3-cell Mass, Insulin, and Glucose Kinetics: Pathways to Diabetes // Journal of Structural Biology. 1999. - 125. - P.11-18.

142. Tulloch P.A. Single-Molecule imagine of Human Insulin Receptor Ectodomain and Its Fab Complexes // Journal of Structural Biology. 1999. - 125. - P.11-18.

143. US Pharmacopeia 28 and National Formulary 23. Rockville, MD: United States Pharmacopeal Convention, Inc., 2005.

144. Welinder B.S. Gel Permeation Chromatography of Insulin // J. Liq. Chromatogr. 1980. - 3. - P.1399-1403.

145. Welinder B.S. Homogeneity of crystalline Insulin estimated by GPC and reversed phase HPLC. In: CRC Handbook of HPLC for Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins. 1980. - II.1. P.413-419.