Идентификация клинически значимых грибов и диагностика инвазивной грибковой инфекции методом газовой хроматографии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Поздоровкина, Вера Витальевна

• Поздоровкина, Вера Витальевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Поздоровкина, Вера Витальевна

Оглавление

СТР

Введение

Глава 1. Обзор литературы. Современные методы

идентификации и диагностики грибковой инфекции -

проблемы и перспективы

Глава 2. Материалы и методы

2.1.Описание биологического материала

2.2.Подготовка образцов для хроматографического

и масс - спектрометрического анализов

2.3.Условия хроматографического и

масс-спектрометрического анализа

ГлаваЗ. Идентификация различных микроскопических грибов по химическому составу клеточной биомассы

3.1.Изучение жирнокислотного состава биомассы клеток микроорганизмов рода Candida и некоторых других грибов

3.2.Изучение состава моносахаров биомассы грибов

Candida и некоторых других клинически значимых грибов

3.3.Видовая идентификация грибов рода Candida по составу клеточных моносахаров и жирных кислот с использованием персонального компьютера

Глава 4. Химический состав продуктов метаболизма представителей различных родов грибов в опытах in vitro

4.1.Изучение состава свободных Сахаров культуральных

сред после роста грибов рода Candida и некоторых других грибов

4.2.Изучение состава летучих и нелетучих кислот, спиртов и аминов - продуктов жизнедеятельности грибов рода Candida и других.

Глава 5. Экспресс - диагностика инвазивной

грибковой инфекции по метаболитам - маркерам грибов

5.1.Газохроматографическая экспресс-диагностика

кандидоза и мониторинг эффективности проводимой терапии

5.2.Количественное определение маннитола в сыворотке крови и ликворе с целью диагностики инвазивного аспергиллеза

3 аключ ение

Выводы. 10

Приложения

Методические рекомендации

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация клинически значимых грибов и диагностика инвазивной грибковой инфекции методом газовой хроматографии»

Введение.

Актуальность темы исследования.

Как показывают отечественные и зарубежные исследования, в последние годы резко возросло количество микозов, вызванных условно-патогенными грибами у больных с ослабленным иммунитетом, в связи с применением широкого спектра антибиотиков, цитостатиков и глюкокортикостероидов (Романюк Ф.П., 1996; Антонов В.Б., 1995/ Степанова Ж.В., 1990; Brown А.Е. 1990) . Все они снижают иммунитет и этим способствуют активизации условно-патогенной флоры, к которой относятся микроскопические грибы.

Среди прочих возбудителей микозов ведущее место занимают грибы рода Candida, вызывающие различные формы кандидоза, в том числе висцеральные и системные (Самсыгина Г.А.,1996). Частота гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных грибами рода Candida, особенно Candida albicans достигает 15% в общей этиологической структере гнойно-воспалительных болезней (Пронина Е.В. 1996). При присоединении кандида-инфекции при любом соматическом заболевании наблюдается значительное ухудшение общего состояния больного, нередко развивается сепсис, протекающий с высокой степенью летальности (Tang С.М., 1992). Причем в 40-60% случаев кандидоз остается нераспознанным или поздно

диагностированным, и это значительно усугубляет его прогноз (Самсыгина Г.А.,1996).

Своевременная идентификация и диагностика возбудителя, и как следстие - правильно начатое лечение, с одной стороны может существенно снизить указанную летальность, с другой -предотвратить часто неоправданное назначение высоко токсичных и дорогих препаратов, таких, как амфотерИцин В, при эмпирической терапии.

На современном этапе для идентификации и диагностики грибковой инфекции используются микробиологические, биохимические и серологические тесты. К сожалению, ни один из существующих методов не является универсальным, в высокой степени чувствительным и специфичным для диагностики инвазивных микозов (Matthews R.S., 1993).

Посев крови до сих пор остается основным методом лабораторной диагностики кандидоза, но во многих случах нерезультативен. В зависимости от очага поражения и стадии заболевания частота выделения грибов из гемокультуры больных с инвазивными кандидозами колеблется около 50% (Berenguer J.M., 1993; Telenti А. 1989) . Кроме того, идентификация возбудителя в зависимости от вида занимает до 10 суток. Серологические методы имеют недостаточную чувствительность и специфичность, так как у больных с нейтропенией понижен уровень антител (Кубась В.Г.,1992).

Это определило необходимость разработки и развития дополнительного хроматографического метода для идентификации и диагностики грибковой инфекции. Метод газовой хроматографии (ГХ) был выбран из-за его высокой чувствительности, воспроизводимости, экспрессности и относительно невысокой стоимости анализа. Скорость, избирательность и

чувствительность ГХ метода делают его очень полезным в клинической микологии. Возможности получения уникальных данных значительно расширяются при использовании газовой хроматографии в комбинации с такими методами, как масс спектрометрия.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является:

1. Родовая идентификация основных клинически значимых грибов и видовая идентификация грибов рода Candida методом газовой хроматографии;

2. поиск специфических метаболитов этих микроорганизмов с целью экспресс-диагностики инвазивной грибковой инфекции.

Исходя из поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1) разработать (или адаптировать) методики пробоподготовки биоматериала и оптимизировать параметры ГХ анализа;

2) изучить жирнокислотный и углеводный состав биомассы клеток медицински значимых грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Pénicillium, а также Micromonospora, Actinomyces, Nocardia;

3) оценить возможность использования различий в химическом составе вышеперечисленных грибов для их таксономии и идентификации и создать алгоритм идентификации;

4) изучить химический состав метаболитов грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Pénicillium и Micromonospora, Actinomyces, Nocardia,;

5) изучить изменения химического состава биологических жидкостей при грибковых инфекциях и оценить диагностическое значение уровня метаболитов в крови и ликворе детей для экспресс-диагностики инвазивных грибковых инфекций;

6) разработать методические рекомендации по экспресс-диагностике инвазивных грибковых инфекций.

Научная новизна работы.

Определен количественный состав моносахаров и жирных кислот биомассы микроорганизмов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Pénicillium, Micromonospora, Actinomyces, Nocardia и показана возможность родовой идентификации по составу жирных кислот клеточной биомассы грибов. Осуществлена видовая идентификация грибов рода Candida по совместному жирнокислотному и моносахаридному составу с применением компьютерной обработки данных.

Изучен качественный состав метаболитов грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Pénicillium и Micromonospora, Actinomyces, Nocardia, выявлен спектр их диагностически значимых метаболитов. Показана возможность диагностики грибковой инфекции на ранних стадиях заболевания.

Практическая значимость.

Разработан и внедрен в практику адаптированный к условиям клинической лаборатории метод видовой идентификации чистых культур грибов рода Candida. Разработаны и внедрены в практическое здравоохранение методы экспресс-диагностики инвазивных грибковых инфекций на ранних этапах заболевания, а также газохроматографический мониторинг противогрибковой терапии, что позволило улучшить диагностику и лечение данной патологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Идентификация различных грибов на основании различия химического состава их биомассы в целях хемодифференциации с применением персонального

компьютера.

2. Экспресс-диагностика инвазивной грибковой инфекции по специфическим метаболитам грибов с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии.

Внедрение в практику полученных результатов было осуществлено в 1994г. в отделениях хирургии, терапии, реанимации и интенсивной терапии Детской городской клинической больницы N13 им.Н.Ф.Филатова, на кафедре детской хирургии и ортопедии Российского государственного медицинского университета, а также в клиниках гематологии/онкологии и иммунологии НИИ Детской гематологии Минздравмедпрома РФ. Изданы методические рекомендации, утвержденные Минздравом РФ "Диагностика грибковой инфекции методом газо-жидкостной хроматографии"Ы96/131 (1997).

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 8 международных симпозиумах и конференциях, а именно: •б-й Международный конгресс по инфекционным болезням, Прага, 1994 .

•7-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным болезням, Вена, 1995.

•3-е Совещание европейского химиотерапевтического общества по инфекционным заболеваниям, Париж, 1995г.

•Международный микологический симпозиум "Патогенез,

диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии", С.Петербург, 199 6г.;

•Международная конференция "Человек и лекарство", Москва, 1996г. ;

•4-е Совещание европейского химиотерапевтического общества по инфекционным заболеваниям, Афины, 1996г.;

•Ъ-е Совещание европейского химиотерапевтического общества по инфекционным заболеваниям, С.-Петербург, 1997г.: •2 0 Международный конгресс по химиотерапии и инфекционным болезням, Сидней, Австралия, 1997г.;

а также на научно-клинических конференциях академической группы акадкмика АМН РФ, профессора Ю.Ф.Исакова и Детской городской клинической больницы N13 им.H.Ф.Филатова.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 14 работ, в том числе 5 статей в центральных журналах:

1. Идентификация грибов по клеточным моносахарам методом газожидкостной хроматографии, Поздоровкина В.В., Демина A.M., Рогатина E.JI., Радюшина Т.В, Минаев В.А., Белобородова Н.В., Курчавов В.А., Антибиотики и химиотерапия, 1994, т.39, с.17-21.

2. Анализ высших жирных кислот грибов рода Candida методом газовой хроматографии, Поздоровкина В.В., Демина A.M., Белобородова Н.В., Курчавов В.А., Рогатина E.JI., Минаев В.А., Антибиотики и химиотерапия, 1994, т.39, с.13-17.

3. Determination of volatile fatty acids - metabolites anaerobes in the urine with the purpose of diagnostic of appendicitis in paediatrics, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V. , Kucherov U.I., In: 6-th International Congress for Infectious Diseases, Prague, 1994, p.117.

4. Госпитальная инфекция и стратегия антибиотикотерапии в детской хирургической клинике, Поздоровкина В. В., Белобородова Н.В., В сб. тез. 8-го Всероссийского Съезда хирургов, 1995, Краснодар, с.437-438.

5. Determination of anaerobic bacteria involved in perinatal pneumonia in neonates with prolonged artificial ventilation by GC-method, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V., Koroleva O.V., In. 7 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Abstracts, Vienna, 1995, p.238.

6. Возможность использования газовой хроматографии для экспресс-диагностики осложнений у детей с нейтропенией, Поздоровкина В.В., Белобородова Н.В., Курчавов В.А., Рогатина E.JI., В сб. тез. 3 Международного микологического симпозиума, 1996, С.-Петербург, с.2.

7. Газо-хроматографическое определение этиологической роли анаэробов в развитии пневмонии у новорожденных высокого риска, находящихся на искуственной вентиляции легких, Поздоровкина В.В., Белобородова Н.В., Королева О.В., Российский вестник перинатологии и педиатрии, 1995, т.40, с.24-28 .

8. Possibility of using the GC-method in the study of invasive infection due to Candida species, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V., Kurchavov V.A., Rogatina E.L., Djemina

A.M., In: 3-nd Scientific Meeting of European society of Chemotherapy Inf. Dis., Paris, 1995, p.72.

9. Сравнительный анализ продуктов метаболизма Candida albicans и других клинически значимых грибов методом газовой хроматографии, Поздоровкина В.В., Демина A.M., Белобородова Н.В., Курчавов В.А., Рогатина Е.Л., Ходорковская В.А., Кульганек В.В., Титкова Н.Ф., Антибиотики и химиотерапия,

1996, т.41, с.39-46.

10. New approaches in diagnosing of fungal meningitis in children, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V., Kurchavov V.A., In:3-nd Scientific Meeting of European society of Chemotherapy Inf. Dis., Athenes, 1996, p.38.

11. Identification of Candida species according to their cellular carbohydrates and fatty acids composition by GC-method, Pozdorovkina V.V., Djemina A.M., In: 20-th International congress of chemotherapy, Sydney,Australia,

1997,p.86.

12. Газохроматографическая экспресс-диагностика кандидоза и мониторинг эффективности противогрибковой терапии по уровню арабинитола и маннозы у детей, Поздоровкина В.В., Белобородова Н.В., Курчавов В.А., Бойко Н.Б., Рогатина Е.Л.,Демина A.M., Антибиотики и химиотерапия (в печати).

13. Диагностика грибковой инфекции у детей методом газожидкостной хроматографии, Методические рекомендации

N 96/131, Поздоровкина В.В., Белобородова Н.В., Курчавов

B.А., Бойко Н.Б., Рогатина Е.Л., Демина A.M. и другие, 1997, 20с.

14. Диагностика анаэробной инфекции у детей методом хроматографии, Методические рекомендации N 96/130, Поздоровкина В.В., Белобородова Н.В., Курчавов В. А., Бойко Н.Б., Рогатина Е.Л., Демина A.M. и другие, 1997, 20с.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана на

русском языке, на 159 страницах машинописи, состоит из

введения, 5 глав, заключения, выводов, методических рекомендаций, приложений и указателя литературы. Библиография

включает 185 источников, в том числе 23 работы отечественных

авторов и 162 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 2 8 таблицами и 9 рисунками.

Глава 1. Обзор литературы.

Современные методы идентификации и диагностики грибковой инфекции - проблемы и перспективы.

Наиболее распространенными возбудителями инвазивных микозов являются Candida spp, Aspergillus spp и Cryptococcus neoformans. Большинство грибковых заболеваний вызываются Candida albicans и другими видами Candida: С.tropicalis, С.parapsilosis, C.glabrata, С.pseudotropicalis и C.krusei (Пронина E.B.,1996; Реброва,1989; Stein D.K.,1990). Наряду с перечисленными, в последнее десятилетие патогенными становятся ранее неизвестные или редко встречающиеся в качестве возбудителей виды Candida, такие как С.lusitaniae, С.lipolytica, С.zeylanoides, С.norvegensis, C.foci и C.pelliculosa (Yamaguchi К., 1993; Dupont В., 1994). Кандидоз часто развивается на фоне основного заболевания и не имеет выраженных клинических признаков. Причиной возникновения кандидоза может явиться иммуносупрессивная терапия, лечение кортикостероидами, радиационные поражения, бесконтрольное применение широкоспектральных антибиотиков, злокачественные образования. Ранняя диагностика и правильно выбранная антифунгальная терапия может значительно повлиять на результат лечения. Зависимость антибиотикочувствительности штаммов от вида гриба, отмеченная рядом авторов, указывает на необходимость быстрой идентификации выделенных грибковых культур (Kerridge D., 1987; Nerrson D., 1987). Это особенно актуально для вышеперечисленных групп больных с повышенным риском развития висцерального кандидоза.

Современные методы идентификации микроорганизмов.

В настоящее время для идентификации возбудителя самым распространенным является метод прямого микроскопического исследования материала, а также культивирование и идентификация гриба по морфологическим и биохимическим признакам (Пронина Е.В., 1995). Морфологические и биохимические признаки, долгое время служившие основными таксономическими критериями грибов, могут быть не одинаковыми для всех штаммов внутри вида, что обусловливает формирование атипичных штаммов. Очевидной была необходимость поиска новых методов идентификации. Благодаря развитию физико-химических методов исследования и успехам молекулярной биологии возникло новое направление, основанное на использовании химического состава клеточных компонентов. Появилась возможность прежде всего характеризовать геном грибов, используя данные изучения нуклеотидного состава ДНК (Stork R.,1970). В качестве одного из главных специфических признаков вида рассматривали отношение нуклеиновых оснований. Штаммы, относящиеся к одному виду, различаются по этому признаку незначительно, различия внутри рода более выражены. Молярное содержание Г+Ц оснований в ДНК колеблется в значительных пределах - от 25 до 75% (Блохина, 1976). Различия между микроорганизмами по нуклеотидному составу ДНК обосновывает отнесение их к различным таксонам, но идентичность по этому признаку может быть принята во внимание лишь при корреляции со сходством по другим критериям.

Степень сходства геномов микроорганизмов оценивается по данным гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-рРНК, применяемых для исследования близкородственных организмов. На основании результатов многочисленных исследований для штаммов одного вида предложен уровень гомологии ДНК, превышающий 60-70%(Johnson,1984; Brenner,1984). Этот метод применяется в

настоящее время при описании новых видов микроорганизмов в целях их систематики(Brenner D.J.,1991; Thacker W.L.,1992). Lori L. с соавторами (1988) предложили данный метод для диагностики кандидоза, вызванного Candida albicans. Метод специфичен на родовом уровне при концентрации не менее 500 клеток в 1мл крови больного(Holmes A.R.,1992).

При наличии многочисленных различий в последовательности оснований двух геномов специфическая реассоциация ДНК-ДНК выражена слабо и не определяется. В этих случаях возможность установить генетическую гомологию дает изучение реассоциации ДНК-рРНК, так как на относительно небольшом участке генома, кодирующем рибосомную РНК, исходная последовательность оснований сохраняется полнее, чем в основной массе хромосомной ДНК. Этот метод используется часто для подтверждения филогенетической позиции неизвестных штаммов (Butler W.R.,1993; Daly J.S.,1993; Holmes В.,1993). Например, на основании 16sPHK последовательности, анализа отношений оснований ДНК и ряда других анализов группа клинических штаммов была отнесена к новому виду, названому Bordetella holmesii sp. nov. (Weyant R.S.,1995).

Обнаружение эндонуклеаз рестрикции II класса, ставших незаменимыми ферментами в генно-инженерных работах, дало еще одну возможность изучения генома с таксономической целью Lachance (1985) .

Многие фенотипически подобные грибы были классифицированы серологическими методами, характеристикой структуры антигена и определения маннана методом ядерно-магнитного резонанса (Shinoda Т.,1981; Tsuchiya Т., 1974; Gorin P.A., 1970).

Примеры некоторых методов, используемых в современной микробиологии, как в клинических лабораториях, так и в научных исследованиях приведены в Таблице 1.1.

Метод Используемая Область Основные

технология применения комментарии

Микро- Просмотр натив Основной метод Клетка должна

скопия ного материала при гистологи- быть не

и окраска по ческих исследо- поврежденной

Граму ваниях биоптатов

Культи- Высев на Основной метод в Используется

вирование твердые или клиническои для оценки

жидкие среды микробиологии чувствительности анти-фунгальных препаратов

Биохими- Реакции Основной

ческий ферментации и ассимиляции таксономический критерий

Определение ДНК-ДНК и Широко Используется в

нуклеиновых ДНК-РНК используется для основном в

кислот гибридизация подтверждения научных

Реакция идентификации исследованиях.

полимеризации неизвестных Высокая чувст-

цепи штаммов вительность

Хемотаксономические признаки, характеризующие

микроорганизм, разнообразны. Составляющие бактериальных и грибковых микроорганизмов можно разделить на 4 основных класса: нуклеиновые кислоты, протеины, полисахариды и липиды. Нуклеиновые кислоты комбинируются из 5 оснований, протеины -из 20 аминокислот, немногим более десяти Сахаров входят в состав полисахаридов, в то время как известно более 300 жирных кислот (БаБзег,1990). Поэтому наиболее информативными компонентами клетки для хемотаксономии являются жирные кислоты и моносахара. Клеточная стенка грибов имеет сложную многослойную структуру, главные компоненты которой полисахариды составляют 80-90% (Кубась, 1990) . В их состав входят глюкоза, Б-глюкозамин, ксилоза, Б-манноза (свойственная дрожжам) и другие моносахара. Полисахариды клеточной стенки могут образовывать с белковыми и жировыми веществами растворимые и нерастворимые комплексы. У дрожжевых грибов - это маннаны (31%) и глюканы (29%), у дерматофитов -

гетерополисахариды (Лещенко,1987). В состав дрожжевой клеточной стенки входят также белки (13%), липиды (8-9%), D-глюкозамин(1-3%), который входит в состав хитина (Феофилова Е.П.,1983).

Состав химических компонентов клеток определяют, используя реакцию пиролиза или гидролиза. Использовать пиролиз микроорганизмов для таксономической дифференциации впервые предложил Оуаша (1963) и E.Reiner (1965) . Ряд авторов продемонстрировали возможности пиролитической газожидкостной хроматографии (ПГЖХ) для анализа макромолекул биологического происхождения для их дифференциации (Aries,1986;

Voorhees,1988; Magee,1989; Freeman,1991). Vincent (1978) сообщил об исследованиях по дифференциации видов и штаммов нескольких членов группы Aspergillus flavus с применением пиролитической ГЖХ, авторы (Sisson P.R. 1991,1992) применили ее для дифференциации микобактерий, однако возможности применения этого метода ограничены из-за недостаточной стандартизации и неудовлетворительной межлабораторной воспроизводимости результатов.

Использование жирнокислотного состава клетки для идентификации бактерий.

Abel с соавторами (1963) и Yamakawa (1964) предложили анализировать состав химических компонентов микроорганизмов с использованием гидролиза и экстракции. Они применили газовую хроматографию для анализа липидов с целью классификации бактерий ряда семейств: Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Micrococcaceae, Enterobacteriaceae, основанной на их химическом составе.

При изучении химического состава бактериальных клеток было выяснено, что наиболее специфичными и информативными являются жирные кислоты, вследствие чего

газохроматографический анализ жирнокислотного состава

успешно применяется для хемодифференциации множества микроорганизмов (Moss,1980,1982; Jantzen, 1984,1985; Asselineau,1984; Васюренко, 1986,1992; Weyant , 1997). Этот метод также используется для идентификации изолятов микроорганизмов в чистой культуре (Stead, 1992).

Жирные кислоты - один из основных строительных материалов клетки. В грибковых и бактериальных клетках они содержатся, главным образом, в клеточных мембранах, как составные части фосфолипидов. На основании механизма биосинтеза мембранные жирные кислоты могут быть разделены на три основные группы (Kaneda,1991). К первой, самой большой группе, отнесены микроорганизмы, клеточные мембраны которых состоят из эфиров жирных кислот с прямой углеродной цепью, ко второй - из эфиров разветвленных и алициклических кислот, к третьей, самой маленькой группе архебактерий - из изопреновых эфиров(De Rosa,1988).

Большинство грибов и бактерий относятся к первой группе и имеют в своем составе прямоцепочечные жирные кислоты (миристиновую, пальмитиновую, стеариновую и т.д.). Именно эти кислоты изучались в первых работах Moss и соавторов (Dees,Moss,1975;1979) и Jantzen (1975,1976) и использовались для идентификации бактерий.

Наличие в составе клетки разветвленных кислот делает его более специфичным и расширяет возможности идентификации. Разветвленные кислоты включают изо-, антеизо- и со-

алициклические кислоты (циклогексановую, циклогептановую), являющиеся основными у некоторых микроорганизмов. Идентификация кислот с прямой углеводородной цепью, таких как пС14:0, пС16:0, С16:1, С18:0 и С18:1 не составляла проблемы при применении коротких набивных колонок. Однако разделение разветвленных и оксикислот требовало более жестких условий, например, разделение пары isoC15 и anteisoC15 кислот, содержащихся в некоторых микроорганизмах, требует колонку с

4000 теоретических тарелок на метр. В восьмидесятые годы на смену набивным пришли высокоэффективные кварцевые капиллярные колонки с химически связанной неподвижной фазой. Возможность разделять близлежащие пики значительно расширила применение газохроматографического метода в микробиологии (Moss C.W.,1980,1981).

Определение разветвленных жирных кислот, как главных компонентов клеточной мембраны, было впервые сделано у Bacillus subtilis (Kaneda,1977). Род Bacillus включает бактерии с широкими вариациями физиологических и биохимических признаков, но является гомогенным по наличию разветвленных жирных кислот. Этот признак был обобщающим и среди штаммов, относящихся к родам Legionella, Flavobacterium, Bacteroides - среди грам-отрицательных микроорганизмов, Staphylococcus, Bacillus и Arthrobacter среди грам-положительных и Streptomyces, Micromonospora среди актиномицетов(Kaneda,1991). Некоторые новые штаммы были отнесены к этим родам на основании наличия разветвленных жирных кислот в липидах этих бактерий, как например, неизвестные штаммы Legionella - возбудитель пневмонии, был идентифицирован как Legionella maceachernii и Legionella lansingensis культуральным, биохимическим и серологическим методами в комплексе с газохроматографическим профилем клеточных жирных кислот(Thomas Е.,1992; Thacker, 1992).

Обобщая собственные и литературные данные Asselineau (1984) и Jantzen(1985) опубликовали обзор по химическому составу грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, добавив к жирным кислотам оксикислоты и целые липидные комплексы. Kaneda (1991) составил перечень бактерий, принадлежащих к 56 родам, содержащих в своем составе более 20% жирных кислот с разветвленной углеводородной цепью в порядке их появления в Berdgey's Manual of Systematic Bacteriology.

Некоторые проблемы, относящиеся к классификации бактерий родов Actinobacillus, Haemophilus, Pasteurella, Prevotella, Bacteroides, Porphyromonas, Campylobacter были решены именно с использованием газохроматографического анализа компонентов клетки, в первую очередь - клеточных Сахаров и жирных кислот (Brondz I., 1986; Brondz I., 1991) . В течение последних лет проявлен особый интерес к выделению и идентификации анаэробов, обнаруживаемых в клинических образцах, и установлению их роли в физиологических и патологических процессах человека. Большие успехи достигнуты в классификации этих организмов, благодаря анализу жирнокислотного состава клеточной стенки (Shan, 1980; Lambe, 1982; Mayberry, 1988 ; Millar,1986 Brondz,1989). Род Bacteroides гетерогенен по ряду биохимических и физиологических признаков и нуждался в таксономическом пересмотре. Авторами (Shan, 1988) было предложено перевести три вида пигментирующих, анаэробных, грам-отрицательных палочек Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, Bacteroides endodontalis в род Porphyromonas, для чего был проведен масс-спектрометрический анализ клеточных жирных кислот и Сахаров нескольких штаммов рода Porphyromonas и Bacteroides. Наличие доминирующей 3-гидрокси-15-метилгексадекановой кислоты, а также

антеизопентадекановой кислоты является типичным признаком рода Bacteroides. Химические профили жирных кислот и Сахаров B.fragilis, В.melaninogenicus, В.intermedies и B.levii были подобны полученным ранее и отличались от Porphyromonas. Профили Р.endodontalis и P. asaccharolyticus были подобны, что подчеркивает близкое таксономическое родство между ними. Bacteroides gracilis, Bacteroides ureolyticus, Wolinella succinogenes, Wolinella recta и Campylobacter fetus subsp. venerealis в отличие от B.fragilis содержали лауриновую (С:12), пальмитоолеиновую (С16:1), олеиновую и 3-гидроксимиристиновую (С3-0Н-14) / но не содержали разветвленных

как простых, так и оксикислот (Brondz I.,1991) . К такому же результату пришли авторы (Vandamme,1995), которые на основании анализа состава жирных кислот, убихинонов и протеинов В.gracilis и В.ureolyticus и сравнении их с соответствующими хемотаксономическими критериями

Campylobacter, перевели B.gracillis в род Campylobacter.

Анализ химических компонентов клетки дает возможность оценить важность такого понятия, как таксономический маркер (Jantzen, 1993) . Например, тетрадекановая кислота и 3-гидрокси-13-метилтетрадекановая кислоты могут служить маркерами при дифференциации рода Porphyromonas, а 3-гидрокси-15-метилгексадекановая кислота и

антеизопентадекановая кислота - рода Bacteroides. Однако, ограниченное количество микроорганизмов имеют специфичные маркеры (такие как туберкулостеариновая, лактобацилловая, миколовые кислоты), которые характерны для соответствующих видов микроорганизмов и могут быть идентифицированы по ним (Fourche,1989).

В последнее время при выделении неизвестных клинических штаммов наряду с культуральными, биохимическими и генетическими методами идентификации все больше используется анализ клеточных жирных кислот (Moss,1992,1993;

Hollis,1992,1993). Неизвестные клинические штаммы на основании биохимического и генетического подобия совместно с анализом состава жирных кислот были идентифицированы как Neisseria elongata (Andersen,1995), Weeksella (Hollis,1995), Francisella tularensis (Bernard,1994), Dermabacter

hominis(Gruner,1994). Уникальным жирнокислотным профилем, отличным от всех ранее изученных микроорганизмов, обладают бактерии Gilardi rod groupl. Авторы (Moss,1993) предлагают использовать его для быстрой идентификации данных организмов.

Подтверждением признания жирнокислотного состава клеток как таксономического критерия является все более частое

включение его в описание новых таксонов (Bernard, 1994 ; Butler,1993/ Daneshvar,1991; Weyant ,1997. Включен он и в описание видов в отдельных разделах "Руководства по

систематике бактерий Берги". Этот справочник состоит из четырех томов, опубликованных в 1984 (Krieg N.R., Holt J.G.), 1986 (Sneath P.), 1989 (Staley J.T.), 1989 (Williams S.T.).

Использование состава клеточных моносахаров и жирных кислот для идентификации грибов.

Все вышесказанное позволяет предположить, что состав жирных кислот является признаком, который может быть использован не только для таксономии бактерий, но и грибов. С таксономической целью был изучен состав жирных кислот в гидролизатах целых клеток 38 штаммов, принадлежащих к родам Candida, Cryptococcus, Torulopsis. Было показано, что все штаммы Candida albicans содержали небольшие количества 2-0Н-12:0 и 2-ОН-14:0 кислоты (1-3%), а также 19:0 кислоту. Для дифференциации отдельных видов использовали отношение гексадеценовой к гексадекановой кислоте (Gangopadujay,1979). Результаты исследования методом газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот дрожжевых клеток показали, что линолевая и линоленовая кислоты являются основными и составляют соответственно 10-50% и до 18% от всех клеточных кислот(Kobayashi,1987; Малхасьян,1983; Weete Y.D.,1980).

Moss с соавторами (1982) нашли, что по составу клеточных кислот 51 штамм грибов делится на четыре группы, куда вошли соответственно грибы родов Candida, Saccharomyces, Torulopsis, Cryptococcus. Авторы не смогли различить внутри рода 10 различных видов грибов Candida и не подтвердили наличие у них оксикислот и 19:0 кислоты. В 198 9 г. был разработан альтернативный метанолизу метод ГХ исследования жирных кислот цельных грибковых клеток (Brondz,1989). Были

исследованы клинически значимые штаммы микроорганизмов Candida albicans, Torulopsis glabrata, Saccharomyces cerevisiae. Клеточный лизис и трансэтерификацию проводили этиловым, пропиловым, бутиловым и метиловым спиртом. Был сделан вывод, что используемый на практике метод метанолиза дает значительную потерю в частоте обнаружения кислот СЮ: 0 и С12:0, которые могут быть использованы, как маркеры для таксономической дифференциации внутри рода.

Использование жирнокислотного состава клеток как таксономического критерия подтвердили ряд авторов (Lechevalier Н., 1988; Viljoen B.C.,1986; Viljoen В.С.,1987).

Наряду с жирнокислотным составом некоторыми авторами для таксономии грибов применялись клеточные сахара, особенно на родовом уровне (Gorin, 1968; Wejman, 1979; Wejman, 1988) . Lloyd (1970) изучил пептидогалактоманнаны темного гриба Cladosporium werneekii. Он отметил, что пептидогалактоманнан состоит из полисахаридов, имеющих варьирующие количества галактозы и фосфата. Он сообщил об обнаружении в полисахариде следующих Сахаров: глюкозы, фруктозы, рибозы и небольших количеств ангидрорибита.

Domer (1971) анализировала содержание моносахаридов и хитина в клеточных стенках Histoplasma capsulatum. Клеточные стенки мицелиальной фазы содержали несколько меньше N-ацетилглюкозамина (хитина), чем дрожжевая фаза, а также характеризовались более высоким содержанием маннозы.

Gargani и Grasso (1968) изучили состав углеводов 8 штаммов С.neoformans и установили, что глюкоза и манноза имелись во всех штаммах, в то время как галактоза и ксилоза присутствовали в одних случаях и отсутствовали в других.

При сравнении содержания моносахаридов и хитина в клеточных стенках Blastomyces dermatitidis и Histoplasma capsulatum с помощью ГЖХ Domer (1971) обнаружила, что из клеточных стенок дрожжевой фазы В. dermatitidis при

ферментативном гидролизе освобождался только

ацетилглюкозамин, в то время как из клеточных стенок Н.capsulatum освобождались ацетилглюкозамин и глюкоза. Клеточные стенки мицелиальной фазы обоих организмов были одинаковыми.

Brondz провел количественный анализ клеточных моносахаров и показал отличие Candida albicans и Torulopsis glabrata от Saccharomyces cerevisiae, а совокупность анализов моносахаров и клеточных жирных кислот дают возможность отличить С.albicans и Т.glabrata друг от друга(I.Brondz, 1990).

Из литературы известно, что факторы роста влияют на содержание жирных кислот в клетках грибов. Изучение изменений в процессе роста в клеточных липидах С.albicans показало, что на ранних стадиях роста содержание кислот с четным количеством атомов углерода в цепи в 5 раз выше, чем кислот с нечетным количеством атомов (Dubravka, 1988) . Следовательно, относительное содержание отдельных кислот зависит от условий культивирования. Изучение состава клеточных жирных кислот С.albicans в присутствии амфотерицина В показало, что количество основных клеточных кислот С16 и С18:1 остается постоянным, а количество кислот С10-С15 заметно изменяется в процессе роста. Существуют различные данные о влиянии температуры культивирования на синтез ненасыщенных жирных кислот в грибах. У некоторых грибов рода Aspergilles содержание ненасыщенных жирных кислот увеличивается при понижении температуры роста (Dart,1976), у некоторых грибов уровень кислот не изменялся, а у некоторых снижался.

Таким образом, выбор и использование стандартной питательной среды, обуславливающей хороший рост культуры в процессе исследования, является важным условием при сравнении данных хроматографического анализа.

Другим важным параметром, при котором состав клеточных жирных кислот микроорганизмов сохраняет стабильность и

воспроизводимость в стационарной фазе роста, является время инкубирования. Однако, более важным фактором, чем время инкубирования, является физиологический возраст клетки. К примеру, когда проверяется много штаммов внутри группы, один или много штаммов могут медленнее расти и нуждаются в более длительном инкубировании для получения эквивалентного роста к другим представителям, растущим быстрее.

Таким образом, схожесть параметров культивирования микроорганизмов в процессе исследования, обеспечивает большую достоверность и воспроизводимость результатов анализа жирных кислот и Сахаров всех штаммов внутри группы. Очевидно, что все микроорганизмы при изучении группы должны расти на одной и той же среде и при аналогичных условиях культивирования.

Несколько работ по изучению жирно-кислотных профилей дерматофитов с хемотаксономической целью показали схожесть качественного и количественного состава кислот внутри Epidermophyton, Microsporum и Trichophyton (Audette,1961; Kostiw,1961; Wirth,1964; Kish,1974; Swenson,1980). Уровни пальмитиновой, гексадеценовой и стеариновой кислот были также одинаковы и для всех трех родов, хотя Epidermophyton отличался по содержанию ненасыщенных олеиновой и линолевой кислот. Однако, некоторые штаммы, например, Е. floccosum выпадали из данного интервала. Изучение влияния возраста культуры Е.floccosum показало, что общее количество жирных кислот значительно снижается с возрастом, в то время как, никаких качественных изменений не наблюдалось. Авторы (Vincent ,1978; Jones,1981) сделали вывод, что несмотря на то, что дерматофиты очень гомологичны по своему составу, род Epidermophyton может быть дифференцирован от Microsporum и Trichophyton.

Collins (1969) изучил содержание эргостерина у Ceratocystis fagacearum. Было обнаружено, что эргостерин является основным стерином этого гриба. Исследования Stone и соавторов (1968) посвящены изучению стереохимии

гексагидропренола, убихинона, биосинтезу эргостерина в мицелии. Так как эргостерин содержится во многих грибах, то он широко используется как химический маркер грибковой биомассы в экологических образцах (Axelsson,1995).

Использование метаболитов микроорганизмов для их

идентификации.

При применении хроматографического анализа в микробиологии для дифференциации микроорганизмов используются два основных методических подхода: анализ химических компонентов микроорганизмов, описанный выше, и анализ продуктов их метаболизма.

Анализ конечных продуктов метаболизма микроорганизмов сыграл значительную роль в упрощении их идентификации.

Обнаружение и идентификация бактерий на основании газохроматографического анализа характерных метаболических профилей впервые были осуществлены Henis с соавторами (Henis Y.,1966). Эти исследователи экстрагировали метаболиты разнообразных бактерий эфиром и экстракты хроматографировали. Полученные метаболические профили оказались характерными для разных таксонов микроорганизмов.

Метаболиты, выделяемые организмами, можно определять качественно и количественно одновременно. В 9-ом издании "Руководства по систематике бактерий Берги" большинство описаний родов включает конечные продукты метаболизма в качестве критерия для отнесения микроорганизма к определенному роду.

Однако, работ по изучению метаболизма патогенных грибов немного. Lategan P.M. с соавторами (Lategan P.M., 1981) впервые исследовал летучие вещества, продуцируемые и утилизируемые 5 видами Candida, выделенными из клинических образцов и культивируемыми в анаэробных и аэробных условиях на среде, содержащей глюкозу. Основными продуктами метаболизма были этанол (анаэробные условия) и ацетон (аэробные условия). Авторы пришли к выводу, что метод может быть использован для характеристики рода Candida после набора статистических данных. Li и Georg (Li, Georg, 1968) применили ГЖХ как вспомогательный метод для дифференциации Actinomyces propionicus и морфологически подобных A.israelii и A.naeslundii на основании анализа некоторых конечных продуктов метаболизма. Анализ конечных продуктов метаболизма грибов нашел более широкое применение в клинико-лабораторной диагностике кандидозов.

Современные лабораторные методы диагностики грибковой

инфекции.

Выделение микроорганизмов из крови и других стерильных биологических жидкостей остается одним из самых достоверных методов установления диагноза кандидоза (Пронина Е.В.,1995). Однако, результаты наших исследований, а также данные литературы (Matthews,1993; Walsh, 1995), показывают, что у больных с подозрением на кандидоз процент выделения Candida из сыворотки очень низкий.

Грибы рода Aspergillus почти никогда не выделялись из крови у пациентов с аспергиллезным эндокардитом (Rubinstein, 1995) . Одна из самых сложных проблем - постановка диагноза аспергиллеза пациентам с иммунодефицитом (Warnock,1995; Krcmery,1996). Высев этих грибов из гемокультуры редок даже среди пациентов с дессиминированными формами. Так же редко

грибы высеваются из мокроты у пациентов с пульмональным аспергиллезом (Yoneda,1997).

Выделение грибов из клинических образцов материала открытых биоценозов не сложно, но не обязательно указывает на их патогенность. Высев С.albicans со слизистых не всегда означает заболевание, и интерпретация результата целиком зависит от клинической картины. У многих пациентов без системного кандидоза, например, с длительной катетеризацией мочевого пузыря, мочеиспускательные пути могут быть обсеменены С.albicans. С другой стороны, обсемененные слизистые являются резервуаром инфекции для пациентов повышенного риска. В некоторых случаях количественный учет колоний грибов рода Candida может способствовать дифференциальной диагностике кандидоза от кандидоносительства (Beznhardt Н., 1986) . Существует и другая, не менее важная проблема: полная идентификация грибковых изолятов, особенно дрожжей, может занимать до 10 дней. Однако, для тяжелых больных важно получить предварительную информацию о возможной инфекции как можно быстрее.

Грибковая инфекция может быть обнаружена при цитогистологическом исследовании образца, полученного на биопсии. Поставить диагноз инвазивного аспергиллеза очень трудно в отсутствии биопсии и без гистологического подтверждения (Andriole, 1996) . Этот метод позволяет получить результат в очень короткий срок. Однако, он не дает возможности точной идентификации грибов и, главное, часто неприменим из-за недоступности очага поражения или тяжести состояния больного (Bitteneourt A.L., 1984).

Ряд авторов считают достаточно информативными иммунологические методы диагностики, которые помогают распознавать различные формы кандидоза и аспергиллеза, а также оценивать результаты проводимой антифунгальной терапии (Muiller H.L., 1987; Schreiber J.R., 1984). Это реакции,

оценивающие состояние гуморального и клеточного иммунитета, а также обнаружение специфических антигенов (АГ) и антител (AT). Kuhn G. С соавторами (Kuhn G.,1985) считают, что определение титров AT к АГ Candida может способствовать отделению кандидоносителей от больных кандидозом. Определение AT к трубкам прорастания С.albicans может быть важным диагностическим методом при системных кандидозах (Villalba,1993). Однако, AT тест у больных с иммуносупрессией имеет пониженную чувствительность и специфичность. Гораздо большую ценность представляет собой обнаружение в сыворотке крови больных Candida АГ - маннана и Aspergillus АГ галактоманнана, но этот метод не получил широкого распространения из-за высокой стоимости анализа (Repentingly, 1992) .

Использование метаболитов микроорганизмов для диагностики гнойно-воспалительных заболеваний.

Исходя из вышеизложенного становится ясно, что ни один из существующих методов диагностики не является универсальным. Хроматографические методы детектирования, основанные на обнаружении в исследуемом клиническом образце характерных для организма известного вида метаболитов, могут оказаться эффективными для ранней и специфической диагностики Candida, особенно при острых формах инфекции, когда метаболиты присутствуют в больших концентрациях.

При использовании газовой хроматографии в клинических бактериологических исследованиях никогда не ставилась задача заменить традиционные культурально-биохимические методы. Такой подход был оправдан только при определении некоторых возбудителей бактериальной и грибковой инфекции из-за трудоемкости их диагностики и в тех случаях, когда

практически важные микроорганизмы не удавалось

дифференцировать традиционным методом.

Впервые Mitruka с соавторами идентифицировали этиологию бактериемии по газохроматографическому профилю сыворотки крови (Mitruka В.М.,1970). Острые клостридиальные и неклостридиальные инфекции легко дифференцировались с помощью газохроматографического метода (Майкова, 1989; Осипов Г.А.,1994; Осипов Г.А.,Демина A.M., 1996). Скорость и простота ГХ метода привлекали исследователей к этому методу: для экспресс - диагностики криптококкового менингита, пневмококковой пневмонии, грам-отрицательных бактериальных инфекций, кандидозов (Wong, 1990; Megson, 1996; Миронов,1989; Larsson, 1994; Cristensson, 1997) . Cryptococcus neoformans продуцирует d-маннитол in vitro в экспериментально зараженных кроликах с менингитом. Маннитол присутствует в ликворе пациентов с криптококковым менингитом, но корреляция между концентрацией маннитола и титром криптоккокового антигена отсутствует (Wong, 1990; Megson, 1996).

Авторы (Miller G.G.,1974) обнаружили, что хроматограмма отмытой культуры С.albicans содержала характерные компоненты (предположительно - производные маннозы, предшественником которой был маннан - главный компонент клеточной стенки грибов), обнаруженные затем в сыворотке крови больных кандидозом и отсутствовавшие в нормальной сыворотке. Однако, в других исследованиях Weiner и Yount (Weiner М.Н., Yount W.J.,1976), используя метод гемагглютинации для обнаружения маннана в сыворотке крови человека показали, что маннан на ранних стадиях в случаях системной инфекции определялся только у 4 из 14 пациентов.

Kiehn (Kiehn Т.Е.,1979) при изучении 14 штаммов С.albicans и 11 штаммов С.tropicalis обнаружил а и ß изомеры глюкозы и D-арабинитол - пятиатомный, неразветвленный сахарный спирт, который оказался специфическим метаболитом грибов рода

Candida. Арабинитол продуцируется почти всеми штаммами Candida, наиболее часто выделяемыми из крови или тканей человека: С.albicans, С.tropicalis, С.parapsilosis,

C.pseudotropicalis (Roboz J., 1980; Bernard E.M.,1981). Скорость продуцирования арабинитола в культуре зависит от количества грибных клеток, активности штаммов и скорости их роста. Подобные факторы, очевидно, влияют на скорость продуцирования арабинитола и в организме. Многие авторы показывают, что когда животные или люди инфицированы грибами Candida уровень D-арабинитола в сыворотке крови повышен по сравнению с нормой (Eng R.H.,1981; Wong ,1982; Roboz, 1980, 1990,1994; McSharry, 1993; Vanderwinkel, 1995;

Togunaga,1995). Также было изучено изменение уровня D-арабинитола в моче, как потенциальная возможность диагностики инвазивного кандидоза (Togunaga,1992; Larsson, 1994; Christensson, 1997). Хотя D-арабинитол не является нормальным метаболитом человека (Touster О.,1962), он был обнаружен в низких концентрациях в сыворотке и моче здоровых людей. Происходит ли арабинитол, обнаруженный в биологических жидкостях, из компонентов пищи, является ли продуктом метаболизма организма человека или производится грибами, присутствующими в кишечнике? Авторами (Wong В.,1982) было доказано, что арабинитол в большей степени продуцируется грибами. Прямая связь между активностью растущих микроорганизмов и уровнем арабинитола может быть использована не только для диагностики кандидоза, но и для оценки массивности инфицирования, то есть тяжести инфекции. При инвазивном кандидозе в биологических жидкостях и тканях в повышенной концентрации обнаруживается именно D-изомер, появляющийся в результате метаболизма грибов(Bernard Е.М.,1985; Larsson, 1994). Для повышения точности анализа было проведено одновременное определение D-арабинитола, являющегося метаболитом грибов и L-арабинитола, образующегося

в результате метаболизма человеческого организма в сыворотке пациентов с кандидозом (Wong В.,1988). Хотя нормальная человеческая сыворотка содержит и D- и L-арабинитол примерно в одинаковых концентрациях, D-арабинитол в сыворотке больных составляет 93-95% от суммы двух изомеров.

Один из факторов, влияющих на уровень арабинитола почечная недостаточность. У пациентов с почечной недостаточностью, не инфицированных Candida, уровень арабинитола составлял 1.8-15.4мкг/мл. В контрольной группе пациенты (без почечной недостаточности и неинфицированные Candida) имели уровень арабинитола < 1,0мкг/мл. Концентрация арабинитола значительно выше нормы была у 18 из 19 пациентов с подтвержденным диагнозом инвазивного кандидоза (Deacon A.G., 1986). Работы по определению D-арабинитола в сыворотке крови методом ГХ и ГХ-МС для диагностики инвазивного кандидоза (Табл.1.2.)суммировала Lehtonen (Lehtonen, 1996). Поскольку в этих работах были использованы разные методы анализа и дериватизации арабинитола, разные диагностические критерии для инвазивного кандидоза, данные, полученные разными авторами, различны, и не могут быть сравнены напрямую. Однако, можно сделать несколько общих заключений. Использование масс спектрометрии улучшает чувствительность и специфичность, так как фоновые концентрации не влияют на хроматограмму.

Некоторые авторы (Monson Т.Р.,1981; Marier R.L.,1982) изучали уровень маннозы как индикатор инвазивного кандидоза. Концентрация свободной маннозы, найденная в сыворотке шести пациентов с кандидозом (диагноз инвазивного кандидоза базировался на гистологических данных, полученных на биопсии или аутопсии) была выше, чем ее концентрация у здоровых людей, а также у пациентов с кандидемией и другими микозами.

Таблица 1.2. Работы по определению Б-арабинитола в сыворотке крови для диагностики инвазивного кандидоза.

Автор Количество образцов Метод Результаты

Kiehn с соавторами (1979) Инвазивный кандидоз 20 Обсеменение Candida 28 Здоровые люди 65 ГХ триметилсилил производных арабинитола Чувствительность 94% Специфичность 88%

Roboz с соавторами (1980) Инвазивный кандидоз 11 Обсеменение Candida 6 Здоровые люди 3 9 ГХ и МС триметилсилил производных арабинитола Чувствительность 82% Специфичность 100%

Wells с соавторами (1983) Candida сепсис 34 Обсеменение Candida 38 Бактериальн. сепсис 62 Здоровые люди 11 ГХ триметилсилил производных арабинитола Чувствительность 59% Специфичность 76%

Gold с соавторами (1983) Онколог.больные с инв. кандидозом 25 Онколог.больные без кандидоза 73 Почечная недостат. 15 ГХ триметилсилил производных арабинитола Чувствительность 84% Специфичность 93%

Repentigly с соавторами (1985) Инвазивный кандидоз 13 Возможный кандидоз 10 Пациенты группы риска без кандидоза 15 Здоровые люди 3 9 ГХ перацетилат альдонитрильных производных арабинитола Чувствительность 26% Специфичность 87%

Deacon с соавторами (1986) Инвазивный кандидоз 27 Госпитализированные пациенты без канд. 68 Здоровые люди 10 ГХ триметилсилил производных арабинитола Чувствительность 92% Специфичность 88%

Wong с соавторами (1988) Инвазивный кандидоз 4 Здоровые люди 27 ГХ триметилсилил производных арабинитола Чувствительность 100% Специфичность 100%

Roboz с соавторами (1992) Инвазивный кандидоз 16 Онкогемат. и почечная недостаточность 49 Здоровые люди 2 9 ГХ и МС с SIM мониторингом трифлюроацетил производных D и L арабинитола Чувствительность 94% Специфичность 88%

Уровень маннозы в спинномозговых жидкостях двух пациентов с грибковым менингитом был выше по сравнению с ее уровнем в семи образцах спинномозговой жидкости, не инфицированной грибами. Одновременно штаммы С.albicans, полученные от пациентов с инвазивным кандидозом, культивировались на среде Сабуро в течение 42, 48, 72, 96 и 102 часов.

Появление маннозы было замечено без каких-либо изменений мицелиальной фазы. Не было замечено разницы между уровнем маннозы у пациентов с почечной недостаточностью и уровнем маннозы у здоровых людей. Только пациенты с диабетом имели

повышенный уровень маннозы, но у них не был найден кандидоз или какой-либо микоз. Одновременно арабинитол и маннозу (Repentigny L.,1983; Greenfield, 1988) количественно определяли в сыворотке кроликов, инфицированных С.albicans. Концентрации D-арабинитола и маннозы были 0.2 6 и 16.9 мкг/мл соответственно за 2 дня до инфекции, 1.6 и 31.2 мкг/мл через 4 дня после инфекции; и 4.9 и 21.5мкг/мл через 8 дней после инфекции. Маннан, не определяемый в сыворотке до инфицирования, появился у всех кроликов спустя 4 дня после инфекции (от 14.1 до 66.3 нг/мл). Тысячекратную разницу, наблюдаемую между концентрацией маннана и маннозы, Monson с соавторами (Monson Т.Р.,1981) объясняют следующими

факторами: 1) количество определенной маннозы есть сумма эндогенной маннозы и маннозы, предположительно происходящей из маннана (причем эндогенный маннан не обнаруживался); 2)большая часть маннана метаболизировалась в маннозу сразу же после его продуцирования; 3)циркулирующий в крови маннан может быть в виде растворимого иммунного комплекса, снижающего чувствительность метода, несмотря на

предварительную диссоциацию.

Таким образом, приведенный обзор литературы показывает, что многие задачи таксономии и идентификации микроорганизмов успешно разрешаются путем ГХ анализа химического состава клеточной стенки или биомассы. Проведено ряд исследований, которые показали ценность применения ГХ анализа клеточных компонентов для идентификации грибов. Однако, данные по грибам, в частности по клинически значимым видам, эпизодичны и недостаточно систематизированы. Поэтому, мы в своих исследованиях ставили задачу - проанализировать

жирнокислотный и углеводный состав медицински значимых штаммов грибов, выяснить значение полученных данных для идентификации и классификации грибов.

Помимо клеточных компонентов в идентификации микроорганизмов широко применяются продукты их

жизнедеятельности. В этих целях нами было спланировано исследовать метаболиты грибов, а также выяснить их значимость для определения присутствия грибов в биологических жидкостях человека. Это направление исследований чрезвычайно важно для экспресс-диагностики инвазивных микозов. При использовании общепринятых методов диагностики грибы должны быть изолированы из клинических образцов и затем идентифицированы на основании морфологических, биохимических и серологических тестов. ГХ метод диагностики основывается на определении веществ, специфичных для данного микроорганизма, поэтому не требуется выделение чистой культуры из клинического материала. Данный метод можно использовать для изучения взаимодействия между макро- и микроорганизмами на протяжении развития инфекционного процесса путем анализа химических изменений в сыворотке крови или тканях.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Описание биологического материала.

В работе были использованы следующие культуры грибов (80 образцов):

род Candida (153 штамма): C.albicans - 54 штамма, C.tropicalis -22 штамма, C.kefyr-13 штаммов, C.krusei -19 штаммов, С.parapsilosis - 15 штаммов, С.guilliermondii - 3 штамма, C.glabrata - 11 штаммов, C.famata - 4 штамма, С. stellatoidea- 3 штамма;

род Aspergillus (8 штаммов): A.niger, A.fumigatus;

род Penicillium (5 штаммов): Р.frequentas, Р.terlikowskii,

Р.diversum;

род Fusarium (4 штамма): F.oxysporum, F.moniliforme, F.Javanicum;

род Alternarla (6 штаммов): A.solani, A.tenuissima, A.tenuis; род Mucor (4 штамма): M.racemosus, M.pusillus; Streptomyces albus (3 щтамма), Micromonospora monospora (4 штамма), Nocardia asteroides (2 штамма), Geotrichum candidum (13 штаммов), Sporotrichum schehkii (1 штамм), Cryptococcus laurentii (1 штамм), Oidiodendrum gracili (1 штамм).

Музейные штаммы микроорганизмов получены из Всероссийской коллекции патогенных грибов г. С.-Петербурга, Всесоюзной коллекции микроорганизмов г.Пущино. Клинические штаммы выделены от больных и идентифицированы с применением методов классической микробиологии в бактериологической лаборатории ДЦЛД г.Москвы (совместно с зав.лаб. Курчавовым В. А. и бактериологом Рогатиной E.JI.) .

В работе исследовались биологические жидкости: кровь, ликвор, моча. Весь материал доставлялся в лабораторию не позднее 2-х часов с момента забора. Взятие клинического материала производилось в асептических условиях в стерильную

посуду. При поступлении в лабораторию нативный материал подвергался прямой микроскопии. Обнаружение при микроскопии почкующихся клеток и нитчатой фазы возбудителя являлось важным диагностическим признаком.

Посев крови и ликвора производился на жидкую среду Сабуро в соотношении 1:10. Патологический материал, содержащий нормальную микрофлору, разводился методом серийных разведений в жидкой среде Сабуро и высевался в количестве 0,1мл на аналогичную плотную среду. При отсутствии роста посевы инкубировались до 10 суток, с периодическими высевами на плотные питательные среды. При наличии роста осуществлялся клинический учет колоний в патологическом материале. После выделения и количественного учета культур дрожжеподобных грибов их идентифицировали. Культивирование грибковых культур осуществляли на чашках Петри с агаровой средой Сабуро в 2-х температурных режимах: при 28° и 37°С до 2-х недель. Для идентификации грибковых культур использовали чистые первичные 48-часовые культуры или вторичные 24-часовые культуры.

Критериями идентификации служили:

1) характер роста культур на агаровых (среда Сабуро) и жидких средах (жидкая среда Сабуро);

2) микроморфология культур (по нативным препаратам форма дрожжевых клеток, характер почкования, наличие псевдомицелия и истинного мицелия);

3) образование "ростовых трубок" (экспресс-видовой тест на С.albicans);

Для этого теста использовали 24-х или 48-часовые культуры. В центрифужную пробирку вносили 0,2мл сыворотки (можно использовать сыворотку после биохимических, иммунологических исследований) или плазмы. По стенке этой пробирки на границе с жидкой средой петлей растиралась биомасса (небольшое количество) дрожжевой колонии, т.е. готовилась взвесь. Затем пробирки инкубировали при 37°С в

течение 3-х часов. При микроскопии взвеси обнаруживаются дрожжевые почкующиеся клетки, клетки, дающие зачатки псевдомицелия и клетки, которые имеют тонкие ровные на всем протяжении проростки (мицелий) - так называемые "ростовые трубки", что характерно только для С.albicans и С.stellatoidea (биохимический вариант С.albicans).

4) выявление хламидоспор;

Посев производился на чашки Петри с рисовым огаром ("голодная Среда"). Штриховой посев покрывали покровным стеклом, предварительно фламбированным над пламенем горелки. Посевы инкубировали при 28°С в течение 24-48 часов. Микроскопировали при малом увеличении. Хламидоспоры округлые клетки с двуконтурной стенкой, иногда с зернистым содержимым. Формируются одиночно или гроздьевидно. Выявление хламидоспор позволяет идентифицировать культуру как С.albicans.

5) выявление типов филаментации;

Производился посев на картофельный агар: биомасса дрожжевой колонии наносилась в одну точку и рассевалась штрихом с незначительным повреждением поверхности агара, посев делали в виде двух сходящихся, но не пересекающихся лучей (чтобы не было угнетения роста). Чашки инкубировали в течение 3-5 дней при 2 8°С . Нитчатая форма образовывалась в толще агара по переферии посева. По ходу псевдомицелия за счет мультиполярного почкования могут образовываться боковые нити, размножаться дрожжевые клетки (бластоспоры), формироваться их скопления (гломерулы) разной формы. В зависимости от характера ветвления и морфологии гломерул выделяли следующие типы роста: Candida, Mycotorula, Mycotoruloides, Mycocandida.

6) посев на Среды с углеводами (изучение ферментативной активности);

производился посев на полужидкие среды Гисса (0,1 - 0,15% агар - агара), в которых концентрация углеводов (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, галактоза) составляла 2%. Посевы инкубировали при 2 8° С в течение 4 8 часов.

7) определение ассимиляционной способности проводилось с использованием ассимиляционного агара и субстратных дисков тест-системы "Minitek" фирмы "Becton Dickinson"(США) и являлось завершающим этапом видовой диагностики грибов рода Candida. Некоторые виды кандид, не вошедшие в базу данных системы "Minitek", были определены с помощью АТВ system (bioMerieux, Франция) с использованием набора ID 32С.

2.2. Подготовка образцов для хроматографического и масс-

спектрометрического анализов.

У перечисленных микроорганизмов были изучены как составы биомассы, так и состав продуктов метаболизма, выделяемых в среду роста.

Подготовка проб для изучения химического состава

биомассы.

Для анализа клеточных жирных кислот и стеринов биомассу грибов (6-суточная культура) промывали физраствором, высушивали и подвергали кислому метанолизу добавлением 2,2N хлористого водорода в метаноле, выдерживая смесь в течение 4 часов при температуре 75°С. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали дважды смесью гексан-диэтиловый эфир (1:1) и аликвоту экстракта направляли на газохроматографический анализ.

Для анализа клеточных моносахаров из оставшейся реакционной массы отбирали 0,6 мл надосадочной жидкости и высушивали под вакуумом. К полученному осадку добавляли

О,04мл N-триметилсилилимидазола (TSIM), нагревали 15 минут при 75°С. К реакционной массе добавляли после охлаждения 0,05мл гексана, энергично встряхивали. После расслоения двух фаз аликвоту верхнего гексанового слоя вводили в газовый хроматограф.

Подготовка проб для анализа культуральных сред после роста

микроорганизмов.

Анализ свободных углеводов.

Для определения свободных углеводов к 0.1 мл культуральной жидкости, пропущенной через мембранный 0.45-цм фильтр (Millipore Corp.), добавляли 1 мл ацетона, выпавший осадок белка отделяли центрифугированием при 4 000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость высушивали на роторном испарителе под вакуумом. К сухому остатку добавляли 50 мкл N-триметилсилилимидазола (ТСИМ), пробирку герметично закрывали завинчивающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, тщательно перемешивали и нагревали в термоблоке в течение 15 мин при температуре 75°С. После охлаждения к реакционной смеси добавляли 50 мкл гексана и энергично встряхивали. Аликвоту гексанового экстракта вводили в хроматограф.

Анализ спиртов и летучих кислот.

Для анализа спиртов и летучих кислот в пробирку брали 2мл культуральной жидкости, пропущенной через мембранный 0,45-jim фильтр (Millipore Corp.), добавляли 0,2мл 50% серной кислоты, 0,4 г хлористого натрия и 1мл серного эфира. Пробирку герметично закрывали завинчивающейся крышкой с

тефлонированной резиновой прокладкой и энергично встряхивали. После разделения слоев центрифугированием верхний эфирный слой собирали в чистую пробирку, упаривали до объема 100 мкл.

В испаритель газового хроматографа вводили аликвоту эфирного экстракта.

Для анализа нелетучих кислот в пробирку брали 1 мл культуральной жидкости, пропущенной через мембранный 0,45-}1м фильтр (Millipore Corp.), добавляли 0,4 мл серной кислоты и 2мл метанола. Пробирку герметично закрывали и помещали в нагревательный блок при 60°С на 30 минут. В охлажденную пробу добавляли 1 мл воды и 0.5 мл хлороформа, герметично закрывали и энергично встряхивали. Для лучшего расслаивания эмульсии пробу центрифугировали 10 минут при 30 00 об/мин. В нижний хлороформенный слой, собранный в чистую пробирку, добавляли 5 мкл внутреннего стандарта (раствор 12.9 мг ундекановой кислоты в 10 мл гексана) . Пробу упаривали до объема 100 мкл. Аликвоту хлороформенного экстракта вводили в испаритель газового хроматографа.

Анализ аминов.

Метод определения аминов основан на разделении с помощью высоэффективной жидкостной хроматографии дансилпроизводных аминов выполнялся Титковой Н.Ф.совместно с НИИБП. Для этого брали 1мл культуральной жидкости, пропущенной через мембранный 0,4 5-jjm фильтр (Millipore Corp.), и помещали в центрифужную пробирку, добавляли 10 мкл 0,5 мМ раствора внутреннего стандарта, 1,6-диаминогексана и 0,5 мл 1М раствора хлорной кислоты. Выпавшие белки отделяли центрифугированием 2 0 минут при 8000 об/мин. Избыток хлорной кислоты удаляли в виде перхлората калия. К 0,5 мл безбелковой пробы в темной склянке добавляли 0,1 мл насыщенного раствора углекислого калия и 1мл раствора 5-диметиламино-1-нафтиленсульфонилхлорида (дансилхлорида) в ацетоне(2мг/мл). Смесь нагревали в течение 1 часа при 55°С. Затем к реакционной смеси добавляли 2мл бидистиллированной воды и экстрагировали дансилпроизводные аминов 1мл этилацетата. Органический слой

переносили в сухую склянку и выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 200 мкл ацетонитрила и использовали для хроматографии.

Подготовка проб для анализа биологических жидкостей человека (кровь и ликвор).

Образец сыворотки крови или ликвора человека в количестве 0,2мл помещали в пробирку вместимостью 2-Змл, добавляли 0,2мл раствора "внутреннего стандарта" и 0,8мл ацетона. Пробирку закрывали и энергично встряхивали. Выпавший осадок белка отделяли центрифугированием (4000 об/мин, 15мин). Надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку и высушивали под вакуумом (в вакуумном эксикаторе или роторном испарителе).

Силильные производные получали при добавлении к сухому остатку 0,05 мл Ы-триметилсилилимидазола (ТСИМ). Пробирку герметично закрывали завинчивающейся крышкой, снабженной тефлонированной резиновой прокладкой, энергично встряхивали и нагревали в термоблоке в течение 15 минут при температуре 65°С. После охлаждения к реакционной смеси добавляли 0,05мл гексана и энергично встряхивали. Аликвоту гексанового экстракта вводили в хроматограф. В качестве внутреннего стандарта для анализа сыворотки крови использовали Б-эритрол, для анализа ликвора - рамнозу.

Подготовка "внутренних стандартов".

Навеску (25±0,001)мг О-эритрола растворяют в дистиллированной воде, доводя объем раствора до метки (пикнометр на 25мл). Полученный раствор в количестве 0,4мл вносят в пикнометр объемом 100мл, доводя объем раствора до метки дистиллированной водой. При этом получают раствор с концентрацией 4 мкг/мл.

Навеску (25±0,001)мг рамнозы растворяют в

дистиллированной воде, доводя объем раствора до метки (пикнометр на 25мл). Полученный раствор в количестве 1мл вносят в пикнометр объемом 100мл, доводя объем раствора до метки дистиллированной водой. При этом получают раствор с концентрацией 10 мкг/мл.

2.3. Условия хроматографического и масс-спектрометрического

анализа.

Анализ метиловых эфиров высших кислот выполняли на на газовом хроматографе фирмы "Hewlett-Packard" (США), используя кварцевую капиллярную колонку длиной 12м и внутренним диаметром 0,2 5мм с метилсиликоновой неподвижной фазой. Температуру колонки изменяли в режиме программирования от 100"С до 250"С со скоростью 5"С/мин. Идентификацию компонентов выполняли с использованием хроматографических стандартов фирмы "Sigma".

Анализ моносахаридного состава биомассы проводили на газовом хроматографе "СЕ-4200" ("Carlo Erba", Италия) на кварцевой капиллярной колонке длиной 2 5м и внутренним диаметром 0,2 мм с метилсиликоновой неподвижной фазой. Температура колонки изменялась от 100°С до 2 60°С со скоростью 4°С/мин.

Анализ углеводов выполняли на газовом хроматографе "СЕ-4200"(Италия) и газовом хроматографе GC-17A

"Shimadzu"(Япония). Температура детектора ионизации в пламени (ПИД) 260°С, испарителя - 250°С. Исследования проводили на кварцевой капиллярной колонке длиной 12 м, внутренним диаметром 0.25мм с метилсиликоновой неподвижной фазой. Температуру колонки изменяли в режиме программирования от 100° до 2 60°С со скоростью 5°С/мин.

Анализ спиртов и летучих кислот выполняли на газовом хроматографе 58 8 0А фирмы Hewlett-Packard (США). Температура ПИД - 2 60°С, температура испарителя 250°С„ Использовали стеклянную колонку, заполненную сорбентом 10% АТ-1000+1% фосфорной кислоты на Chromosorb W-AW 100-120 меш. Температуру термостата колонок изменяли от 80 до 225°С со скоростью 5°С/мин.

Анализ метиловых эфиров нелетучих кислот проводили на отечественном газовом хроматографе "Цвет-500". Температура ПИД - 260°С, температура испарителя - 250°С. Использовали стеклянную колонку длиной 1.6 м, внутренним диаметром 2 мм, заполненную сорбентом 10% АТ-1000 на Chromosorb W-AW 100-120 меш. Температуру термостата колонок изменяли в режиме программирования от 90° до 220°С со скоростью 5°С/мин.

Разделение дансилпроизводных аминов проводили на жидкостном хроматографе фирмы Altex на обращенно-фазной колонке (С8) в градиенте концентрации ацетонитрила в воде от 50 до 80% за 2 0 минут. Детектировали ультрафиолетоавым детектором на длине волны 254нм. Предел детектирования при отношении сигнал/шум равном 3 составляет от 1.10"11 до 5.10"11 моля/инжекцию для разных аминов.

Идентификацию компонентов выполняли на хромато-масс-спектрометре GCMS-QP2000 "Shimadzu" (Япония) с хроматографом GC-14A, снабженным РС2 96 для управления и обработки данных. Масс-спектрометр - квадрупольный, диапазон масс(ш/г) - 1090 0, ионизация электронами с энергией 7 0ЭВ. Предел детектирования - lng метилстеарата M(m/z298) в режиме селективных ионов. При идентификации компонентов проб использовали машинный поиск по библиотеке масс-спектров GC-MSPAC 200S.

Анализ сыворотки крови и ликвора человека на метаболиты грибов выполняли на газовом хроматографе GC-17A "Shimadzu" (Япония), снабженным пламенно-ионизационным детектором, на

кварцевой капиллярной колонке с метилсиликоновой неподвижной фазой. Температура детектора - 250°С, температура инжектора -2 0 0°С, температура колонки программировалась в режиме повышения со скоростью 4°С/мин от 100°С до 2 00°С.

Полученные данные обрабатывались на РС 386. Видовая идентификация грибковых штаммов проводилась путем машинного поиска, по методике, разработанной группой авторов в ВНИИБП (Помазанов В.В.,1988).

Схема подготовки проб для изучения метаболитов грибов

Схема подготовки проб для изучения химического состава клеток грибов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Поздоровкина, Вера Витальевна

Выводы

1. Установлены различия в химическом составе биомассы клеток клинически значимых -грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Micromonospora, Streptomyces, Nocardia, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Pénicillium, Torulopsis с использованием метода газовой хроматографии. Определены веществ - маркеры, специфичные для отдельных родов грибов: для грибов Candida - гептадеценовая кислота,

- для грибов рода Mucor - эйкозеновая кислота,

- для Nocardia asteroides - туберкулостеариновая кислота,

- для Streptomyces albus - изогексадекановая и антоизогептадекановая кислоты.

2. Родовая идентификации грибов возможна по жирнокислотному составу биомассы. Видовая идентификация 12 5 штаммов грибов рода Candida: С.albicans, С.tropicalis, C.krusei, C.kefyr, С.parapsilosis, C.glabrata проведена на основании совместного анализа их жирнокислотных и углеводных составов с использованием кмпьютерной обработки данных.

3. Определены специфические продукты метаболизма микроорганизмов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Pénicillium, Micromonospora, Actinomyces, Nocardia и показана возможность использования этих метаболитов для идентификации :

- для Candida информативными компонентами являются глицерин, арабинитол и манноза, этиловый и изиамиловый спирты и изокапроновая кислота;

- для Aspergillus, Fusarium и Cryptococcus - маннитол.

4. Газохроматографическая экспресс-диагностика инвазивного кандидоза возможна по уровням арабинитола и маннозы специфическим метаболитам-маркерам грибов Candida в биологических жидкостях человека (крови и ликворе). Установлены фоновые концентрации (норма) вышеназванных маркеров в крови и ликворе детей без клинико-лабораторных признаков грибковой инфекции.

Норма в сыворотке крови:

- арабинитол - 0,51±0,28 мкг/мл,

- манноза -17,7110,4 мкг/мл.

Норма в ликворе:

- арабинитол - 7,2±3,1 мкг/мл,

- манноза -35,1±17,4 мкг/мл.

5. Показано, что уровни метаболитов в сыворотке крови и ликворе пациентов с инвазивным кандидозом достоверно превышают норму. Совокупность изменений в содержании этих метаболитов является достоверным объективным диагностическим критерием, и рекомендуется для контроля эффективности проводимой антифунгальной терапии.

6. Доказана 'возможность использования маннитола - метаболита грибов Aspergillus для диагностики инвазивного аспергиллеза. Определены фоновые концентрации маннитола в сыворотке крови и ликворе контрольной группы детей без признаков грибковой инфекции:

- Норма маннитола в сыворотке - от 10 до 15 мкг/мл;

- Норма маннитола в ликворе не превышает 30 мкг/мл.

7. Уровень маннитола в сыворотке крови пациентов с инвазивным аспергиллезом значительно превышает норму.

Заключение.

Грибковая инфекция - проблема, с которой все чаще приходится сталкиваться врачам всех специальностей. Рост количества микозов связан с широким применением антибактериальных препаратов, цитостатиков, глюкокортикостероидов, снижающих иммунитет и, тем самым способствующих активизации условно-патогенных грибов. Особенно это касается недоношенных и новорожденных детей с незрелым иммунитетом, онкологических и гематологических больных после химиотерапии опухолей, больных СПИДом и других больных с ослабленным иммунитетом, у которых существует серьезная опасность быстрого развития системных и генерализованных форм инфекции.

Основное количество микозов вызывают грибы рода Candida и Aspergillus. Частота гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных грибами рода Candida, особенно Candida albicans, достигает 15% в общей этиологической структуре гнойно-воспалительных болезней (Пронина, 1996). В 40-60% случаев кандидоз остается нераспознанным или поздно диагностированным, и это значительно затрудняет лечение(Самсыгина, 1996). Постановка диагноза аспергиллеза является оцной из самых сложных проблем, особенно среди пациентов с иммунодефицитом. Поэтому очень важно как можно раньше поставить правильный диагноз и начать целенаправленную антифунгальную терапию.

Зависимость антибиотикочувствительности штаммов от вида гриба, отмеченная рядом авторов (Kerridge, 1987; Nerson,1987) указывает на необходимость быстрой идентификации выделенных грибковых культур. . Это особенно актуально для вышеперечисленных групп больных с риском развития генерализованной грибковой инфекции.

Для идентификации возбудителя традиционно использовались методы, основанные на оценке их фенотипических особенностей: морфологических, культуральных, биохимических и иммунохимических. Вместе с тем, специфичность всех этих методов, согласно определению фенотипа, может• варьировать в зависимости от условий внешней среды. Использование гибридизационного анализа в целях идентификации и диагностики оказалось очень эффективным (Турова, 1992), однако, возможности широкого применения этого метода ограничены из-за сложности и трудоемкости экспериментальных процедур, отсутствия коммерческих наборов реагентов, автоматических систем проведения реакции и обнаружения ее результатов. Это определило необходимость поиска новых идентификационных тестов. Благодаря развитию хроматографических методов исследования возникло новое направление, основанное на использовании знаний о химическом составе клеточных компонентов для их идентификации.

Мы проанализировали жирнокислотный и углеводный состав медицински значимых штаммов грибов и выяснили значение полученных данных для их идентификации и классификации. В работе представлены результаты исследования клеточных высших жирных кислот восьми видов грибов рода Candida: С.albicans, С.tropicalis, C.krusei, C.kefyr, С.parapsilosis, C.glabrata, C.famata и С.guilliermondii, и жирнокислотного состава микроорганизмов родов Aspergilus, Mucor, Fusarium,

Geotrichum, Cryptoccocus, Pénicillium и Micromonospora, Streptomyces, Nocardia, а также проведен сравнительный анализ с грибами рода Candida.

В результате исследования профилей клеточных жирных кислот вышеперечисленных грибов обнаружены существенные различия в их качественном и количественном составе, показана их индивидуальность на уровне рода. Основным отличием липидного профиля грибов рода Candida является высокое содержание кислот с 17-ю углеродными атомами, особенно гептадеценовой кислоты, не встречающейся у других изученных нами грибов. Характерным для грибов рода Mucor является содержание длинноцепочечных жирных кислот, таких как С20:1, С22:0, С2 4:0. Эйкозенов'ая кислота (С20:1), найденная в штаммах грибов Mucor, характерна только для данного рода и является его отличительным признаком. Жирнокислотный > состав изученных актиномицетов харкктеризуется наличием кислот с разветвленной углеродной цепью, что резко ¿отличает, ,их от других, видов. Actinomyces, например Actinomyô^ israelii и Actinomyces viseosus, в спектре которых присутствуют кислоты только с прямой цепью. Ведущей кислотой у грибов Streptomyces albus, как и у Micromonospora monospora является изогексадекановая кислота ici6:0. Характерным компонентом обладают грибы Nocardia asteroides, в составе биомассы которых обнаружена туберкулостеариновая (10СНЗС18:0) и Í1,12-гексадеценовая (С16:1А11) кислоты. Мы пришли к выводу, что анализ липидных компонентов грибной клетки позволяет сделать заключение о родовой принадлежности изучаемого штамма. Тем самым показана информативность и специфичность липидных профилей грибов на уровне рода. В результате нашей работы был обнаружен ряд специфических маркеров клеточной мембраны грибов, принадлежащих к разным родам, по которым они могут быть узнаны не только в чистой культуре, но и в ассоциациях, например в инфицированной биологической жидкости или ткани человека.

Нами был определен качественный состав и процентное соотношение моносахаров клеточной биомассы 55 штаммов б видов грибов рода Candida и 4 4 штаммов микроорганизмов родов Aspergillus, Mucor, Fusarium, Cryptoccocus, Pénicillium, Sporotrichum, Alternarla и Micromonospora, Actinomyces, Nocardia. Показано, что только грибы рода Candida и Sporotrichum содержат в своем составе сахарный спирт арабинитол, который ранее по литературным данным (Bernard,1981; Wong,1982) был представлен только как продукт жизнедеятельности грибов Candida albicans. Для вышеперечисленных родов отличительным признаком является также более низкое содержание маннозы и фруктозы, в то время как у грибов С.albicans уровень маннозы и фруктозы достаточно высок. Маннитол в низких концентрациях может обнаруживаться у С.albicans, но всегда отсутствует у Nocardia. Высокое содержание маннитола характерно для представителей родов Aspergillus, Penicillum, Alternaria, Fusarium, Micromonospora.

Анализ клеточных моносахаров большого количества грибов, относящихся к-различным родам показал, что их состав является специфичным для многих из изученных микроорганизмов.

Было показано, что клетка грибов Candida содержит достаточное число липидных компонентов для видовой идентификации грибов. На основании полученных нами жирнокислотных спектров б видов грибов Candida был организован локальный банк данных, содержащий их жирнокислотные профили и проведена видовая идентификация грибов Candida (С.albicans - 40 штаммов, С.tropicalis - 23 штамма, C.kefyr - 14 штаммов, С.parapsilosis - 16 штаммов, C.glabrata - 12 штаммов, C.krusei - 20 штаммов) по составу жирных кислот с использованием персонального компьютера.

Для обработки данных использовали модифицированную в ВНИИБП программу для идентификации микроорганизмов по профилю жирных кислот. Специфичность идентификации была повышена путем введения в базу данных дополнительных компонентов клетки. Мы использовали для этого клеточные моносахара грибов Candida. На основании компьютерного сопоставления профилей жирных кислот и моносахаров грибных клеток мы пришли к заключению о существовании непрерывности в изменении их химического состава при переходе от одного вида к другому. Наши исследования подтверждают концепцию, выдвинутую ранее автором Осиповым (Осипов, 1996) о существовании континуума непрерывного количественного изменения химических параметров клетки, которые переходят в определенный момент в качественные - меняется вид.

Помимо клеточных компонентов для идентификации микроорганизмов широко применяются продукты их жизнедеятельности. Для этого мы изучили состав контрольной и культуральной сред после роста грибов родов Candida, Aspergillus, Fusarium, Geotrichum, Sporotrichum,

Cryptoccocus, Pénicillium, Oidiodendrum, Alternaria, Mucor, Micromonospora, Streptomyces, Nocardia. Исследован широкий спектр их метаболитов, таких как свободные сахара, спирты, летучие и нелетучие кислоты, амины и выявлены вещества, специфичные для этих родов или видов, а также выяснена значимость некоторых из них для идентификации.

В результате проведенного исследования спектра метаболитов некоторых грибов был определен целый ряд информативных компонентов для хемотаксономии этих грибов. Из состава свободных Сахаров культуральной среды после роста грибов Candida такими веществами являются глицерин, арабинитол и манноза. Для грибов родов Aspergillus, Fusarium и Cryptococcus информативным компонентом является маннитол.

Из летучих компонентов для идентификации грибов Candida информативными представляются этиловый и изиамиловый спирт и изокапроновая кислота. Из нелетучих компонентов, перспективных для использования в идентификации, интерес вызывают фумаровая, янтарная, щавелевоуксусная, пировиноградная кислоты. Продуцирование в среду роста этанола, изоамилового спирта, а также нелетучих кислот, схожих по спектру с Candida, характерно для грибов рода Sporotrichum.

В результате изучения состава полиаминов, выделяемых в культуральную среду грибами Candida albicans перспективных маркеров для целей таксономии не выявлено. Для других видов Candida среди полиаминов информативных компонентов также не обнаружено. Для грибов рода Aspergillus характерно повышенное содержание путресцина, а также специфического неидентифицированного вещества. Небольшое количество спермидина характерно для грибов Fusarium и Alternaria, a ß-фенилэтиламина - для Penicillum и Sporotrichum.

Определение специфических метаболитов медицински значимых грибов чрезвычайно важно для клинической экспресс-диагностики инвазивных микозов. Мы применили газохроматографический метод, основанный на принципе постоянства и специфичности спектра метаболитов грибов рода Candida для диагностики инвазивного кандидоза. Поскольку ни один из существующих методов лабораторной диагностики инвазивного кандидоза не является универсальным, включая микроскопические, культуральные, серологические и цитогистологические исследования, данный метод может быть использован как вспомогательный при решении вопроса о диагностике и назначении адекватной терапии. Метод хроматографической диагностики кандидоза отличается экспрессностью, высокой чувствительностью и специфичностью, относительно невысокой стоимостью. Так как метод основан на определении метаболитов грибов в биологической жидкости (ликвор, кровь), он не требует инвазивных процедур (биопсия и т.д.) и предварительного выделения чистой культуры.

Мы определили фоновые концентрации арабинитола и маннозы - метаболитов грибов рода Candida в сыворотке крови и ликворе (отобранных в ходе других диагностических и лечебных мероприятий) контрольной группы детей без каких-либо признаков грибковой инфекции.

Нормальный уровень : арабинитола в сыворотке составил 0,51±0,2 8 мкг/мл. Нормальная концентрация маннозы составила 17,7±10,4 мкг/мл.

Было обнаружено, что нормальная концентрация арабинитола и маннозы в ликворе намного выше, чем в крови. Уровень арабинитола в ликворе в контрольной группе был 7,2±3,1 мкг/мл. Уровень маннозы в контрольной группе был 35,1+17,4 мкг/мл.

У всех детей с различными формами инвазивного кандидоза на фоне онкогематологических заболеваний, обследованных методом ГХ, до начала противогрибковой терапии уровень арабинитола в крови был достоверно (рА<0,001) выше нормы и составлял 1,8710,24 мкг/мл, маннозы - до 106,4±21,8 мкг/мл (рм<0, 001) .

При ГХ-исследовании спиномозговой жидкости детей с диагнозом грибкового менингита установлено, что арабинитол в ликворе достоверно (р= 0,012) значительно превышал норму и составил 35,7112,5 мкг/мл. В среднем уровень маннозы составил 91,4±21,0 мкг/мл.

В результате адекватной терапии уровень метаболитов существенно снижался и практически достигал нормальных показателей, что совпадало с положительной клинической динамикой. -Таким образом, метод газовой хроматографии можно использовать для мониторинга эффективности противогрибковой терапии путем анализа изменений уровней метаболитов в сыворотке крови или ликворе.

Обследование группы детей с неинвазивным кандидозом, или без клинических признаков кандидоза (кандидоносительство), показало незначительное возрастание уровней метаболитов по сравнению с их уровнями при инвазивной инфекции. Таким образом, оценка уровней арабинитола и маннозы может служить дифференциально-диагностическим критерием в комплексе с другими клинико-диагностическими мероприятиями.

В опытах in vitro мы обнаружили, что некоторые грибы рода Aspergillus продуцируют значительное количество маннитола, шестиатомного сахарного спирта. В связи с этим выдвинуто предположение о возможности использования этого показателя с целью диагностики инвазивного аспергиллеза. При анализе уровней маннитола в крови больных детей из онкогематологического отделения с достоверно подтвержденным диагнозом инвазивного аспергиллеза, (поставленного по гистологическим данным и/или аутопсии), выявлено, что из 11 таких больных у 9 были обнаружены высокие концентрации маннитола. Уровень маннитола в сыворотке крови детей контрольной группы составил 10-15 мкг/мл. Нами было показано, что нормальные фоновые концентрации маннитола в ликворе выше, чем в крови, и составляет 20-30 мкг/мл. Сравнивая уровень содержания маннитола в сыворотке крови в норме с уровнем маннитола у пациентов с инвазивным аспергиллезом, мы пришли к выводу, что грибы Aspergillus продуцируют в ткани достаточное количество маннитола, чтобы поднять его уровень в крови больного до высоких значений (от 30 до 80 мкг/мл) . Таким образом, полученные предварительные данные указывают на перспективность исследования содержания метаболита грибов рода Aspergillus - маннитола в биологических жидкостия человека с целью экспресс-диагностики инвазивного аспергиллеза.

На основании полученных данных изданы методические рекомендации "Диагностика грибковой инфекции у детей методом газожидкостной хроматографии", утвержденные Минздравом РФ и рекомендуемые к внедрению в крупных диагностических центрах по всей территории России для лабораторной диагностики кандидоза и мониторинга эффективности противогрибковой терапии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Поздоровкина, Вера Витальевна, 1998 год

Список использованной литературы.

1. Антонов В.Б., Баранцевич Е.П., Мирзаболаева А. К., Клиническое применение дифлюкана при поверхностных и глубоких микозах, Методические рекомендации, 1995, С.Петербург, с. 17.

2. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Геносистематика бактерий,М.,"Наука",1976,с.150.

3. Быченко Б.Д., Каплунова О.П., Применение газовой хроматографии для идентификации рода Clostridium, Журн. Микроб.Эпидем.Иммунол., 1988, т.З, с.118-119.

4. Васюренко З.П., Фролов А.Ф., Жирнокислотный состав бактерий как хемотаксономический критерий, Журн. Гигиены, эпидем., микробиол., эммунол.,198 б, т.30, с.293-300.

5. Васюренко З.П., Фролов А.Ф., Смирнов В.В., Рубан Н.М., Жирнокислотные профили бактерий, патогенных для человека и животных, Киев,"Наукова думка",1992,2бЗстр.

6.Кубась В.Г., Особенности биохимических изменений и формирование иммунитета при экспериментальном системном кандидозе, дисс. док. мед. наук, Л.,1990, с.376.

7. Кубась В.Г., Чайка Н.А., Кандидоз и СПИД, С.-Петербург, 1992, с.7-9.

8 . Лещенко В.М.,Лабораторная диагностика грибковых

заболеваний, М.,"Медицина", 1978, с.5-23.

9.Малхасьян С.С., Нечаев А.П.,Гаврилова Н.Н., Зотова Е.Е., Доронина О.Д., Групповой и жирнокислотный состав липидов некоторых родов дрожжей, Прикладн. биохим. и микробиолог., 1983, т.XIX., вып.2-е.193-201.

10. Маякова Т.И., Кузнецова Э.Э. и др., Аспекты использования метода газожидкостной хроматографии для экспресс-диагностики возбудителей хирургической инфекции, Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии, 1988, ч.2. с.18-19.

11. Маякова Т.И., Кузнецова Э.Э., Лазарева М.В., Количественное определение летучих жирных кислот газохроматографическим методом для экспресс-диагностики возбудителей неклостридиальной анаэробной инфекции, Вопросы мед.химии, 1989, т.35, с.71-75.

12. Миронов А.Ю., Пашков Е.П., Истратов В.Г., Быков A.C., Бактериологическая и газохроматографическая диагностика неклостридиальной анаэробной инфекции при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области и J10P-органов, Клин. Микробиология, 1988, т.8, с.31-35.

13. Митрука Б.М., Применение газовой хроматографии в биологии и медицине, М., 1978, с.335.

14. Осипов Г.А., Шабанова Е.А., Бабайцева В.А., Недорезова Т.П., Ходорковская В.А., Истратов В.Г., Сергеева Т.И., Чирикова Е.В., Способ диагностики клостридиальной анаэробной газовой инфекции, Патент РФ N кл. G01N 33/50.-Зарегистртровано в гос.реестре 15.10.94.-Бюл.N19.

15. Осипов Г.А., Демина A.M., Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах, Вестник РАМН, 1996, N1.

16. Пронина Е.В., Горшкова Г.И., Богомолова Т.С. и др. Диагностика и лечение глубоких форм кандидоза у детей раннего возраста, В сб.: III Международный микологический симпозиум "Патогенез, диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии", С-Пб., 1995, с.105.

17. Реброва Р.Н., Некоторые аспекты проблемы кандидозной инфекции в сб.:Проблемы глубоких микозов, ЦИУВ,М.,1984,с.32.

18. Реброва Р.Н., Чистякова И.С., Серебрянникова И.И. Грибы рода Candida у здоровых людей, Вестник дерматологии и венерологии, 1986, N3, с.62-65.

19. Реброва Р.Н., Грибы рода Candida при заболеваниях не грибковой этиологии,М.,"Медицина",1989,с.11-16.

20. Романюк Ф.П. Кандидоз центральной нервной системы у детей, Учебное пособие, 1996, С.-Петербург.

21. Самсыгина Г. А., Буслаева Г.Н., Корнюшин М.А., Кандидоз новорожденных и детей раннего возраста, 1996, Москва, с.76.

22. Степанова Ж.В., Клиника, патогенез и терапия хронического генерализованного (гранулематозного) кандидоза, дисс.док.мед.наук, Л.,1990,с.427.

23. Феофилова Е.П.- Клеточная стенка грибов-М.Наука-1983.

24. Abel K., De Schmertzing H., Peterson J.I., Classification of microorganisms by analysis of chemical composition, J.Bacterid. , 1963, v.85, p: 1039-1044 .

25. Axelsson B., Saraf A., Larsson L., Determination of ergosterol in organic dust by gas chromatography-mass spectrometry, J.Chromatogr.,1995, v.666, p.77-84.

26. Andersen B.M., Weyant R.S., Steigerwalt A.G., Characterization of Neisseria elongata subsp. glycolytica isolates obtained from human wound specimens and blood cultures, J.Clin.Microbiol., 1995, v.33, p.76-78.

27. Andriole V.T., Aspergillus infections: problems in diagnosis and treatment, Infect.Agents Dis, 1996, v. 5, p.47-54.

28. Aries R.E., Gutteridge C.S., Ottley T.W., Evaluation of a low-cost, automated pyrolisis mass spectrometer, J.Anal.Appl.Pirolysis, 1986, V.9, p.81-98.

29. Asselineau J., Vers l'utilisation des lipides pour l'identification d'une souche bacterienne, Bulletin de l'institut Pasteur, 1983, v.81, p.367-381.

30. Asselineau C., Daffe M., David H.L., Laneelle M.A.,Rastogi N., Lipids as taxonomic markers for bacteria derived from leprosy infections. Acta leprol.1984, v. 95, p. 121-127.

31. Audette R.C.S., Baxter R.M., Walker G.C., A stady of the lipid content of Trichophyton mentagrophytes, Canad.J.Microb.,1961, v.7/ p.282-283.

32. Berenguer J., Buck M., Witebsky F., Stock F., Pizzo P.A., Walsh T.J., Lysis-centrifugation blood cultures in the detection of tissue-proven invasive candidiasis: disseminated versus singale-organ infection, 1993, Diagn.Microbiol. Infect., v.17, p.103-109.

33. Bernard E.M., Christiansen K.J., Tsang S.F., Armstrong D., Rate of arabinitol prodaction by pathogenic yeast species, J.Clin.Microbiol., 1981, v.14, p.189-194.

34. Bernard E.M., Wong B., Armstrong D., Stereoisomeric configuration of arabinitol in serum, urine and tissues in invasive candidiasis, J. Inf. Diseas, 1985, v.151, p.711-715.

35. Bernard K., Bellefeuille M., Hollis D.G., Cellular fatty acid composition and phenotypic and cultural characterization of CDC fermentative coryneform groups 3 and 5, J.Clin.Microbiol.,1994, v.32, p.1217-22.

36. Bernard K., Tessier S., Winstanley J., Chang D., Borczyk A., Early recognation of atypical Francisella tularensis strains lacking a cysteine requirement, J.Clin.Microbiol.,1994, v.32, p.551-553.

37. Beznhardt H., Knoke M., Seebacker C., Systemmykosen. Definition, pathogenese und diagnostik. Klin. Med., 1986, v.41, p.585-588.

38. Bitteneourt A.L., Santos W.C., H.de Olweira C., Placental febol candidiasis, Mycopathologia, 1984, v.87, p.181-187.

39. BrennerD.J.,Fanning G.R.,Knutson J.K.L.,Attempts to classify herbicola group Enterobacter agglomerans strains by deoxyribonucleicacid hybridization and phenotypic test, Int. J. Syst. Bacterid. , 1984,v. 1,p.45-55.

40. Brenner D.J. , Hollins D.G., Moss C.W., et al., Proposal of Afipia gen. nov., with Afipia felis sp. nov. (formerly the cat scratch disease bacillus), Afipia clevelandensis sp. nov. (formerly the Cleveland Clinic Foundation strain), Afipia broomeae sp. nov., and three unnamed genospecies J.Clin.Microbiol. 1991,v. 29,p. 2450-2460.

41. Brondz I., Olsen I., Review. Chemotaxonomy of selected spesies of the Actinobacillus-Haemophilus-Pasteurella group by means of the gas chromatography, gas chromatography-mass-spectrometry and bioenzymatic methods. J.Chromatogr., 1986, v.380,p.1-17 .

42. Brondz I., Carlsson J., Sjostrom M., Sundqvist G., Significant of cellular fatty acid and sugars in defining the genus Porphyromonas, J. of System. Bacter., 1989, v.39, p.314-318.

43. Brondz I., Olsen I., Gas chromatographic assessment of alcoholyzed fatty acids from yeasts: a new chemotaxonomic method, J.Clin.Microbiol.,1989, v.27, p.2815-2819.

44. Brondz I., I.Olsen, Multivariate Analyses of Cellular Carbohydrates and Fatty Acids of Candida albicans, Torulopsis glabrata, and Saccharomyces cerevisiae, J.of Clinical Microb., 1990, v.28, p.1854-1857.

45. Brondz I., Olsen I., Haapasalo M., Van-Winkelhoff A.J., Multivariate analyses of cellular fatty acid data of Prevotella, Bacteroides and Porphyromonas spp., J.Gen.Microbiol., 1991, v.137, p.1445-1452.

46. Brondz I., Olsen I., Multivariate analyses of cellular fatty acids in Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas, Wolinella and Campylobacter spp., J.Clin.Microbiol., 1991, v. 29, p.183-189.

47. Brondz I., Olsen I.,Multivariate chemosystematics demonstrate two group of Actinobacillus actinomycetemcomitans strains, Oral Microbiol.Immunol., 1993, v.8, p.129-133.

48. Brondz I., Olsen I., Review of chemosystematics: multivariate approaches to oral bacteria and yeast, Acta Odontol. Scand.,1992, v.50, p.321-336

49. Brown A.E. Overview of fungal infections in cancer patients, 1990, Semin. Oncol.17(Suppl.6), p.2-5.

50. Butler W.R., O'Connor S.P., Yakrus M.A., Mycobacterium celatum sp. nov., Int.J.Syst.Bacteriol., 1993, v.43, p.539-548 .

51. Christensson B., Roboz J., Arabinitol enantiomers in cerebrospinal fluid, J.Neurological Sciences, 1991, v.105, p.234-239.

52. Christensson B., Wiebe T., Perhson C., Larsson L., Diagnosis of invasive candidiasis in neutropenic children with cancer by determination of D-/L-arabinitol ratio in urine, J.Clin.Microbiol., 1997, v.35, p.636-640.

53. Daly J.S., Worthington M.G., Brenner D.J, Moss C.W., Rochalimaea elizabethae sp. nov. isolated from a patient with endocarditis, J.Clin.Microbiol., 1993, v.31,p.872-881.

54. Daneshvar M.I., Hollis D.G., Moss C.W., Chemical characterization of clinical isolates which are similar to CDC group DF-3 bacteria,J.Clin.Microbiol., 1991, v.29,p.2351-2353.

55. Dart R.K., Stretton R.J., Effect of temperature on fatty acid composition in Aspergillus, Microbios Letters, 1976, v. 3, p . 31-34.

56. Deacon A.G., Estimation of serum arabinitol for diagnosing invasive candidiasis, J.Clin.Pathol.1986, v.39, p.842-85012.

57. De Rosa M., Gambacorta, The lipid of archaebacteria, Prog.Lipid Res., 1988,v.27, p.153-175.

58. Dees S.B., Moss C.W., Cellular fatty acids of Acaligenes and Pseudomonas species isolated from clinical specimens, J.Clin.Microbiol., 1975, v.l, p.414-419.

59. Dees S.B., Moss C.W., Identification of Achromobacter species by cellular fatty acids and by production of keto acids, J.Clin.Microbiol., 1978, v.8, p.61-66.

60. Dees S.B., Moss C.W., Weaver R.E., Hollis D., Cellular fatty acid composition of Pseudomonas paucimobilis and groups IIk-2,Ve-l,Ve-2. J.Clin.Microbiol., 1979, v.10, p.206-209.

61. Dubravka Y., Period.Biologorum, 1982, v.84,p.31-41.

62. Dupont B., Invasive fungal infections caused by yeasts as emerging pathogens. Infec. Dis. in Clin. Practice, 1994, v.3, p. 78-82.

63. Eng R.H., Chmel H., Buse M.,Serum levels of arabinitol in the detection of invasive candidiasis in anamals and humans, J.Inf.Diseas, 1981, v.143, p.677-683.

64. Fourche J., Gas chromatographic fatty acid determination to differentiate Nocardia asteroides, Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium chelonei, J.Chromatogr., 1989, v.487,p.142-146.

65. Freeman R., Goodfellow M., Gould F.K., Hudson S.J., Lighfoot N.F.,Pyrolisis-mass spectrometry for the rapid epidemiological typing of clinically significant bacterial pathogens, J.Med.Microbiol,1990,V.32,p.283-286.

66. Freeman R. , Goodfellow M., Gould F.K., Hudson S.J. Rapid epidemiological typing of clinical isolates of Staphylococcus epidermidis: a preliminary study with pyrolisis mass spectrometry, Zbl. Bakt. Hyg.,1990,V.21,p.396-398.

67. Freeman R., Gould F.K., Wilkinson R., Ward A.C., Lighfoot N.F., Sisson A.C.,Rapid inter-strain comparison by pyrolisis mass spectrometry of coagulase-negative

staphylococci from persistent CAPD peritonitis, Epidemiol.Infect., 1991,V.106, p.239-246.

68. Gangopadujay P.K., ThadepalliH., Roy I., Ansari A., Identification of spesies of Candida, Cryptococcus and Torulopsis by gas-liquid chromatography, J.Infec.Diseases.,1979, v.140, p.952-958.

69. Greenfield R.A., Troutt D.L., Richard R.C., Altmiller D.H., Comparison of antibody, antigen, and metabolite assays in rat models of systemic and gastrointestinal candidiasis, J.Clin.Microbiol., 1988, v.26, p.409-417.

70. Gruner E., Steigerwalt A.G., Hollis D.G., Recognition of Dermabacter hominis, formerly CDC fermentative coryneform group 3 and group 5, as a potential human pathogen, J.Clin.Microbiol., 1994, v.32,p.1918-1922.

71. Gold J., Wong B., Bernard., E., Kiehn., T., Armstrong.D., Serum arabinitol concentration and arabinitol/creatinin ratios in invasive candidiasis, J.Infect.Dis., 1983, v.147, p.323-333.

72. Gorin P.A., Spencer J.F.T., Proton magnetic resonans spectroscopy - an aid in identification and chemotaxonomy of yeasts. Adv.Appl.Microbiol., 1970, v.13,p.25-89.

73. Hollis D.G., Weaver R.E., Moss C.W., Daneshvar M.I., Wallace P.L., Chemical and cultural characterization of CDC group WO-1, a weakly oxidative gram-negative group of organisms isolated from clinical sources, J.Clin.Microbiol., 1992,v.30,p.291-295.

74. Hollis D.G., Moss C.W., Daneshvar M.I., Meadows L., Jordan J., Hill B., Characterization of Centers for Disease Control group N0-1, a fastidious, nonoxidative, gramnegative organism associated with dog and cat bites, J.Clin.Microbiol., 1993,v.31,p.746-748.

75. Hollis D.G., Daneshvar M.I., Moss C.W., Baker C.N., Phenotypic characteristics, fatty acid composition, and isoprenoid quinone content of CDC group Ilg bacteria,J.Clin.Microbiol., 1995,v.33,p. 762-764.

76. Holmes A.R., Lee Y.C., Cannon K.D., Jenkinson H.F., Sheferd H.G., Yeast-specific DNA probes and their application for the detection of Candida albicans, 1992, J.Med.Microbiol.v.37, p.346-351.

77. Holmes B., Moss C.W., Daneshvar M.I., Cellular fatty acid compositions of "Achromobacter groups B and E", J.Clin.Microbiol., 1993,v.31,p.1007-1008.

78. Jantzen E., Bryn K., Bergan T. , Bovre K., Gas chromatography of whole cell metanolysates. V. Fatty acids composition of Neisseria and Moraxella. Acta. Patol. Microbial. Scand.,1975, v.82,p.767-779.

79. Jantzen E., Bryn K., Bergan T. , Bovre K., Gas chromatography of whole cell metanolysates. VII. Fatty acids composition of Acinetobacter in relatin to the taxonomy of Neisseriaceae. Acta. Patol. Microbial. Scand., 1976,v.83,p.569-576.

80. Jantzen E.,Analysis of cellular components in bacterial classification and diagnosis. InrOldham G.,Larsson L., Mardh P.A., Gas chromatography and mass spectrometry. Application in microbiology. New York;Plenum Press, 1984,p.257-302.

81. Jantzen E., Bryn K., Whole-cell and lipopolysaccharide fatty acids and sugars of Gram-negative bacteria, In; Goodfellow M. and Minnikin D., Chemical methods in bacterial systematics. The Society for Appl.Bacter. Technical Series. Academ. Press, London, 1985,p.145-171.

82. Jantzen E.,Sonesson A., Tangen T., End J., Hydroxy fatty acid profiles of Legionella species: Diagnostic usefulness assessed by principal component analysis, J.Clin.Microbiol.,1993, v.31,p.1413-1419.

83. Jones M.G., Noble W.C., A study of fatty acids as a taxonomic tool for dermatophyte fungi, J. Applied Bacterid., 1981, v. 50, p . 577-583 .

84. Jonson J.L., Nucleic acids in bacterial classification, Bergey's manual of systematic bacteriology,Baltimore:Williams and Wilkins Co,1984,v.l,p.8.

85. Kaneda T., Iso-and Anteiso-Fatty Acids in Bacteria: Biosynthesis, Function, and Taxonomic Significans, Microbiol. Rev.,1991, v.55, p.288-302.

86. Kaneda T., Biosynthesis of branched-chain fatty acids, I.Isolation and identification of fatty acids from Bacillus subtilis, J.Biol.Chem.,1963, v.238, p.1222-1228.

87. Kaneda T., Fatty acids in genus Bacillus: an example of branched-chain preference, Bacterial.Rev., 1977, v. 41, p.391-418.

88. Karayannopoulou G., Weiss J., Damjanov I., Arch. Pathol. Lab. Med., 1987, V. 112, p.746-748.

89. Kerridge D.,Nicholas R.O.,Wayman F.I. Resistance to Clinically Important Antimycotic Drugs in Candida spp. Ann.1st.Super. Sanita, 1987, v.23, p.827-833.

90. Kiehn T.E., Bernard E.M., Golf G.W.M., Armstrong D, Candidiasis: detection by gas-liquid chromatography of D-arabinitol, a fungal metabolite, in human serum, American Assoc.for Advanc. of Science, 1979, v.206, p.577-580.

91. Kish Z, Jack R.C., Phospolipids of two strains of dermatophyte Arthroderma uncinatum, Lipids, 1974,v.9, p.264-268.

92. Kobayashi K. , Suginaka H., Yano I., Analysis of fatty acid composition of Candida species by gas-liquid chromatography using a polar column, Microbios, v.51, p. 3742 .

93. Kostiw L.L., Vicher E.E., Lyon I.// The fatty acids of Trichophyton rubrum// Mycopathologia, 1961,v.29, p.145-150.

94. Krcmery V.J., Kunova E., Jesenska Z., Trupl J., Invasive mold infections in cancer patients: 5 years' experiece with Aspergillus, Mucor, Fusarium and Acremonium infections, Support Care Cancer, 1996, v.4, p.39-45.

95. Krieg N.R., Holt J.G., Berdgey's Manual of Systematic Bacteriology, 1984, v.l, The Williams & Wilkins Co., Baltimore.

96. Lachance M.A., Luttikhuis A., Anweiler L.L., Assessment ofintraspecific variation in Clavispora sp. by restriction mapping of tandemly repeated deoxyribonucleic acid, Int. J. Syst .Bacterid. , 1985,v. 35,p. 4 62-466.

97. Lambe D.W., Ferguson K.P., Mayberry W.R., Characterization of Bacteroides species by direct fluorescent antibody steining and cellular fatty acid profils, Can.J.Microbiol.,1982,v.28, p.367-374.

98. Larone D.H., Medically importent fungi, A guide to identification, Elsewier, N.-Y., 1993, 230p.

99. Larsson L., Determination of microbial chemicak markers by gas chromatography-mass spectrometry - potential for diagnosis and studies on metabolism in sity, APMIS, 1994, v.102, p.161-169.

100. Larsson L., Pehrson C., Wieb T., Christensson B., Gas chromatographic determination of D-/L-arabinitol raition in urine: a potential method for diagnosis of disseminated candidiasis, J.Clin.Microbiol., 1994, v.32, p.1855-1859.

101. Lategan P.M., Erasmus S.C., Preez J.C., Characterisation of pathogenic species of Candida by Gas Chromatography: Preliminary Findings, J.Med.Microbiol., 1981, v.14,p.219-

222

102. Lechevalier H., Lechevalier M.P., Chemotaxonomic use of lipids - an overview, Microbial lipids, 1988,v.1,p.869-902

103. Lehtonen L., Detection of microbial constituents and metabolites by gas chromatography and mass spectrometry, Turun Yliopisto, 1996, p.21.

104. Li Y.E., Georg L.K., Can.J.Microbiol., 1968, v.14, p.749.

105. Lori L., Hadson C., Hadson J.B., Development of DNA probes for Candida albicans, 1988, Diagn.Micr.Infect.Dis., v. 10., p.171-179.

106. Lloyd K.O., Biochemistry, 1970, v.9, p.3446.

107. Magee J.T., Hindmarch J.M., Burnett I.A., Pease A., Epidemiological typing of Streptococcus pyogenes by pyrolisis mass spectrometry, J.Med.Microbiol., 1989, V.30, p.273-278.

108. Maksymiuk A.W., Thongprasert S., Hopfer R., Luna M., Fainsten V.,Systemic candidiasis in cancer patient, Am. J. Med., 1984, V.27, p.20-27.

109. Marier R.L., Milligan E., Fan Y.D.,Elevated mannose levels detected by gas-liquid chromatography in hydrosylates of serum from rats and humans with candidiasis, J.Clin.Microbiol., 1982, v.16, p.123-128.

110. Mayberry W.R., Lambe D.W., Ferguson K.P.,Identification of Bacteroides species by cellular fatty acid profils, Int.J.Syst.Bacterid., 1988, v.32, p.21-27.

111. McSherry C., Lewis C., Cruckshank G., Rickhardson M.D., Measurement of serum arabinitol by gas-liquid

chromatography: limitation for detection of systemic Candida infection, J.Clin.Pathology, 1993, v.43, p.475-476.

112. Matthews R.C., Early diagnosis of systemic candidal infection, 1993, J.Antimicrob.Chemother., v.31, p.809-812.

113. Megson G.M., Stevens D A., Hamilton J R., Denning D W., D-mannitol in cerebrospinal fluid of patients with AIDS and cryptococcal meningitis, J.Clin.Microbiol.,1996, v.34, p.218-221.

114. Millar S.J., GoldsteinE.G., Levine M.J., Hausmann E., Modulation of bone metabolism by two chemically distinct lipopolysaccharide fraction from Bacteroides gingivalis, Infect.Immunol.,1986, v.51,p.302-306.

115. Mitruka B.M., Jonas A.M., Fingerprinting of bacterial infection by ggas-chromatography, In: 10th Internatinal congress of microbiology, Mexico city, 1970, p.119.

116. Monson T.P., Wilkinson K.P.,Mannose in body fluids as an indicator of invasive candidiasis, J.Clin.Microb., 1981, v.14, p.557-562.

117. Moss C.W., Dees S.B., Cellular fatty acid and metabolic prodacts of Pseudomonas spesies obtained from clinical specimens, J.Clin.Microb.,1976, v.4, p.492-502.

118. Moss C.W., Dees S.B., Cellular fatty acids of Flavobacterium meningosepticum and Flavobacterium species group lib, J.Clin.Microb., 1978, v.8, p.772-774.

119. Moss C.W., Samuels S.B., Weaver R.E., Cellular fatty acid composition of selected Pseudomonas species, Appl.Microbiol., 1972, v.24, p.596-598.

120. Moss C.W., Dees S.B., Guerrant G.O., Gas-liquid chromatography of bacterial fatty acids with a fused-silica capillary column, J.Clin.Microb.,1980, v.12, p.127-130.

121. Moss C.W., Gas-liquid chromatography as an analytical tool in microbiology, J.Clin.Microbiol., 1981, v.12, p.127-130 .

122. Moss C.W., Shinoda T., Samuels J.W., Determination of cellular fatty acid composition of various yeasts by gasliquid chromatography, J.Clin.Microb., 1982, v.16, p.1073-

1079.

123. Moss C.W., Daneshvar M.I., Identification of some uncommon monounsaturated fatty acids of bacteria, J.Clin.Microbiol., 1992, v.30, p. 2511-2512.

124. Moss C.W., Daneshvar M.I., Hollis D.G., Biochemical characteristics and fatty acid composition of Gilardi rod group 1 bacteria, J.Clin.Microbiol., 1993, v.31, p. 689691.

125. Nerrson D., De Closets F., Kures L.,e.a. Sensibilité des levures aux antifongiques par une micromethode standardisée. Bull. Soc. Fr. Micol. Met. 1987, v.2, p.395-398 .

126. Nucci M., Pulcheri W., Spector N., Fungul infections in neutropenic patients. A 8-year prospectve study, Rev.Inst.Med.Trop.SaoPaulo, 1995, v.37, p.397-406.

127. Oyama V.I., Use of gas chromatography for the detection of life on Mars, Nature, 1963, v.200, p.1058-1059.

128. Reiner E., Studies of differentiation of microorganisms by pyrolysis-gas-liquid chromatography, Nuture, 1965, v.206, P.1272-1274.

129. Reiss E., Morrison C., Nonculture methods for diagnosis of disseminated candidiasis, Clin.Microb.Rev., 1993, v. 6, p.311-323.

130. Repentigny L., Kuykendall R.J., Reiss E.,Simultenues determination arabinitol and mannosa by gas-liquid chromatography in experimental candidiasis, J.Clin.Microb.,1983, v.17, p.1166-1169.

131. Repetingly L., Marr L., Keller J., Comparison of enzyme immunoassay and gas-liquid chromatography for the rapid diagnosis of invasive candidiasis in cancer patiants, , J.Clin.Microb.,1985,v.21, p.972-979.

132. Repetingly L., Serodiagnosis of candidiasis, aspergillosis, cryptococcosis, Clin.Inf.Dis., 1992, v.14, p.11-22 .

133. Roboz J, Diagnosis and monitoring of dissiminated candidiasis based on serum/urine D/L-arabinitol ratios, Chirality, 1994, v.6, p.51-57.

134. Roboz J., Gas chromatographic and mass spectrometric techniques for the diagnosis of disseminated candidiasis,

Analitical microbiology methods. Chromatography and mass-spectrometry. New York: Plenum press, 1990, p.239-258.

135. Roboz J., Suzuki R., Holland J.F., Quntification of arabinitol in serum by selected ion monitorong as a diagnostic technique in invasive candidiasis, J.Clin.Microbiol., 1980, v.12, p.594-602.

136. Rubinstein E., Lang R. , Fungal endocarditis, Eur.Heart J., !995, V.16, p.84-89.

137. Sasser M., Identification of bacteria Through fatty acid analysis,In:Klement Z., Rudolph K. , Sands D., Method in phytobacteriology., Budapest:Akademiai Kiado,1990,p.199-204 .

138. Shan H.N., Collins M.D., Fatty acid and isoprenoid quinone composition in the classification of Bacteroides melaninogenicus and related taxa, J.Appl.Bacteriol., 1980, v. 48, p.75-87.

139. Shan H.N., Collins M.D., Proposal for reclassification of Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, Bacteroides endodontalis in a new genus, Porphyromonas, Int. J. Syst. Bacteriol.,1988, v.38, p.128-131.

140. Shinoda T., Kaufman L., Padhye A.A.,Comparative evaluation of the Iatron Serological Candida Check kit and the API 20C kit for identification of medically impotent Candida species. J.Clin.Microbiol., 1981, v.13,p.513-518.

141. Shinoda T., Ikeda A., Nishikava A., Fukazawa Y., The serological, chemical and physiochemical analysis of cryptococcal capsular polysaccharides. Jpn.J.Med.Mycol. 1980, v.21,p.230-238.

142. Sisson P.R., Freeman R., Magee J.T., Lighfoot N.F., Differentiation between mycobacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex by pyrolisis mass spectrometry, Tubercle., 1991, v.72, p.206-209.

143. Sisson P.R., Freeman R., Magee J.T., Lighfoot N.F., Rapid differentiation of Mycobacterium xenopi from Mycobacterium avium-intracellulare complex by pyrolisis mass spectrometry, J.Clin.Patohol., 1992, v.45, p.355-357.

144. Schlossberg D., Brooks J.B., Shulman J.A., Possibility of diagnosing meningitis by gas chromatography: cryptococcal meningitis, J.Clin.Microbiol., 1976, v.3, p.239-245.

145. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G., Berdgey's Manual of Systematic Bacteriology, 1986,v.2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore.

146. Staley J.T., Bryant M.P. Pfennig N., Holt J.G., Berdgey's Manual of Systematic Bacteriology, 1989, v.3, The Williams & Wilkins Co., Baltimore.

147. Stead D.E., Sellwood J.E., Wilson J., Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acids profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria, J.Appl.Bacteriol.,1992, v.72, p.315-321.

148. Stein D.K., Sugar A.M., Fungal infections in the immunocompromised host. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1990, V.12, p.221-228.

149. Stone K.U., Butterworth P.H., Hemming E.W., Biochem. J.,1967, v.102, p.443.

150. Stork R., Alexopoulos C.J., Deoxyribonucleic acid of fungi. Bacteriol.Rev. 1970, v.34,p.126-154.

151. Swenson F.J., Ulrich J.A., Fatty acids of dermatophytes, Sabouraudia, 1980, v.18,p.1-9.

152. Thacker W.L.,Dyke J.W., Benson R.F., Legionella lansingensis sp. nov. isolated from a patient with pneumonia and underlying chronic lymphocytic leukemia, J.Clin.Microbiol., 1992 ,v.30,p. 2398-2401.

153. Tang C.M., Cohen J., Diagnosing fungal infections in immunocompromised hosts, J.Clin.Pathol., 1992, v.45, p.1-5.

154. Telenti A., Roberts G.D., Fungal blood culture, Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 1989, v.8, p.825-831.

155. Thomas E., Gupta N.K., Van-der-Westhuizen N.G., Chan E.,Bernard K., Fatal Legionella maceachernii pneumonia in Canada, J.Clin.Microbiol., 1992, v.30, p.1578-1579.

156. Tokunaga S., Ohkawa M., Takashima M., Hisazumi H., Clinical significans of measurement of serum D-arabinitol levels in candiduria patiants, Urology International, 1992, v.48, p.195-199.

157. Tokunaga S., Ohkawa M., Takashima M.,Seto C., Nakamura S., D-arabinitol versus mannanantigen and candidal protein

antigen as a serum marker of Candida pyelonephritis, Eroup.J.Clin.Microbiol.Inf.Dis., 1995, v.14, p.118-121.

158. Touster 0. Shaw R.D., Biochemistry of acyclic poliols Physiol.Rev., 1962,42,181-225

159. Tsuchiya T., Fukazawa Y., Taguchi M., Nacase T., Shinoda T., Serological aspects of yeast classification. Mycopathol.Mycol.Appl. 197 4,v.53,p.77-92.

160. Vandamme P., Daneshvar M.I., Dewhirst F.E., Paster B.J., Kersters K., Goossens H., Moss C.W., Chemotaxonomic analyses of Bacteroides gracilis and Bacteroides ureolyticus and reclassification of B. gracilis as Campylobacter gracilis comb, nov., Int.J.Syst.Bacteriol., 1995, v.45, p.145-152.

161. Vanderwinkel E., Depauw P., Philipp D., Tenhave J. P., Bainter K., The human and mammalian N-acetilmuramil-L-alanine amidase: distribution, action on different bacterial peptidoglycans, and comparison with the human lysozyme activities, Biochemical and Molecular Medicine, 1995, v.54, p.26-32.

162. Villalba R., Gonzalez A.I., Linares M.J., Detection of antibodies to Candida albicans germ tube as possible aid in diagnosing systemic candidiasis in bone marrow trasplantat patients., Eur.J.CIin.Microbiol.Infect.Dis.,1993, v.12,p.347-349.

163. Viljoen B.C., Kock L.F., Lategan P.M., Fatty acid composition as a guide to the classification of selected genera of yeasts belonging to the Endomycetales. J.Gen.Microbiol., 1986, v.132,p.2397-2400.

164. Viljoen B.C., Kock L.F., Muller H.B., Lategan P.M., Long chain fatty acid composition of some asporogeneous yeasts and their respective ascosporogeneous states. J.Gen.Microbiol., 1987, v.133,p.1019-1022.

165. Vincent J., Dermatophyte lipids, Progress in Chemistry of Fats and Other Lipids, 1978, v.16, p.171-177.

166. Voorhees K.J., Durfee S.L., Updegraff D.M., Identification of deverse bacteria grown under diverse condition using pyrolisis mass spectrometry, J.Microbial Metods., 1988, V.8, p.315-325.

167. Walsh T.J., Pizzo P.A., Laboratory diagnosis of candidiasis, In: Bodey GP, Candidiasis, N.-Y., 1993, p.109-135.

168. Warnock D.W., Fungal complications of transplantation: diagnosis, treatment and prevention, J.Antimicrob.Chemother.,1995, v.36,p.73-90.

169. Weete Y.D., Lipid biochemistry of fungi and other organisms, Plenum Press, 1980, N.-Y.-London.

170. Wejman A.C.M. Carbohydrate composition and taxonomy of Geotrichum, Trichosporon and applied genera. Antonie van Leeuwenhoek J.Microbiol.,1979,v.45,p.119-127.

171. Wejman A.C.M., Rodrigues de Miranda L., Carbohydrate patterns of Candida, Cryptoccocus and Rhodotorula species, Antonie van Leeuwenhoek J.Microbiol.,1988,v.54,p.535-543.

172. Weiner M.H., Yount W.J. J. Clin.Invest.,1976, V.58, p. 1045-1053.

173. Wells A., Sirany M., Blazevic D., Evaluation of serum arabinitol as a diagnostic test for candidiasis, J.Clin.Microbiol., 1983, v.18, p.353-357.

174. Weyant R.S., Hollis D.G., Weaver R.E., Bordetella holmesii sp. nov., a new gram-negative species associated with septicemia, J.Clin.Microbiol., 1995,v.33,p.1-7.

175. Weyant R.S., Moss C.W., Weaver R.E., Hollis D.G., Jordan J.G., Cook E.C., Daneshvar M.I., Identification of unusual pathogenic gramm-negative aerobic and facultatively anaerobic bacteria, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, 1997, p.378.

176. Williams S.T., Sharpe M.E., Holt J.G., Berdgey's Manual of Systematic Bacteriology, 1989, v.4, The Williams & Wilkins Co., Baltimore.

177. Wirth J.C., Anand S.R., The fatty acids of Trichophyton rubrum, Canad.J.Microb.,1964, v.10, p.23-27.

178. Wirth J.C., Anand S.R, Kish Z.L., The fatty acids of Microsporum gypseum, Canad.J.Microb.,1964, v.10, p.811-812.

179. Wong B., Bernard E.M., Gold V.M., Fong D., Silber A., Armstrong D., Increased arabinitol levels in experimental candidiasis in rats: arabinitol appearance rates, arabinitol/creatinin ratios, and severity of infection, J.Inf.Diseas, 1982, v.146, p.346-352.

180. Wong B., Brauer K.L., Enantioselective measurement of fungal D-arabinitol in the sera of normal adults and patiants with candidiasis, J. Clin. Microbiol., 1988, v. 26, p.1670-1674.

181. Wong B., Brauer K., Tsai R., Jayasimhulu K., Increased amount of the Aspergillus metabolite D-mannitol in tissue and serum of rats with experimental Aspergillosis, J.Iferct.Diseases, 1989, v.160, p.95-103.

182. Wong B., Perfect J.R., Beggs S., Wright K.A., Prodaction of the hexitol D-mannitol by Cryptococcus neoformans in vitro and in rabbits with experimental meningitis, Infect.Immun., 1990, v.58, p.1664-1670.

183. Wong B., Murray J.S., Castellanos M. , Croen K.D., D-arabinitol metabolism in Candida albicans - studies of the biosynthetic pathway and the gene that encodes NAD-dependent Darabinitol dehydrogenase, J.Bacteriology, 1993, v.63, p.6314-6320.

184. Yamaguchi K., Goto N. An autopsy case of brain candidiasis in premature infant: morphology and intraparenchymal distribution of Candida foci. No.To.Hattatsu.,1993, v.25, p.369-373

185. Yamakawa T., Ueta N., Gas-chromatographic studies of microbial components, Jpn.J.Exp.Med., 1964, v.34, p.361-374 .

186. Yoneda R., Diagnisis and treament of pulmonary aspergillosis, Kekkaku,1997, v.72, p.79-82.