Интеркалированные мотивы модифицированных олигонуклеотидов в рН-сенсорах и системах скрининга лигандов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Петрунина Наталия Андреевна

• Петрунина Наталия Андреевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Петрунина Наталия Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Научная новизна исследования

Цели и задачи работы

Методология и методы диссертационного исследования

Теоретическая и практическая значимость

Структура и объём диссертации

Апробация работы и публикации

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад соискателя

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Интеркалированные мотивы ДНК: общая характеристика

1.2. Геномное распределение и биологическая роль интеркалированных мотивов

1.3. Геномные интеркалированные мотивы как терапевтические мишени

1.4. Низкомолекулярные лиганды к интеркалированнным мотивам

1.5. Скрининг лигандов к интеркалированным мотивам

1.6. Интеркалированные мотивы в дизайне рН-сенсоров и наномашин

1.7. Изменения рН в клетке как маркер патологии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Методы получения и характеристики систем скрининга лигандов к

интеркалированным мотивам

2.1.1. Получение интеркалированных мотивов - мишеней лигандов

2.1.2. Мотивы с терминальными метками или псевдонуклеозидом

2.1.3. Абсорбционная спектроскопия, круговой дихроизм и флуориметрия

2.1.4. Плавление с детекцией по флуоресценции и круговому дихроизму

2.2. Методы получения и характеристики рН-сенсоров на основе интеркалированных мотивов

2.2.1. Получение ратиометрических и контрольных рН-сенсоров

2.2.2. Спектроскопия кругового дихроизма и флуориметрия сенсоров

2.2.3.Калибровка в бесклеточной системе и анализ термостабильности

2.2.4. Анализ FRET единичных молекул сенсоров

2.2.5. Анализ кинетики сенсоров методом остановленного потока

2.2.6. Клеточные линии

2.2.7. Трансфекция и проверка цитотоксичности сенсоров

2.2.8. Флуоресцентная микроскопия и FRET-микроскопия

2.2.9. Внутриклеточная калибровка и определение рН в ядрах клеток

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Модифицированные iM-олигонуклеотиды для скрининга лигандов

3.1.1. Артефакты плавления iM c терминальными меткой и гасителем

3.1.2. Модификация iM и альтернативная схема плавления

3.1.3. Тестирование альтернативной схемы с известными лигандами

3.2. рН-Сенсоры на основе модифицированных iM-олигонуклеотидов

3.2.1. Дизайн рН-сенсоров на основе модифицированных iM

3.2.2. рН-калибровка сенсоров в бесклеточной системе

3.2.3. Проверка влияния 3'Е/5'Е-изомерии на сигнал сенсора

3.2.4. Кинетика отклика сенсоров на изменения рН

3.2.5. Распределение и стабильность сенсоров в клетках

3.2.6. Детекция рН в ядрах условно-нормальных и раковых клеток

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

КД - круговой дихроизм;

КД-плавление - плавление с детекцией по изменению спектров кругового

дихроизма;

ОДН - олигодезоксирибонуклеотид;

ТО - тиазоловый оранжевый;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

BHQ - гаситель флуоресценции Blackhole quencher 1;

BRACO - BRACO-19, лиганд к iM;

DAPI - 4',6-диамино-2-фенилиндол;

E - эффект FRET (Фёрстеровского переноса энергии);

FAM - 6-карбоксифлуоресцеин;

FI - интенсивность флуоресценции;

FI-плавление - плавление с детекцией по изменению флуоресценции;

FRET - Фёрстеровский перенос энергии;

FRET-плавление - плавление с детекцией гашения или FRET-эффекта;

G4 - G-квадруплекс;

iM - интеркалированный мотив;

MALDI-TOF MS - матрично-активированная лазерная десорбционно/

ионизационная времяпролётная масс-спектрометрия;

MTX - митоксантрон, лиганд к iM;

smFRET - анализ FRET-эффекта в единичных молекулах;

TAMRA - тетраметилродамин.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интеркалированные мотивы модифицированных олигонуклеотидов в рН-сенсорах и системах скрининга лигандов»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

рН-Чувствительные вторичные структуры олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН), такие как интеркалированные мотивы (iM), являются удобной основой для получения ряда биосовместимых молекулярных инструментов. В данной работе рассмотрены два примера таких инструментов: системы рН-имиджинга и системы скрининга низкомолекулярных регуляторов транскрипции (Рисунок 1). Первые позволяют оценивать рН и визуализировать изменения этого показателя в клетках и тканях. Вторые предназначены для прогнозирования действия низкомолекулярных соединений на iM-содержащие участки генома.

Рисунок 1. Схематическое представление \Ыв геноме, в составе систем скрининга лигандов и сенсоров.

Актуальность получения олигонуклеотидных рН-сенсоров определяется недостаточной эффективностью наиболее распространённых на сегодняшний день типов индикаторов - низкомолекулярных и генетически кодируемых - для решения отдельных задач рН-имиджинга в диагностике и исследованиях механизмов патогенеза заболеваний, сопровождающихся дисбалансом рН [1]. Коммерчески доступные генетически кодируемые индикаторы (белки) и малые молекулы отличаются иммуногенностью и/или неоптимальным распределением внутри клетки, динамическим диапазоном, не включающим физиологические значения рН, и медленной кинетикой отклика. В этой связи ведётся поиск альтернатив.

Актуальность получения систем скрининга лигандов определяется потребностью в новых селективных низкомолекулярных стабилизаторах и дестабилизаторах iM для изучения роли этих структур в геноме и возможностей регуляции генной экспрессии за счёт действия на промоторные iM.

Степень разработанности темы

Оптические сенсоры для внутриклеточного рН-имиджинга на основе флуоресцентно-меченных iM-ОДН активно разрабатываются последнее десятилетие, однако примеры их практического применения в фундаментальных исследованиях не описаны. Ключевым ограничением является несовместимость рабочего диапазона таких молекулярных инструментов с характерными для внутриклеточной среды значениями рН.

Предпосылками к частичному решению проблемы стали исследования условий формирования iM в геноме человека [2]. Они позволили скорректировать дизайн сенсоров, существенно улучшив их характеристики. Тем не менее, оптимизация рабочего диапазона и кинетических параметров остаются актуальными задачами. На основе природных iM не удаётся получить сенсоры, пригодные для анализа малых изменений рН в отдельных клеточных компартментах. Предложенная в данной работе модификация ОДН открывает новые возможности конструирования сенсоров с заданными характеристиками.

Стоит отметить, что помимо дизайна искусственных рН-чувствительных конструкций обнаружение iM в геномной ДНК эукариот стимулировало изучение биологической роли эндогенных структур такого рода [3]. Поскольку накопление iM наблюдается преимущественно на этапе транскрипции, и iM-формирующие последовательности представлены в регуляторных участках генома, предполагается участие самих iM, а также стабилизирующих и дестабилизирующих их соединений (лигандов) в контроле генной экспрессии.

Для экспресс-скринига iM-лигандов до недавних пор применялся метод, основанный на Фёрстеровском переносе энергии - метод FRET-плавления -прямой аналог FRET-плавления G-квадруплексных (G4) структур с 04-лигандами [4]. Терминальное мечение iM/G4-ОДН остатками FRET-пары флуорофоров или флуорофора и гасителя в теории позволяет оценивать термостабильность структуры в присутствии или в отсутствие лиганда, регистрируя изменения флуоресценции при расхождении меток в ходе термической денатурации вторичной структуры ОДН. Метод хорошо себя зарекомендовал применительно к G4, однако в случае iM были выявлены артефакты. Для дальнейшего поиска стабилизаторов и дестабилизаторов iM требовалась оптимизация метода, и в данной работе эта задача была решена с использованием модифицированных iM-формирующих ОДН.

Научная новизна исследования

В данной работе предложены оригинальные решения двух актуальных проблем в области исследования iM и их адаптации для нужд диагностики. Проблема экспресс-скрининга iM-лигандов решена с использованием модификации, разработанной коллективом из ИБХ РАН под руководством А.В. Аралова [5]. Данная модификация представляет собой включение в структуру ОДН остатков псевдонуклеотида на основе феноксазина, флуоресценция которого чувствительна к микроокружению и, как следствие - к структуре ОДН. Анализ термической денатурации iM c остатками феноксазинового производного в петлях по изменению интенсивности его

флуоресценции ^1-плавление) не был описан ранее. Его комбинация с БИЕТ-плавлением G4 и дуплексов/шпилек позволяет унифицировать условия профилирования малых молекул, т.е. отслеживать параллельно их эффекты на все ключевые типы вторичных структур ДНК. Данное техническое решение позволит адекватно оценивать селективность малых молекул в отношении конкретных типов вторичной структуры, что определяет его принципиальную новизну и научную значимость.

Проблема получения рН-сенсоров с заданными характеристиками, а именно быстрым откликом на изменения рН и рабочим диапазоном, охватывающим область физиологических значений рН, также решена в данной работе с помощью известных модификаций ДНК [6]. Они представляют собой включение в структуру ОДН остатков Г,2Л-дидезоксирибозы и алкильных линкеров. Данные модификации не применялись ранее для изменения свойств iM. Их выбор объясняется гипотезой о негативном влиянии объёмных гидрофобных заместителей (нуклеиновых оснований) в петлях на термодинамическую устойчивость iM - за счёт повышения энтропии сольватации, а также на скорость отклика - за счёт снижения конформационной подвижности. Модификации фактически представляют собой удаление оснований или полную замену нуклеозидного остатка гибким алкильным линкером. Данный подход к оптимизации характеристик iM не имеет прямых аналогов.

Цели и задачи работы

Целью диссертационного исследования являлась разработка систем скрининга лигандов и сенсоров для внутриклеточного рН-имиджинга на основе модифицированных iM.

Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Анализ артефактов FRET-плавления iM с терминальными меткой и гасителем;

2. Тестирование альтернативной схемы плавления iM с метками в петлях;

3. Переоценка эффектов iM-лигандов с помощью новой схемы плавления;

4. Дизайн ратиометрических рН-сенсоров на основе модифицированных iM;

5. Характеристика и рН-калибровка сенсоров в бесклеточной системе;

6. Характеристика и калибровка сенсоров в клетках.

Методология и методы диссертационного исследования

При конструировании рН-сенсоров и систем скрининга iM-лигандов были использованы известные и оригинальные подходы к введению репортерных групп и модификаций ОДН (терминальное мечение и модификации петель соответственно).

Встраивание в петли iM остатков нуклеозидных аналогов с феноксазиновым производным вместо гетероциклического основания, алкильных линкеров или остатков Г,2л-дидезоксирибозы выполнялось на стадии твердофазного автоматического синтеза ОДН с использованием соответствующих фосфорамидитов. Для постсинтетического терминального мечения остатками 6-карбоксифлуоресцеина (FAM) и тетраметилродамина (TAMRA) получали 5'-амино-ОДН-3л-алкин, используя помимо стандартных реагентов фосфорамидит аминогексанола и алкин-модифицированную смолу CPG. Мечение осуществляли путём 5'-ацилирования и 3л-азид-алкин-циклоприсоединения, используя N-гидроксисукцинимидное производное FAM и азидопроизводное TAMRA, соответственно. Фосфорамидиты нуклеозидных аналогов для модификации петель iM синтезированы А.В. Араловым по опубликованным протоколам. Стандартные реактивы для олигонуклеотидного синтеза получены от компании "Glen Research" (США). Реактивы для терминального мечения получены от компании "Lumiprobe" (Россия). Синтез iM-ОДН выполнен коллективом из МГУ под руководством Т.С. Зацепина. Чистота всех ОДН подтверждена методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и матрично-активированной лазерной десорбционно/ионизационной времяпролётной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS).

Тестирование новой системы скрининга iM-лигандов и её сравнение с классической системой проводилось методами FI-плавления и FRET-плавления

соответственно. Результаты этих экспериментов - кривые плавления и полученные из них характеристики термостабильности iM в присутствии и в отсутствие лигандов сравнивали с референсными данными плавления с детекцией методом спектроскопии кругового дихроизма (КД-плавление). Все перечисленные эксперименты выполнены с использованием мультимодульного спектрофотометра Chirascan компании "Applied Photophysics" (Великобритания).

Тестирование новых рН-сенсоров на основе iM-ОДН в бесклеточной системе включало, помимо анализа термостабильности, определение рН-зависимости флуоресцентного сигнала и скорости отклика сенсора на изменения рН. Для построения кривой рН-зависимости и определения на её основе рабочего диапазона сенсора, а также его ключевой характеристики - точки перехода (рН1/2) - регистрировали спектры флуоресценции сенсора в различных буферных системах, используя планшетный ридер Tecan M200 компании "Tecan Group Ltd" (Швейцария). Для оценки констант скорости отклика сенсора имитировали допустимые в биологических системах скачки рН и регистрировали кинетические кривые, используя спектрофлуориметр с модулем остановленного потока компании "Applied Photophysics" (Великобритания). Эффективность переноса энергии между метками сенсора на уровне единичных молекул (smFRET) анализировали, регистрируя испускание акцептора при возбуждении донора на микроскопе LSM710-Confocor 3 с детектором API компании "Zeiss" (Германия).

Для анализа внутриклеточного распределения и внутриклеточной калибровки сенсоров использовали клетки аденокарциномы лёгкого человека (А549) и иммортализованные клетки почки эмбриона человека (HEK293). Трансфекция клеток сенсорами с использованием липофекатамина в качестве трансфектанта, проверка цитотоксичности сенсоров c использованием реагента Presto Blue, а также изменение рН в клетке для калибровки сенсора с использованием ионофоров и стандартных буферных растворов проводились по стандартным протоколам. Распределение сенсоров в клетках и изменение флуоресцентного сигнала в зависимости от рН регистрировали методом

конфокальной флуоресцентной микроскопии на микроскопе Eclipse T-E компании "Nikon" (Япония).

Теоретическая и практическая значимость

В данной работе рассмотрено применение модифицированных iM-ОДН в дизайне молекулярных инструментов, которые могут быть востребованы при создании диагностических систем и разработке прототипов лекарственных препаратов, адресованных к iM-ДНК. Сферы возможного непосредственного применения представленных в работе рН-сенсоров включают окрашивание клеток для выявления характерных изменений рН при метаболических нарушениях, онкотрансформации, нейродегенерации и др. [7-8]. В перспективе они также могут быть адаптированы для обнаружения единичных трансформированных клеток в срезах тканей и отслеживания влияния дисбаланса рН на развитие патологии.

Необходимо отметить, что сенсоры накапливаются преимущественно в ядрах клеток, что нехарактерно для большинства коммерчески доступных альтернатив. Хотя поддержание градиента рН между ядром и цитоплазмой изучается не первое десятилетие, имеющиеся данные противоречивы и недостаточны. Неочевидно, сопровождается ли острый ацидоз в опухоли изменением рН нуклеоплазмы; сказывается ли он на процессах транскрипции, сплайсинга и др. Эти принципиальные для раскрытия механизмов патогенеза вопросы остаются открытыми именно ввиду отсутствия подходящих молекулярных инструментов. Предложенные сенсоры в комбинации с другими индикаторами открывают возможность комплексного анализа рН-зависимых процессов в норме и патологии.

Ожидаемое практическое применение систем скрининга iM-лигандов также связано с фундаментальными исследованиями. Рациональный дизайн лекарственных соединений, действующих на iM, возможен в отдалённой перспективе. Ему должны предшествовать более точное установление вклада iM в нарушения генной экспрессии и выделение конкретных геномных iM -

терапевтических мишеней. Разработки G4-лигандов - прототипов терапевтических агентов для индивидуальной или комбинированной противоопухолевой терапии [9] опережают разработки iM-лигандов, но уже сейчас очевидна необходимость тестирования всех новых соединений с обоими типами неклассических структур ДНК для корректной оценки селективности и предсказания побочного действия. Подобное тестирование обычно не проводится по причине отсутствия методов экспресс-скринига, пригодных для профилирования лигандов к G4 и iM одновременно. Предложенный метод FI-плавления iM можно сочетать с общедоступным методом FRET-плавления G4/дуплексов/шпилек на типовом оборудовании (термоциклеры), что и определяет его практическую ценность.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 100 страницах и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 107 источников. Работа содержит 3 таблицы и проиллюстрирована 25 рисунками.

Апробация работы и публикации

Достоверность результатов подтверждается использованием общепризнанных методологий исследований с применением высокоточного оборудования. Все проведённые эксперименты являются воспроизводимыми, для каждого из экспериментальных исследований набрано достаточное количество повторений, результаты обработаны с использованием статистических методов для подсчёта погрешностей.

Основные результаты работы были представлены на 7 российских и международных конференциях:

1. Н.А. Петрунина и ост.; «Геномные i-мотивы в роли сенсоров для определения изменения pH в клетках»; Научная конференция молодых ученых

ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА России, Москва, 13-14 апреля 2021.

2. Н.А. Петрунина и ост.; «Сенсоры для определения изменения ph в клетках на основе геномных интеркалированных мотивов»; III объединённый научный форум физиологов, биохимиков и молекулярных биологов, Сочи - Дагомыс, 3-8 октября 2021.

3. A.S. Shtork, N.A. Petrunina, A.M. Varizhuk, "Impact of molecular crowding on i-motif-based pH sensors"; Международная конференция "Innovative ThERApeutiC Targets In nOn-canonical Nucleic acids structures Winter InterNational School 2021", Павия, Италия, 23-26 ноября 2021.

4. А.С. Шторк, А.М. Варижук, Н.А. Петрунина, С.А. Лизунова; «ДНК-сенсоры на основе i-мотивов для измерения pH в клетке»; 64-ая Всероссийская научная конференция МФТИ, Москва, 29 ноября - 3 декабря 2021.

5. А.С. Шторк, Н.А. Петрунина и ост.; «Сенсоры для измерения ph в ядре клетки на основе i-мотивов днк с алкильной модификацией остова»; Научная конференция молодых ученых ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России, Москва, 20-21 апреля 2022.

6. Н.А. Петрунина и ост.; «Оптимизация структуры модельных iM для дизайна внутриклеточных рН-сенсоров»; Всероссийская конференция «Синтетическая биология и биофармацевтика, Новосибирск, 24-28 июля 2022.

7. Н.А. Петрунина и ост.; «Сенсоры для определения изменения pН в клетках на основе геномных интеркалированных мотивов»; VII Съезд биохимиков, молекулярных биологов и физиологов России, Сочи, 3-7 октября 2022.

По материалам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых изданиях:

1. V.B. Tsvetkov, A.V. Turaev, N.A. Petrunina, D.M. Melnik, Yu.M. Khodarovich, G.E. Pozmogova, T.S. Zatsepin, A.M. Varizhuk, A.V. Aralov. Phenoxazine pseudonucleotides in DNA i-motifs allow precise profiling of small molecule binders by fluorescence monitoring. Analyst, 2021, V. 146, № 14, pp. 44364440.

2. Н.А. Петрунина, В.В. Лебедев, Ю.Г. Кириллова, А.В. Аралов, А.М. Варижук, М.В. Сардушкин // Интеркалированные мотивы ДНК с ненуклеозидными вставками. Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 837840.

3. N.A. Petrunina, A.S. Shtork, M.M. Lukina, V.B. Tsvetkov, Yu.M. Khodarovich, A.V. Feofanov, A.M. Moysenovich, E.G. Maksimov, V.O. Shipunova, T.S. Zatsepin, A.N. Bogomazova, V.O. Shender, A.V. Aralov, M.A. Lagarkova, A.M. Varizhuk // Ratiometric i-Motif-Based Sensor for Precise Long-Term Monitoring of pH Micro Alterations in the Nucleoplasm and Interchromatin Granules // ACS sensors, 2023, V. 8, № 2, pp. 619-629.

Положения, выносимые на защиту

1. Введение псевдонуклеозида, флуоресценция которого чувствительна к микроокружению, в петлевые участки iM-ОДН позволяет отслеживать термическую денатурацию iM по изменению флуоресценции (FI-плавлению).

2. В отличие от FRET-плавления iM с терминальными метками, FI-плавление iM с псевдонуклеозидом в петле отражает разрушение ядра iM в присутствии низкомолекулярных лигандов.

3. Введение в петли остатков Г,2л-дидезоксирибозы или алкильных линкеров повышает термодинамическую стабильность iM в условиях, близких к физиологическим (рН 7).

4. Меченные парой флуорофоров iM c алкильными линкерами в петлях представляют собой ратиометрические рН-сенсоры, рабочий диапазон которых совместим с внутриклеточным рН-имиджингом за счёт повышенной стабильности модифицированных iM.

5. Ратиометрические рН-сенсоры на основе модифицированных iM характеризуются повышенной скоростью отклика на изменения рН в сравнении с аналогами на основе природных iM за счёт повышенной гибкости петель.

6. Предложенные ратиометрические сенсоры накапливаются в ядрах клеток, пригодны для оценки рН в ядре и позволяют зарегистрировать характерное для ряда опухолевых клеток незначительное защелачивание нуклеоплазмы.

Личный вклад соискателя

Основные результаты диссертационной работы получены автором лично или при его непосредственном участии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Интеркалированные мотивы ДНК: общая характеристика

Цитозин-богатые последовательности ДНК способны образовывать квадруплексные структуры - интеркалированные мотивы (iM) [10-11]. Их последовательности можно описать общей формулой C5+NxC5+NyC5+Nz, где - петли между С-блоками [11]. Часть iM с протяжёнными С-блоками устойчива в нейтральных условиях, но большинство таких структур требует слабокислой среды, поскольку для образования ядра iM необходимо протонирование атома N-3 в половине остатков цитозина [12] (Рисунок 2).

Рисунок 2. Общий вид мономолекулярных и межмолекулярных интеркалированных мотивов.

Одно из первых детальных описаний iM основывалось на исследованиях структуры тетрамеров коротких ОДН с С5-блоками в кислой среде методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопии) [13]. Было установлено, что четырёхспиральная структура представляет собой два взаимно интеркалированных параллельных дуплекса в антипараллельной ориентации, удерживаемых вместе гемипротонированными парами оснований - цитозин-

цитозин (С-С+). В общем случае iM, как и G4, могут образовываться за счёт межмолекулярного взаимодействия при объединении двух (димерные 1М) или четырёх (тетрамерные 1М) отдельных цепей ДНК. В геномной ДНК преимущественно формируются внутримолекулярные структуры (мономеры, образованные за счёт изгиба одной цепи ДНК).

Расстояние между последовательными парами оснований в iM составляет 3,1 А, что меньше, чем у В-ДНК (3,4 А) [14]. Интеркаляция пар оснований из двух параллельных дуплексов приводит к структуре с двумя большими (широкими) бороздками и двумя малыми (узкими) бороздками. Две малые бороздки являются чрезвычайно узкими (3,1 А; для сравнения в В-ДНК ширина малой бороздки составляет ~ 5,7 А), т.е. сахарофосфатные остовы в них сближены. Эти особенности геометрии обуславливают дестабилизирующее iM взаимное отталкивание фосфатных остатков, которое частично компенсируется энергетически выгодными взаимодействиями сахарных остатков. Поскольку малые бороздки образуются между антипараллельными нитями, сахар-сахарные контакты реализуются в двух альтернативных вариантах: "лицом-к-лицу" и "спиной-к-спине". В первом случае атомы кислорода обращены друг к другу, а во втором случае сближены углеродные атомы.

Исходя их пространственного расположения пар оснований С-С+, iМ могут быть классифицированы по двум различным топологиям интеркаляции (Рисунок 2), известным как 3'Е (внешней является пара с З'-концевым цитозиновым остатком) и 5'Е (внешней является пара с 5'-концевым цитозиновым остатком) [15]. При отсутствии дополнительных взаимодействий и одинаковом количестве С-С+-пар, конформация 5'Е более стабильна, чем 3'Е, за счёт протяжённых сахарно-сахарных контактов вдоль малых бороздок.

Гемипротонированные пары оснований С-С+ являются ключевыми для стабильности iM. Три водородные связи такой пары обеспечивают высокую стабильность структуры. Компьютерные расчёты показывают, что энергия спаривания этих оснований составляет 169,7 кДж/моль, что выше, чем энергия

для канонического уотсон-криковского взаимодействия G-C (96,6 кДж/моль) и нейтрального C-C (68,0 кДж/моль) [16].

В отличие G4-структур, ядра которых могут иметь различную топологию в зависимости от ориентации соседних цепей, топология ядра iM практически универсальна, и специфичность взаимодействий с белками либо низкомолекулярными лигандами в большей степени определяется размером и последовательностями петель. Непосредственно примыкающие к ядру участки петель (кэпирующие остатки) также оказывают большое влияние на стабильность iM [17].

Данные о влиянии длины петель на стабильность iM, основанные преимущественно на анализе последовательностей из генома человека [18-19], противоречивы. Выделяют два класса iM: к первому относят структуры с короткими петлями (до 4 нуклеотидов в центральной петле и до 2 - в остальных), ко второму - структуры с петлями до 8 нуклеотидов. Примеры iM класса I обнаружены в промоторах генов VEGF, RET и Rb; примеры класса II - в промоторах c-Myc и Bcl-2 [20].

Хотя длинные петли допускают дополнительную стабилизацию за счёт кэпирования или внутренних шпилечных элементов, экспонирование в раствор нуклеиновых оснований неструктурированной петли энергетически невыгодно. Последние данные подтверждают, что iM класса I, в частности структуры с однонуклеотидными петлями, наиболее устойчивы при физиологических условиях [11, 21]. Такие iM наиболее часто встречаются в промоторных областях и рассматриваются как вероятные участники регуляции транскрипции [22-23].

1.2. Геномное распределение и биологическая роль интеркалированных мотивов

Поиск и предсказание iM в геномах выполняются с использованием автоматических алгоритмов. В одной из ранних работ для этих целей был адаптирован алгоритм, изначально предложенный для G4 [10]. После верификации предсказанных iM физико-химическими методами был установлен

консенсусный мотив устойчивой внутримолекулярной структуры: четыре С-блока минимум из пяти цитозинов, разделённые трактами длиной от 1 до 19 нуклеотидов. По этим критериям было отобрано более 5 тысяч последовательностей в геноме человека, которые потенциально могут складываться в iM [10]. Статистически значимое обогащение iM-формирующими последовательностями было отмечено для промоторов генов, ассоциированных с развитием скелетной системы, сиквенс-специфичным связыванием ДНК, и положительной регуляцией транскрипции. Последовательности, отвечающие критериям поиска, отсутствовали в генах, участвующих в контроле иммунного ответа, рецепторной функции, связанной с G-белком, и активности обонятельных рецепторов.

Анализ генома человека с использованием альтернативного алгоритма, который опирался на полуэмпирическое правило "4п-1" для стабильных iM в гомо-олигомерных последовательностях Сп, дал сходные результаты [24]. Была установлена сравнительно широкая представленность потенциальных iM в промоторах, интронах и 5'- и З'-нетранслируемых областях. Кодирующие области и межгенные участки, напротив, обеднены потенциальными iM. К тем же выводам подводит применение современных алгоритмов, в частности G4-iM Grinder [25].

Ключевым итогом биоинформатического анализа генома человека можно назвать установление неслучайного расположения последовательностей с высоким потенциалом формирования iM, что указывает на их регуляторную роль. Биоинформатические предсказания не всегда точны [19], и формирование iM в составе хроматина требует тщательной проверки. В то же время, "строгие" алгоритмы поиска не позволяют выявить iM c относительно короткими ^-блоками (n < 5), часть которых способна выдержать внутриклеточные условия за счёт дополнительных структурных элементов - фланкирующих ядро пар оснований или неканонических тетрад (Рисунок 3) либо стабилизации белковыми факторами [11, 26-27]. Примеры таких мотивов были обнаружены в сателлитных участках генома человека - теломерах и центромерах [26, 28-29].

Рисунок 3. Устойчивые iM c малым числом цитозиновых пар в ядре, стабилизированные дополнительными элементами вторичной структуры (уотсон-криковскими парами, T-T псевдопарами и смешанными тетрадами).

Центромерная ДНК образована тандемными повторами с GC-богатыми сегментами в окружении АТ-богатых участков. Эти сегменты, известные как CENP-B-бокс и A-бокс, формируют (по крайней мере, in vitro) необычные димерные iM, структуры которых были установлены методом ЯМР-спектроскопии [30]. Предполагается, что димерные iM обеспечивают

взаимодействия между латерально ассоциированными нуклеосомами, способствуя компактизации ДНК при формировании центромеры (Рисунок 3). Проверка этой гипотезы требует дальнейших исследований.

На сегодняшний день преждевременно говорить о полном картировании iM в геноме - отсутствуют данные по иммунопреципитации хроматина с соответствующими антителами. Тем не менее, с 2017 года накапливаются всё более убедительные доказательства существования iM в ядрах живых клеток (Рисунок 4). Первые подтверждения [31] были получены методом ЯМР-спектроскопии в живых клетках человека. Авторы использовали синтетические iM, последовательности которых были взяты из промоторов генов DAP, HIF-1, PDGF-A и JAZF1. Флуоресцентно меченные iM, доставленные в клетки HeLa методом электропорации, локализовались в ядре и не проявляли цитотоксичности. Три из четырёх экзогенных ОДН (DAP, PDGF-A и JAZF1) сохраняли iM-структуру в ядрах клеток при температуре, близкой к физиологической (до 35°С), о чём свидетельствовали характерные 1Н-ЯМР-сигналы иминовых протонов гемипротонированных цитозиновых пар.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Петрунина Наталия Андреевна, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Steinegger A., Wolfbeis O. S., and Borisov S. M. Optical Sensing and Imaging of pH Values: Spectroscopies, Materials, and Applications // Chem. Rev. - 2020 - Vol. 120 - no. 22 - pp. 12357-12489.

2. Zeraati M. et al. I-motif DNA structures are formed in the nuclei of human cells // Nat. Chem. - 2018 - vol. 10 - no. 6 - pp. 631-637.

3. Assi H. A., Garavís M., González C., and Damha M. J. I-motif DNA: Structural features and significance to cell biology // Nucleic Acids Res. - 2018 -vol. 46 - no. 16 - pp. 8038-8056.

4. De Cian A. et al. Fluorescence-based melting assays for studying quadruplex ligands // Methods - 2007 - vol. 42 - no. 2 - pp. 183-195.

5. Tsvetkov V. B. et al. Phenoxazine pseudonucleotides in DNA i-motifs allow precise profiling of small molecule binders by fluorescence monitoring // Analyst - 2021 - vol. 146 - no. 14 - pp. 4436-4440.

6. Lennox K. A., Owczarzy R., Thomas D. M., Walder J. A., and Behlke M. A. Improved performance of anti-miRNA oligonucleotides using a novel non-nucleotide modifier // Mol. Ther. - Nucleic Acids - 2013 - vol. 2 -no. AUG - p. e117.

7. Majdi A., Mahmoudi J., Sadigh-Eteghad S., Golzari S. E. J., Sabermarouf B., and Reyhani-Rad S. Permissive role of cytosolic pH acidification in neurodegeneration: A closer look at its causes and consequences // J. Neurosci. Res. -2016 - vol. 94 - no. 10 - pp. 879-887.

8. Corbet C. and Feron O. Tumour acidosis: From the passenger to the driver's seat // Nat. Rev. Cancer - 2017 - vol. 17 - no. 10 - pp. 577-593.

9. Kosiol N., Juranek S., Brossart P., Heine A., and Paeschke K. G-quadruplexes: a promising target for cancer therapy // Mol. Cancer - 2021 -vol. 20 - no. 1 - pp. 1-18.

10. Wright E. P., Huppert J. L., and Waller Z. A. E. Identification of multiple genomic DNA sequences which form i-motif structures at neutral pH // Nucleic Acids Res. - 2017 - vol. 45 - no. 6 - pp. 2951-2959.

11. Mir B., Serrano I., Buitrago D., Orozco M., Escaja N., and González C. Prevalent Sequences in the Human Genome Can Form Mini i-Motif Structures at Physiological pH // J. Am. Chem. Soc. - 2017 - vol. 139 - no. 40 -pp. 13985-13988.

12. Lieblein A. L., Krämer M., Dreuw A., Fürtig B., and Schwalbe H. The nature of hydrogen bonds in cytidine- H +••• cytidine DNA base pairs // Angew. Chemie - Int. Ed. - 20212 - vol. 51 - no. 17 - pp. 4067-4070.

13. Wang A. H.-J. and Robinson H. I-Motif // Encycl. Mol. Biol. - 2002.

14. Berger I., Egli M., and Rich A. Inter-strand C-H—O hydrogen bonds stabilizing four-stranded intercalated molecules: Stereoelectronic effects of O4' in cytosine-rich DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1996 - vol. 93 - no. 22 -pp. 12116-12121.

15. Phan A. T. and Leroy Intramolecular J. L. I-motif structures of telomeric DNA // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2000 - vol. 17 - no. SUPPL. 1 - pp. 245-251.

16. Yang B. and Rodgers M. T. Base-pairing energies of proton-bound heterodimers of cytosine and modified cytosines: Implications for the stability of DNA i-motif conformations // J. Am. Chem. Soc. - 2014 - vol. 136 - no. 1 -pp. 282-290.

17. Dai J., Hatzakis E., Hurley L. H., and Yang D. I-motif structures formed in the human c-MYC promoter are highly dynamic-insights into sequence redundancy and I-motif stability // PLoS One - 2010 - vol. 5 - no. 7 - pp. 1-8.

18. Gurung S. P., Schwarz C., Hall J. P., Cardin C. J., and Brazier J. A. The importance of loop length on the stability of i-motif structures // Chem. Commun. -2015 - vol. 51 - no. 26 - pp. 5630-5632.

19. Brooks T. A., Kendrick S., and Hurley L. Making sense of G-quadruplex and i-motif functions in oncogene promoters // FEBS J. - 2010 -vol. 277 - no. 17 - pp. 3459-3469.

20. Mergny J. L., Lacroix L., Hélène C., Han X., and Leroy J. L. Intramolecular Folding of Pyrimidine Oligodeoxynucleotides into an i-DNA Motif // J. Am. Chem. Soc. - 1995 - vol. 117 - no. 35 - pp. 8887-8898.

21. Lieblein A. L., Fürtig B., and Schwalbe H. Optimizing the Kinetics and Thermodynamics of DNA i-Motif Folding // ChemBioChem - 2013 - vol. 14 - no. 10 -pp. 1226-1230.

22. Miglietta G., Cogoi S., Pedersen E. B., and Xodo L. E. GC-elements controlling HRAS transcription form i-motif structures unfolded by heterogeneous ribonucleoprotein particle A1 // Sci. Rep. - 2015 - vol. 5 - no. November -pp. 1 -13.

23. Niu K. et al. BmILF and i-motif structure are involved in transcriptional regulation of BmPOUM2 in Bombyx mori // Nucleic Acids Res. - 2018 - vol. 46 -no. 4 - pp. 1710-1723.

24. Fleming A. M. et al. 4n-1 Is a 'Sweet Spot' in DNA i-Motif Folding of 2'-Deoxycytidine Homopolymers // J. Am. Chem. Soc. - 2017 - vol. 139 -no. 13 - pp. 4682-4689.

25. Belmonte-Reche E. and Morales J. C. G4-iM Grinder: when size and frequency matter. G-Quadruplex, i-Motif and higher order structure search and analysis tool // NAR Genomics Bioinforma. - 2020 - vol. 2 - no. 1 - pp. 1-12.

26. Garavís M., Escaja N., Gabelica V., Villasante A., and González C. Centromeric Alpha-Satellite DNA Adopts Dimeric i-Motif Structures Capped by at Hoogsteen Base Pairs // Chem. - A Eur. J. -2015 - vol. 21 - no. 27 -pp. 9816-9824.

27. Escaja N., Viladoms J., Garavís M., Villasante A., Pedroso E., and González C. A minimal i-motif stabilized by minor groove G:T:G:T tetrads // Nucleic Acids Res. - 2012 - vol. 40 - no. 22 - pp. 11737-11747.

28. Phan A. T. and Mergny J. L. Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson-Crick double helix // Nucleic Acids Res. - 2002 - vol. 30 -no. 21 - pp. 4618-4625.

29. Dvoráková Z. et al. I-Motif of cytosine-rich human telomere DNA fragments containing natural base lesions // Nucleic Acids Res. - 2018 - vol. 46 -no. 4 - pp. 1624-1634.

30. Henikoff S., Thakur J., Kasinathan S., and Talbert P. B. Remarkable Evolutionary Plasticity of Centromeric Chromatin // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. - 2017 - vol. 82 - pp. 71-82.

31. Dzatko S. et al. Evaluation of the Stability of DNA i-Motifs in the Nuclei of Living Mammalian Cells // Angew. Chemie - Int. Ed. - 2018 - vol. 57 - no. 8 -pp. 2165-2169.

32. Biffi G., Tannahill D., McCafferty J., and Balasubramanian S. Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells // Nat. Chem. - 2013 -vol. 5 - no. 3 - pp. 182-186.

33. King J. J. et al. DNA G-Quadruplex and i-Motif Structure Formation Is Interdependent in Human Cells // J. Am. Chem. Soc., vol. 142 - no. 49 -pp. 20600-20604.

34. Biffi G., Antonio M. Di, Tannahill D., and Balasubramanian S. Visualization and selective chemical targeting of RNA G-quadruplex structures in the cytoplasm of human cells // Nat. Chem. - 2014 - vol. 6 - no. 1 - pp. 75-80.

35. Takahashi S., Brazier J. A., and Sugimoto N. Topological impact of noncanonical DNA structures on Klenow fragment of DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -2017 - vol. 114 - no. 36 - pp. 9605-9610.

36. Bar-Am O., Weinreb O., Amit T., and Youdim M. B. H. Regulation of Bcl-2 family proteins, neurotrophic factors, and APP processing in the neurorescue activity of propargylamine // FASEB J. - 2005 - vol. 19 - no. 13 - pp. 1899-1901.

37. Kendrick S., Akiyama Y., Hecht S. M., and Hurley L. H. The i-Motif in the bcl-2 P1 Promoter Forms an Unexpectedly Stable Structure with a Unique 8:5:7 Loop Folding Pattern // J. Am. Chem. Soc. - 2009 - vol. 131 - no. 48 -pp. 17667-17676.

38. Kang H., Kendrick S., Hecht S. M., and Hurley L. H. The Dynamic Character of the BCL2 Promoter i-Motif Provides a Mechanism for Modulation of Gene Expression by Compounds That Bind Selectively to the Alternative DNA Hairpin Structure // J. Am. Chem. Soc. - 2014 - vol. 136 - pp. 4161-4171.

39. Kang H.-J, Kendrick S., Hecht S. M., and Hurley L. H. The Transcriptional Complex Between the BCL2 i-Motif and hnRNP LL Is a Molecular Switch for Control of Gene Expression That Can Be Modulated by Small Molecules // J. Am. Chem. Soc. - 2014 - vol. 136 - pp. 4172-4185.

40. Kaulage M. H., Bhattacharya S., and Muniyappa K. Structural Characterization of i-Motif Structure in the Human Acetyl-CoA Carboxylase 1 Gene Promoters and Their Role in the Regulation of Gene Expression // ChemBioChem -2018 - vol. 19 - no. 10 - pp. 1078-1087.

41. Banerjee R. et al. TRIP13 promotes error-prone nonhomologous end joining and induces chemoresistance in head and neck cancer // Nat. Commun. - 2014 -vol. 5 - no. 1 - article number 4527.

42. Sutherland C., Cui Y., Mao H., and Hurley L. H. A Mechanosensor Mechanism Controls the G-Quadruplex/i-Motif Molecular Switch in the MYC Promoter NHE III1 // J. Am. Chem. Soc. - 2016 - vol. 138 - no. 42 -pp. 14138-14151.

43. Brown R. V. et al. The Consequences of Overlapping G-Quadruplexes and i-Motifs in the Platelet-Derived Growth Factor Receptor p Core Promoter Nuclease

Hypersensitive Element Can Explain the Unexpected Effects of Mutations and Provide Opportunities for Selective Targeting of // J. Am. Chem. Soc. - 2017 - vol. 139 -no. 22 - pp. 7456-7475.

44. Kaiser C. E., Van Ert N. A., Agrawal P., Chawla R., Yang D., and Hurley L. H. Insight into the Complexity of the i-Motif and G-Quadruplex DNA Structures Formed in the KRAS Promoter and Subsequent Drug-Induced Gene Repression // J. Am. Chem. Soc. - 2017 - vol. 139 - no. 25 - pp. 8522-8536.

45. Martino L., Pagano B., Fotticchia I., Neidle S., and Giancola C. Shedding light on the interaction between TMPyP4 and human telomeric quadruplexes // J. Phys. Chem. B - 2009 - vol. 113 - no. 44 - pp. 14779-14786.

46. Alberti P. et al. Interaction of an acridine dimer with dna quadruplex structures // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2001 - vol. 19 - no. 3 - pp. 505-513.

47. Day H. A., Pavlou P., and Waller Z. A. E. I-Motif DNA: Structure, stability and targeting with ligands // Bioorganic Med. Chem. - 2014 - vol. 22 - no. 16 -pp. 4407-4418.

48. Xu H., Zhang H., and Qu X. Interactions of the human telomeric DNA with terbium-amino acid complexes // J. Inorg. Biochem. - 2006 - vol. 100 -no. 10 - pp. 1646-1652.

49. Shi S. et al. Interaction of [Ru(bpy)2(dppz)]2+ with human telomeric DNA: Preferential binding to G-quadruplexes over i-motif // Biochimie - 2010 -vol. 92 - no. 4 - pp. 370-377.

50. Shu B. et al. Syntheses and evaluation of new acridone derivatives for selective binding of oncogene c-Myc promoter i-motifs in gene transcriptional regulation // Chem. Commun. - 2018 - vol. 54 - no. 16 - pp. 2036-2039.

51. Li X., Peng Y., Ren J., and Qu X. Carboxyl-modified single-walled carbon nanotubes selectively induce human telomeric i-motif formation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2006 - vol. 103 - no. 52 - pp. 19658-19663.

52. Chen Y. et al. Insights into the biomedical effects of carboxylated singlewall carbon nanotubes on telomerase and telomeres // Nat. Commun. -2012 - vol. 3 - article number 1074.

53. Tikhomirov A. S. et al. Water-Soluble Heliomycin Derivatives to Target i-Motif DNA // J. Nat. Prod. - 2021 - vol. 84 - no. 5 - pp. 1617-1625.

54. De Rache A. and Mergny J. L. Assessment of selectivity of G-quadruplex ligands via an optimised FRET melting assay // Biochimie - 2015 -vol. 115 - no. June - pp. 194-202.

55. Luo Y., Granzhan A., Verga D., and Mergny J. L. FRET-MC: A fluorescence melting competition assay for studying G4 structures in vitro // Biopolymers - 2021 - vol. 112 - no. 4. - e23415.

56. Pagano A. et al. Common G-quadruplex binding agents found to interact with i-motif-forming DNA: Unexpected multi-target-directed compounds // Front. Chem. - 2018 - vol. 6 - no. July - pp. 1-13.

57. Kypr J., Kejnovska I., Renciuk D., and Vorlickova M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA // Nucleic Acids Res. -2009 - vol. 37 - no. 6 - pp. 1713-1725.

58. Cheng M., Chen J., Ju H., Zhou J., and Mergny J. L. Drivers of i-DNA Formation in a Variety of Environments Revealed by Four-Dimensional UV Melting and Annealing // J. Am. Chem. Soc. - 2021 - vol. 143 - no. 20 -pp. 7792-7807.

59. Sheng Q., Neaverson J. C., Mahmoud T., Stevenson C. E. M., Matthews S. E., and Waller Z. A. E. Identification of new DNA i-motif binding ligands through a fluorescent intercalator displacement assay // Org. Biomol. Chem. - 2017 -vol. 15 - no. 27 - pp. 5669-5673.

60. Tse W. C. and Boger D. L. A Fluorescent Intercalator Displacement Assay for Establishing DNA Binding Selectivity and Affinity // Acc. Chem. Res. - 2004 -vol. 37 - no. 1 - pp. 61-69.

61. Monchaud D., Allain C., and Teulade-Fichou M. P. Development of a fluorescent intercalator displacement assay (G4-FID) for establishing quadruplex-DNA affinity and selectivity of putative ligands // Bioorganic Med. Chem. Lett. - 2006 - vol. 16 - no. 18 - pp. 4842-4845.

62. Tran P. L. T., Largy E., Hamon F., Teulade-Fichou M. P., and Mergny J. L. Fluorescence intercalator displacement assay for screening G4 ligands towards a variety of G-quadruplex structures // Biochimie - 2011 -vol. 93 - no. 8 - pp. 1288-1296.

63. Shin D., Sinkeldam R. W., and Tor Y. Emissive RNA alphabet // J. Am. Chem. Soc. - 2011 - vol. 133 - no. 38 - pp. 14912-14915.

64. Schmidt O. P., Mata G., and Luedtke N. W. Fluorescent Base Analogue Reveals T-HgII-T Base Pairs Have High Kinetic Stabilities That Perturb DNA Metabolism // J. Am. Chem. Soc. - 2016 - vol. 138 - no. 44 -pp. 14733-14739.

65. Lin K. Y. and Matteucci M. D. A cytosine analogue capable of clamp-like binding to a guanine in helical nucleic acids // J. Am. Chem. Soc. - 1998 - vol. 120 -no. 33 - pp. 8531-8532.

66. Tsvetkov V. B. et al. I-Clamp phenoxazine for the fine tuning of DNA i-motif stability // Nucleic Acids Res. - 2018 - vol. 46 - no. 6 - pp. 2751-2764.

67. Yatsunyk L. A., Mendoza O., and Mergny J. L. 'Nano-oddities': Unusual nucleic acid assemblies for DNA-based nanostructures and nanodevices // Acc. Chem. Res. - 2014 - vol. 47 - no. 6 - pp. 1836-1844.

68. Alba J. J., Sadurni A., and Gargallo R. Nucleic Acid i-Motif Structures in Analytical Chemistry // Crit. Rev. Anal. Chem. - 2016 - vol. 46 - no. 5 - pp. 443-454.

69. Dembska A. The analytical and biomedical potential of cytosine-rich oligonucleotides: A review // Anal. Chim. Acta - 2016 - vol. 930 - pp. 1-12.

70. Dembska A., Bielecka P., and Juskowiak B. PH-Sensing fluorescence oligonucleotide probes based on an i-motif scaffold: A review // Anal. Methods -2017 - vol. 9 - no. 43 - pp. 6092-6106.

71. Cheng E. et al. A pH-triggered, fast-responding DNA hydrogel // Angew. Chemie - Int. Ed. - 2009 - vol. 48 - no. 41 - pp. 7660-7663.

72. Liao W. C. et al. PH-and ligand-induced release of loads from DNA-acrylamide hydrogel microcapsules // Chem. Sci. - 2017 - vol. 8 - no. 5 -pp. 3362-3373.

73. Shi L., Peng P., Du Y., and Li T. Programmable i-motif DNA folding topology for a pH-switched reversible molecular sensing device // Nucleic Acids Res. -2017 - vol. 45 - no. 8 - pp. 4306-4314.

74. Wang J. et al. Oscillatory Reaction Induced Periodic C-Quadruplex DNA Gating of Artificial Ion Channels // ACS Nano - 2017 - vol. 11 - no. 3 -pp. 3022-3029.

75. Heinen L. and Walther A. Temporal control of i-motif switch lifetimes for autonomous operation of transient DNA nanostructures // Chem. Sci. - 2017 - vol. 8 -no. 5 - pp. 4100-4107.

76. Modi S., Swetha M. G., Goswami D., Gupta G. D., Mayor S., and Krishnan Y. A DNA nanomachine that maps spatial and temporal pH changes inside living cells // Nat. Nanotechnol. - 2009 - vol. 4 - no. 5 - pp. 325-330.

77. Surana S., Bhat J. M., Koushika S. P., and Krishnan Y. An autonomous DNA nanomachine maps spatiotemporal pH changes in a multicellular living organism // Nat. Commun. - 2011 - vol. 2 - no. 1 - pp. 340-347.

78. Modi S., Nizak C., Surana S., Halder S., and Krishnan Y. Two DNA nanomachines map pH changes along intersecting endocytic pathways inside the same cell // Nat. Nanotechnol. - 2013 - vol. 8 - no. 6 - pp. 459-467.

79. Damaghi M., Wojtkowiak J. W., and Gillies R. J. pH sensing and regulation in cancer // Front. Physiol. - 2013 - vol. 4 DEC - no. December -pp. 1-11.

80. Ma W. et al. Hairpin-Contained i-Motif Based Fluorescent Ratiometric Probe for High-Resolution and Sensitive Response of Small pH Variations // Anal. Chem. - 2018 - vol. 90 - no. 3 - pp. 1889-1896.

81. Pasternak A. and Wengel J. Modulation of i-motif thermodynamic stability by the introduction of UNA (unlocked nucleic acid) monomers // Bioorganic Med. Chem. Lett. - 2011 - vol. 21 - no. 2 - pp. 752-755.

82. Assi H. A. et al. Stabilization of i-motif structures by 2'-ß-fluorination of DNA // Nucleic Acids Res. - 2016 - vol. 44 - no. 11 - pp. 4998-5009.

83. Devaux A., Bonnat L., Lavergne T., and Defrancq E. Access to a stabilized: I -motif DNA structure through four successive ligation reactions on a cyclopeptide scaffold // Org. Biomol. Chem. - 2020 - vol. 18 - no. 32 -pp. 6394-6406.

84. Wright E. P., Huppert J. L., and Waller Z. A. E. Erratum: Identification of multiple genomic DNA sequences which form i-motif structures at neutral pH // Nucleic Acids Res. - 2017 - vol. 45 - no. 22 - pp. 13095-13096.

85. Turaev A. V. et al. Genomic DNA i-motifs as fast sensors responsive to near-physiological pH microchanges // Biosens. Bioelectron. - 2021 - vol. 175 - no. November, p. 112864.

86. Anemone A., Consolino L., Arena F., Capozza M., and Longo D. L. Imaging tumor acidosis: a survey of the available techniques for mapping in vivo tumor pH // Cancer Metastasis Rev. - 2019 - vol. 38 - no. 1-2 - pp. 25-49.

87. Chu X.-P. and Xiong Z.-G. Physiological and Pathological Functions of Acid-Sensing Ion Channels in the Central Nervous System // Curr. Drug Targets - 2012 - vol. 13 - no. 2 - pp. 263-271.

88. Gonçalves P. P., Meireles S. M., Neves P., and Vale M. G. P. Synaptic vesicle Ca2+/H+ antiport: Dependence on the proton electrochemical gradient // Mol. Brain Res. - 1999 - vol. 71 - no. 2 - pp. 178-184.

89. Dunant Y., Cordeiro J. M., and Gonçalves P. P. Exocytosis, mediatophore, and vesicular Ca2+/H+ antiport in rapid neurotransmission // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2009 - vol. 1152 - pp. 100-112.

90. Ruusuvuori E. and Kaila K. Carbonic anhydrases and brain pH in the control of neuronal excitability // Subcell. Biochem. - 2014 - vol. 75 - pp. 271-1290.

91. Young A. M. H., Campbell E., Lynch S., Suckling J., and Powis S. J. Aberrant NF-kappaB expression in autism spectrum condition: A mechanism for neuroinflammation // Front. Psychiatry - 2011 - vol. 2 - no. MAY - pp. 1-8.

92. Guillozet-Bongaarts A. L. et al. Altered gene expression in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals with schizophrenia // Mol. Psychiatry - 2014 - vol. 19 -no. 4 - pp. 478-485.

93. Cegielski V., Chakrabarty R., Ding S., Wacker M. J., Monaghan-Nichols P., and Chu X. P. Acid-Sensing Ion Channels in Glial Cells // Membranes (Basel) - 2022 - vol. 12 - no. 2 - p. 119.

94. Hagihara H. et al. Decreased Brain pH as a Shared Endophenotype of Psychiatric Disorders // Neuropsychopharmacology - 2018 - vol. 43 - no. 3 -pp. 459-468.

95. Husson Z. and Smith E. S. J. Naked mole-rat cortical neurons are resistant to acid-induced cell death // Mol. Brain - 2018 - vol. 11 - no. 1 - pp. 1-10.

96. Ullman J. C. et al. A mouse model of autism implicates endosome pH in the regulation of presynaptic calcium entry // Nat. Commun. - 2018 - vol. 9 - no. 1 -p. 330.

97. Sinning A. and Hubner C. A. Minireview: PH and synaptic transmission // FEBS Lett. - 2013 - vol. 587 - no. 13 - pp. 1923-1928.

98. Ruffin V. A., Salameh A. I., Boron W. F., and Parker M. D. Intracellular pH regulation by acid-base transporters in mammalian neurons // Front. Physiol. -2014 - vol. 5 FEB - no. February - pp. 1-12.

99. Chiacchiaretta A. M., Latifi S., Bramini M., Fadda M., Fassio A., Benfenati F., and Cesca F. Neuronal hyperactivity causes Na+/H+ exchanger-induced extracellular acidification at active synapses // J. Cell Sci. - 2017 - vol. 130 - no. 8 -pp. 1435-1449.

100. Martynov V. I., Pakhomov A. A., Deyev I. E., and Petrenko A. G. Genetically encoded fluorescent indicators for live cell pH imaging // Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 2018 - vol. 1862 - no. 12 - pp. 2924-2939.

101. Hoyer S. Abnormalities of glucose metabolism in Alzheimer's disease // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1991 - vol. 640 - no. 1948 - pp. 53-58.

102. Wright E. P. et al. Mitoxantrone and analogues bind and stabilize i-motif forming DNA sequences // Sci. Rep. - 2016 - vol. 6 - pp. 4-10.

103. Cui J., Waltman P., Le V. H., and Lewis E. A. The effect of molecular crowding on the stability of human c-MYC promoter sequence I-motif at neutral pH // Molecules - 2013 - vol. 18 - no. 10 - pp. 12751-12767.

104. Doose S., Neuweiler H., and Sauer M. Fluorescence quenching by photoinduced electron transfer: A reporter for conformational dynamics of macromolecules // ChemPhysChem - 2009 - vol. 10 - no. 9-10 - pp. 1389-1398.

105. Lieblein A. L., Buck J., Schlepckow K., Fürtig B., and Schwalbe H. Time-resolved NMR spectroscopic studies of DNA i-motif folding reveal kinetic partitioning // Angew. Chemie - Int. Ed. - 2012 - vol. 51 - no. 1 - pp. 250-253.

106. Reiff D. F. et al. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies // J. Neurosci. - 2005 - vol. 25 - no. 19 - pp. 4766-47785.

107. Casey J. R., Grinstein S., and Orlowski J. Sensors and regulators of intracellular pH // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2010 - vol. 11 - no. 1 - pp. 50-61.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает огромную признательность принимавшим участие в работе сотрудникам ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России, МФТИ, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова. В частности, автор благодарит за помощь с экспериментом и плодотворные дискуссии А.С. Шторк, М.М. Лукину, А.В. Аралова, Ю.М. Ходаровича, А.В. Феофанова, А.М. Мойсенович, А.Н. Богомазому и М.А. Лагарькову.