Структура и свойства комплексов порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами и магнитными частицами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Кульвелис, Юрий Викторович

• Кульвелис, Юрий Викторович
• кандидат физико-математических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Кульвелис, Юрий Викторович

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Строение порфина и его производных.

1.2. Природные металлопорфирины и их свойства.

1.3. Металлопроизводные фталоцианина.

1.4. Водорастворимые порфирины.

1.5. Электронные спектры поглощения порфиринов.

1.6. Порфирины как сенсибилизаторы в фотодинамической терапии.

1.7. Взаимодействие порфиринов с ДНК.

1.8. Поли-М-виниламиды и их свойства в водных растворах.

1.9. Магнитные жидкости — синтез, свойства и области применения.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Спектры поглощения и спектрофотометрическое титрование.

2.2.2. Капиллярная и низкоградиентная вискозиметрия.

2.2.3. Малоугловое рассеяние нейтронов.

2.2.3.1. Метод малоуглового рассеяния нейтронов и его применение к исследованию крупномасштабных неоднородностей

2.2.3.2. Когерентное и некогерентное рассеяние нейтронов на ядрах.

2.2.3.3. Метод дейтериевого контрастирования и исследование строения макромолекул.

2.2.3.4. Методы структурной интерпретации данных малоуглового рассеяния.

2.2.3.5. Анализ с помощью корреляционных функций в прямом пространстве.

2.2.3.6. Использованные приборы.

2.2.4. Динамическое рассеяние света.

Глава 3. Исследование взаимодействия сульфированных порфиринов и дифталоцианинов металлов с поли-Ы-винипирролидоном и ДНК.

3.1. Комплексы сульфированного тетрафенилпорфина с поли-Nвинилпирролидоном.

3.1.1. Определение связывания TPPS с ПВП методом спектрофотометрического титрования.

3.1.2. Капиллярная вискозиметрия растворов комплексов TPPS с ПВП

3.1.3. Исследование строения комплексов TPPS с ПВП методом малоуглового рассеяния нейтронов.

3.1.4. Динамическое рассеяние света на растворах комплексов TPPS с ПВП.

3.1.5. Анализ результатов.

3.2. Исследование взаимодействия сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с ДНК.

3.2.1. Спектрофотометрическое титрование L11PC2S4 и SCPC2S4 растворами ДНК.

3.2.2. Исследование комплексов l11pc2s4 и SCPC2S4 с ДНК методом низкоградиентной вискозиметрии.

3.2.3. Малоугловое рассеяние нейтронов на растворах комплексов ДНК с ScPc2S4.

3.2.4. Динамическое рассеяние света на растворах комплексов ДНК с ScPc2S4.

3.2.5. Анализ результатов, выводы.

Глава 4. Синтез, структура и свойства магнитных наноразмерных комплексов фотодитазина.

4.1. Синтез и стабилизация магнитных жидкостей.

4.2. Нейтронные исследования образцов.

4.3. Доклинические испытания препаратов на культурах опухолевых клеток и на мышах.

4.4. Обобщение результатов, выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и свойства комплексов порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами и магнитными частицами»

Порфирины и их аналоги — макрогетероциклические соединения, содержащие в своей основе цикл порфина, состоящий из четырех колец пиррола. Природные порфирины являются широко распространенными веществами и выполняют важнейшие биологические функции. Они входят в состав гемоглобина, миоглобина, ферментов каталазы, пероксидазы и многочисленной группы цитохромов. В форме железосодержащих комплексов гемопротеиды участвуют в транспорте кислорода, обеспечивая процесс дыхания. Фотосинтез и родственные ему процессы выполняются хлорофиллами и бактериохлорофиллами, содержащими магний.

Большое разнообразие свойств порфиринов и их распространенность обуславливают их применение в промышленности красящих пигментов, полупроводников и катализаторов, а также широкое использование в научных исследованиях физико-химического и биологического характера.

Фундаментальный и прикладной интерес к природным порфиринам и их синтетическим аналогам связан с широкими возможностями синтеза молекулярных структур, обладающих выраженными фотолюминесцентными свойствами, а также высокой устойчивостью к температурным и химическим воздействиям. Благодаря наличию 7Г-электронного сопряжения по макрокольцу и особенностям электронных спектров поглощения (ЭСП) порфирины служат основой для получения множества перспективных материалов (пигменты, полупроводники, сенсоры, катализаторы), функциональные свойства которых базируются на чрезвычайно высокой чувствительности ЭСП порфиринов к молекулярному окружению вблизи центра и периферии молекулы. Наблюдаемые изменения ЭСП порфиринов позволяют детектировать процессы кислотной ионизации, протонирования, комплексообразования и молекулярной агрегации с участием молекул порфиринов.

Важной областью применения порфиринов и их аналогов является медицина. Интенсивно развиваются исследования порфиринов в качестве сенсибилизаторов для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний, основанной на способности порфиринов к накоплению преимущественно в опухолевых клетках и к фотолюминесценции с генерацией цитотоксичного синглетного кислорода. Поглощая свет, сенсибилизатор переходит из основного в возбужденное состояние. Возбуждение передается на содержащийся в тканях организма кислород, который переходит в синглетную форму и разрушает главным образом опухолевые клетки, поскольку сенсибилизаторы обладают сродством и накапливаются преимущественно в опухолевых клетках.

Наиболее эффективным сенсибилизатором, разработанным и применяющимся в России, является фотодитазин (производное хлорина), однако, он не всегда накапливается в опухолевых клетках с достаточным контрастом по отношению к нормальным. Важной и актуальной задачей является повышение контраста накопления сенсибилизатора, например, в комплексе с внешне управляемым магнитным носителем. Известны антивирусные свойства некоторых порфиринов. Так, сульфированные тетрафенилпорфины, помимо фотодинамической активности, проявляют активность против вируса иммунодефицита. Сульфированные дифталоцианины редкоземельных элементов (впервые синтезированные П.Н. Москалевым и сотр. в ЛИЯФ АН СССР в 1960-х годах [1, 2]) и некоторых других металлов обладают антивирусной активностью против вируса гриппа, саркомы Рауса [3]. Наибольшим индексом антивирусной защиты в ряду сульфированных дифталоцианинов металлов обладают соединения лютеция и скандия.

Терапевтический эффект порфиринов напрямую связан со структурной организацией и взаимодействием порфиринов с молекулами и органеллами в живых клетках и организмах. Актуальной задачей является изучение механизмов взаимодействия порфиринов и их аналогов с различными биомолекулами (ДНК, белки, ферменты) и другими биосовместимыми полимерами в связи с необходимостью разработки новых эффективных антивирусных и терапевтических препаратов.

Цель работы заключалась в изучении механизмов взаимодействия порфиринов и их аналогов с биосовместимыми полимерами (поли-]М-винилпирролидон и ДНК) и магнитными частицами для создания перспективных антивирусных и противоопухолевых препаратов, исследовании структуры комплексов порфирин-полимер и магнитных носителей с фотодитазином для магнитоуправляемого транспорта препарата к опухолевым клеткам, а также оценке эффективности магнитоуправляемого противоопухолевого препарата в доклинических испытаниях на животных.

Задачи исследования:

1. Исследование межмолекулярных взаимодействий и образования комплексов в водных растворах при взаимодействии сульфированного тетрафенилпорфина и 5 поли-Ы-винилпирролидона, определение характера конформационных изменений полимера при комплексообразовании, анализ молекулярной структуры комплексов и количественных характеристик связывания в зависимости от температуры и соотношения концентраций компонентов.

2. Изучение механизмов образования комплексов сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с макромолекулами ДНК, исследование структуры комплексов и их гидродинамических свойств в водно-солевых растворах.

3. Разработка стабильного наноразмерного магнитоуправляемого носителя для фотодитазина на основе частиц магнитной жидкости для повышения эффективности препарата для фотодинамической терапии. Определение и сравнительный анализ структуры магнитных наносистем с фотодитазином и тройных комплексов с биосовместимым полимером (плюроником), стимулирующим активность фотодитазина в модельных системах.

4. Проверка эффективности разработанных магнитных комплексов с фотодитазином и плюроником в ходе биомедицинских тестов на животных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сульфированный тетрафенилпорфин образует комплексы с макромолекулами поли-N-винилпирролидона по данным спектрофотометрического титрования, рассеяния нейтронов, вискозиметрии и динамического рассеяния света. Связывание носит кооперативный характер и приводит к нарушению электронейтральности цепей полимера при низких ионных силах внешнего электролита.

2. Отрицательно заряженные сульфированные дифталоцианины лютеция и скандия образуют комплексы с ДНК в водно-солевых растворах, приводя к компактизации молекулы ДНК, что подтверждено данными рассеяния нейтронов, вискозиметрии, спектрофотометрического титрования.

3. Установленные по данным рассеяния нейтронов структура и характер корреляций между частицами в магнитных жидкостях регулируются способами стабилизации феррочастиц. В феррожидкостях, стабилизированных лимонной кислотой, частицы ассоциируют в цепные структуры по мере повышения концентрации синтезированной магнитной жидкости.

4. Введение макромолекул плюроника, играющего роль полимерного поверхностно-активного вещества, в феррожидкость блокирует образование цепных структур, вызывая формирование глобулярных кластеров из феррочастиц в оболочках плюроника.

5. Фотодитазин в составе синтезированных магнитных комплексов с плюроником не только сохраняет свои функциональные свойства, но и приобретает повышенную эффективность как магнитоуправляемый сенсибилизатор для фотодинамической терапии.

Научная новизна работы:

1. Установлено образование комплексов сульфированного тетрафенилпорфина с поли-N-винилпирролидоном в водных растворах, определена молекулярная структура, гидродинамические и спектральные характеристики комплексов.

2. Установлено образование комплексов отрицательно заряженных сульфированных дифталоцианинов с ДНК в водно-солевых растворах, определены структурные и гидродинамические свойства комплексов.

3. Разработаны стабильные магнитоуправляемые комплексы на основе наночастиц магнетита, связанных с молекулами сенсибилизатора фотодитазина. Достигнута биосовместимость комплексов при сохранении функциональных свойств сенсибилизатора, в том числе, с использованием плюроников, связывающих фотодитазин и повышающих его эффективность.

4. Показано торможение роста опухоли в ходе доклинических испытаний на мышах при применении магнитоуправляемого комплекса с фотодитазином и направленной доставке препарата с помощью внешнего магнитного поля. Использование плюроника в составе комплексов увеличивает терапевтическое воздействие на опухоль.

Практическая значимость работы. Синтезированные и исследованные в работе комплексы порфиринов и их аналогов с поли-Ы-винилпирролидоном и ДНК перспективны для создания новых эффективных антивирусных препаратов. Полученные магнитоуправляемые комплексы с фотодитазином представляют практический интерес в качестве эффективных сенсибилизаторов для фото динамической терапии.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Кульвелис, Юрий Викторович

Выводы о компактизации ДНК в составе комплексов в тяжеловодных растворах, сделанные на основе экспериментов по рассеянию нейтронов и света, подтвердили результаты, полученные для аналогичных растворов в легкой воде методами вискозиметрии и спектрофотометрии в видимой области при 20°С.

3.2.5. Анализ результатов, выводы

Результаты, полученные методами вискозиметрии, рассеяния нейтронов и света свидетельствуют о формировании комплексов сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с молекулой ДНК, стабильных в области температур 20—40°С в водно-солевых растворах, и компактизации ДНК под действием дифталоцианинов.

Анализ причин образования комплексов приводит к выводу, что наиболее вероятным является внешнее связывание молекул дифталоцианинов с поверхностью ДНК посредством водородных связей с участием молекул растворителя и гидрофобных взаимодействий между компонентами. Важную роль должны играть электростатические взаимодействия, что подтверждено ослаблением эффекта компактизации ДНК с увеличением внешней ионной силы (экранировка фосфатных групп ДНК противоионами). Интеркаляция молекул дифталоцианинов между парами оснований ДНК маловероятна в виду достаточно крупных размеров молекул дифталоцианинов.

Заряженная нить ДНК окружена электростатическим потенциалом, медленно спадающим по логарифмическому закону. Дополнительная посадка зарядов того же знака на цепь ДНК в некоторых точках создает точечные центры поля с потенциалом ~ Mr, имеющим высокий градиент на малых расстояниях от нити. Это может вызвать усиление тока противоионов внутрь клубка и частичную нейтрализацию зарядов, приводящую к сжатию клубка.

При анализе явлений ассоциации ДНК с дифталоцианинами следует учитывать особенности строения молекул дифталоцианинов. Структура дифталоцианина лютеция (LuPc2) приведена в работе [178] (рис. 51а). Атом Lu находится между двумя лигандами фталоцианина. Лиганды не плоские, а блюдцеобразные. Основание каждого блюдца направлено к атому металла, что показано для UPc2 [17] и справедливо для LuPc2 и дифталоцианинов других металлов. Отклонение от плоскости одного лиганда больше, чем другого. Лиганды повернуты друг относительно друга на 45° (рис. 516). Изоиндоловые атомы азота каждого из лигандов лежат в параллельных плоскостях, расстояние между которыми - 2.69 А. Расстояние между усредненными плоскостями двух лигандов (phthalocyanine ring mean planes) - 3.1-3.2 А, что примерно совпадает с известным расстоянием 3.208 А для YPc2, изоморфного LuPc2 [179]. пространственное строение, б - поворот лигандов друг относительно друга на 45° [ 178]

Что касается структуры сульфированных дифталоцианинов, то работ, посвященных их определению, не известно. Следует отметить, что сульфирование может изменять общее строение дифталоцианинов. Взаимодействие отрицательно заряженных сульфогрупп способно возмущать угол поворота лигандов относительно друг друга, усиливать степень отклонения их от плоскости, увеличивать расстояние между лигандами, что может влиять на взаимодействие дифталоцианинов с ДНК.

При синтезе П.Н. Москалевым сульфированных дифталоцианинов металлов [1, 2] состав продуктов синтеза был охарактеризован только по элементному анализу (спектры поглощения в растворах), что позволило предположить анион с зарядом 4— и сэндвичевую структуру, а распределение зарядов на периферии сэндвича не определялось. По-видимому, синтез не был специфичен по положению сульфогрупп на периферии. Четыре сульфогруппы (в среднем на молекулу) могли располагаться на бензольных кольцах периферии несколькими способами, и продукт мог представлять собой смесь изомеров. Таким образом, считая, что каждое бензольное кольцо может связывать не больше одной сульфогруппы, без учета положения атома С, к которому присоединяется сульфогруппа, возможны несколько структурных изомеров по положению сульфогрупп в молекуле дифталоцианина. При возможном анализе вероятности появления каждого изомера при синтезе следует учитывать расстояние между двумя лигандами. Если учитывать также и разное отклонение формы лигандов от плоскости (один искривлен больше другого), то количество изомеров увеличится еще в несколько раз. Кроме того, конформация сэндвичей может изменяться при растворении твердой фазы из-за влияния растворителя. Определение положения сульфогрупп в сэндвичах возможно с помощью ЯМР высокого разрешения в твердой фазе и растворах, но подобные исследования не известны. Каждый из изомеров за счет особенностей структуры (угол поворота между фталоцианинами, расстояние между периферией лигандов, отличающихся от параметров несульфированной формы из-за наличия зарядов) способен по-разному взаимодействовать с ДНК. Описание такого взаимодействия является весьма непростой задачей, даже если знать состав изомеров в продукте и структуру каждого изомера.

Полученные результаты в определенной степени можно сравнивать с данными для комплексов поли-М-виниламидов (ПВКЛ и ПВП) с отрицательно заряженными порфиринами. Не являясь полиэлектролитами, поли-М-виниламиды имеют сходство с ДНК. Цепи поли-Ы-виниламидов содержат карбонильные группы - диполи С=0", в которых кислород несет отрицательный заряд, образуя водородные связи с молекулами

102 воды и формируя гидратиый слой из поляризованных молекул воды [103]. Несмотря на отрицательные заряды боковых групп цепи, поли-Ы-виниламиды ассоциируют преимущественно с анионами, а не с катионами. Образование комплекса ПВП + анионный краситель обеспечивают водородные связи между поляризованными молекулами воды в гидратном слое вокруг полимерной цепи и сульфоанионами красителя и в некоторой степени электростатические взаимодействия. Установлено, что молекулы ПВП, связывая красители, превращаются в отрицательно заряженный полиэлектролит, при введении красителя возрастает относительная вязкость раствора полимера, а добавление соли уменьшает вязкость, нейтрализуя отрицательные заряды на цепи и снимая электростатические эффекты отталкивания [103, с. 162-164]. Аналогичные эффекты наблюдались в системах ПВКЛ с сульфированными дифталоцианинами [106] и ПВП с TPPS, что позволяют считать механизм образования комплексов с участием водородных связей и гидрофобных взаимодействий общим для исследованных систем. ДНК, как более сложная молекула, допускает несколько способов связывания дифталоцианинов.

Размер молекулы дифталоцианина ~ 10-12 А, толщина «сэндвича» не более 3.5 А, т.е. он может легко поместиться и в малую (12 А), и в большую (22 А) бороздку ДНК. Локализация в бороздках может быть стабилизирована за счет водородных связей между основаниями ДНК (донорами могут быть группы NH, акцепторами - атомы N и О) и молекулами дифталоцианинов (напрямую, через молекулы воды) и гидрофобных взаимодействий. У дифталоцианинов акцепторами водородных связей могут быть атомы О сульфогрупп и атомы N в макрокольце). Дифталоцианины могут также конкурировать с основаниями ДНК за их собственные водородные связи (А=Т и Г=Ц), которые могут разрываться с «раскрытием» пары оснований и образовываться вновь за счет конформационной подвижности ДНК по данным тритиевого обмена [123, с. 293— 305]. В момент раскрытия пар освобождаются дополнительные доноры и акцепторы, способные участвовать в образовании водородных связей с дифталоцианинами. При локальном разъединении нитей цепь ДНК может стать менее жесткой, что ведет к уменьшению размера клубка ДНК. Именно это и наблюдалось при измерениях вязкости и подтверждено методом рассеяния нейтронов.

Возможно внешнее связывание (как с поли-Ы-виниламидами) через гидратный слой ДНК посредством водородных связей. При этом молекула дифталоцианина должна стремиться расположиться так, чтобы ее сульфогруппы на периферии были разнесены в разные стороны от поверхности двойной спирали (чтобы свести к

103 минимуму электростатическое отталкивание). Такие комплексы могут быть стабилизированы и гидрофобными взаимодействиями.

Увеличение наблюдаемого диаметра ДНК в ~ 2 раза при посадке на нее дифталоцианина (нейтронные данные для SCPC2S4) можно объяснить способностью фталоцианинов ассоциировать между собой (димеры, агрегаты), когда они присоединяются не непосредственно к ДНК, а к молекулам дифталоцианина, уже связанным с ДНК. Однако это требует дополнительного обоснования, так как существуют данные, что в водных растворах сульфированные дифталоцианины, в отличие от сульфированных фталоцианинов, не димеризуются, а находятся в форме мономеров [176].

Экспериментальный факт уменьшения эффекта (по вязкости) при увеличении внешней ионной силы (растворителя) легко объясняется при внешнем связывании -отрицательные заряды фосфатных групп в большей степени нейтрализуются противоионами и становятся менее доступными для связывания.

Также возможно «связывание» далеких по цепи и случайно сблизившихся в пространстве фосфатных групп ДНК в местах нахождения молекул дифталоцианинов через сетку водородных связей. Предположение о возможности подобного связывания было высказано для систем ДНК с гистонами HI и НЗ и синтетическими пептидными фрагментами гистона Н2В в которых также наблюдается двукратное уменьшение удельного объема ([7]) [180, 181].

Для понимания специфики связывания сульфированных дифталоцианинов лютеция и скандия с ДНК (SCPC2S4 связывается сильнее) необходимо знать различия в их структуре, однако структурные данные по дифталоцианину скандия неизвестны. В нем расстояние между лигандами может быть меньше, чем в LuPc2 (атом скандия меньше атома лютеция), а угол поворота между лигандами может отличаться. Для сравнения, у SnPc2 угол поворота составляет 42°, у UPC2 — 37° [16]. Поэтому необходимо знать структуру именно сульфированных соединений.

Сульфированные дифталоцианины могут рассматриваться как составляющая внешнего электролита по отношению к ДНК. Известно, что на конформацию ДНК более сильное влияние оказывает анионный, а не катионный состав внешнего электролита [182]. Анионный эффект для однозарядных анионов из одного или нескольких атомов проявляется во влиянии анионов на размеры молекулы ДНК, определяемые по характеристической вязкости, что объясняется авторами [182] воздействием анионов и их гидратации только на дальние взаимодействия в цепи ДНК.

104

Обнаружено, что размеры молекул ДНК экстремальны (максимальны, минимальны) в водно-солевых растворах ряда солей, когда анионы мало влияют на структуру воды (анионы слабо гидратируются, подвижность молекул воды вблизи аниона близка к подвижности в чистой воде). Анионный эффект может иметь место и в системе ДНК + сульфированные дифталоцианины. Разница в действии дифталоцианинов лютеция и скандия может быть вызвана центральным атомом металла, который может опосредованно воздействовать на способность анионов MPC2S44" к гидратации, что проявляется во влиянии их на размеры ДНК.

Таким образом, комплекс может представлять ДНК, окруженную молекулами дифталоцианина, связанными с ней в основном внешне - через гидратную оболочку на поверхности спирали. Уменьшение жесткости ДНК может быть вызвано тем, что часть молекул дифталоцианина может связываться в бороздках, а также влиянием анионов на дальние взаимодействия в цепи ДНК (анионным эффектом).

Глава 4. Синтез, структура и свойства магнитных наноразмерных комплексов фотодитазина

В работе впервые синтезированы и исследованы методами малоуглового рассеяния нейтронов и спектрофотометрии комплексы наночастиц магнетита в водной среде с порфиринами - сульфированным тетрафенилпорфином дигидрохлоридом (H2TPPS4(HC1)2 или TPPS) и препаратом «фотодитазин», использующимся в фотодинамической терапии (ФДТ) при лечении онкологических заболеваний. Также исследовано влияние плюроников на функциональные свойства синтезированных комплексов. Полученные комплексы феррожидкости с фотодитазином и плюроником показали высокую эффективность при воздействии на культуры опухолевых клеток. Результаты могут быть использованы при создании магнитоуправляемого препарата для ФДТ.

Одним из наиболее эффективных отечественных препаратов в ФДТ является фотодитазин (рис. 8), разработанный в 1998 году на основе глюкаминовой соли хлорина еб в качестве фотосенсибилизатора для лечения целого ряда опухолей (рак кожи, рак щитовидной железы, злокачественные опухоли головного мозга и др.) [77]. Терапия основана на селективной способности фотодитазина накапливаться в онкологическом образовании с существенно более высокой концентрацией по сравнению со здоровой тканью и кровью, а также способностью фотодитазина под действием оптического облучения генерировать биологически активный синглетный кислород, вызывающий гибель клеток. Поскольку концентрация фотодитазина существенно выше в злокачественных клетках, то преимущественно погибают злокачественные клетки. Однако на практике остаются нерешенные проблемы, в основном связанные с недостаточным контрастом накопления рабочего препарата в клетках злокачественного онкологического новообразования. Актуальным является вопрос повышения контраста «злокачественное образование / здоровая ткань» для лечебного препарата.

Для этих целей в данной работе впервые исследовалась возможность управляемой (внешним магнитным полем) транспортировки и локализации фотодитазина, связанного с частичками ферромагнитной жидкости (ФМЖ), в злокачественном образовании. В связи с этим разработаны магнитные жидкости на водной основе с использованием фотодитазина.

До последнего времени разрабатывались в основном феррожидкости на основе наночастиц ферритов, концентрирование которых в опухолях при внешнем воздействии (инфракрасным облучением или магнитным полем) создавало эффект гипертермии [183, 184] — локального нагревания до 42—44°С, которое приводит к гибели только опухолевых клеток, поскольку они более восприимчивы к нагреванию, чем здоровые. Однако во многих случаях после гипертермии опухоль восстанавливается [84], а сам сеанс гипертермии является длительным процессом (до 60-120 минут) и часто болезненным для пациента. С точки зрения избирательного действия наиболее эффективными представляются феррожидкости — носители лекарственных препаратов за счет наличия комплекса препарата с магнитной частицей и последующей управляемой полем локализации препарата в нужном месте организма. Указанная область исследований еще только формируется [83, 84].

Использован препарат «фотодитазин» производства ООО «Вета-Гранд» в виде раствора в водно-солевой среде с физиологической ионной силой с исходной концентрацией препарата 0.5 г/дл ~ 0.0507 М. Рис. 52 демонстрирует спектры поглощения препарата, разбавленного в 0.15 М NaCl.

Рис. 52. Электронные спектры поглощения: 1 — раствора фотодитазина С = 0.0013 г/дл в 0.15 М NaCl; 2 - раствора фотодитазина С = 0.0050 г/дл в 0.15 М NaCl. Т = 20°С

Сульфированный тетрафенилпорфин дигидрохлорид H2TPPS4(HC1)2 (рис. 7), использовавшийся в качестве модели фотодитазина на начальном этапе работы, получен от Porphyrin Products (Logan, USA).

Методом малоуглового рассеяния нейтронов исследовались различные способы локализации фотодитазина на частицах феррожидкости, его спектральные свойства и способы их модификации. Для повышения эффективности и биологической совместимости препарата (фотодитазина) в феррожидкости вводили третий компонент

- плюроник F-108 или F-127 (тройной блок-сополимер этиленоксида и пропиленоксида, фирма BASF, молекулярные массы F-108 - 14600, F-127 - 12300), широко используемый в фармацевтике и медицине и способный солюбилизировать фотодитазин [86]. Буква «F» в названии плюроника указывает на его исходное агрегатное состояние (твердое, firm); последующие две цифры в названии указывают длину гидрофобного блока пропиленоксидного полимера, деленную на 5; третья цифра

- процентное (по массе) содержание этиленоксида в молекуле, деленное на 10 [185]. Плюроники облегчают проникновение лекарств через биологические барьеры, увеличивают накопление лекарств в опухолевых клетках. Обнаружено, что в системах, моделирующих процесс ФДТ, фотокаталитическую активность можно модулировать при использовании ряда плюроников [86]. Также был предложен способ увеличения фотоиндуцируемой токсичности фотодитазина в сеансах фототерапии in vitro, который заключается в одновременном добавлении фотодитазина в заведомо нетоксичных концентрациях к опухолевым клеткам [86].

Эффективность приготовленных препаратов проверялась на онкологических клеточных культурах и на мышах.

4.1. Синтез и стабилизация магнитных жидкостей

Синтез магнетита производили стандартным методом — химической конденсацией солей Fe2+ и Fe3+ в концентрированном растворе аммиака, на основе модифицированной реакции Элмора [114].

Использовали два метода стабилизации синтезированных частиц магнетита (табл.

11).

ФМЖ-1. Активирование магнетита производили по Массару [84] добавлением 2 М соляной кислоты и нагреванием до 100°С. При 100°С в присутствии НС1 в поверхностные слои кристаллов магнетита внедряются ионы С1", что обуславливает образование дислокаций. В результате этого на поверхности и в глубине кристаллической решетки феррита происходит накопление различных дефектов, и образуется активированный феррит [109]. Для очистки и выделения полученного золя его центрифугировали и пептизировали в дистиллированной воде.

ФМЖ-2. Магнетит стабилизировали добавлением лимонной кислоты и фосфата натрия, в соответствии с методом, предложенным в работе [186]: 2 г магнетита заливали смесью 150 мл 0.1 М лимонной кислоты СзН4(0Н)(С02Н)зхН20 и 50 мл 0.2 М гидрофосфата натрия Na2HJJ04>< 12Н20. В результате адсорбции ионов лимонной кислоты на поверхности магнетита образовался устойчивый золь черного цвета, имеющий рН 5.3-5.7. Добавлением гидрофосфата натрия получали стабильные золи с рН 6.0-6.5, пригодные для биоприменения [186]. Полученные растворы имели слабые магнитные свойства и низкую интенсивность рассеяния нейтронов вследствие низкой концентрации магнетита (0.5-1.0 г/дл). Для повышения концентрации магнитной жидкости образец, доведенный до рН 6.5 добавлением 0.2 М Na2lIP04x 12Н20, был упарен досуха при нагревании до 70°С и растворен в воде объемом, в несколько раз меньше исходного образца. Полученная жидкость (ФМЖ-2.1) имела высокую концентрацию магнетита (4 г/дл) и сохраняла стабильность (отсутствие заметного осаждения магнитной фазы) в течение длительного времени наблюдения (более года).

Также провели синтез ФМЖ-2 с большей концентрацией, добавляя к магнетиту те же количества лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, растворенные в два раза меньшем объеме воды (75 мл 0.2 М лимонной кислоты СзН4(0Н)(С02Н)3хН20 и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20) и частично выпаривая воду из полученного образца при нагревании до 30-40°С. Полученная жидкость имела значение рН 5.7, которое доводили до 6.1 добавлением кристаллов соли Na2HP04x12H20. Концентрация магнетита в полученной жидкости (ФМЖ-2.2) составляла около 6 г/дл. Подобным же образом, но без нагревания, была приготовлена ФМЖ на тяжелой воде (D2O) для проведения нейтронных экспериментов с использованием водородно-дейтериевого контрастирования растворителя по отношению к полимерной оболочке частиц ФМЖ, поскольку оболочка состояла из протонированного плюроника, имеющего слабый контраст по отношению к легкой воде. Величину pD феррожидкости, приготовленной на тяжелой воде, определенную из измеренного значения рНизм по формуле pD = рНшм + 0.4 [187, с. 45] и имевшую значение 5.75, доводили до 6.1 добавлением кристаллов Na2HPC>4x 12Н20. Полученная жидкость имела концентрацию магнетита около 3 г/дл.

Образец Условия стабилизации магнетита Концентрация магнетита, г/дл рН

ФМЖ-1 в Н20 25 г магнетита + 37 мл 2 М НС1, 100°С. 25.5 1.7

ФМЖ-2.1 в Н20 2 г магнетита + 150 мл 0.1 М лимонной кислоты С3Н4(0Н)(С02Н)3хН20 и 50 мл 0.2 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20. 1.0 5.3-6.5

ФМЖ-2.2 в Н20 2 г магнетита + 75 мл 0.2 М лимонной кислоты С3Н4(0Н)(С02Н)3хН20 и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20, частичное выпаривание воды при 30-40°С для увеличения концентрации магнетита. 5.9 5.7-6.1

ФМЖ-2.2 в D20 2 г магнетита + 75 мл 0.2 М лимонной кислоты С3Н4(0Н)(С02Н)3хН20 и 25 мл 0.4 М гидрофосфата натрия Na2HP04><12H20. 3.1 pD 5.7-6.1

Концентрации магнетита в исходных образцах определяли по массе сухого остатка, получавшегося в результате прокаливания раствора известного объема.

Приготовление комплексов для исследований методом малоуглового рассеяния нейтронов производили смешиванием раствора TPPS или фотодитазина с ФМЖ. Для ФМЖ-1 проводили нагревание смеси до 50-70°С и обработку ее ультразвуком для растворения образовавшегося осадка. В случае ФМЖ-2 нагревания и ультразвуковой обработки не требовалось. Образцы, с содержанием плюроника, готовили добавлением к ФМЖ сначала плюроника, а затем, если требовалось, фотодитазина. Концентрация тяжелой воды в ФМЖ-2.2 при добавлении легководного раствора фотодитазина составляла 90%, поэтому и остальные образцы ФМЖ-2.2 на тяжелой воде для нейтронного рассеяния доводили до 90% D20 (и 10% Н20) добавлением легкой воды. Состав исследованных растворов приводится в табл. 12—16.

4.2. Нейтронные исследования образцов

Методом малоуглового рассеяния нейтронов на дифрактометре «Мембрана-2» (ПИЯФ PAII) исследованы растворы ФМЖ-1 и ФМЖ-1 + TPPS. Кривые рассеяния I(q) (зависимости интенсивности рассеяния I от переданного импульса q) показаны на рис. 53.

Рис. 53. SANS ФМЖ-1 + TPPS в воде, Т= 20°С: 1,3 - ФМЖ-1 без TPPS; 2, 4 ~ ФМЖ-1 + H2TPPS4(HC1)2. Концентрации см. в табл. 12

Наилучшим образом кривые рассеяния приближаются формулой

1(g) =-/(Q) ? (1 +--—тт)у (1)

1 + (ЯС1д)2)гК (1 +(RC2q)2)2 К * соответствующей модели плотных сферических частиц, образующих кластеры, где /(0) = Iq^ - интенсивность рассеяния в нулевой угол при отсутствии интерференции

1 , волн, рассеянных от разных частиц, —--=-у = F (q) - квадрат формфактора + (ЛС[?) ) рассеивающих частиц в виде квадрированного лоренциана, хорошо описывающий Л рассеяние нейтронов на феррожидкостях [188]. 1 +-----= ^W) структурный

RC2q) ) фактор, обусловленный взаимной пространственной корреляцией частиц, образующих кластеры, а А = а(п -1), где а ~ вероятность образования кластера, и п - число частиц в кластере. Rci и Rc2 — радиусы корреляции отдельных частиц магнетита и кластеров, соответственно. Состав и параметры исследованных образцов приведены в табл. 12.

Заключение

1. Установлено образование комплексов сульфированного тетрафенилпорфина с поли-N-винилпирролидоном с использованием методов рассеяния нейтронов, спектрофотометрии и молекулярной гидродинамики. Определен характер конформационных изменений полимера, установлен кооперативный характер и найдены количественные характеристики связывания. Показано, что в разбавленных водных растворах макромолекулы полимера являются полиэлектролитными вследствие присоединения к ним молекул тетрафенилпорфина посредством водородных связей сульфогрупп порфирина с поляризованными молекулами воды из гидратной оболочки полимера.

2. Впервые получены и исследованы комплексы анионных сульфированных дифталоцианинов металлов (mpc2s4) с ДНК. Методом малоуглового рассеяния нейтронов установлена ассоциация молекул LUPC2S4 и SCPC2S4 с ДНК, что ведет к увеличению наблюдаемого поперечного диаметра, к уменьшению жесткости и к компактизации цепи ДНК в водно-солевом растворе, подтвержденной данными вискозиметрии и динамического рассеяния света. Предложены гипотезы, которые объясняют наблюдаемые эффекты ассоциации.

3. Разработаны биосовместимые магнитные жидкости на основе магнетита, стабильные в диапазоне температур 20-70°С и сохраняющие функциональные свойства фотодитазина как фотосенсибилизатора.

4. Установлены структурные особенности магнитных коллоидов методом рассеяния нейтронов в зависимости от состава и условий синтеза. Определены размеры и строение кластерных структур магнетита. Из анализа данных рассеяния нейтронов в импульсном и реальном пространстве найдены корреляционные функции и построены структурные модели наноразмерных ассоциатов феррочастиц.

5. Впервые создан магнитоуправляемый сенсибилизатор, содержащий фотодитазин и плюроник, адаптированный для применения в фотодинамической терапии. Определено строение комплекса, размеры составляющих комплекс частиц и комплекса в целом.

6. В серии доклинических испытаний фотодитазина в комплексах с магнитным носителем и плюроником установлено его повышенное терапевтическое действие на опухолевые клеточные культуры, показано торможение роста размеров опухолей у мышей по сравнению с результатами традиционной терапии с использованием чистого фотодитазина, что свидетельствует об увеличении эффективности препарата в составе комплекса. Отмечено повышение эффективности комплекса фотодитазина с магнетитом с применением внешнего магнитного поля для доставки препарата к опухоли.

Благодарю в первую очередь моего научного руководителя Лебедева Василия Тимофеевича за постоянное внимание и поддержку в процессе работы, Д.Н. Орлову за помощь в синтезе магнитных жидкостей, JI. Рошту и Д. Торока за помощь в организации проведения нейтронных экспериментов в Будапеште, M.JI. Гельфонда и А.Н. Стукова за помощь в проведении испытаний на мышах и предоставленный образец фотодитазина, Н.С. Мелик-Нубарова и Т.М. Жиентаева за предоставленные образцы плюроника, М.В. Филатова за помощь в оценке токсичности магнитных жидкостей, В.В. Клюбина и А.Б. Мельникова за возможность исследований образцов методом динамического светорассеяния, А.И. Сибилева и П.Н. Москалева за предоставленные образцы дифталоцианинов и обсуждения, В.А. Трунова, В.М. Лебедева, И.Н. Иванову, И.В. Голосовского, В.В. Исаева-Иванова и Г.В. Пономарева за полезные обсуждения и ценные замечания, а также сотрудников кафедры молекулярной биофизики СПбГУ за подготовку и необходимые знания, полученные в процессе обучения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Кульвелис, Юрий Викторович, 2009 год

1. Кирин И. С., Москалев П. Н., Макашев Ю. А. Образование необычных фталоцианинов редкоземельных элементов // Журн. Неорг. Химии. — 1965. — Т. 10. № 8. — С. 1951—1953.

2. Москалев П. Н. Способ получения комплексов дифталоцианинов редкоземельных элементов с йодом и бромом. Авт. свид. № 196216, зарег. 15.03.1967 // Бюлл. Изобр. 1967. —Т. 11. —С. 10.

3. Москалев П. Н., Комаров Е. В., Шнейдер М. А., Рачковская JI. А., Штильбанс Е. Б. Сульфированный дифталоцианин скандия, обладающий противовирусной активностью // Авт. свид. 1153536, зарег. 03.01.1985 // Бюлл. Изобр. — 1985. Т. 37.1. С. 257.

4. Гуринович Г. П., Севченко А. Н., Соловьев К. Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск: Наука и техника, 1968. 520 с.

5. Березин Б. Д. Координационные соединения порфиринов и фталоцианина. М.: Наука, 1978. 280 с.

6. Linstead R. P. Phthalocyanines. Part I. A new type of synthetic colouring matters // J. Chem Soc. — 1934. — P. 1016—1017.

7. Barrett P. A., Dent С. E., Linstead R. P. Phthalocyanines. Part VII. Phthalocyanine as a co-ordinating group. A general investigation of the metallic derivatives // J. Chem. Soc.1936. —P. 1719—1736.

8. Robertson J. M. An X-ray study of the structure of the phthalocyanines. Part I. The metal-free, nickel, copper, and platinum compounds // J. Chem. Soc. — 1935. — P. 615—621.

9. Robertson J. M. An X-ray study of the phthalocyanines. Part II. Quantitative structure determination of the metal-free compound // J. Chem. Soc. — 1936. — P. 1195—1209.

10. Лебедева H. Ш. Термодинамика образования и физико-химические свойства молекулярных комплексов металлопорфиринов и металлофталоцианинов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук. Иваново: 2007. 39 с.

11. Ломова Т. Н., Соколова Т. Н. Строение и реакционная способность металлофталоцианинов в процессах диссоциации / Успехи химии порфиринов, т. 2; под. Ред. О. А. Голубчикова. СПб: НИИ Химии СПбГУ, 1999. Гл. 8. С. 167—189.

12. Кирин И. С., Москалев П. Н., Макашев Ю. А. О новых комплексных соединениях фталоцианина с редкоземельными элементами // Журн. Неорган. Химии. — 1967. — Т. 12. №3, —С. 707—712.

13. Москалев П. Н., Шапкин Г. Н., Даровских А. Н. Синтез и свойства электрохимически окисленных дифталоцианинов РЗЭ и америция // Журн. Неорган. Химии. — 1979. — Т. 24. № 2. — С. 340—346.

14. Москалев П. Н., Кирин И. С. Способ получения сульфированных дифталоцианинов металлов. Авт. свид. № 298579, зарег. 04.01.1971 // Бюлл. Изобр. — 1971. Т. 11. — С. 84.

15. Bennet W. Е., Broberg D. Е., Baenziger N. С. Crystal structure of stannic phthalocyanine, an eight-coordinated tin complex // Inorg. Chem. — 1973. — V.12. No. 4. — P. 930—936.

16. Москалев П. H. Сэндвичевые координационные соединения металлов с фталоцианином и порфиринами // Коорд. Химия. — 1990. — Т. 16. № 2. — С. 147—158.

17. Tomilova L. G., Dyumaev К. М. The First Synthesis of Sandwich-type Titanium Bisphthalocyanines // Mendeleev Commun. — 1995. — V. 5. No. 3. — P. 109—110.

18. Бреусова M. О. Синтез и исследование новых симметрично замещенных фталоцианинов различного строения и их аналогов. Поиск новых областей их применения. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. М.: 2007. 26 с.

19. Толбин А. Ю., Томилова Л. Г., Зефиров Н. С. Би- и полиядерные фталоцианины: синтез и исследование физико-химических свойств // Успехи химии. — 2008. — Т. 77. № 5. — С. 460—475.

20. Галанин Н. Е., Якубов JI. А., Шапошников Г. П. Синтез и спектральные свойства комплексов «сэндвичевого» типа мезотетраметилтетрабензопорфирин-фталоцианин с лютецием, эрбием, иттрием и лантаном. // Журн. Орг. Химии. — 2008. — Т. 44. № 6. — С. 928—933.

21. Andersson-Engels S., Klintenberg C., Svanberg K., Svanberg S. In vivo fluorescence imaging for tissue diagnostics // Phys. Med. Biol. 1997. — V. 42. No. 5. — p. 815—824.

22. Pandey R. K., Zheng G. Porphyrins as photosensitizers in photodynamic therapy / The porphyrin handbook. Ed. Kadish К. M., Smith К. M., Guilard R. 2000 V. 6. P. 157—230.

23. Augulis R., Snitka V., Rotomskis R. Self-assembled tpps4 nanostructures revealed by atomic force microscopy // Solid State Phenomena. — 2004. — V. 97—98. P. 191—194.

24. Valanciunaite J., Bagdonas S., Streckyte G. and Rotomskis R. Spectroscopic study of tpps4 nanostructures in the presence of bovine serum albumin // Photochem. Photobiol. Sci. — 2006. — V. 5. — P. 381—388.

25. Ohno O., Kaizu Y., Kobayashi H. ./-aggregate formation of a water-soluble porphyrin in acidic aqueous media // J. Chem. Phys. — 1993. — V. 99. — P. 4128—4139.

26. Chen I. Molecular orbitals of phthalocyanine // J. Mol. Spectrosc. — 1967. — V. 23. No. 2.—P. 131—143.

27. Красновский А. А., Быстрова M. И. Перестройка агрегированных форм хлорофилла и бактериохлорофилла // Докл. АН СССР. — 1967. — Т. 174. № 2. — С. 480—483.

28. Быстрова М. И., Красновский А. А. Сравнительное изучение агрегированных форм хлорофилла и его аналогов в связи со структурными особенностями молекул пигментов // Молек. биол. — 1967. — Т. 1. № 3. — С. 362—372.

29. Быстрова М. И., Красновский А. А. Сравнительное исследование люминесценции агрегированных форм хлорофилла и его аналогов в твердых пленках // Молек. биол. — 1968. — Т. 2. № 6. — С. 847—858.

30. Быстрова М. И., Красновский А. А. Фотохимические свойства разных типов агрегированных форм хлорофилла а и бактериовиридина // Молек. биол. — 1971. — Т. 5. № 2. — С. 291—301.

31. Теренин А. Н. Фотоника молекул красителей и родственных соединений. JL: Наука, 1967.616 с.

32. Степанов Б. И. Введение в химию и технологию органических красителей. М.: Химия, 1984. 592 с.

33. Henderson В. W., Dougherty Т. J. How does photodynamic therapy work? // Photochem. Photobiol. — 1992. — V. 55. No. 1. — P. 145—157.

34. Henderson B. W., Dougherty T. J. Photodynamic therapy: basic principles and clinical application. New York: Marcel Dekker, 1992.

35. Черноносов А. А., Кнорре Д. Г., Федорова О. С. Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами — реагенты для направленной окислительной модификации нуклеиновых кислот // Рос. Хим. Журн. — 2004. — Т. 48. № 4. — С. 83—99.

36. Pass Н. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use // J. Nat. Canser Inst. — 1993. — V. 85. No. 6. — P. 443—456. Перевод: Пасс X. И. Фотодинамическая терапия в онкологии // Физическая медицина. — 1993. — Т. 3. №3—4. —С. 5—21.

37. Riccelli F. Photophysical properties of porphyrins in biological membranes // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1995. — V. 29. No. 2—3. P. 109—118.

38. Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1990. — V. 6. No. 3. — P. 343—344.

39. Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1997. — V. 39. — P. 1—18.

40. Moore J. V., West С. M. L., Whitehurst C. The biology of photodynamic therapy // Phys. Med. Biol. — 1997. — V. 42. No. 5. — P. 913—935.

41. Zamzami N., Susin S. A., Marchetti P., Hirsch Т., Gomez-Monterrey I., Castedo M., Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis // J. Exp. Med. — 1996. — V. 183. No. 4.— P. 1533—1544.

42. Gomer C. J., Luna M., Ferrario A., Wong S., Fisher A. M. R., Rucker N. Cellular targets and molecular responses associated with photodynamic therapy // J. Clinical Laser Med. Surgery. — 1996. — V. 14. No. 5. — P. 315—321.

43. Geze M., Morliere P., Maziere J. C., Smith К. M., Santus R. Lysosomes, a key target of hydrophobic photosensitizers proposed for photochemotherapeutic applications // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1993. — V. 20. No. 1. — P. 23—25.

44. Hamblin M. R., Newman E. L. New trends in photobiology: On the mechanism of the tumour-localising effect in photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1994. — V. 23. No. 1. — P. 3—8.

45. Kessel D. Sites of photosensitization by derivatives of hematoporphyrin // Photochem. Photobiol. — 1986. — V. 44. No. 4. — P. 489—493.

46. Moan J., Boye E. Photodynamic effect on DNA and cell survival of human cells sensitized by hematoporphyrin // Photobiochem. Photobiophys. — 1981. — V. 2. — P. 301—307.

47. Crute J. J., Wahl A. F., Bambara R. A., Murant R. S., Gibson S. L., Hilf R. Inhibition of mammalian DNA polymerases by hematoporphyrin derivative and photoradiation // Cancer Res. — 1986.— V. 46. No. 1. —P. 153—159.

48. Sterry Ashby B. pH studies in human malignant tumours // The lancet. — 1966. — V. 288. No. 7458. — P. 312—315.

49. Thistlethwaite A. J., Alexander G. A., Moylan D. J., Leeper D. B. Modification of human tumor pH by elevation of blood glucose // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. — 1987. — V. 13. No. 4.— P. 603—610.

50. Thomas J. P., Girotti A. W. Glucose administration augments in vivo uptake nd phototoxicity of the tumor-localizing fraction of hematoporphyrin derivative // Photochem. Photobiol. — 1989. — V. 49. No. 3. — P. 241—247.

51. Nelson J. S., Kimel S., Brown L., Bems M. W. Glucose administration combined with photodynamic therapy of cancer improves therapeutic efficacy // Lasers Surg. Med. — 1992. — V. 12. No. 2. — P. 153—158.

52. Feldman G. В., Knapp R. C., Order S. E., Hellman S. The role of lymphatic obstruction in the formation of ascites in a murine ovarian carcinoma // Cancer Res. — 1972. — V. 32. No. 8. —P. 1663—1666.

53. Folkman J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? — G. H. A. Clowes Memorial Award Lecture // Cancer Res. — 1986. — V. 46. No. 2. — P. 467—473.

54. Underwood J. С. E., Carr I. The ultrastructure and permeability characteristics of the blood vessels of a transplantable rat sarcoma // J. Pathol. — 1972. — V. 107. No. 3. — P. 157—166.

55. Muller-Eberhard U., Morgan W. T. Porphyrin-binding proteins in serum // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1975. — V. 244. — P. 624—650.

56. Grossweiner L. I., Goyal G. C. Binding of hematoporphyrin derivative to human serum albumin // Photochem. Photobiol. — 1984. — V. 40. No. 1. — P. 1—4.

57. Jori G., Beltramini M., Reddi E., Salvato В., Pagnan A., Ziron L., Tomio L., Tsanov T. Evidence for a major role of plasma lipoproteins as hematoporphyrin carriers in vivo // Cancer Lett. — 1984. — V. 24. No. 3. — P. 291—297.

58. Гельфонд МЛ. Фотодинамическая терапия в онкологии // Практическая онкология. — 2007. — Т. 8. № 4. — С. 204—210.

59. Barth R. F., Soloway А. Н., Brugger R. М. Boron neutron capture therapy of brain tumors: past history, current status, and future potential // Cancer Invest. — 1996. — V. 14. No. 6. —P. 534—550.

60. Winkelman J., Slater G., Grossman J. The concentration in tumor and other tissues of parenterally administered tritium- and 14C-labeled tetraphenylporphinesulfonate // Cancer Res. — 1967. — V. 27. No. 11(1). — P. 2060—2064.

61. Evensen J. F., Moan J. A test of different photosensitizers for photodynamic treatment of cancer in a murine tumor model // Photochem. Photobiol. — 1987. — V. 46. No. 5. — P. 859—865.

62. Kessel D., Thompson P., Saatio K., Nantwi K. D. Tumor localization and photosensitization by sulfonated derivatives of tetraphenylporphine // Photochem. Photobiol. — 1987. — V. 45. No. SI. — P. 787—790.

63. Berg K., Western A., Bommer J. C., Moan J. Intracellular localization of sulfonated meso-tetraphenylporphines in a human carcinoma cell line // Photochem. Photobiol. — 1990. — V. 52. No. 3. — P. 481—487.

64. Nelson J. S., Roberts W. G., Berns M. W. In vivo studies on the utilization of mono-L-aspartyl chlorin (NPe6) for photodynamic therapy // Cancer Res. — 1987. — V. 47. No. 17.— P. 4681—4685.

65. Wong Kee Song L.-M., Wang К. K., Zinsmeister A. R. Mono-L-aspartyl chlorin e6 (NPe6) and hematoporphyrin derivative (HpD) in photodynamic therapy administered to a human cholangiocarcinoma model // Cancer. — 1998. — V. 82. No. 2. — P. 421—427.

66. Гельфонд M. JI. Возможности фотодинамической терапии в онкологической практике // Физическая медицина. — 2005. — Т. 15. № 2. — С. 31—34.

67. Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic sensitizers // Photochem. Photobiol. — 1991. — V. 53. — P. 859—870.

68. Тахчиди X. П., Белый Ю. А., Терещенко А. В., Семенов А. Д., Каплан М. А., Володин П. Л., Румянцев Д. С., Пономарев Г. В., Баум Р. Ф. Фотодинамическая терапия в офтальмологии (обзор) // Офтальмохирургия. — 2005. — №1. — С. 45—51.

69. Brusentsov N. A., Baryshnikov A. Yu., Bayburtskiy F. S., Goncharov L. A. Evaluation of ferrofluids containing photosensitizer Электронный ресурс. // URL: http://maanetic1iquid.narod.rii/autoritv/066.htm (дата обращения: 15.04.2009).

70. Idowu M., Nyokong Т. Photophysical and photochemical properties of zinc and aluminum phthalocyanines in the presence of magnetic fluid // J. Photochem. Photobiol. A: Chem.2007. — V. 188. No. 2—3. — P. 200—206.

71. Мелик-Нубаров H. С. Взаимодействие водорастворимых полимеров с липидными мембранами. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. М.: 2007. 350 с.

72. Сибилева М. А., Морошкина Е. Б. Руководство к лабораторному практикуму по молекулярной биофизике. СПб. 1998. 122 с.

73. Fiel R. J., Howard J. С., Mark E. H., Datta-Gupta N. Interaction of DNA with a porphyrin ligand: evidence for intercalation // Nucleic Acids Res. — 1979. — V. 6. No. 9. — P. 3093—3118.

74. Решетников А. В., Швец В. И., Пономарев Г. В. Водорастворимые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака / Успехи химиипорфиринов, т. 2; под ред. О. А. Голубчикова. СПб: НИИ Химии СПбГУ, 1999. Гл. 4. С. 70—114.

75. Fiel R. J., Datta-Gupta N., Mark E. H., Howard J. C. Induction of DNA damage by porphyrin photosensitizers // Cancer Res. — 1981. — V. 41. No. 9(1). — P. 3543—3545.

76. Le Doan Т., Perrouault L., Rougee M., Bensasson R., Helene C. Singlet oxygen formation and cleavage of DNA photosensitized by porphyrins / Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases. Libreria Progetto. Ed., 1985. 423 p. P. 56—58.

77. Praseuth D., Gaudemer A., Verlhac J.-B., Kraljic I., Sissoeff I., Guille E. Photocleavage of DNA in the presence of synthetic water-soluble porphyrins // Photochem. Photobiol. — 1986. — V. 44. No. 6. — P. 717—724.

78. Croke D. Т., Perrouault L., Sari M. A., Battioni J.-P., Mansuy D., Helene C., Le Doan T. Structure—activity relationships for DNA photocleavage by cationic porphyrins // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1993. — V. 18. No. 1. — P. 41—50.

79. Merchat M., Spikes J. D., Bertoloni G., Jori G. Studies on the mechanism of bacteria photosensitization by meso-substituted cationic porphyrins // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. — 1996. — V. 35. No. 3. — P. 149—157.

80. Moan J., Berg K. Photochemotherapy of cancer: experimental research // Photochem. Photobiol. — 1992. — V. 55. No. 6. — P. 931—948.

81. Groves J. Т., Matsunaga A. Designed double-strand DNA cleavage with chelate-appended porphyrins // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 1996. — V. 6. No. 13. — P. 1595—1600.

82. Shneider H.-J., Wang M. DNA Interactions with Porphyrins Bearing Ammonium Side Chains // J. Org. Chem. — 1994. — V. 59. No. 24. — P. 7473—7478.

83. Villanueva A., Jori G. Pharmacokinetic and tumour-photosensitizing properties of the cationic porphyrin meso-tetra(4JV-methylpyridyl)porphine // Cancer Lett. — 1993. — V. 73. No. 1,—P. 59—64.

84. Boyle R. W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers // Photochem. Photobiol. — 1996. — V. 64. No. 3. — P. 469—485.

85. Драбкин Г. M., Забиякин В. С., Иоффе А. И., Сибилев А. И., Марочкина И. К. Установка для исследования физико-химических и структурных свойств мономолекулярных пленок на границе раздела жидкость-газ. Препринт ЛИЯФ АН СССР № 1052. Л., 1985.26 с.

86. Юпобин В. В., Круглова Л. А., Сибилев А. И. Влияние добавок комплексообразующей соли на электрокинетические и гранулометрическиехарактеристики полистирольных латексов // Коллоид, журн. — 1991. — Т. 53. № 1. — С. 39-45.

87. Кирш Ю. Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды: синтез и физико-химические свойства. М.: Наука, 1998. 252 с.

88. Платэ Н. А., Васильев А. Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986. 294 с.

89. Sibileva M. A., Kul'velis Yu. V., Sibilev A. I., Moskalev P. N. Complexes of sulfonated lutecium and scandium diphthalocyanines with poly(N-vinylcaprolactam) and DNA // Russ. J. Phys. Chem. A. — 2005. — V. 79. Suppl. 1. — P. S60—S65.

90. Solomon O. F., Corciovei M., Cuita I., Boghina C. Properties of solutions of poly-N-vinylcaprolactam // J. Appl. Polym. Sci. — 1968. — V. 12. No. 8. — P. 1835—1842.

91. Lebedev V. Т., Torek Gy., Cser L., Kali Gy., Kirsch Yu. E., Sibilev A. I., Orlova D. N. NSE-study of poly(N-vinylcaprolactam) by coil-globule transition // Physica B: Condensed Matter. — 2001. — V. 297. — P. 50—54.

92. Байбуртский Ф. С. Магнитные жидкости: способы получения и области применения Электронный ресурс. // URL: http://maiineticliquid.narod.ru/ autoritv/008.htm (дата обращения: 15.04.2009).

93. Шлиомис М.И. Магнитные жидкости // Успехи физических наук. — 1974. — Т. 112. № 3. — С. 427—458.

94. Papell S. S. Low viscosity magnetic fluid obtained by the colloidal suspension of magnetic particles. Patent USA № 3215572, 1965.

95. Kaiser R., Miskolczy G. Magnetic Properties of Stable Dispersions of Subdomain Magnetite Particles // J. Appl. Phys. — 1970. — V. 41. No. 3. P. 1064—1072.

96. Kaiser R. Ferrofluid composition. Patent USA № 3700595, 1972.

97. Elmore W.C. Ferromagnetic colloid for studying magnetic structures // Phys. Rev., 1938. — V. 54. — P. 309—310.

98. Королев В. В., Рамазанова А. Г., Блинов А. В. Адсорбция поверхностно-активных веществ на высокодисперсном магнетите // Известия АН. Серия химическая. — 2002. — № 11. — С.1888—1893.

99. Королев В. В., Яшкова В. И., Рамазанова А. Г, Балмасова О. В. Адсорбция олеата натрия из водных растворов на поверхности магнетита. // Журн. Физ. Химии.2000. — Т. 74. № 11. — С. 2072—2075.

100. Бибик Е.Е. Приготовление феррожидкости // Коллоид. Журн. — 1973. — Т. 35. №6. —С. 1141—1142.

101. Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media // IEEE Trans. Magn. — 1981. — V. 17. — P. 1247—1248.

102. BrusentsovN. A., Lukashevich M. V., Gogosov V. V. Magnetic and physicochemical aspects of the biomedical magnetic fluid technology // Magnetohydrodynamics. — 1994.

103. V. 30. No. 2. — P. 176—179.

104. BrusentsovN. A., Gogosov V. V., Lukashevich M.V. Physical and chemical criteria for the creation of ferrimagnetic composites for biomedical applications // Pharmac. Chem. J. 2006 — V. 30. No. 10. — P. 654—659.

105. Scatchard G. The attraction of protein for small molecules and ions // Ann. NY Acad. Sci. — 1949. — V. 51. — P. 660—672.

106. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия, т. 3, М.: Мир, 1985. 536 с.

107. Цветков В. Н., Эскин В. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворе. М.: Наука, 1964.719 с.

108. Фрисман Э. В., Щагина Л. В., Воробьев В. И. Стеклянный ротационный вискозиметр //Коллоидный журнал. — 1965. — Т. 27. №1. — С. 130—133.

109. Будтов В. П. Физическая химия растворов полимеров. СПб: Химия, 1992. 384 с.

110. Eigner Y., Doty P. The native, denatured and renatured states of deoxyribonucleic acid // J. Mol. Biol. — 1965. — V. 12. No. 3. — P. 549—580.

111. Алексеев В. Л. Формирование структуры частиц полимерных коллоидов в процессе эмульсионной полимеризации. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Л., 1986. 116 с.

112. Gladkich I., Kunchenko А. В., Ostanevich Yu. М., Cser L. Spectrometer for investigation of small-angle neutron scattering using the time-of-flight method // J. Polym. Sci. — 1977. — V. 61. — P. 359—368.

113. Schmatz W., Springer Т., Schelten J., Ibel K. Neutron small-angle scattering: experimental techniques and applications // J. Appl. Cryst. — 1974. — V. 7. — P. 96—116.

114. Kadanoff L. P., Martin P. C. Hydrodynamic equations and correlation functions // Annals of Physics. — 1963. — V. 24. — P. 419—469.

115. Debye P., Bueche A. M. Scattering by an inhomogeneous solid // J. Appl. Phys. — 1949. — V. 20. No. 6. — P. 518—525.

116. Guinier A., Fournet G. Small-angle scattering of X-rays. New York: John Wiley and Sons, 1955.266 р.

117. Свергун Д. И., Фейгин J1. А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986. 280 с.

118. Jacrot В. The study of biological structures by neutron scattering from solution // Rep. Prog. Phys. — 1976. — V. 39. — P. 911—953.

119. Останевич Ю. M., Сердюк И. H. Нейтронографические исследования структуры биологических макромолекул // Успехи физических наук. — 1982. — Т. 131. — С. 85—116.

120. Асадчиков В. Е., Дембо А. Т., Львов Ю. М., Агамалян М. М., Крившич Т. И. Об исследовании радиусов инерции формиатдегидрогеназы методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов // Кристаллография. — 1982. — Т. 27. — С. 189—190.

121. Li Z. Q., Jacrot В., Le Gaillard F., Loucheux-Lefebrve M. H. Transcortin: a neutron scattering study of a glycoprotein // FEBS Lett. — 1980. — V. 122. — P. 203—206.

122. Бояринцева А. К., Дембо А. Т., Рольбин Ю. А., Фейгин Л. А. Рентгеновское малоугловое рассеяние системой хаотически ориентированных правильных многогранников // Кристаллография. — 1975. — Т. 20. — С. 149—151.

123. Рольбин Ю. А., Свергун Д. И., Фейгин Л. А., Гаспар Ш., Ронто Д. Строение бактериофага Т7 по данным малоуглового рентгеновского рассеяния // Докл. АН СССР. — 1980. — Т. 255. — С. 1497—1500.

124. Дембо А. Т., Добров Е. Н, Леднев В. В., Тихоненко Г. И., Фейгин Л. А. Об упаковке ДНК внутри головок бактериофагов Д7, С2, Сд // Биофизика. — 1965. — Т. 10.— С. 404—407.

125. Фейгин Л. А. Рентгеновское малоугловое исследование структуры биополимеров в растворе. Автореферат дисс. на соискание ученой степени доктора физ.-мат. наук. М., 1975. 45 с.

126. Свергун Д. И., Фейгин JI. А., Щедрин Б. М. Прямой метод интерпретации данных малоуглового рассеяния системами идентичных частиц // Докл. АН СССР.1981. — Т. 261. — С. 878—882.

127. Ibel К. The neutron small-angle camera Dll at the High-flux Reactor, Grenoble // J. Appl. Cryst. — 1976. — V. 9. — P. 296—309.

128. Гуревич И. И., Тарасов JI. В. Физика нейтронов низких энергий. М.: Наука, 1965. 607 с.

129. Bacon G. Е. Neutron diffraction. Third edition. Oxford: Clarendon press, 1975. P. 38—41.

130. Sears V. F. Neutron scattering lengths and cross sections // Neutron News. — 1992.1. V. 3. No. 3. — P. 26—31.

131. Вайнштейн Б. К. Дифракция рентгеновских лучей на цепных молекулах. М.: изд-во АН СССР, 1963. 372 с.

132. Stuhrmann Н. В., Miller A. Small-angle scattering of biological structures // J. Appl. Cryst. — 1978. — V. 11. — P. 325—345.

133. Stuhrmann H. B. Neutron small-angle scattering of biological macromolecules in solution // J. Appl. Cryst. — 1974. — V. 7. — P. 173—178.

134. Ibel K., Stuhrmann H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions // J. Mol. Biol. — 1975. — V. 93. — P. 255—265.

135. Engelmann D. M., Moore P. B. A new method for the determination of biological quarternary structure by neutron scattering // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1972. — V. 69.— P. 1977—1999.

136. Harrison S. C. Structure of Tomato Bushy Stunt virus. I. The apherically averaged electron density // J. Mol. Biol. — 1969. — V. 42. — P. 457—483.

137. Mateu L., Tardieu A., Luzzati V., Aggerbeck L., Schanu M. On the structure of human serum low density lipoprotein // J. Mol. Biol. — 1972. — V. 70. — P. 105—116.

138. Engelmann D. M., Moore P. В., Schoenborn B. P. Neutron scattering measurements of separation and shape of proteins in 30s ribosomal subunit of Euscherichia coli // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1975. — V. 72. — P. 3888—3892.

139. Debye P. Molecular-weight Determination by Light Scattering // J. Phys. Colloid. Chem. — 1947. — V. 51. No. 1. — P. 18—32.

140. Kratky O., Porod G. X-ray Investigation of Dissolved Chain Molecules // Reel. Trav. Chim. Pays-Bas. — 1949. — V. 68. — P. 1106—1122.

141. Sharp P., Bloomfield V. A. Light scattering from wormlike chains with excluded volume effects // Biopolymers. — 1968. — V. 6. No. 8. — P. 1201—1211.

142. Schelten J., Wignall C. D., Ballard D. G., Schmatz W. Neutron small-angle scattering by mixtures of H- and D-tagged molecules of polystyrene and polyethylene // Colloid and Polymer Sci. — 1974. — V. 252. — P. 749—752.

143. Kirste R. G. Kruse W. A., Ibel K. Determination of the conformation of polymer in the amorphous solid state and in concentrated solution by neutron diffraction // Polymer.1975. — V. 16. — P. 120—124.

144. Lieser G., Fisher E. W., Ibel K. Conformation of polyethylene molecules in the melt as revealed by small-angle neutron scattering // J. Polym. Sci.: Polym. Lett. Ed. — 1975.1. V. 13. No. 1. —P. 39—43.

145. Glatter O., Kratky O. Small-angle X-ray scattering. London, New York: Acad. Press, 1982.515 р.

146. Фейгин JI. А. Абсолютная интенсивность малоуглового рассеяния рентгеновских лучей щелевыми системами и вычисление молекулярного веса макромолекул // Кристаллография. — 1967. — Т. 12. — С. 274—280.

147. Jacrot В., Zaccai G. Determination of molecular weight by neutron scattering // Biopolymers. — 1981. — V. 20. — P. 2413—2426.

148. Шоллер И. Приближение формы частиц однородным трехосным эллипсоидом на основе данных малоуглового рассеяния // Кристаллография. — 1975. — Т. 20. — С. 1175—1177.

149. Kratky О., Pils J. Recent advances and applications of diffuse X-ray small-angle scattering on biopolymers in dilute solutions // Quart. Rev. Biophys. — 1972. — V. 5. — P. 481—537.

150. Рольбин Ю. А., Фейгин JI. А., Щедрин Б. M. Расчет на ЭВМ интенсивности рентгеновского малоуглового рассеяния моделями произвольной формы с заданным распределением электронной плотности // Аппаратура и методы рентг. Анализа. — 1971. —Т. 9. —С. 46—50.

151. Fedorov В. A., Ptitsyn О. В., Voronin L. A. X-ray diffuse scattering by proteins in solution. Consideration of solvent influence // J. Appl. Cryst. — 1974. — V. 7. — P. 181—186.

152. Свергун Д. И. Разработка прямого метода определения структуры биологических макромолекул по данным малоуглового рассеяния. Дисс. На соискание ученой степени кандидата физ.-мат. Наук. М., 1982. 110 с.165

153. Stuhrmann H. В. Interpretation of small-angle scattering functions of dilute solutions and gases. A representation of the structures related to a one-particle scattering function // Acta Cryst. Sect. A. — 1970. — V. 26. No. 3. — P. 297—306.

154. Svergun D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria // J. Appl. Cryst. — 1992. — V. 25. — P. 495—503.

155. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. Под ред. Г. Камминса и Э. Пайка. М.: Мир, 1978. 583 с.

156. Vzorov A. N., Dixon D. W., Trommel J. S., Marzilli L. G., Compans R. W. Inactivation of human immunodeficiency virus type 1 by porphyrins // Antimicrob. Agents Chemother. — 2002. — V. 46. No. 12. — P. 3917—3925.

157. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. — 1958. — Т. 23. № 5. — С. 656—662.

158. Москалев П. Н., ЬСирин И. С. Спектрофотометрическое исследование свойств сульфированных дифталоцианинов иттрия, гадолиния и лютеция в водных растворах//Журн. неорган, химии. — 1971. —Т. 16. № 1.—С. 110—114.

159. Гросберг А. Ю., Хохлов А. Р. Статистическая физика макромолекул. М.: Наука, 1989. 344 с.

160. Сибилева М. А., Осипова Т. Н., Заленский А. О., Чебишян М. А., Голикова А. И., Воробьев В. И., Фрисман Э. В. Исследование комплексов ДНК с гистонами F3 и F3 + F2a2 // Молек. биол. — 1976. — Т. 10. № 3. — С. 514—520.

161. Сибилева М.А., Затяева А.А., Сабанеева Н.В., Матвеева Н.И. Конформация молекулы ДНК в водно-солевых растворах зависит от типа аниона соли // Биофизика. — 2002. — Т. 47. № 3. — С. 427—432.

162. Соловьева А. Б., Мелик-Нубаров H. С., Аксенова H. А., Глаголев H. H., Встовский Г. В., Бугрин В. С., Лузгина В. Н.,. Ольшевская В. А, Белкова Г. В. // Журн. физ. Химии. — 2006. — Т. 80. № 1. — С. 137—143.

163. Байбуртский Ф. С., Гончаров Л. А., Брусенцов Н. А. Получение магнитоуправляемых носителей для биомедицинских исследований Электронный ресурс. // http://magneticliquid.nafod.rii/medicine/012.htm (дата обращения: 15.04.2009).

164. Лобышев В. И., Калиниченко Л. П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах. М.: Наука, 1978. 216 с.

165. Lebedev V. Т., Gordeev G. P., Panasiuk Е. A., Kiss L., Cser L., Rosta L., Torok Gy., Farago В. Ferrofluid dynamics: Spin-echo experiment // J. Magn. Magn. Mater. — 1993. — V. 122. —P. 83—89.

166. Лебедев В. Т., Гордеев Г. П., Панасюк Э. А., Дудаков А. Д., Орлова Д. Н., Сибилев А. И., Клюбин В. В., Качурин А. Л., Рошта Л., Чер Л., Торок Д., Киш Л., Фараго Б. Структура и динамика феррожидкости. Препринт ПИЯФ № 1839. Санкт-Петербург, 1992. 46 с.

167. Балашою М., Авдеев М.В., Аксенов В.Л. Исследование кластеров в водных магнитных жидкостях методом малоуглового рассеяния нейтронов. Обзор // Кристаллография. — 2007. — Т. 52. № 3. — С. 528—535.

168. Аксельрод JI. А., Гордеев Г. П., Драбкин Г. М., Лазебник И. М., Лебедев В. Т. Анализ малоуглового рассеяния поляризованных нейтронов в ненамагниченных феррожидкостях // ЖЭТФ. — 1986. — Т. 91. № 2(8). — С. 531—541.

169. Torok Gy., Lebedev V. Т., Orlova D. N. Structure of colloidal particles in aqueous ferrofluid // Magnetohydrodynamics. — 2002. — V. 38. No. 3. — P. 277—280.

170. Wiedenmann A., Hoell A., Kammel M. Small-angle scattering investigations of cobalt-ferrofluids using polarised neutrons // J. Magn. Magn. Mater. — 2002. — V. 252. — P. 83—85.

171. Gazeau F., Boue F., Dubois E., Perzynski R. Static and quasi-elastic small angle neutron scattering on biocompatible ionic ferrofluids: magnetic and hydrodynamic interactions // J. Phys.: Condens. Matter. — 2003. — V. 15. — P. S1305—S1334.