Идентификация и характеристика новых хромосомных факторов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у Staphylococcuc aureus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, Васильева, Евгения

• Васильева, Евгения
• 1996

Оглавление диссертации Васильева, Евгения

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Антибиотики и возникновение резистентности.

1.2 Общее об антибиотиках.

1.2.1 Воздействие антибиотиков на бактерии.

1.2.2 Перзистентность.

1.2.3 Общая устойчивость к антибиотикам.

1.2.3.1 Механизмы устойчивости.

1.3 Бета-лактамные антибиотики.

1.3.1 Действие бета-лактамных антибиотиков.

1.3.2 Клеточная стенка стафилококков.

1.3.2.1 Строение клеточной стенки.

1.3.2.2 Биосинтез клеточной стенки.

1.3.3 Мишени бета-лактамов.

1.3.4 Резистентность по отношению к бета-лактамным антибиотикам.

1.3.4.1 Бета-лактамазы.

1.3.5 Толерантность по отношению к бета-лактамным антибиотикам.

1.4 Стафилококки и резистентность к бета-лактамам.

1.4.1 Бета-лактамазы Staphylococcus aureus.

1.4.2 Чувствительные к бета-лактамам СПБ

Staphylococcus aureus.

1.4.2.1 Селективное ингибирование отдельных СПБ.

1.4.3 Функции стафилококковых СПБ в биосинтезе клеточной стенки.

1.4.4 Бактериолизис у стафилококков.

1.4.5 Устойчивость к метициллину.

1.4.5.1 Гомогенная и гетерогенная тес-резистентность.

1.4.5.2 Влияние бета-лактамазы на устойчивость к метициллину.

1.4.5.3 Мес-детерминанта.

1.4.5.4 Дополнительные факторы устойчивости к метициллину.

1.5 Исследование факторов резистентности посредством транспозонного мутагенеза.

1.6 Постановка вопроса.

2. Материалы и методы.

2.1 Материалы.

2.1.1 Антибиотики.

2.1.2 Штаммы бактерий и плазмиды.

2.1.3 Праймеры для секвенирования.

2.1.4 Среды.

2.1.5 Растворы.

2.2 Методы.

2.2.1 Культивирование и хранение бактерий.

2.2.1.1 Получение ночной культуры (НК).

2.2.1.2 Хранение бактерий.

2.2.2 Трансдукция.

2.2.2.1 Получение лизата трансдуцируемых фагов.

2.2.2.2 Получение трансдуктантов.

2.2.3 Мутагенез посредством интеграции транспозона.

2.2.4 Реплицирование на чашки.

2.2.5 Фенотипические характеристики мутантов.

2.2.5.1 Определение размера зоны ограниченного роста.

2.2.5.2 Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК).

2.2.5.3 Градиентные чашки.

2.2.5.4 Доказательство существования бета-лактамазы тест с нитроцефином).

2.2.6 Выделение ДНК.

2.2.6.1 Хромосомная ДНК.

2.2.6.1.1 Выделение хромосомной ДНК.

2.2.6.1.2 Очистка ДНК. Фенольная экстракция.

2.2.6.2 Выделение плазмидной ДНК.

2.2.6.2.1 Минивыделение.

2.2.6.2.2 Максивыделение.

2.2.7 Разделение ДНК.

2.2.7.1 Аналитический электрофорез в геле.

2.2.7.2 " Пульс" электрофорез в геле (PFGE).

2.2.7.2.1 Приготовление проб для PFGE.

2.2.7.2.2 Рестрикционная смесь для PFGE.

2.2.7.2.3 Разделение проб.

2.2.7.3 "Инверсированный" электрофорез в геле (FIGE).

2.2.8 Экстракция ДНК из геля.

2.2.9 Гибридизация по Саузерну.

2.2.9.1 Перенос ДНК.

2.2.9.2 «Лифтинг» колоний и плаков.

2.2.9.3 Мечение ДНК по методу " Random Primed ".

2.2.9.4 Гибридизация.

2.2.10 Клонирование.

2.2.10.1 Дефосфорилирование вектора.

2.2.10.2 Лигирование.

2.2.10.3 Трансформации.

2.2.10.3.1 Электротрансформация штамма E.coli DH10B.

2.2.10.3.1.1 Получение компетентных клеток.

2.2.10.3.1.2 Электропорация.

2.2.10.3.2 СаС^-трансформация штамма E.coli DH10B.

2.2.10.3.2.1 Получение компетентных клеток.

2.2.10.3.2.2 Трансформация.

2.2.10.4 Определение положительных клонов.

2.2.11 Дидеокси-ДНК-Секвенирование.

2.2.11.1 Подготовка проб.

2.2.11.1.1 Денатурация ДНК.

2.2.11.1.2 Мечение.

2.2.11.2 Подготовка гелей.

2.2.12 Выделение СПБ.

2.2.12.1 Мечение СПБ в клетках.

2.2.12.2 Мечение СПБ в клеточных экстрактах.

2.2.12.2.1 Получение фракции мембранных белков.

2.2.12.2.2 Мечение экстракта протеина 3Н-пенициллином.

2.2.12.3 SDS-полиакриламидный электрофорез в геле (SDS-PAGE).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Получение инсерционных мутантов с измененной устойчивостью к бета-лактамам.

3.1.1 Схема эксперимента.

3.1.2 Получение первичных мутантов.

3.1.3 Идентификация мутантов.

3.1.3.1 Определение минимальной ингибирующей концентрации для различных СПБ-блокирующих антибиотиков для штамма SG511.

3.1.3.2 Селекция на редуцированную устойчивость к бета-лактамам.

3.1.3.3 Котрансдукция фенотипа устойчивости с транспозоном.

3.1.3.4 Доказательство наличия транспозона посредством гибридизации.

3.1.3.5 Выделение мембранных белков.

3.2 Характеристика мутантов.

3.2.1 Фенотипические характеристики.

3.2.1.1 Трансдукция мутантов в штаммы с различным генетическим фоном.

3.2.1.2 Определение резистентности.

3.2.1.2.1 Измерение зоны ограниченного роста.

3.2.1.2.2 Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК).

3.2.1.2.3 Определение резистентности посредством Е-теста.

3.2.1.2.4 Оценка градиентных чашек.

3.2.1.2.5 Сравнение различных методов для определения резистентности.

3.2.1.3 Доказательство наличия плазмидных маркеров.

3.2.1.4 Тест на экспрессию 1ас2-тът. из Тп917.

3.2.2 Хромосомная локализация инсерций.

3.2.2.1 Картирование инсерций на £»ш1-карте.

3.2.2.2 Картирование ТпР77-вставки в Бта\К фрагменте.

3.2.2.3 Новые 5>?ш1-фрагменты.

3.2.2.4 Дальнейшие рестрикционные картины инсерций.

3.2.2.4.1 Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

3.2.2.5 Характеристика плазмидсодержащих мутантов.

3.2.3 Гибридизация с различными ДНК-пробами.

3.2.4 Анализ Об- и ОЮ-инсерционных мутантов.

3.2.4.1 Анализ ОЮ-инсерции.

3.2.4.1.1 Фагонезависимая котрансдукция резистентного фенотипа с ОЮ-инсерцией.

3.2.4.1.2 Клонирование фрагмента, прерванного 010-инсерцией.

3.2.4.1.3 Рестрикционный анализ сайта инсерции 010.

3.2.4.1.4 Анализ последовательности сайта Ш0-инсерции.

3.2.4.1.4.1 Определение транспозоновой части в клонированном фрагменте.

3.2.4.1.4.2 " Открытые рамки считывания " в пределах фрагмента, прерванного ОЮ-инсерцией.

3.2.4.2 Анализ О 6-инсерционных мутантов.

3.2.4.2.1 ОЮ7 в пределах фрагмента, прерванного 06-инсерцией.

3.2.4.3 Резистентность по отношению к аминоглюкозидам.

3.2.4.4 Анаэробиоз.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Методический подход.

4.1.1 Транспозоннный мутагенез.

Генетический фон, транспозоны.

4.1.2 Ход интеграции. Мутанты без инсерции.

4.1.3 Стратегия отбора.

4.2 Специфические изменения устойчивости к бета-лактамам.

4.2.1 Зависимость изменений резистентности от генетического фона.

4.2.2 Индуцированная резистентность.

4.2.3 Парадоксальный эффект бета-лактамазы на устойчивость к цефокситину.

4.3 Локализация и новизна инсерций.

4.4 Новые механизмы развития резистентности в стафилококках. Влияние факторов дыхательной цепи.

4.5 Дыхательная цепь и устойчивость к аминоглюкозидам.

4.6 К концепцииуеяг/бшх-факторов.

4.7 К роли инактивированных генов как возможных мишеней для антибиотиков.

4.8 Заключительные замечания.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация и характеристика новых хромосомных факторов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам у Staphylococcuc aureus»

1.1 Антибиотики и возникновение резистентности

Применение антибиотиков и химиотерапевтических препаратов для лечения бактериальных инфекций и патогенных возбудителей заболеваний было начато в 1902 году в связи с открытием различной аффинности красителей по отношению к бактериальным клеткам и клеткам млекопитающих. Это открытие было сделано немецким врачом Паулем Эрлихом (Нобелевская премия 1908 года). В 1928 году английский микробиолог Александр Флемминг обнаружил антибактериальное действие плесневого грибка Penicillum potatum (Нобелевская премия 1945 года), в 1939 году Флорей и Чайн выделили пенициллин - действующее вещество гриба Penicillum (Нобелевская премия 1945 года совместно с А. Флеммингом), а в 1941 году было налажено производство пенициллина в коммерческих целях.

Начиная с того времени и за последующие годы, стали известны более сотни новых антибактериальных веществ. Эти вещества делятся на группы в соответствии со спектром их действия, их происхождением, их мишенями, их химическим составом и их электрическим зарядом.

Уже к началу эры химиотерапии был замечен негативный феномен применения антибиотиков: под действием селективного давления бактерии различными путями могут приобретать устойчивость (или резистентность) и становиться, таким образом, нечувствительными к воздействию антибактериальных агентов.

Первый случай бактериальной устойчивости был замечен в 1944 году; тогда был обнаружен штамм Staphylococcus aureus (S.aunus) , который мог расщеплять пенициллин за счет наличия у него фермента бета-лактамазы (53). Под воздействием бета-лактамазы происходит гидролиз пенициллинового кольца, и пенициллин превращается в пенициллиновую кислоту, которая не обладает антибактериальнами свойствами. Случаи устойчивости к пенициллину резко участились в последующие десятилетия до тех пор, пока практически все клинические изоляты стафилококков не стали устойчивыми к пенициллину.

В промежутке с 1940 по 1950 годы была обнаружена устойчивость к другим антибактериальным веществам (часто в сочетании с пенициллиновой). Развитие мультиустойчивости в значительной степени затрудняет лечение и на сегодня является большой клинической проблемой. Для того, чтобы решить проблему устойчивости и мультиустойчивости, особенно важно иметь точную информацию об отдельных факторах устойчивости, ее возникновении и генетической основе.

Взаимодействие бактерий и антибиотиков может быть рассмотрено по двум различным аспектам:

1. Как антибиотики воздействуют на бактерии? (механизмы, мишени, физиологические последствия)

2. Какие стратегии вырабатываются бактериями для защиты от антибиотиков? (приобретенная устойчивость)

Исследования показали, что и действие антибиотиков, и бактериальный ответ могут принимать самые различные формы. На сегодняшний день наука имеет в распоряжении целый ряд методов и средств для детального изучения процессов в области бактериальной устойчивости. Важнейшая информация о бета-лактамных антибиотиках, их действии, о возникновении устойчивости у S. aureus и методах, применяемых для ее изучения, будет кратко описана в литературной части данной работы.

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Васильева, Евгения

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Посредством транспозонового мутагенеза были сконструированы инсерционные мутанты с измененной устойчивостью к бета-лактамам.

Были получены как инсерции одного транспозона, так и инсерции всей плазмиды.

Изменения резистентности или метаболизма не были вызваны непосредственной инактивацией СПБ-генов.

Инсерции происходили в различных фрагментах генома. Была получена одна инсерция вблизи и одна в /етАВ-регионе. Дальнейшие инсерции были локализованы в £>ш1-А, 8та1-В и Бта!-К фрагментах.

Кроме одной инсерции в ^стАВ-регионе, все остальные инсерции не были до сих пор идентифицированы.

Были обнаружены новые, до сих пор не опубликованные Бта1-фрагменты, величиной 16 кб, 20.5 кб (двойная полоса) и 21 кб.

Фенотипические проявления инсерций зависели от штамма и в наиболее сильно экспримировались в тес-резистентном генетическом фоне ВВ270, особенно при инсерции в неизвестном гене вблизи/етАВ-региона.

При некоторых инсерциях наблюдали рестрикционный полиморфизм, вызванный вторичными структурными изменениями.

Одна из инсерций инактивировала предположительный регулятор цитохрома, при этом это был затронут рост мутантов, устойчивость к бета-лактамам и к аминоглюкозидам.

6. РЕЗЮМЕ

Применение антибиотиков и химиотерапевтических препаратов для клинического лечения бактериальных инфекций привело уже к началу эры антибиотиков к развитию устойчивых бактерий. До сегодняшнего дня постоянно возрастало распространение мультирезистентных стафилококков, так что большинство стафилококковых штаммов сегодня устойчивы по отношению к почти всем применяемым в клинике классам антибиотиков. На сегодняшний день для лечения подобных инфекций мультирезистентных стафилококков еще можно использовать относительно токсичные и тяжело переносимые гликопептидные антибиотики (например, ванкомицин). Однако поскольку уже известны устойчивые к ванкомицину лабораторные штаммы, поиск новых потенциальных мишеней для антибиотиков имеет не только теоретическое, но и клиническое значение. Поиск новых антимикробных соединений требует также знаний о возникновении резистентности, механизмах и возможных влияющих факторах.

В этой работе исследовались новые факторы устойчивости к бета-лактамам в стафилококках посредством транспозонового мутагенеза. Посредством этой техники и ранее были локализованы в хромосоме и фенотипически охарактеризованы несколько факторов резистентности (гены резистентности или вспомогательные факторы). Инактивация этих факторов более или менее негативно отражалась на соответствующих резистентностях. Однако до сих пор соответствующие исследования устойчивости к бета-лактамам у Staphylococcus aureus проводились лишь в известном штамме NCTC8325, а для мутагенеза использовали исключительно транспозон Тп557.

Целью этой работы было посредством транспозонового мутагенеза найти дальнейшие, до сих пор неизвестные стафилококковые факторы (также новые yew-факторы, "factors essential for expression of methicillin-resistance"), которые влияют на устойчивость к бета-лактамам. Чтобы достигнуть этой цели, для транспозонового мутагенеза был использован вместо обычного штамма NCTC8325 другой генетический фон (штамма SG511-Berlin). Транспозоновый мутагенез проводили посредством двух различных транспозонов: Тп551 и дополнительно Тп917.

При этом наблюдались, как инсерции одного транспозона, так и плазмиды (полностью или частично). Теоретическая вероятность инсерции плазмиды известна из литературы, однако до сих пор ей уделялось мало внимания. У одного из таких мутантов (Q4) часть плазмиды инсерировала даже дважды. Подобное событие является крайне редким и до сих пор еще не было описано.

При селекции мутантов искали прежде всего инсерции в кодирующих или регулирующих последовательностях для пенициллинсвязывающих белков (мишени бета-лактамов). Поэтому инсерционные мутанты были селекционированы на редуцированную резистентность по отношению к четырем бета-лактамам, который предпочтительно связывают отдельные СПБ. После отбора были идентифицированы 9 инсерционных мутантов штамма SG511 с редуцированной устойчивостью к бета-лактамам. Однако вопреки отбору на СПБ-специфических бета-лактамах, наблюдаемые изменения резистентности или метаболизма в полученных мутантах не были вызваны непосредственной инактивацией СПБ-генов.

В этой работе был установлен парадоксальный эффект бета-лактамазы на устойчивости к бета-лактамам: положительные по бета-лактамазе штаммы указывали слабое, но воспроизводимое повышение чувствительности к цефокситину в 1ЧСТС8325-штаммах.

Было проверено, не были ли полученные инсерции в штамме ВВ255 (аналог NCTC8325) ранее описаны, и исследовано, как эти инсерции влияют на устойчивость к метициллину на резистентном генетическом фоне ВВ270. Фенотипические проявления инсерций было четко зависимы от штамма, и наиболее сильно выражены в тес-резистентном генетическом фоне ВВ270. Транс дукция в гетерологичный штамм и вторичные структурные изменения привели при некоторых инсерциях к рестрикционному полиморфизму.

Девять инсерций были картированы на хромосомной карте стафилококков в Smal-A, Smal-B и Smal-K фрагментах. Кроме того, как в мутантах, так и в контролях были обнаружены новые до сих пор неопубликованные Smal-фрагменты величиной 16 кб, 20.5 кб (двойная полоса) и 21 кб. Одна инсерция (05) была локализована вблизи промотора. Следующая инсерция (03) оказалась уже известной инсерцией 02003 в /етАВ-регионе, все другие инсерции были идентифицированы как новые. Одна из них (010) была локализована вблизи /етАВ-региона. Эта инсерция радикально снижала устойчивость к бета-лактамам специально на тес-положительном генетическом фоне ВВ270. Неизвестно, участвует ли этот новый fem-фактор в биосинтезе клеточной стенки, подобно всем до сих пор охарактеризованным /em-факторам, так как производная последовательность протеина не показала никакой сигнификантной гомологии с уже известными последовательностями белков.

Дальнейший инсерционный мутант (Об) показал ослабленный рост, причиной которого стала, вероятно, инактивация последовательности предположительного регулятора цитохрома.

В этой работе впервые было показано, что существуют другие, несвязанные с биосинтезом клеточной стенки факторы, которые могут сходным образом влиять на устойчивости к бета-лактамам: изменения устойчивости к бета-лактамам могут, очевидно, быть также вызваны инактивацией в гене белка, регулирующего цитохром. Это представляет полностью новый механизм устойчивости к бета-лактамам. Вследствие прерывания предположительной последовательности регулятора цитохрома была, с одной стороны, затронута устойчивость к бета-лактамам, а с другой стороны, чувствительность к аминоглюкозидным антибиотикам уменьшилась в два раза. У этого мутанта с нарушенным ростом был, очевидно, нарушен общий транспортный механизм. До сих пор не было сообщений о возможном влиянии цитохрома на развитие резистентности у S. aureus.

В этой работе было показано, что на чувствительность к бета-лактамам при определенных обстоятельствах могут влиять условия роста (например, скорость роста) и анаэробные условия.

Всего 7 новых факторов данной работы должны были быть рассмотрены как дальнейшие /еш-факторы. Большинство этих факторов, вероятно, являются общими регулирующими факторами клеточного метаболизма, которые непосредственно не связаны с резистентностью. В этом случае спорно, можно ли именовать такие гены факторами резистентности (концепция/em-факторов), так как они могут охватывать совершенно различные аспекты клеточного метаболизма, и их воздействие на устойчивость к антибиотикам могло бы косвенно отражать последствия других изменений.

Вновь открытые в данной работе семь факторов, инактивация которых приводит к потере резистентности MRSA-штаммах, а при случае вызывает также дальнейшую сенсибилизацию уже чувствительных штаммов S. aureus, могут при определенных обстоятельствах быть использованы как мишени для новых антибиотиков. Разумеется, нужно учитывать, что в данном случае, также как у большинства раннее описанных факторов, за исключением /¿mAB-оперона, достигаемый эффект, как правило, слишком незначителен, чтобы ожидать клиническую релевантность. Возможное исключение, тем не менее, могла бы составить ОЮ-инсерция, влияние которой на тес-резистентность сравнимо с влиянием /стАВ-оперона. Это предположение поддерживается и тем фактом, что определенная в этой работе частичная последовательность инактивированного гена не имеет, также как и УстАВ-оперон, никакой гомологии с известными протеинами. Исходя из вышесказанного можно при необходимости рассчитывать на получение возможных блокирующих субстанций с высоким уровнем специфичности.

Список литературы диссертационного исследования Васильева, Евгения, 1996 год

1. Albus, A., R. D. Arbeit, and J. C. Lee. 1991. Virulence of Staphylococcus aureus mutants altered in type 5 capsule production. Infect Immun 59:1008-14.

2. Arrow, A. S., and H. W. Taber. 1986. Streptomycin accumulation by Bacillus subtilis requires both a membrane potential and cytochrome aa3. Antimicrob Agents Chemother 29:141-6.

3. Barber, M. 1964. Naturally occurring methicillin-resistant staphylococci. J.Gen. Microbiol. 35:183-190.

4. Barry, A. L. 1986. Critical Evaluation of Amdinocillin Disk Susceptibility Tests with Agar Dilution Tests. J Clin Microbiol 23:983-985.

5. Beck, W. D., B. Berger-Baechi, and F. H. Kayser. 1986. Additional DNA in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and molecular cloning of mec-specific DNA. J Bacterid 165:373-378.

6. Beise, F., H. Labischinski, and P. Giesbrecht. 1988. Selective inhibition of penicillin-binding proteins and its effects on growth and architecture of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 55:195-202.

7. Berger-Baechi, B. 1983. Insertional inactivation of staphylococcal methicillin resistance by Tn557. J. Bacteriol. 154:479-487.

8. Berger-Baechi, B. 1995. Factors affecting methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Int J Antimicrobial Agents 6:13-21.

9. Berger-Baechi, B., L. Barberis-Maino, A. Straessle, and F. H. Kayser. 1989. FemA, a host-mediated factor essential for methicillin resistance in Staphylococcus aureus: molecular cloning and characterization. Molec. Gen. Genetics 219:263-269.

10. Berger-Batchi, B., and M. L. Kohler. 1983. A novel site on the chromosome of Staphylococcus aureus influencing the level of methicillin resistance: genetic mapping. FEMS Microbiol. Lett. 20:305-309.

11. Berger-Baechi, B., A. Straessle, J. E. Gustafson, and F. H. Kayser.1992. Mapping and characterization of multiple chromosomal factors involved in methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 36:1367-1373.

12. Boyce, J. M., and A. A. Medeiros. 1987. Role of beta-lactamase in expression of resistance by methicillin- resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 31:1426-1428.

13. Brosius, J., A. Ullrich, M. A. Raker, A. Gray, T. J. Dull, R. R. Gutell, and H. F. Noller. 1981. Construction and fine mapping of recombinant plasmids containing the rrnB ribosomal RNA operon of Escherichia coli. Plasmid 6:112-118.

14. Brown, D. F. G., and P. E. Reynolds. 1980. Intrinsic resistance to f3-lactam antibiotics in Staphylococcus aureus. FEBS Lett. 122:275.

15. Bryan, L. E. 1988. General mechanisms of resistance to antibiotics. Review., J Antimicrob Chemother 22 Suppl A: 1-15.

16. Bush, K., G. A. Jacoby, and A. A. Medeiros. 1995. A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure. Review. Antimicrob Agents Chemother 39:1211-33.

17. Canepari, P., P. E. Varaldo, R. Fontana, and G. Satta. 1985. Different staphylococcal species contain various numbers of penicillin-binding proteins ranging from four (,Staphylococcus aureus) to only one {Staphylococcus hyicus). J Bacterid 163:796-8.

18. Chambers, H. F. 1988. Methicillin-resistant staphylococci. Clin Microbiol Rev 1:173-186.

19. Chambers, H. F., and C. J. Hackbarth. 1987. Effect of NaCl and nafcillin on penicillin-binding protein 2a and heterogeneous expression of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 31:1982-1988.

20. Chambers, H. F., M. J. Sachdeva, and C. J. Hackbarth. 1994. Kinetics of penicillin binding to penicillin-binding proteins of Staphylococcus aureus. Biochem J 301:139-144.

21. Craig, W. A., and S. C. Ebert. 1990. Killing and regrowth of bacteria in vitro: a review. Review. Scand J Infect Dis Suppl 74:63-70.

22. Croux, C., C. Ronda, R. Lopez, and J. L. Garcia. 1993. Interchange of functional domains switches enzyme specificity: construction of a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme. Mol Microbiol 9:1019-25.

23. Dever, L. A., and T. S. Dermody. 1991. Mechanisms of bacterial resistance to antibiotics. Review., Arch Intern Med 151:886-95.

24. Evans, J., and K. G. Dyke. 1988. Characterization of the conjugation system associated with the Staphylococcus aureus plasmid pJEl. J Gen Microbiol

25. Georgopapadakou, N. H. 1993. Penicillin-Binding proteins and bacterial resistance to beta-Lactams. Antimicrob Agents Chemother 37:20452053.

26. Georgopapadakou, N. H., and F. Y. Liu. 1980. Penicillin-binding proteins in bacteria. Antimicrob Agents Chemother 18:148-57.

27. Ghuysen, J. M. 1991. Serine beta-lactamases and penicillin-binding proteins. Review. Annu Rev Microbiol 45:37-67.

28. Giesbrecht, P., T. Kersten, and J. Wecke. 1992. Fan-shaped ejections of regularly arranged murosomes involved in penicillin-induced death of staphylococci. J Bacteriol 174:2241-52.

29. Giesbrecht, P., H. Labischinski, and J. Wecke. 1985. A special morphogenetic wall defect and the subsequent activity of "murosomes" as the very reason for penicillin-induced bacteriolysis in staphylococci. Arch Microbiol 141:315-24.

30. Giesbrecht, P., J. Wecke, and B. Reinicke. 1976. On the morphogenesis of the cell wall of Staphylococci. Int. Rev. Cytol. 44:225-318.

31. Glanzmann, P. 1994. Genetische und physiologische Untersuchungen an femD Mutanten in Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus. ETH Zuerich.

32. Goessens, W. H. 1993. Basic mechanisms of bacterial tolerance of antimicrobial agents. Review., Eur J Clin Microbiol Infect Dis 12:S9-12.

33. Group, G. C. 1991. Program manual for the GCG-package, version7., Genetics Computer Group, Madison, Wis.

34. Gustafson, J., A. Straessle, H. Haechler, F. H. Kayser, and B. Berger-Baechi. 1994. The femC locus of Staphylococcus aureus required for methicillin resistance includes the glutamine synthetase operon. J. Bacterid. 176:1460-1467.

35. Gustafson, J. E., and B. J. Wilkinson. 1989. Lower autolytic activity in a homogeneous methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain compared to derived heterogeneous- resistant and susceptible strains. FEMS Microbiol. Lett. 50:107-111.

36. Hackbarth, C. J., T. Kocagoz, S. Kocagoz, and H. F. Chambers.1995. Point mutations in Staphylococcus aureus PBP 2 gene affect penicillin-binding kinetics and are associated with resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 39:103-106.

37. Hartman, B. J., and A. Tomasz. 1984. Low-affinity penicillin-binding protein associated with beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 158:513-516.

38. Hayes, M. V., and J. B. Ward. 1986. The Role of penicillin-binding Proteins in the Antibacterial Activity of 3-Lactam Antibiotics, p. 722-56. In V. Lorian, Antibiotics in Laboratory Medicine. Waverly Press, Inc, Baltimore, USA.

39. Henze, U. U., and B. Berger-Baechi. 1995. Staphylococcus aureus penicillin-binding protein 4 and intrinsic p-lactam resistance. Anticrob. Agents Chemother. 39:2415-2422.

40. Hiramatsu, K., E. Suzuki, H. Takayama, Y. Katayama, and T. Yokota. 1990. Role of penicillinase plasmids in the stability of the mecA gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 34:600-604.

41. Hoeltje, J. V., and A. Tomasz. 1975. Lipoteichoic acid: a specific inhibitor of autolysin activity in Pneumococcus. Proc Natl Acad Sci U S A 72:1690-4.

42. Iandolo, J. J., and G. C. Stewart. 1995. The Staphylococcus aureus genome map. Dept. of Diagnostic Medicine and Pathology1. Kansas State University.

43. Jacoby, G. H., and K. D. Young. 1988. Unequal Distribution of Penicillin-Binding Proteins among Inner Membrane Vesicles of Escherichia coli. ¿Bacterid. 170:3660-3667.

44. Kayser, F. H., K. A. Bienz, J. Eckert, and J. Lindenmann. 1989. Medizinische Mikrobiologie. Immunologie, Bakteriologie, Mykologie, Virologie, Parasitologic, Georg Thieme Verlag, Stutgait.

45. Khan, S. A., and R. P. Novick. 1980. Terminal nucleotide sequences of Tn551, a transposon specifying erythromycin resistance in Staphylococcus aureus: homology with Tn3. Plasmid 4:148-54.

46. Kirby, W. M. M. 1944. Extraction of a highly potent penicillin inactivator from penicillin-resistant staphylococci. Science 99:452-3.

47. Kopp, U., M. Roos, J. Wecke, and H. Labischinski. 1996. Staphylococcal peptidoglycan interpeptide bridge biosynthesis: a novel antistaphylococcal target? Microbial drug resistance (in press)

48. Labischinski, H. 1992. Consequences of the interaction of beta-lactam antibiotics with penicillin binding proteins from sensitive and resistant Staphylococcus aureus strains. Med Microbiol Immunol 181:241-265.

49. Latinwo, L. M., and E. Archibold. 1993. Isolation and characterization of Membrane-Associated form of penicillase plasmid (pI524) DNA in Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun 197:11181125.

50. Lindberg, M., and R. P. Novick. 1973. Plasmid-specific transformation in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 115:139-45.

51. Livermore, D. M. 1995. p-Lactamases in Laboratory and Clinical Resistance. Clin Microb Rev 6:557-584.

52. Lyon, B. R., and R. Skurray. 1987. Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus: genetic basis. Microbiological Review 51:88-134.

53. Maidhof, H., L. Johannsen, H. Labischinski, and P. Giesbrecht.1989. Onset of penicillin-induced bacteriolysis in staphylococci is cell cycle dependent. J Bacteriol 171:2252-7.

54. Matthews, P. R., and P. R. Stewart. 1984. Resistance heterogeneity in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. Lett. 22:161-6.

55. McDougal, L. K., and C. Thornsberry. 1986. The role of beta-lactamase in staphylococcal resistance to penicillinase-resistant penicillins and cephalosporins. J Clin Microbiol 23:832-839.

56. McEnroe, A. S., and H. W. Taber. 1984. Correlation between cytochrome aa3 concentrations and streptomycin accumulation in Bacillus subtilis. Antimicrob Agents Chemother 26:507-12.

57. Mueller, J. P., and H. W. Taber. 1989. Isolation and Sequence of ctaA, a Gene Required for Cytochrome aa$ Biosynthesis and Sporulation in

58. Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 171:4967-4978.

59. NCCLS. 1994. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing-fifth edition; Approved Standard, NCCLS Document M100-S5., Villanova, Pa.

60. Neirinck, L. G., I. W. DeVoe, and J. M. Ingram. 1980. Events leading to cell death and lysis of Neisseria meningitidis in low concentration of penicillin G. Antimicrob Agents Chemother 17:715-724.

61. Neu, H. C. 1989. Overview of mechanisms of bacterial resistance. Review., Diagn Microbiol Infect Dis 12:109S-116S.

62. Novick, R. P. 1991. Genetic systems in staphylococci, p. 587-636. In J. H. Miller, Methods in Enzymology, Bacterial genetic systems. Academic Press Inc.,

63. Novick, R. P., I. Edelman, M. D. Schwesinger, A. D. Gruss, E. C. Swanson, and P. A. Pattee. 1979. Genetic translocation in Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sei U S A 76:400-4.

64. Novick, R. P., E. Murphy, T. J. Gryczan, E. Baron, and I. Edelman. 1979. Penicillinase Plasmids of Staphylococcus aureus: Restriction-Deletion Maps. Plasmid 2:109-129.

65. Oda, K., K. Yamato, E. Ohta, Y. Nakamura, M. Takemura, N. Nozato, K. Akashi, T. Kanegae, Y. Ogura, T. Kohchi, and K. Ohyama.1992. Gene Organization from the Complete Sequence of Liverwort Marchantía polymorpha Mitochondrial DNA. J. Mol. Biol. 223:1-7.

66. Oshida, T., and A. Tomasz. 1992. Isolation and Characterization of a Tn551-Autolysis Mutant of Staphylococcus aureus. J Bacteriol 174:49524959.

67. Park, W. a. M. M. 1984. Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus peptidoglycan transglycosylases that are not penicillin-binding proteins. J. Bacteriol. 157:538-544.

68. Pattee, A. P. 1993. Genetic and physical map of Staphylococcus aureus NCTC8325, p. 2.106-2.113. In S. J. e. O'Brien, Genetic maps 1993. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.

69. Pattee, P. A., N. E. Thompson, D. Haubrich, and R. P. Novick.1977. Chromosomal map locations of integrated plasmids and related elements in Staphylococcus aureus. Plasmid 1:38-51.

70. Paul, T. R., N. G. Halligan, L. C. Blaszczak, T. R. Parr, and T. J. Beveridge. 1992. A New Mercury-Penicillin-V Derivative as a Probe for Ultrastructural Localization of Penicillin-Binding Proteins in Escherichia coli. J Bacterid 174:4689-4700.

71. Perkins, J. B., and P. J. Joungman. 1986. Construction and properties of Til917lac, a transposon derivative that mediates transcriptional gene fusions in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci 83:140-144.

72. Perkins, J. B., and P. J. Youngman. 1984. A physical and functional analysis of Tn917, a Streptococcus transposon in the Tn3 family that functions in Bacillus. Plasmid 12:119-38.

73. Quirk, P. G., D. B. Hicks, and K. T.A. 1993. Cloning of the eta Operon from Alkaliphic Bacillus firmus OF4 and Cgarakterisation of the pH-regulated Cytochrome caas Oxidase it Encodes. J. Biol. Chem. 268:678-685.

74. Reynolds, P. E., and D. F. Brown. 1985. Penicillin-binding proteins of beta-lactam-resistant strains of Staphylococcus aureus. Effect of growth conditions. FEBS Lett 192:28-32.

75. Rossi, L., E. Tonin, Y. R. Cheng, and R. Fontana. 1985 Regulation of penicillin-binding protein activity: description of a methicillin-inducible penicillin-binding protein in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 27:828-831.

76. Sabath, L. D. 1982. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics in strains of Staphylococcus aureus. Ann Intern Med 97:339-44.

77. Sachithnandam, S., D. L. Lowery, and A. K. Saz. 1978. Isolation of (3-lactamase from a penicillin-susceptible strain of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 13:289-292.

78. Schleifer, K. H., and O. Kandier. 1972. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bact Rev 36:407-477.

79. Schroeder, C. J., and P. A. Pattee. 1984. Transduction analysis of transposon Tn557 insertions in the trp-thy region of the Staphylococcus aureus chromosome. JBacteriol 157:533-7.

80. Schwesinger, M. D., and R. P. Novick. 1975. Prophage-dependent plasmid integration in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 123:724-38.

81. Spratt, B. G. 1977. Properties of the penicillin-binding proteins of Escherichia coli Kl 2. Eur. J. Biochem. 72:341-352.

82. Stranden, A., M. Roos, and B. Berger-Baechi. 1995. Glutamine synthetase and heteroresistance in methicillin resistant Staphylococcus aureus. Microbial Drug Resistance (submitted)

83. Sugai, M., K. Ooku, T. Akiyama, S. Inoue, S. Iseda, Y. Miyake, and H. Suginaka. 1991. Suppression of penicillin-induced lysis of Staphylococcus aureus by cibacron blue 3G-A. Fems Microbiol Lett 64:1514.

84. Taber, H. W., J. P. Mueller, P. F. Miller, and A. S. Arrow. 1987 Bacterial Uptake of Aminoglycoside Antibiotics. Microbiological Reviews 51:439-457.

85. Thornsberry, C. 1988. The development of antimicrobial resistance in staphylococci. 21 Suppl C:9-17

86. Tipper, D. J., and J. L. Strominger. 1965. Mechanism of action of penicillins: a proposal based on their structural similarity to acyl-D-alanayl-alanine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54:1133-1141.

87. Tomasz, A. 1990. Auxiliary genes assisting in the expression of methicillin resistance in Staphylococcus aureus, p. 565-583. In R. P. Novick, Molecular biology of the staphylococci. VCH Publishers Inc., New York.

88. Tomasz, A., and S. Waks. 1975. Mechanism of action of penicillin: triggering of the pneumococcal autolytic enzyme by inhibitors of cell wall synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A 72:4162-6.

89. Trumpower, B. L. 1990. Cytochrome bcl complexes of microorganisms. Review. Microbiol Rev 54:101-29.

90. Tuomanen, E. 1986. Newly made enzymes determine ongoing cell wall synthesis and the antibacterial effects of cell wall synthesis inhibitors. J. Bacteriol. 167:535-543.

91. Wada, A., Watanabe H. 1994. Cloning and characterization of the pbpA gene encoding penicillin-binding protein 1 of Staphylococcus aureus. (in preparation):

92. Waley, S. G. 1987. An explicit model for bacterial resistance: applicatio to p-lactam antibiotics. Microbiol. Sci. 4:143-146.

93. Waxman, D. J., and J. L. Strominger. 1983. Penicillin-binding proteins and the mechanism of action of P-lactam antibiotics. Annu Rev Biochem 52:825-869.

94. Wyke, A. 1984. Isolation of five penicillin-binding proteins from Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. Lett. 22:133-138.

95. Wyke, A. W., J. B. Ward, M. V. Hayes, and C. A. M. Curtis.1981. A role in vivo for penicillin-binding protein-4 of Staphylococcus aureus. Europ. J. Biochem. 119:389-393.

96. Место рождения Новосибирск, Россия1. Гражданское не замужемсостояние

97. Vasilieva Е. Labischinski H., Berger-Baechi В. Identification and mapping of new chromosomal sites affecting response to P-lactams in Staphylococcus aureus, (послано в International Journal of Antimicrobial Agents)

98. Lushnikova T.P., Vasilieva E.A. Kholodilov N., Graphodatsky A.S. The primary structure of 353 bp BspKi complex tandem repeat of Calomyscus (Cricetidae, Rodentia)(b работе)1. Доклады:

99. Construction of PBP-mutants in Staphyloccocus aureus. 3rd Workshop on Procaryotic Genetics, Neggio, Switzerland, 2-4 March 1994.

100. Resistance to (3-lactam antibiotics in Staphyloccocus aureus. Universitaet Wien, April 1996.9. Благодарственное слово

101. Кроме того, я чрезвычайно благодарна госпоже приват-доценту доктору Бригитте Бергер-Бэхи за всеохватывающее научное руководство, за предоставленную поддержку, а также за то, что она сделала возможным мое пребывание в Цюрихе.

102. Я приношу свою благодарность также господину профессору доктору Петеру Гизбрехту за ценные обсуждения, критическую проверку и оценку работы и господину профессору доктору Рандольфу Лохману за реферирование этой работы.

103. Я благодарю моих коллег по работе в группе профессора Ф.Х. Кайзера и группе профессора П. Гисбрехта за хорошее научное сотрудничество, особенно хотелось бы упомянуть в этой связи Хейнриха Майдхофа, Эллен Альбрехт, Элизабет Хуф.

104. И не в последнюю очередь мне бы хотелось выразить свою благодарность всем сотрудникам института медицинской микробиология и института Роберта Коха за человеческую атмосферу и готовность помочь.

105. Я благодарю моих родителей, моего брата и моих русских друзей за их поддержку в любой ситуации.