Гиперметилирование ДНК в опухолях человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Иванова, Татьяна Анатольевна

• Иванова, Татьяна Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванова, Татьяна Анатольевна

Оглавление 1

Введение 4

Глава 1. Обзор литературы "Маркеры метилирования ДНК в опухолях человека"

1.1. Введение 6

1.2. Сигнальные пути, нарушаемые в опухолевых клетках вследствие инактивации генов гиперметилированием промоторов 7

1.3. Профиль гиперметилированных генов в опухолях 17

1.4. Методы определения статуса метилирования CpG-динуклеотидов в ДНК 22

1.5. Использование маркеров метилирования ДНК в клинической практике 24

Глава 2. Материалы и методы исследования 28

2.1. Список использованных реактивов 28

2.2. Клинические материалы

2.3. Клеточные линии

2.4. Обработка клеточных линий деметилирующим агентом

2.5. Выделение ДНК 31

2.5.1. Одновременное выделение ДНК и РНК

2.5.2. Выделение ДНК из лейкоцитов 31

2.6. Выделение плазмидной ДНК

2.6.1. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

2.6.2. Выделение плазмидной ДНК на колонках

2.7. Обработка ДНК рестриктазами

2.8. Бисульфитная конверсия ДНК 33

2.8.1. Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 33

2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах

2.9. Полимеразная цепная реакция 34

2.9.1. Праймеры

2.9.2. Метилчувствительная ПЦР

2.9.3. Метилспецифическая ПЦР 36

2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК после бисульфитной конверсии

2.10.1. Препаративное получение продукта ПЦР 37

2.10.2. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозных гелях

2.10.3. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля 38

2.10.3.1. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на колонках

2.10.3.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля на DEAE-деллюлозе 38

2.11. Клонирование продуктов ПЦР 39

2.11.1. Описание плазмид, использованных в работе в качестве вектора

2.11.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli 39

2.11.3. Трансформация клеток Escherichia coli

2.12. Блот-гибридизация 40 2.12.1. Получение препаратов ДНК, меченных Р32 40

2.13. Реакция обратной транскрипции 41

CpG-островка гена RAR-J32 в опухолях 43

Глава 3. Результаты: 43

3.1. Анализ метилирования шейки матки

3.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 в опухолях шейки матки 50

3.2.1. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом блот гибридизации по Саузерну 50

3.2.2. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МЧ ПЦР 52

3.2.3. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом секвенирования ДНК после бисульфитной конверсии 57

3.2.4. Анализ метилирования CpG-островка гена TIMP-2 методом МС ПЦР 59

3.2.5. Влияние деметилирующих агентов на экспрессию TIMP-2 61

3.2.6. Сравнение частоты метилирования генов TIMP-2 и TIMP-3 в опухолях шейки матки

3.3. Определение статуса метилирования TIMP-2 в опухолях молочной железы 63

3.4. Профиль метилирования генов в опухолях шейки матки 65

Глава 4. Обсуждение 70

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гиперметилирование ДНК в опухолях человека»

В качестве объекта исследования в работе использовали одну из наиболее распространенных форм опухолей - рак шейки матки. По частоте заболеваемости, и смертности рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска» (HPV 16, 18 и родственные им, WHO, Press Release, 1996). Период от начала инфекции до возникновения опухоли может занимать несколько лет. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании клеточных генов, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических событий (мутаций), так и вследствие эпигенетических изменений (наследуемых при делении клетки изменений, не связанных с изменением последовательности ДНК). К эпигенетическим изменениям, часто наблюдаемым в опухолях всех типов, относятся нарушения паттерна метилирования ДНК. Гиперметилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5' регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках они, как правило, не метилированы. Метилирование промоторов и первых экзонов генов сопровождается подавлением их транскрипции. Таким образом, гиперметилирование 5' регуляторных районов приводит к таким же последствиям для функций генов, как и инактивирующие мутации. Исследования последних лет показали, что опухоли разных типов отличаются по набору генов, инактивируемых вследствие гиперметилирования. В связи с этим необходимо выявление маркеров аберрантного метилирования для каждого типа опухолей.

Выявление генов - потенциальных маркеров аберрантного метилирования кардинальным образом расширяет список генов, вовлеченных в канцерогенез, что в свою очередь расширяет возможности для молекулярного подхода к диагностированию, мониторингу и прогнозированию течения заболевания.

Цель настоящей работы: идентификация генов, инактивированных в опухолях шейки матки, вследствие гиперметилирования промоторов.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) Определить частоту метилирования в опухолях шейки матки гена рецептора ретиноевой кислоты RAR/3-2\

2) Выяснить, связано ли наблюдаемое в опухолях шейки матки подавление экспрессии гена TIMP-2 (тканевой ингибитор металлопротеиназ 2) с метилированием 5*области гена;

3) В случае обнаружения метилирования определить район 5' области гена TIMP-2, метилирование которого коррелирует с подавлением транскрипции;

4) Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в опухолях шейки матки;

5) Определить частоту метилирования гена TIMP-2 в другой форме эпителиальных опухолей — раке молочной железы.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Иванова, Татьяна Анатольевна

выводы

1) Двумя независимыми методами показано метилирование промотора и первого экзона гена RAR/3-2 в 12 из 25 (48%) HPV позитивных опухолях шейки матки и в 4 морфологически нормальных тканях, прилегающих к опухоли.

2) Впервые обнаружено гиперметилирование 5' области гена TIMP-2 в клеточных линиях и опухолях шейки матки.

• Определен дискретный район промотора TIMP-2 (от -240 до -350 п.н. по отношению к старту транскрипции), в котором наблюдается наибольшая плотность метилирования.

• Установлено, что метилирование этого района промотора коррелирует со снижением уровня мРНК TIMP-2 в клеточных линиях карцином шейки матки.

• Показано, что транскрипция гена TIMP-2 может быть активирована при обработке клеток деметилирующими агентами: 5-аза-цитидином и 5-аза-дезоксицитидином.

3) Установлено, что метилирование промотора TIMP-2 наблюдается в 16 из 39 (41%) опухолях шейки матки и в 5 из 39 морфологически нормальных тканях шейки матки, прилегающих к опухоли. Показано, что метилирование TIMP-3, известного маркера метилирования, наблюдается в 8 из 39 (21%) опухолей шейки матки.

4) При сравнении частоты метилирования трех маркеров RAR/3-2, TIMP-2 и TIMP-3 в опухолях шейки матки установлено:

• HPV-позитивные опухоли различаются между собой по профилю метилирования: а) в 70% опухолей метилирован хотя бы один маркер из трех. б) в 30% опухолей не выявлено метилирования ни одного из трех маркеров.

• Профиль метилирования генов в опухолях шейки матки не зависит от присутствия в них генома HPV из группы «высокого риска».

5) Впервые установлено, что метилирование промотора TIMP-2 наблюдается в 15 из 47 (32%) опухолей молочной железы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванова, Татьяна Анатольевна, 2004 год

1. Волгарева ГМ, Завалишина ЛЭ, Франк ГА, Андреева ЮЮ, Петров АН, Киселев ФЛ, Спитковский ДЦ. Экспрессия белкового маркера р16ШК4А в раке шейки матки. Архив патологии, 2002; 1:22-24.

2. Ровенский ЮА. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии. Биохимия, 1998; 63(9): 1204-1221

3. Ahonen М, Baker АН, Kahari V-M. Adenovirus-mediated gene delivery of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 inhibits invasion and induces apoptosis in melanoma cells. Cancer Res, 1998; 58:2310-2315

4. Ahuja N, Li Q, Mohan AL, Baylin SB, Issa JP. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer. Cancer Res, 1998; 58:5489-5494

5. Anand-Apte B, Bao L, Smith MR, Iwata K, Olsen BR, Zetter B, Apte SS. A review of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) and experimental analysis of its effect on primary tumor growth. Biochem. Cell Biol.,1996; 74:853-862

6. Baeza N, Weller M, Yonekawa Y, Kleihues P, Ohgaki H. PTEN methylation and expression in glioblastomas. Acta Neuropathol (Berl), 2003; 106(5):479-485

7. Battagli C, Uzzo RG, Dulaimi E, Krassenstein R, Al-Saleem T, Greenberg RE, Cairns P. Promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in urine from kidney cancer patients. Cancer Res, 2003; 63:8695-8699

8. Belinsky SA, Palmisano WA, Gilliland FD, Crooks LA, Divine KK, Winters SA, Grimes MJ, harms HJ, Tellez CS, Smith TM, Moots PP, Lechner JF, Stidley CA,

9. Crowell RE. Aberrant promoter methylation in bronchial epithelium and sputum from current and former smokers. Cancer Res, 2002; 62(8):2370-2377

10. Belinsky SA, Nikula KJ, Palmisano WA, Michels R, Saccomanno G, Gabrielson E, Baylin SB, Herman JG. Aberrant methylation of pl6INK4A is early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 1189111896

11. Benassi MS, Gambery G, Magagnoli G, Molendini L, Ragazzini P, Merli M, Chiesa F, Ballabelly A, Mafrini M, Bertoni F, Merccuri M, Picci P. Metalloproteinase expression and prognosis in soft tissue sarcomas. Ann Oncol, 2001; 12:75-80

12. Bergman Y, Mostoslavsky R. DNA demethylation: turning genes on. Biol Chem, 1998;379:401-7

13. Bian J, Wang Y, Smith MR, Kim H, Jacobs C, Jackman J, Kung HF, Colburn NH, Sun Y. Suppression of in vivo tumor growth and induction of suspension cell death by tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP-3). Carcinogenesis(Lond), 1996; 17:1805-1811

14. Bird AP. CpG-rich islands and function of DNA methylation. Nature, 1986, 321:209213.

15. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev, 2002; 16:621.

16. Bird AP, Southern EM. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation:!. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus Iaevis. J MolBiol, 1978; 118:27-47

17. Bovenzi V, Le NLO, Cote S, Sinnett D, Monparler L, Monparler RL. DNA methylation of retinoic acid receptor P in breast cancer and possible therapeutic role of 5-aza-2'-deoxycytidine. Anti-Cancer Drugs, 1999; 10:471-476

18. Cairns P, Okami K, Halachmi N, Esteller M, Herman JG et al. Frequent inactivation of PTEN/MMAC1 in primary prostate cancer. Cancer Res, 1997; 57:4997-5000

19. Caliaro MJ, Marmouget C, Guichard S. Response of four ovarian carcinoma cell lines to all-trans retinoic acid: relationship with induction of differentiation and retinoic acid receptor expression. Int J Cancer, 1994; 56:743-748

20. Chambon P. The retinoid signaling pathway: molecular and genetic analyses. Semin Cell Biol, 1994; 5:115-125.

21. Chan MW, Chan LW, Tang NL, Tong JH, Lo KW, Lee TL, Wong WS, Chan PS, Lai FM, TO KF. Hypermethylation of multiple genes in tumor tissues and voided urine in urinary bladder cancer patients. Clin Cancer Res, 2002; 8(2):464-470

22. Chan AO-O, Kim SG, Bedeir A, Issa J-P, Hamilton SR, Rashid A. CpG island methylation in carcinoid and pancreatic endocrine tumors. Oncogene, 2003; 22(6):924-934

23. Chang KW, Kao SY, Tzeng RJ, Liu CJ, Cheng AJ, Yang SC, Wong YK, Lin SC. Multiple molecular alterations of FHIT in betel-associated oral carcinoma. J Pathol, 2002;196(3):300-306

24. Chen CL, Liu SS, Ip SM, Wong LC, Ng TY, Ngan HY. E-cadherin expression is silenced by DNA methylation in cervical cancer cell lines and tumors. Eur J Cancer, 2003; 39(4):517-523

25. Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res, 1994; 22(15):2990-2997

26. Cohen Y, Singer G, Lavie O, Dong SM, Beller U, Sidransky D. The RASSF1A tumor suppressor gene is common inactivated in adenocarcinoma of th uterine cervix. Clinical Cancer Res, 2003; 9:2981-2984

27. Cohen O, Kimchi A. DAP-kinase: from functional gene cloning to establishment of its role in apoptosis and cancer. Cell Death Differ, 2001; 8:6-15

28. Comerci JT, Hallam S, Goldberg GL, Runowcz CD, Fields AL, Wadler S, Gallagher RE. Expression of retinoic acid receptor-P2 mRNA in normal cervical epithelium and cervical squamous cell carcinoma. Int J Oncology, 1997; 11:983-988

29. Costello JF, Futscher BW, Tano K, Graunke DM, Pieper RO. Graded methylation in the promoter and body of 06-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) gene correlates with MGMT expression in human glioma cells. J Biol Chem, 1994; 269:17228-17237

30. Costello JF, Fruhwald MC, Smiraglia DJ, Rush LJ, Robertson GP, Gao X, Wright FA, Feramisco JD, Peltomaki P, Lang JC, Schuller DE, Yu L, Bloomfield CD, Caligiuri MA, Yates A, Nishikawa R, Huang H-JS, Petrelli NJ, Zhang X, O'Dorisio MS, Held

31. WA, Cavenee WK, Plass C. Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns. Nature Genet, 2000; 24(2): 132-138

32. Dong SM, Kim H-S, Rha S-H, Sidransky D. Promoter hypermethylation of multiple genes in carcinoma of the uterine cervix. Clinical Cancer Res, 2001; 7:1982-1986

33. Eads С A, Danenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D, Daneneberg PV, Laird PW. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res, 2000; 28(8):E32

34. Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, Baylin SB, Herman JG. Inactivation of the DNA repair gene 06-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia. Cancer Res, 1999; 59:793-797

35. Esteller M, Guo M, Moreno V, Peinado MA, Capella G, Galm O, Baylin SB, Herman JG. Hypermethylation-associated inactivation of the cellular retinal-binding-protein 1 gene in human cancer. Cancer Res, 2002; 62(20):5902-5905

36. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res, 2001; 61:3225-3229

37. Evron E, Dooley WC, Umbrecht CB, Rosenthal D, Sacchi N, Gabrielson E, Soito AB, Hung DT, Ljung B, Davidson NE, Sukumar S. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR. Lancet, 2001; 2001:1335-1336

38. Frazier ML, Xi L, Zong J, Viscofsky N, Rashid A, Wu EF, Lynch PM, Amos CI, Issa J-P. Association of the CpG island methylator phenotype with family history of cancer in patients with colorectal cancer. Cancer Res, 2003; 63:4805-4808

39. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigo GW, Molloy PL, Paul CL. A genomic sequencing protocol that yelds a positive display of 5methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89:1827-1831

40. Futscher BW, Oshiro MM, Wozniak RJ, Holtan N, Hanigan CL, Duan H, Domann FE. Role for DNA methylation in the control of the cell type specific maspin expression. Nature Genet, 2002; 31:175-179

41. Galm O, Yoshikawa H, Esteller M, Osieka R, Herman JG. SOCS-1, a negative regulator of cytokine signaling, is frequently silenced by methylation in multiple myeloma. Blood, 2003; 101(7):2784-2788

42. Gemma A, Hagiwara К, Ke K, Burke LM, Khan MA, Nagashima M, Bennet WP, Harris CC. FHIT mutations in human primary gastric cancer. Cancer Res, 1997; 57:1435-1437

43. Goessl C, Krause H, Muller M, Hlicappel R, Schrader M, Sachsinger J, Miller K. Fluorescent methylation-specific polimerase chain reaction for DNA-based detection of prostate cancer in bodily fluids. Cancer Res, 2000; 60:5941-5945

44. Gonzalez-Gomez P, Bello MJ, Aijona D, Alonso ME, Lomas J, De Campos JM, Kusak ME, Gutierrez M, Sarasa JL, Rey JA. Aberrant CpG island methylation in neurofibromas and neurofibrosarcomas. Oncol Rep, 2003; 10(5):1519-23

45. Graff JR, Herman JG, Lapidus RG, Chopra H, Xu R, Jarrar DF, Pitha PM, Davidson NE, Baylin SB. E-cadherin expression is silenced by DNA hypermethylation in human breast and prostate carcinomas. Cancer Res, 1995; 55:5195-5199

46. Greger V, Passarge E, Hopping W, Messmer E, Horsthemke B. Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression of retinoblastoma. Hum Genet, 1989;83:155-158

47. Hammani K, Blakis A, Morsette D, Bowcock AM, Schmutte C, Henriet P, DeClerck YA. Structure and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinase-2 gene. J Biol Chem, 1996; 271:25498-505

48. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell, 2000; 100:57-70

49. Harden SV, Tokumaru Y, Westra WH, Goodman S, Ahrendt SA, Yang SC, Sidransky D. Gene promoter hypermethylation in tumors and lymph nodes of stage I lung cancer patients. Clinical Cancer Res, 2003; 9:1370-1375

50. Hasegawa M, Nelson HN, Peters E, Ringstrom E, Posner M, Kelsey KT. Patterns of gene promoter methylation in squamous cell cancer of the head and neck. Oncogene, 2002; 21(27):4231-4236

51. Hayashi K, Yokozaki H, Goodison S, Que N, Suzuki T, Lotan R, Tahara E. Inactivation of retinoic acid receptor beta by promoter CPG hypermethylation in gastric cncer. Differentiation, 2001, 68(1): 13-21

52. He B, You L, Uematsu K, Zang K, Xu Z, Lee AY, Costello JF, McCormick F, Jablons DM. SOCS-3 is frequently silenced by hypermethylation and suppresses cell growth in human lung cancer. ProcNatl Acad Sci USA, 2003; 100(24):14133-14138

53. Herman JG. Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer. Semin Cancer Biol, 1999; 9:359-367

54. Herman JG, Baylin SB. Mechanisms of disease: gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J Med, 2003; 349(21):2042-2054

55. Herman.G, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA,1996; 93:9821-9826

56. Hibi K, Nakayama H, Kodera Y, Ito K, Akiyama S, Nakao A. CDH 13 promoter region is specifically methylated in poorly differentiated colorectal cancer. British J Cancer, 2004; 90:1030-1033

57. Hong WK, Itri LM: Retinoids and human cancer. In: The retinoids: biology, chemistry and medicine. 1994, 387-442

58. Issa JP , Ottaviano JL, Celano P, Hamilton SR, Davidson NE, Baylin SB. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. Nature Genet, 1994; 7:536-540

59. Jang TJ, Kim DI, Shin YM, Chang HK, Yang CH. P16INK4A promoter hypermethylation of non-tumorous tissue adjacent to gastric cancer is correlated with glandular atrophy and chronic inflammation. Int. J. Cancer, 2001; 93:629-634

60. Jeronimo С, Usadel H, Henrique R, Silva C, Oliveira J, Lopes C, Sidransky D. Quantitative GSTP1 hypermethylation in bodily fluids of patients with prostate cancer. Urology, 2002; 60:1131-1135

61. Jiang Y, Goldberg ID, Shi YE. Complex role of tissue inhibitors of metalloproteinases in cancer. Oncogene, 2002; 21:2245-2252

62. Jones PA, Baylin SB. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nature Rev Genet, 2002; 3:415-428

63. Kanai Y, Ushijima S, Hui A-M, Ochiai A, Tsuda H, Sakamoto M, Hirohashi S. The E-cadherin gene is silenced by CpG methylation in human hepatocellular carcinomas. Int. J. Cancer, 1997; 71(3):355-359

64. Kang YH, Lee HS, Kim WH. Promoter methylation and silencing of PTEN in gastric carcinoma. Lab Invest, 2002; 82(3):285-291

65. Kang GH, Lee S, Kim JS, Jung HY. Profile of aberrant CpG island methylation along multistep gastric carcinogenesis. Lab Invest, 2003; 83(4):519-26

66. Kang GH, Shim YH, Jung HY, Kim WH, Ro JY, Rhyu MG. CpG island methylation in premalignant stages of gastric carcinoma. Cancer Res, 2001; 61(7):2847-2851

67. Kim D-H, Nelson HH, Wiencke JK, Zheng S, Christiani DC, Wain JC, Mark EJ, Kelsey KT. Pie"^48 and histology-specific methylation of CpG islands by exposure to tobacco smoke in non-small cell lung cancer. Cancer Research, 2001; 61:3419-3424

68. Kim D-H, Nelson HH, Wiencke JK, Christiani DC, Wain JC, Mark EJ, Kelsey KT. Promoter methylation of DAP-kinase: association with advanced stage in non-small cell lung cancer. Oncogene, 2001; 20(14): 1765-1770

69. Kim S.G, Chan AO, Wu TT, Issa JP, Hamilton SR, Rashid A. Epigenetic and genetic alterations in duodenal carcinomas are distinct from biliary and ampullary carcinomas. Gastroenterology, 2003,124(5):1300-1310

70. Krassenstein R, Sauter E, Dulaimi E, Battagli C, Ehya H, Klein-Szanto A, Cairs P. Detection of breast cancer in nipple aspirate fluid by CpG island hypermethylation. Clinical Cancer Res, 2004; 10:28-32

71. Kuzmin I, Liu L, Dammann R, Geil L, Stanbridge EJ, Wilczynsky SP, Lerman MI, Pfeifer GP. Inactivation of RAS association domain family 1A gene in cervical carcinomas and the role of human papillomavirus infection. Cancer Res, 2003, 63:1888-1893

72. Kwong J, Lo KW, To KF, Teo PM, Johnson PJ, Huang DP. Promoter hypermethylation of multiple genes in nasopharyngeal carcinoma. Clin Cancer Res 2002, 8(1):121-131

73. Laird PW. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer, 2003; 3:253-266

74. Lee T-L, Leung WK, Chan MWY, Ng EKW, Tong JHM, Lo K-W, Chung SCS, Sung JJY, To K-F. Detection of gene promoter hypermethylation in the tumor and serum of patients with gastric carcinoma. Clinical Cancer Res, 2002; 8:1761-1766

75. Li Q, Ahuja N, Burger PC, Issa JP. Methylation and silencing of the Thrombospondin-1 promoter in human cancer. Oncogene, 1999; 18:3284-3289

76. Li E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nature Rev Genet, 2002; 3:662-673

77. Liu Y, Lee M, Wang H-G, Li Y, Hashimoto Y, Klaus M. Retinoic acid receptor p mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis- in human breast cancer cells. Mol Cell Biol, 1996; 16:1138-1149

78. Lotan R, Dawson MI, Zou CP. Enhanced efficacy of combinations of retinoic acid-and retinoid X receptor-selective retinoids and a-interferon in inhibition of cervical carcinoma cell proliferation. Cancer Res, 1995; 55:232-236

79. Margaret HL NG, To KW, Lo KW, Chan S, Tsang KS, Cheng SH, Ng HK. Frequent death-associated protein kinase promoter hypermethylation in multiple myeloma. Clinical Cancer Res, 2001; 7:1724-1729

80. Muller HM, Widschwendter A, Fiegl H, Ivarsson L, Goebel G, Perkmann E, Marth C, Widschwendter M. DNA methylation in serum of breast cancer patients. Cancer Res, 2003;63:7641-7645

81. Nagai H, Naka T, Terada Y, Komazaki T, Yabe A, Jin E, Kawanami O, Kishimoto T, Konishi N, Nakamura M. Hypermethylation associated with inactivation of the

82. SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor, in human hepatoblastomas. J Hum Genet, 2003; 48(2):65-69

83. Nakayama T, Watanabe M, Yamanaka M, Hirokawa Y, Suzuki H, Yatani R, Shiraishi T. The role of epigenetic modifications in retinoic acid receptor beta2 gene expression in human prostate cancers. Lab Invest, 2001; 81(7): 1049-57

84. Negrini M, Monaco C, Vorechovsky I, Ohta M, Druck T, Baffa R, Huebner K, Croce CM. The FHIT gene at 3pl4.2 is abnormal in breast carcinomas. Cancer Res, 1996; 56:3173-3179

85. Nervi C, Vollberg TM, George MD, Zelent A, Chambon P, Jetten AM: Expression of nuclear retinoic acid receptors in normal tracheobronchial cells and in lung carcinoma cells. Exp Cell Res, 1991; 195: 163-170

86. Nobori T, Miura K, Wu DJ. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature, 1994; 368:753-756

87. Okochi O, Hibi K, Sakai M, Inoue S, Takeda S, Kaneko T, Nakao A. Methylation-mediated silencing of SOCS-1 gene in hepatocellular carcinoma derived from cirrhosis. Clinical Cancer Res, 2003; 9:5295-5298

88. Palmisano WA, Divine KK, Saccomanno G, Gilliland FD, Baylin SB, Herman JG. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res, 2000; 60:5954-5958

89. Pegg AE. Mammalian 06-aIkylguanine-DNA alkyltransferase: regulation and importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res, 1990; 50:6119-6129

90. Oue N, Shigeishi H, Kuniyasu H, Yokozaki H, Kuraoka K, Ito R, Yasui W. Promoter hypermethylation of MGMT is associated with protein loss in gastric carcinoma. Int J Cancer, 2001; 93:805-809

91. Remacle A, McCarthy K, Noel A, Maguire T, McDermont E, Higgens NO, Fiodart JM, Duffy MJ. High levels of TIMP-2 correlate with adverse prognosis in breast cancer. Int J Cancer, 2000; 89:118-121

92. Rigg AS, Lemoine NR. Adenoviral delivery of TIMP1 or TIMP2 can modify the invasive behavior of pancreatic cancer and can have a significant antitumor effect in vivo. Cancer Gene Ther, 2001;8(11):869-878

93. Robertson KD, Wolffe AP. DNA methylation in health and disease. Nature Rev Genet, 2000; 1:11-19

94. Robertson KD. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene, 2002; 21(35):5361-5379

95. Samoylova EV, Shakhaiev GO, Petrov SV, Kisseljova NP, Kisseljov FL. HPV infection in cervical-cancer cases in Russia. Int J Cancer, 1995; 61:337-341

96. Salvesen HB, MacDonald N, Ryan A, Jacobs I J, Lynch ED, Akslen LA, Das S. PTEN methylation is associated with advanced stage and microsatellite instability in endometrial carcinoma. Int J Cancer, 2001; 91(l):22-26

97. Seewaldt VL, Johnson BS, Parker MB, Collins SJ, Swisshelm K. Expression of retinoic acid receptor beta mediates retinoic acid-induced growth arrest and apoptosis in breast cancer cells. Cell Growth Differ, 1995; 6(9):1077-1088

98. Seo DW, Guedez L, Wingfield PT, Diaz T, Salloum R, Wei BY, Stetler-Stevenson WG. TIMP-2 mediated inhibition of angiogenesis: an MMP-independent mechanism. Cell, 2003; 114(2):171-180

99. Schagdarsurengin U, Wilkens L, Steinemann D, Flemming P, Kreipe HH, Pfeifer GP, Schlegelberger B, Dammann R. Frequent epigenetic inactivation of the RASSFIA gene in hepatocellular carcinoma. Oncogene, 2003; 22(12):1866-1871

100. Seo DW, Guedez L, Wingfield PT, Diaz T, Salloum R, Wei BY, Stetler-Stevenson WG. TIMP-2 mediated inhibition of angiogenesis: an MMP-independent mechanism. Cell, 2003; 114(2):171-180

101. Singer-Sam J, LeBon JM, Tanguay RL, Riggs AD. A quantitative Hpall-PCR assay to measure methylation of DNA from a small number of cells. Nucleic Acids Res, 1990; 18(3):687

102. Sirchia SM, Ferguson AT, Sironi E, Subramanyan S, Orlandi R, Sukumar S, Sacchi N. Evidence of epigenetic changes affecting the chromatin state of the retinoic acid receptor beta2 promoter in breast cancer cells. Oncogene, 2000; 19(12): 1556-63

103. Sirchia S.M., Ren M, Pili R, Sironi E, Somenzi G, Ghidoni R, Tomas S, Nicolo G, Sacchi N. Endogenous reactivation of the RARbeta2 tumor suppressor gene epigenetically silenced in breast cancer. Oncogene, 2000; 62(9):2455-246l

104. Soria JC, Lee HY, Lee JI, Wang L, Issa JP, Kemp BL, Liu DD, Kurie JM, Mao L, Khuri FR. Lack of PTEN expression in non-small cell lung cancer could be related to promoter methylation. Clin Cancer Res, 2002; 8(5): 1178-1184

105. Strathdee G, MacKean MJ, Illand M, Brown R. A role for methylation of the hMLHl promoter in loss of hMLHl expression and drug resistance in ovarian cancer. Oncogene, 1999; 18:2335-2341

106. Sun SY, Wan H, Hong WK, Lotan R. Evidence that retinoic acid receptor beta induction by retinoids is important for tumor cell growth inhibition. J Biol Chem, 2000; 275(22):17149-53

107. Swisshelm K, Ryan K, Lee X, Tsou НС, Peacocke M, Sager R: Down-regulation of retinoic acid receptor P in mammary carcinoma cell lines and its up-regulation in senescing normal mammary epithelial cells. Cell Growth Differ, 1994; 5:133-141

108. Tada Y, Wada M, Taguchi K-I, Mochida Y, Kinugawa N, Tsuneyoshi M, Naito S, Kuwano M. The association of death-associated protein kinase hypermethylation with early recurrence in superficial bladder cancers. Cancer Res, 2002; 62:4048-4053

109. Tamura M, Gu J, Matsumoto K, Aota S, Parsons R, Yamada KM. Inhibition of cell migration, spreading, and focal adhesions by tumor suppressor PTEN. Science, 1998; 280:1614-1617

110. Thiagalingam S, Lisitsyn NA, Hamaguchi M, Wigler MH, Willson JKV, Markowitz SD, Leach FS, Kinzler KW, Vogelstein B. Evalution of the FHIT gene in colorectal cancers. Cancer Res, 1996; 56:2936-2939

111. Toyooka S, Toyooka КО, Maruyama R, Virmani AK, Girard L, Miyajima K, Harada K, Ariyoshy Y, Takahashi T, Sugio K, Brambilla E, Gilcrease M, Minna JD, Gazdar AF. DNA methylation profiles of lung tumors. Mol Cancer Ther, 2001; l(l):61-67

112. Toyota M, Ahuja N, Suzuki H, Itoh F, Ohe-Toyota M, Imai K, Baylin SB, Issa JP. Aberrant methylation in gastric cancer associated with the CpG island methylator phenotype. Cancer Res, 1999; 59:5438-5442

113. Toyota M, Ahuja N, Ohe-Toyota M, Herman JG, Baylin SB, Issa JP. CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96:86818686

114. Toyota M, Ho C, Ahuja N, Jair KW, Li Q, Ohe-Toyota M, Baylin SB, Issa JP. Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res, 1999; 59:2307-2312

115. Ueki T, Toyota M, Sohn T, Yeo С J, Issa JP, Hruban RH, Goggins M. Hypermethylation of multiple genes in pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res, 2000; 60(7):1835-1839

116. Vasioukhin V, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Stroun M. Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. Br J Haematol, 1994; 86:774-779

117. Virmani A.K, Muller C, Rathi A, Zoechbauer-Mueller S, Mathis M, Gazdar AF. Aberrant methylation during cervical carcinogenesis. Clin Cancer Res, 2001; 7(3):584-589

118. Virmani AK, Tsou JA, Siegmund KD, Shen LY, Long TI, Laird PW, Gazdar AF, Laird-Offringa IA. Hierarchical clustering of lung cancer cell lines using DNA methylation markers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2002; 11(3):291-297

119. Viswanathan M, Tsuchida N, Shanmugan G. Promoter hypermethylation profile of tumor-associated genes pi6, pi5, hMLH and E-cadherin in oral squamous cell carcinoma. Int J Cancer, 2003; 105(l):41-46

120. Walsh CP, Chaillet JR, Bestor TH. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nature Genet, 1998; 20:116-117

121. Wang Z, Juttermann R, Soloway PD. TIMP-2 is required for efficient activation of proMMP-2 in vivo. J Biol Chem, 2000; 275:26411-26415

122. Wang Y, Fang MZ, Liao J, Yang G-Y, Nie Y, Song Y, So C, Xu X, Wang L-D, Yang CS. Hypermethylation-associated inactivation of retinoic acid receptor p in human esophageal squamous cell carcinoma. Clinical Cancer Res, 2003; 9:5257-5263

123. Wamecke PM, Stirzaker C, Melki JR, Millar DS, Paul CL, Clark SJ. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Res, 1997; 25(21):4422-4426

124. Widschwendter M, Berger J, Muller HM, Zeimet AG, Marth C. Epigenetic downregulation of the retinoic acid receptor-beta2 gene in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2001,6(2):193-201

125. Widschwendter A, Muller HM, Fiegl H, Ivarsson L, Wiedemair A, Muller-Holzner E, Goebel G, Marth C, Widschwendter M. DNA methylation in serum and tumors of cervical cancer patients. Clinical cancer Res, 2004; 10:565-571

126. Wu Q, Shi H, Suo Z, Nesland JM. 5'-CpG island methylation of the FHIT gene is associated with reduced protein expression and higher clinical stage in cervical carcinomas. Ultrastruct Pathol, 2003; 27(6):417-422

127. Wu Q, Li Y, Liu R, Agadir A, Lee MO, Lui Y. Modulation of retinoic acid sensitivity in lung cancer cells through dynamic balance of orphan receptors nur 77 and COUP-TF and their heterodimerization. EMBO, 1997; 16:1656-1669

128. Xu X-C, Liu X, Tahara E, Lippman SM, Lotan R. Expression and up-regulation of retinoic acid receptor (3 is associated with retinoid sensitivity and colony formation in esophageal cancer cell lines. Clinical Cancer Res, 1999; 59:2477-2483

129. Xu XC, Ro JY, Lee JS, Shin DM, Hong WK, Lotan R. Differential expression of nuclear retinoid receptors in normal, premalignant and malignant head and neck tissues. Cancer Res, 1994; 54:3580-3587

130. Yamanaka M, Watanabe M, Yamada Y, Takagi A, Murata T, Takahashi H, Suzuki H, Ito H, Tsukino H, Katoh T, Sugimura Y, Shiraishi T. Altered methylation of multiple genes in carcinogenesis of the prostate. Int J Cancer 2003,106(3):382-388

131. Yang QW, Liu S, Tian Y, Salwen HR, Chlenski A, Weinstein J, Cohn SC. Methylation-associated silencing of the Thrombospondin-1 gene in human neuroblastoma. Cancer Res, 2003; 63:6299-6310

132. Yang Q, Mori I, Shan L, Nakamura M, Nakamura Y, Yoshimura G, Suzuma T, Tamaki T, Umemura T, Sakurai T, Kakudo K. Biallelic inactivation of retinoic acid receptor beta 2 gene by epigenetic change in breast cancer. Am J of Pathol, 2001; 158(l):299-303

133. Yang Q, Sakurai T, Yoshimura G, Mori I, Suzuma T, Tamaki T, Umemura T, Kakudo K. Hypermethylation does not account for the frequent loss of the retinoic acid receptor beta 2 in breast carcinoma. Anticancer Res, 2001; 21(3B): 1829-1833

134. Yu MY, Tong JHM, Chan PKS, Lee TL, Chan MWY, Chan AWH, Lo KW, To KF. Hypermethylation of the tumor suppressor gene RASSF1A and frequent concomitant loss of heterozygosity at 3p21 in cervical cancers. Int J Cancer, 2003; 105(2):204-209

135. Zhong S, Tang MW, Yeo W, Liu C, Lo D, Johnson PJ. Silencing of GST1 gene by CpG island DNA hypermethylation in HBV-associated hepatocellular carcinomas. Clinical Cancer Res. 2002; 8:1087-1092

136. Zochbauer-Muller S, Fong KM, Virmani AK, Geradts J, Minna JD. Aberrant promoter methylation of multiple genes in non-small cell lung cancers. Cancer Res, 2001; 61(l):249-255

137. Zochbauer-Muller S, Lam S, Toyooka S, Virmani AK, Toyooka КО, Seidl S, Minna JD, Gazdar AF. Aberrant methylation of multiple genes in the upper aerogestive tract epithelium of heavy smokers. Int J Cancer, 2003; 107(4):612-618