Интерполимерные комплексы нуклеиновых кислот с белками тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Ряднова, Ирина Юрьевна

• Ряднова, Ирина Юрьевна
• кандидат химических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ряднова, Ирина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурная организация дезоксирибонуклеиновой кислоты.

1.2. Свойства ДНК в водных растворах.

1.3. Связывание ионов металлов с нуклеиновыми кислотами.

1.4. Интеркаляция.

1.5. Взаимодействие ДНК с пептидами и белками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 .Материалы исследования.

2.2.Методы исследования.

2.2.1. Гель-хроматография.

2.2.2. Метод определения белка по Лоури.

2.2.3. Метод фракционирования ДНК при микрофильтрации.

2.2.4. Вискозиметрия.

2.2.5. Метод мембранного диализа.

2.2.6. Метод выделения природных нуклеопротеиновых комплексов

2.2.7. Метод получения кортексина.

2.2.8. Электрофорез нуклеопротеиновых комплексов.

2.2.9. Ферментативный гидролиз.

2.2.10. Аффинная хроматография.

2.2.11. Электронная микроскопия.

2.2.12. Метод оценки биологической активности.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1.Исследование взаимодействия ДНК с модельными белками по спектральным характеристикам.

3.2.Исследование взаимодействия ДНК с модельными белками методом гель-хроматографии.

3.3.Микрофильтрация вязких растворов на трек-мембранных модулях

3.4.Комплексообразование ДНК с модельными белками по данным метода мембранного диализа.

3.5.Вязкостные характеристики ДНК при взаимодействии с белками.

3.6.Исследование природных нуклеопротеиновых комплексов.

3.7.Исследование морфологии нуклеопротеиновых комплексов методом электронной микроскопии.

3.8.Сравнение тканеспецифичности природных и модельных нуклеопротеиновых комплексов.

3.9.Обсуждение практической значимости полученных результатов.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интерполимерные комплексы нуклеиновых кислот с белками»

Актуальность проблемы. Исследование процессов, протекающих в организме и создание препаратов, способных влиять на метаболические функции, является приоритетным направлением для большинства современных наук и, в частности, химии высокомолекулярных соединений.

В последние годы все большее внимание исследователей привлекает поиск новых веществ, которые позволяют направленно корректировать функциональную активность клеток. В медицинском аспекте этой проблемы целью является восстановление органов и тканей организма на клеточном уровне при их радиационном поражении или геронтологической дисфункции. В настоящее время в качестве таких препаратов, корректирующих клеточный цикл, используют различного рода экстракты из тканей животных, содержащие биорегуляторы белковой природы.

Известно, что в постоянно функционирующих органах высших организмов в состоянии митотического равновесия оптимальное соотношение между делящимися, функционирующими и отмирающими клетками поддерживается группой белков-регуляторов, связанных с ДНК. Такие белки являются специфическими эндогенными регуляторами как деления клеток, так и их последующей дифференциации. Однако, использование этих веществ для коррекции цикла клеточного развития при решении медицинских и геронтологических задач не было успешным из-за короткого времени жизни этих белков в плазме крови и цитоплазме, когда их вводили туда в очищенном виде.

Существует способ пролонгирования действия белка и его целенаправленного транспорта в организме путем включения его в интерполимерный комплекс (ИПК), при этом наиболее надежными носителями являются линейные полиэлектролиты. Нуклеиновые кислоты (НК) - ДНК и РНК - относятся к группе сильных линейных жесткоцепных полиэлектролитов, которые несут постоянный отрицательный заряд на фосфатных группах и образуют прочные комплексы с белковыми макромолекулами. При этом сохраняется тканеспецифическая регуляторная активность белковой молекулы, которая также защищена в комплексе от действия гидролаз (протеиназ). Участие ДНК в ИПК стабилизирует ее структуру, защищает от расщепления клеточными нуклеазами и обеспечивает трансмембранный транспорт комплекса в ядро клетки. Все это определяет перспективы использования подобных нуклеопротеиновых комплексов (НПК) в качестве тканеспецифических эндогенных регуляторов. Поэтому исследование особенностей комлексообразования ДНК и белков представляет большой практический интерес для создания пролонгированных форм лекарственных препаратов, направленно корректирующих функциональную активность организма на молекулярном уровне.

В работах школы академика В.А. Кабанова широко исследованы физико-химические особенности связывания ДНК с синтетическими полиэлектролитами и определены перспективы использования таких комплексов для доставки генетического материала в клетку. Наряду с этим, исследованы особенности образования интерполимерных комплексов белковых макромолекул с синтетическими или природными полимерами, несущими сульфо- и карбоксильные группы. Таким образом, в настоящее время развивается новое научное направление, посвященное созданию, исследованию и медицинскому применению ИПК ДНК с биологически активными лигандами. Однако, до начала представляемой работы не проводилось физико-химических исследований закономерностей связывания НК с неядерными белками и стабильности таких нуклеопротеиновых комплексов.

Цель работы состояла в получении устойчивых комплексов ДНК с глобулярными неядерными белками для стабилизации макромолекулы ДНК и защиты ее от расщепления нуклеазами при сохранении структуры и свойств молекулы белка. Получение подобных комплексов является существенным для проведения медико-биологических исследований. Для достижения поставленной цели было необходимо: оценить устойчивость комплексов нативной ДНК с глобулярными белками, которые различаются изоэлектрической точкой и количеством заряженных групп в физиологических условиях в достаточно широком диапазоне ионной силы - 0.1-7-0.5 н. Кроме того, необходимо было определить коэффициенты связывания модельных белков с ДНК и сравнить полученные закономерности с взаимодействием ДНК с ядерным тканеспецифическим регулятором пептидной природы, входящим в состав хроматина. В работе требовалось оценить изменение конформации природного высокомолекулярного полиэлектролита - ДНК при взаимодействии с белками и изучить морфологию природных НПК и комплексов ДНК с модельными белками.

Для оценки тканеспецифического биологического действия этих комплексов был использован метод аффинной хроматографии. В работе оценивали селективность связывания природных НПК с рецепторами клеток коры головного мозга в сравнении с коэффициентами связывания белков и модельных нуклеопротеиновых комплексов.

Научная новизна. В рамках темы X научных исследований ИВС РАН "Экохром 95-98" - программы по созданию новых полимеров, в том числе для мембранной технологии, решения экологических задач и развития новых хроматографических методов - был разработан метод фракционирования ДНК микрофильтрацией на трек-мембранных модулях.

Впервые изучены закономерности связывания ДНК с неядерными глобулярными белками, которые различаются электро-химическими характеристиками и исследована устойчивость полученных комплексов в интервале ионной силы 0.1-й).5 н.

Впервые получены изотермы связывания ДНК с белками инсулином, цитохромом С, пепсином и кортексином. Рассчитаны константы связывания и степень заполнения молекулы ДНК белком при различном количественном 7 соотношении компонентов в растворе. Показано, что при образовании интерполимерных комплексов наблюдается компактизация молекулы ДНК.

Впервые изучена селективность связывания с мембранами клеток коры головного мозга ДНК, препарата специфических полипептидов мозга -кортексина, инсулина, нуклеопротеиновых комплексов ДНК-инсулин, ДНК-кортексин, а также природных нуклеопротеиновых комплексов из мозга и печени крупного рогатого скота.

Впервые проведено микроскопическое исследование морфологии природного НПК мозга и нуклеопротеиновых комплексов ДНК с цитохромом С и кортексином.

Впервые проведены эксперименты по оценке тканеспецифичного действия НПК мозга и печени в культуре ткани.

Практическая значимость выполненной работы определяется тем, что результаты исследований модельных систем и природных НПК были использованы при разработке промышленного регламента и технических условий на выделение природных НПК для получения лечебно-профилактических препаратов (биологически активных добавок к пище).

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Ряднова, Ирина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Методами гель-хроматографии, неравновесного мембранного диализа, УФ-спектрофотометрии, вискозиметрии и электронной микроскопии исследованы модельные и природные нуклеопротеиновые комплексы. Установлено, что свойства изученных комплексов зависят от индивидуального компонентного состава.

2. Получены модельные НПК нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты с белками: протамином, инсулином, цитохромом С, пепсином и кортексином при различных весовых соотношениях. Установлено, что в физиологической области рН происходит образование необратимо связанных нуклеопротеиновых комплексов. Полученные НПК устойчивы в диапазоне ионной силы раствора 0.1-Ю.5 н.

3. Показано, что изотермы связывания ДНК с белками имеют кооперативный характер. Степень заполнения молекулы ДНК белком зависит от начального соотношения компонентов в растворе и от индивидуальных физико-химических характеристик белка. Максимальная степень связывания наблюдается для кортексина и цитохрома С.

4. Установлено, что характеристическая вязкость ДНК уменьшается при образовании НПК, что свидетельствует об изменении конформации нуклеиновой кислоты. Показана корреляция между снижением характеристической вязкости и увеличением степени заполнения ДНК белком. Максимальная компактизация наблюдается при связывании ДНК с кортексином. Это подтверждают данные электронной микроскопии свободной ДНК и ее комплексов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ряднова, Ирина Юрьевна, 2000 год

1. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. -М: Мир, 1976. -412 с.

2. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. -М.: Мир, 1987. -584 с.

3. Arnott S., Chondraserakan R., Hall L.H. Puigjaner J.K., Walker J.K., Wang M. DNA secondary structures: helices, wrinkles and junctions. -In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative biology. -1983. -V. XLVII. -P. 53-67.

4. Lilley D.M.J. Dynamic, sequence-dependent DNA-structures as exemplified by cruciform extrusion from inverted repeats in negatively supercoiled DNA. -In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative biology. -1983. -V. XLVII. -P. 101-113.

5. Strick T.R., Croquette V., Bensimon D. Homologous pairing in stretched supercoiled DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. -V. 95, № 18. -P. 1057910583.

6. Бреслер C.E. Молекулярная биология. -Л.: Наука, 1973. -577 с.

7. L. Cruzeiro-Hansson DNA bending due to sequence-induced torsional stress // J. Chem. Soc. Faraday Trans. -1997. -V. 93, № 14. -P. 2419-2425.

8. Новейшие методы исследования полимеров. Под ред. Б.Ки. -М.: Мир, 1966. -571 с.

9. Ю.Чанг P. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. -М.:

10. Мир, 1980. -662 с. 11.Моравец Г. Макромолекулы в растворе. -М.: Мир, 1967. -398 с.

11. Scott E. Osborne, Jens Volker, Shawn Y. Stevens, Kenneth J. Breslauer, Gary P. Click, design, synthesis and analysis of disulfide cross-linked DNA duplexes // J. Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118, № 48. -P. 11993-12003.

12. Scott E. Osborne, Robert J. Cain, Gary P. Click, structure and dynamics of disulfide cross-linked DNA triple helices // J. Am. Chem. Soc. -1997. -V. 119, № 6.-P. 1171-1182.

13. Павлова C.-C.A., Дубровина JI.B., Брагина Т.П. Изучение процесса ассоциации макромолекул методом рассеяния света // Высокомолек. Соед. Б. -1996. -Т. 38, № 12. -С. 2065-2073.

14. Ануфриева E.B., Краковяк М.Г. Динамика полимерных цепей в процессах структурных и химических превращений макромолекул // Высокомолек. Соед. -1984. -Т. 29, № 2. -С. 211-222.

15. Ануфриева Е.В., Некрасова Т.Н., Шевелева Т.В., Краковяк М.Г. Строение и структурные превращения макромолекул и люминесценция магниевой соли 8-анилиннонафталин-1-сульфокислоты // Высокомолек. Соед. А. -1994. -Т. 36, №3. -С. 449-452.

16. Фрисман Е.В., Воробьев В.Ю., Щагина JI.B., Яновская Н.К. Динамическое двойное лучепреломление в растворах дезоксирибонуклеиновой кислоты // Высокомолек. Соед. -1962. -Т. 4, № 5. -С. 762-768.

17. Штенникова И.Н., Филиппова Т.В., Даутценберг X. Влияние природы растворителя на динамооптические свойства молекулкарбоксиметилцеллюлозы в растворе // Высокомолек. Соед. Б. -1993. -Т. 35, № 9. -С. 1459-1464.

18. Цветков В.Н. Жесткоцепные полимерные молекулы. -Л.: Наука, 1986. -379 с.

19. Голуб Е.И., Дворкин Г.А., Назаренко В.Г. Об оценке жесткости молекул ДНК в растворе // Биохимия. -1963. -Т. 28, № 6. -С. 1048-1046.

20. Маршал Э. Биофизическая химия. Принципы, техника и приложения в 2-х томах. -М.: Мир, 1981. -820 с.

21. Kirchener J.J., Hopkins Р.В. Nitrous acid cross-links duplex DNA fragments through deoxyguanosine residues at the sequence 5'-CG // J. Am. Chem. Soc. -1991. -V. 113, № 23. -P. 4681-4682.

22. Wolf В., Hanlon S. Structural transitions of deoxyribonucleic acid in aqueous electrolyte solutions. II The role of hydration // Biochemistry. -1975. -V. 14, № 8. -P. 1661-1670.

23. Монтрель M.M., Сухоруков Б.И. Влияние водородных ионов на В-А переход в ДНК // Молек. биол. -1989. -Т. 23, № 3. -С. 699-707.

24. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. -М.: Химия, 1978. -582 с.

25. Бреслер С.Е. Введение в молекулярную биологию. М.-Л.: Наука, 1966. -514 с.

26. Переход спираль-клубок ДНК в щелочной среде / Ахрем А.А., Арутюнян С.Г., Асланян В.Н., Далян Е.Б., Ландо Д.Ю., Шпаковский А.Г. // Молек. биол. -1989. -Т. 25, № 2. -С. 518-525.

27. Frank-Kamenetskii M.D. Protonated DNA structures. -In Methods in enzymology. -V.211.-P. 180-191.

28. Gehring K., Leroy J.-L., Gueron M. A tetrameric DNA structure with protonated cytosine-cytosine base pairs //Nature. -1993. -V. 363, № 6429. -P. 561-565.

29. Кочетков H.K., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. -М.: Химия, 1970.-718 с.

30. Young М.А., Jayaram В., Beveridge D.L. Local dielectric enveronment of B-DNA in solutions results from a 14 ns molecular dynamics trajectory // J. Phys. Chem. B. -1998. -V. 102, №. 39. p. 7666-7669.

31. Merchie A.I.N., Lilley D.M.J. Supercoiled DNA and cruciform structures. -In Methods in enzymology. -1992. -V. 211. -P. 158-180.

32. Michelson A.M. The chemistry of nucleosides and nucleotides. -L. and N.-Y.: Academic Press, 1963. -622 p.

33. Фрисман E.B., Воробьев В.Ю., Щагина JI.B., Яновская Н.К. Динамическое двойное лучепреломление в растворах дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) // Высокомолек. Соед. -1963. -Т. 5, № 4. -С. 622-627.

34. Golub E.I. The method for estimation of chain macromolecule rigidity. Biopolymers. -1964. -V. 2, № 2. -P. 113-121.

35. Khan M.O., Jonsson B. Electrostatic correlations fold DNA // Biopolymers. -1999.-V. 49, №2.-P. 121-125.

36. Manning G.S. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic properties of polynucleotides // Quaterly reviews of Biophysics. -1978. -V. 11, № 2. -P. 176-246.

37. Pezzano H., Podo F. Structure of binary complexes of mono- and polynucleotides with metal ions of the first transition group // Chemical reviews. -1980. -V. 80, № 5.-P. 365-401.

38. Structure of B DNA cationic shell as revealed by an X-ray difraction study of Cs DNA / Bartenev V.N., Golovamov Eu.I., Kapitonova K.A., Mokulskii M.A., Volkova L.I., Skuratovskii I.Ya. // J. Mol. Biol. -1983. -V. 169, № 1. -P. 217-234.

39. Hanlon S., Brudno S., Wu T.T. Wolf B. Structural transitions of deoxyribonucleic acid in aqueous electrolyte solutions. I Reference spectra of conformation limits // Biochemistry. -1975. -V. 14, № 8. -P. 1648-1660.

40. Nucleic acid-metal interactions. Ed. Spiro T.G. -N.-Y.: 1980. -V. 1. -256 p.

41. Bellon S.F., Coleman J.H., Lippard S.J. DNA unwinding produced by site-specific intrastrand cross-links or the antitumor drug cw-diamminedichloroplatinum (II) // Biochemistry. -1991. -V. 30. -P. 8026-8035.

42. Kasyanenko N., Arikainen N., Frisman E. Investigation of DNA-complexes with iron ions in solution // Biophys. Chem. -1998. -V. 70, № 2. -P. 93-100.

43. Kasyanenko N., Zanina A., Plotnikova L., Simonenkova A., Deffrenney S. Study of the DNA packing caused by charged compounds of different nature in solution // Macromol. Symp.-1998.-V. 136, № l.-P. 25-31.

44. Patel D.J., Pardi A., Itakura K. DNA conformation, dynamics and interactions in solution // Science. -1982. -V. 216, № 4546. -P. 581-590.

45. Gopalakrishnan S., Liu X., Patel D.J. Solutions structure of the covalent sterigmatocystin-DNA adduct // Biochemistry. -1992. -V. 31, № 44. -P. 1079010801.

46. Sun D., Hansen M., Clement J.J., Hurley L.H. Structure of the altromycin B (N7-guanine)-DNA adduct. A proposed prototypic DNA adduct structure for the pluramycin antitumor antibiotics // Biochemistry. -1993. -V. 32, № 32. -P. 80688074.

47. Vogel H.J. (ed). Nucleic acid-protein recognition. -N.-Y.: Academic press. -1977. -587 p.

48. Von Hippel P.H., McGhee J.D. DNA-protein interactions // Ann. Review Biochem. -1972. -V. 41, № 1. -P. 231-300.

49. Van Dam L., Nardenskiold L. Interactions of polyamines with the DNA octamers d(m5CG)4 and d(GGAATTCC): A 'H-NMR investigation // Biopolymers. -1999. -V. 49, № 1.-P. 41-53.

50. Suzuki M., Yagi N. An in-the groove view of DNA structures in complexes with proteins // J. Mol. Biol. -1996. -V. 255, № 5. p. 677-687.

51. Church G.M., Sussman J.L., Kim S.-H. Secondary structural complementarity between DNA and proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1977. -V. 74, № 4. -P. 1458-1462.

52. Seeman N.C., Rosenberg J.M. Sequence-specific recognition of double helical nucleic acid by proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1976. -V. 73, № 3. -P. 804808.

53. Hassan M.A., Calladine C.R. Two distinct models of protein-induced bending in DNA //J. Mol. Biol. -1998. -V. 282, № 2. -P. 331-343.

54. Nekludova L., Pabo C.O. Distinctive DNA conformation with enlarged major groove is found in Zn-finger-DNA and other protein-DNA complexes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1994. -V. 91, № 15. -P. 6948-6952.

55. Structure of the CAP-DNA complex at 2.5 A resolution: a complete picture of the protein-DNA interface / Parkinson G., Wilson C., Gunasekera A., Ebright Y.W., Ebright R.E., Berman H.M. // J. Mol. Biol. -1996. -V. 260, № 3. -P. 395-408.

56. Klug A. Gene regulatory proteins and their interaction with DNA. -In DNA: the double helix. Perspective and prospective at forty years. Annals of the New York Academy of sciences. -1995. -V. 758. -P. 143-160.

57. Leonard D.A., Rajaram N., Kerppola Т.К. Structural basis of DNA bending and oriented heterodimer binding by the basic leucine zipper domains of Fos and Jun // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. -V. 94, № ю. -P. 4913-4918.

58. Kim J.L. Nikolov D.V., Burley S.K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element // Nature. -1993. -V. 365, № 6446. -P. 520-527.

59. Luisi В., Orozco M., Sponer J., Luque F. On the potential role of the amino nitrogen atom as a hydrogen bond acceptor in macromolecules // J. Mol. Biol. -1998. -V. 279, №5.-P. 1123-1136.

60. Романов Ю.А., Кетлинский C.A., Антонхин А.И., Окулов В.Б. Кейлоны и регуляция деления клеток. -М.: Медицина, 1984. -208 с.

61. Pellegrini L., Tan S., Richmond T.J. Structure of serum response factor core bound to DNA // Nature. -1995. -V. 376, № 6540. -P. 490-498.

62. Ruoslahti E., Yamaguchi Y., Hildebrand A., Border W.A. Extracellular matrix.growth factor interactions. -In Cold Spring Harbor symposia. -1992. -V. LVII. -P. 309-315.

63. Кетлинский С.А., Парфенова Е.В. Изучение биологической активности кейлонов, выделенных из нормальной и регенерирующей печени // Бюл. Экспер. Биол. -1981, № 7. -С. 96-98.

64. Якубов Л.А., Шестова О.Е., Андреева А.Ю., Власов В.В. Участие специфических белков клеточной поверхности в транспорте нуклеиновых кислот в клетки //Докл. АН. России. -1998. -Т. 361, № 4. -С. 550-553.

65. Лобов И.Б., Митчелл А.Р., Подгорная О.И. Белок ядерного матрикса, специфически связывающий сателлит мыши // Молек. биол. -1998. -Т. 32, № 6.-С. 1056-1061.

66. Malchy B.L. Studies on the reactive properties of histone amino groups: reactivities of free histones and histones in chromatin as a function of ionic strength // Biochemistry. -1977. -V. 16, № 17. -P. 3922-3927.

67. McGhee J.D., Felsenfeld G. Nucleosome structure // Ann. Rev. Biochem. -1980. -V. 49. -P. 1115-1156.

68. Zhou Y.-B., Gerchman S.E., Ramakrishnan Y., Travers A., Muyldermans S. Position and orientation of the globular domain of linker histone H5 on the nucleosome // Nature. -1998. -V. 395, № 6700. -P. 402-405.

69. Butler P.J.G., Thomas J.O. Dinucleosomes show compaction by ionic strength consistent with bending of linker DNA // J. Mol. Biol. -1998. -V. 283, № 3. -P. 401-407.

70. Wu Z., Murphy C., Wu C.-H.H., Tsvetkov A., Gall J.G. Snurposomes and coiled bodies. -In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. -1993. -V. 58, -P. 747-754.

71. Gurlie R., Duong T.N., Zakrzewska K. The role of DNA-protein salt bridges in molecular recognitions model study // Biopolymers. -1999. -V. 49. № 4. -P. 313327.

72. Dunaway M., Ostrander E.A. Local domains of supercoiling activate a eukariotic promoter in vivo //Nature. -1993. -V. 361, № 6414. -P. 746-748.

73. Rich A. The nucleic acid. -In DNA: the double helix. Perspective and prospective at forty years // Annals of the New York Academy of sciences. -1995. -V. 758. -P. 97-142.

74. Crothers D.M. Upsetting the balance of forces in DNA // Science. -1994. -V. 266. -P. 1819-1820.

75. Strauss J.K., Maher III J. DNA bending by asymmetric phosphate neutralisation // Science. -1994. -V. 266. -P. 1829-1834.

76. Wolffe A.P. Architectural transcription factors // Science. -1994. -V. 264, -P. 1100-1101.

77. Katan-Khaykovich Y., Shaul Y. RFX1, a single DNA-binding protein with a split dimerization domain, generates alternative complexes // J. Biol. Chem. -1998. -V. 273, №38. -P. 24504-24512.

78. Bell A., Kittler L., Lober G., Zimmer C. DNA binding properties of minor groove binders and their influence on the topoisomerase II cleavage reaction // J. Mol. Recognit. -1997. -V. 10, № 6. -P. 245-255.

79. Tanatani A., Fukutomi R., Ranuta H., Tomioka N., Itai A. Novel DNA minor groove binders with an aromatic layered structure // Nucleic acid Symp. Ser. -1998.-V. 39. -P. 31-32.

80. Cattau D., Bourgoin D., Joly M. Change of conformation of DNA by association with proteins // Eur. J. Biochem. -1969. -V. 8, № 4. -P. 541-546.

81. Панарин Е.Ф. Основные типы и принципы синтеза биологически активных полимеров. В сб.: "Синтез, структура и свойства полимеров" (ИВС АН СССР). Л.: Наука, 1989. -С. 187-198.

82. Simon M.I. Summary: the cell surface regulates information flow, material transport, and cell identity. In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative biology. -1992. -V. LVII. -P. 673-688.

83. Кабанов A.B., Кабанов B.A. Интерполиэлектролитные комплексы нуклеиновых кислот как средство доставки генетического материала в клетку // Высокомолек. Соед. 1994. -Т. 36, № 2. -С. 198-211.

84. Дебабов В.Г. ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзитной экспрессии нуклеиновых кислот в соматических клетках человека и животных // Молек. биол. -1997. -Т. 31, № 2. -С. 209-215.

85. Стеценко Д.А., Лубяко E.H., Потапов В.К., Ажикина Т.Л., Свердлов Е.Д. Синтез и свойства новых смешанных биополимеров, содержащих олигонуклеотиды и их полиамидные аналоги // Докл. АН России. -1995. -Т. 343, №6. -С. 834-837.

86. Розенкранц A.A., Ячменев C.B., Соболев A.C. Использование искусственных конструкций для селективного переноса генетического материала в клетки человека путем рецептор-опосредованого эндоцитоза // Докл. АН России. -1990. -Т. 312, № 2. -С. 493-494.

87. Хавинсон В.Х., Кузнецов C.B. Теоретические аспекты применения цитаминов // Междунар. симпозиум "Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма", Санкт-Петербург, 25-27 ноября, 1996: Тез. докл. -СПб.: Наука. -1996. -С. 87-88.

88. Tinoco I.Hypochromism in polynucleotides // J. Amer. Chem. Soc. -1960. -V. 82, № 18.-P. 4785-4790.

89. Мосолов B.B. Протеолитические ферменты. -M.: Наука, 1971. -414 с.

90. Fruton J.S. Pepsin. In The enzymes. Ed. Boyer P.D., 3-d ed. -N-Y, London: Academic Press. -1970. V. 3, -P. 120-165.

91. Фердман Д.Л. Биохимия. M.: Высшая школа, 1966. -644 с.

92. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. -М.: Медицина, 1983. -750 с.

93. Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology. -Oxford Univ. Press, 1997. p. 447.

94. Кортексин. ВФС 42-3311-99.

95. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25 летний опыт экспериментальных и клинических исследований. -СПб.: Наука, 1998. -310 с.

96. Биохимический справочник. -Киев.: Издательство Киевского университета "Вища школа", 1997. -С. 25.

97. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М.: Наука, 1985.-536 с.

98. Lowry О.Н., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. -1951. -V. 193, № 1. -P. 265-275.

99. Шатаева JI.K., Ряднова И.Ю., Потехина T.C., Синицкая Н.С., Зеликсон Б.И. Фракционирование макромолекул при микрофильтрации вязких растворов // Журн. приклад, химии. 1999. -Т. 72, вып. 1. -С. 152-156.

100. Мчедлишвили Б.В., Флеров Г.Н. Ядерные фильтры: новый класс микрофильтрационных мембран в прецизионном разделении коллоидных растворов // Рос. Хим. Журн. -1987. -Т. 32, № 6. -С. 641-647.

101. Особенности смачивания и адсорбционных свойств трековых мембран на основе полиэтилентерефталата / Шатаева JI.K., Ряднова И.Ю., Нечаев А.Н., Сергеев A.B., Чихачева И.П., Мчедлишвили Б.В. // Журн. коллоидн. химии. 2000. - № 1.-С. 126-132.

102. Радченко И.Г., Пономаренко М.Н., Глазова Н.В., Иозеп И.И. Исследование полимерных комплексов, включающих ферменты и растворимые полимеры // Журн. приклад, химии. -1997. -Т. 70, № 6. -С. 1040-1043.

103. Рожанская Т.И., Дмитренко Л.В., Самсонов Г.В. Исследование межмолекулярных взаимодействий по кинетике диализа // Высокомолек. Соед. Б. -1972. -Т. 14, № 5. -С. 370-373.

104. Диффузионная проницаемость трековых мембран / Тищенко Г.А., Мчедлишвили Б.В., Грушка Э., Тырачкова В., Попович A.M., Шашков Б.В., Шатаева Л.К. // Докл. АН. СССР. -1989. -Т. 308, № 3. -С. 655-658.

105. Crank J. The mathematics of diffusion. -Oxford.: Claredon Press. -1975. P. 51.

106. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе гликопротеинов клеточного микроокружения // Рос. Хим. Журн. -1998. -Т. 62, № 3. -С. 85-90.

107. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Способ получения белковой пищевой добавки. Пат. 2075944 РФ от 27.03.1997. БИ. 1997, № 9.

108. Препаративная биохимия липидов. -М.: Наука, 1981. -256 с.

109. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Писарев O.A. Выделение из тимуса и изучение природы фактора, стимулирующего иммуногенез // Докл. АН СССР. -1977. -Т. 233, №3. -С. 491-494.

110. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. -1970. -V. 227, № 5259. -P. 680-685.

111. Аффинная хроматография. Методы. Под ред. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф. -М.: Мир, 1988.-278 с.

112. Власов В.В., Грачев М.А., Лаврик О.А. Аффинная модификация полимеров. -Новосибирск.: Наука, 1983. 241 с.

113. Грушка 3., Тырачкова В., Тищенко Г.А., Шатаева Л.К. Структура и проницаемость композиционных карбоксильных мембран на основе полиакрилонитрила // Collection Czechoslovak Chem. Commun. -1988. -V. 53.-P. 3089-3095.

114. Chernova I.A., Gurevich K.Ya. Structure and sorption characteristics of bioaffinity membranes // J. Membr. Sci. -1996. -V. 113, № 1. -P. 161-167.

115. Бараш A.H., Зверев М.П., Литовченко Г.Д., Костина Т.Ф. Влияние природы второго компонента на процесс гидразидирования сополимеров акрилонитрила // Высокомолек. Соед. Б. 1984. -Т. 26, № 9. -С. 687-691.

116. Dunn В.М., Chaiken I.M. Quantitative affinity chromatography. Determination of binding constants by elution with competitive inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1974. -V. 71, № 6. -P. 2382-2385.

117. Магонов C.H. Сканирующая силовая микроскопия полимеров и родственных материалов // Высокомолек. Соед. Б. 1996. -Т. 38, № 1. -С. 143-182.

118. Киселев Н.А. Электронная микроскопия биологических макромолекул. -М.: Наука, 1965.-147 с.

119. Levi-Montalchini R. Developmental neurobiology and the natural history of NGF // Ann. Rev. Neurosci. -1982. -V. 5, -P. 341-356.

120. Хавинсон B.X., Морозов В.Г., Чалисова Н.И., Окулов В.Б. Влияние пептидов головного мозга на клетки нервной ткани in vitro // Цитология. -1997. -Т. 39, № 7. -С. 571-576.

121. Мартынкина Jl.П., Семенов Т.Е., Венгеров Ю.Ю. Электронно-микроскопическое изучение компактизации индивидуальных молекул ДНК в пленках при взаимодействии с гистоном HI // Молек. биол. -1991. -Т. 25, №5.-С. 1338-1343.

122. Процессы ассоциации-диссоциации в растворах нестехиометричных полиэлектролитных комплексов / Харенко О.В., Изумрудов В.А., Харенко A.B., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Высокомолек. Соед. -1980, № 1.-С. 218-223.

123. Радзявичюс К.И. Взаимодействие пористых карбоксильных сетчатых полиэлектролитов с макромолекулами белков. -Дис. канд. хим. наук. -Л., 1982.-153 с.

124. Шатаева Л.К., Радзявичюс К.И., Самсонов Г.В. Влияние кислотности ионогенных групп сетчатого полиэлектролита на прочность белково-полимерного комплекса // Высокомолек.Соед. А. 1985. -Т. 27, № 4. -С. 702-706.

125. Степченко А.Г., Поляновский О.Л. Взаимодействие Oct-белков с ДНК // Молек. биол. -1996. -Т. 30, № 3. -С. 503-513.

126. П. де Жен. Идеи скейлинга в физике полимеров. -М.: Мир, 1982. -368 с.

127. Desoye G. Error analysis in equilibrium dialysis: evaluation of adsorption phenomena // J. Biochem. Biophys. Meth. -1988. -V. 17, № 1. -P. 3-16.

128. Складчикова Г.Ю. Выделение, физико-химическая характеристика и идентификация новой группы кислоторастворимых белков головного мозга млекопитающих. -Дис. канд. биол. наук. -Санкт-Петербург, 1994. -134 с.

129. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины и их роль в регуляции физиологических функций // Успехи совр. биол. -1995. -Т. 115, № 3. -С. 353-367.

130. Климов П.К., Барашкова Г.М. Эндогенные пептиды как единая система регуляторных веществ // Физиол. Журн. -1993. -Т. 79, № 3. -С. 80-87.

131. Dodson M., Echols H. Electron microscopy of protein-DNA complexes. -In Methods of enzymology. -1991. -V. 208, -P. 168-196.

132. Кульберг А.Я. Рецепторы клеточных мембран. -M.: Высшая школа, 1987. -104 с.

133. Kabanov A.V., Kabanov V.A. DNA complexes with polycations for the delivery of genetic material into cells // Bioconjugate Chem. -1995. -V. 6, № 1. -P. 7-20.

134. Teng C.S., Teng C.T., Allfrey V.G. Studies of nuclear acidic proteins // J. Biol. Chem. -1971. -V. 246, № 11. -P. 3597-3609.

135. Власов Г.П., Изварина Н.Я., Илларионова Н.Г., Денисов И.Г., Малышев Д.А. Влияние полимерной модификации инсулина на его ферментативный гидролиз и конформационные свойства // Прикл. биохим. и микробиол. -1988. -Т. 24, № 1.-С. 56-61.122

136. Валуев И.Л, Валуев Л.И., Платэ Н.А. О механизме действия препаратов иммобилизованного инсулина для перорального применения // Докл. АН России. -1998. -Т. 360, № 1. -С. 57-60.

137. Глебов Р.Н. Эндоцитоз и экзоцитоз, сер. Биохимия мембран. -М: Высшая школа, 1987. -96 с.

138. Willeman T.m Harding С., Ftahl Rh. Receptor-mediated endocytosis // Biochem. J. -1985. -V. 232, № 1. -P. 1-14.

139. Protein targeting. A practical approach, ed. A.I. Magee and T. Willeman, IRL. -Oxford: Oxford Univ. Press, 1993.-315 p.и1. Утверждаюм1. Чайка О.В.медицинскихн1999 г.1. АКТ

140. Полученные характеристики использованы для стандартизации технологии получения препаратов НПК, выделенных из различных тканей.

141. Масштабирование лабораторных методов выделения НПК из тканей мозга продемонстрировало хорошую воспроизводимость метода при переходе к обработке 50 и 100 кг исходного сырья.1. Начальник цеха1. Старший мастер1. Аспирант

142. САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИСТИТУТ БИОРЕГУЛЯЦИИ И ГЕРОНТОЛОГИИ СЗО РАМН МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д.З, тел. [phone]

143. Заключение о полезности проведенных исследований

144. Заместитель директора по научной работе 71. V Л 1

145. Заместитель директора главный технолог (О?доктор мед. наук Морозов В.Г.кандидат мед. наук Рыжак Г.А.