Гидрогелевый клеточный микрочип для исследования внутриклеточных процессов и детекции химических соединений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Фесенко, Денис Олегович

• Фесенко, Денис Олегович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фесенко, Денис Олегович

Оглавление.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Технология биологических микрочипов.

1.2. Аналоги клеточных микрочипов.

1.3. Иммобилизация клеток. Гелевые основы для иммобилизации живых клеток.

1.3.1. Агароза.

1.3.2. Альгинат.

1.3.3. Полиакриламид.

1.3.4. ПАА-гидразид.

1.4. Влияние иммобилизации микроорганизмов в ПААГ на их жизнеспособность.

1.5. Физиология и морфология иммобилизованных клеток, характер роста в геле.

1.6. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток.

1.7. Выводы к главе 1.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы, штаммы и условия культивирования.

2.2. Компоненты гелеобразующих растворов.

2.2.1. Акриламид и бисакриламид.

2.2.2. Персульфат аммония.

2.2.3. ТЭМЕД.

2.2.4. Полиакриламид-гидразид.

2.2.5. Агароза, альгинат.

2.2.6. Глицерин.

2.3. Подготовка подложки для ГКМ.

2.4. Оценка токсичности компонентов.

2.5. Введение флюоресцентной метки в живые бактериальные клетки.

2.6. Регистрация флюоресценции и люминесценции ячеек ГКМ. Обработка данных.

2.7. Инкубационная камера.

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГИДРОГЕЛЕВОГО КЛЕТОЧНОГО МИКРОЧИПА.

3.1. АгарозныйГКМ.

3.2. Полиакриламидный ГКМ.

Влияние физических факторов

3.2.1. Влажность атмосферы.

3.2.2. Размер ячеек.

3.2.3. Температура полимеризиции.

3.2.4. Скорость полимеризации.

Влияние химического состава ГР

3.2.5. Акриламид и бисакриламид.

3.2.6. Глицерин.

3.2.7. Осмолярность ГР.

3.2.8. Персульфат аммония.

3.2.9. ТЭМЕД.

3.2.10. Изготовление полиакриламидного клеточного микрочипа.

3.2.11. Установки для полимеризации ПКМ.

Общие указания по изготовлению ПКМ.

3.3. Полиакриламид-гидразидный ГКМ.

3.4. Альгинатный КМ.

3.4.1. Способ химической пришивки альгината к поверхности подложки.

3.4.2. Изготовление альгинатного клеточного микрочипа.

3.5. Хранение КМ.

3.6. Выводы к главе 3.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ И ДЕТЕКЦИЯ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ КМ.

4.1 Детекция антибиотиков.

4.2. Количественный анализ антибиотиков.

4.3. Мониторинг синтеза НК и белка у прокариот и дрожжей. Оценка влияния веществ на синтез НК и белка у E.coli на примере хлорамфеникола.

4.4. Обнаружение и количественое определение веществ, индуцирующих флюоресцентные и биолюминесцентные репортеры.

4.5. Выводы к главе 4.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гидрогелевый клеточный микрочип для исследования внутриклеточных процессов и детекции химических соединений»

Разработка метода биологических микрочипов явилось крупным вкладом в молекулярную биологию, и современные исследования с его помощью продолжают приносить ценную информацию о взаимодействии биомолекул. Это обусловлено тем, что применение биочипов позволяет в ходе одной реакции исследовать особенности взаимодействия изучаемого объекта с множеством биологических элементов (ДНК, белок и пр.) иммобилизованных в ячейках матрицы, избавляя тем самым, от необходимости постановки и учета реакций с каждым биоэлементом в отдельности. Биочипы также применяют для идентификации биологических объектов путем анализа их специфических взаимодействий с известными биомолекулами, иммобилизованными в ячейках матрицы. Широкое распространение методов исследования с использованием биочипов обусловлено не только их преимуществами в плане временных и материальных затрат, но и расширенными возможностями экспериментальной работы. За 15 лет, прошедших с момента основания, метод приобрел титул классичесского и прочно вошел в монографии [12, 28, 63, 64]. Изначально биочип возник, как решение задачи секвенирования ДНК. Принцип регистрации взаимодействий исследуемого объекта с известной матрицей биомолекул, положенный в основу первого биочипа, стал ключевым для десятков новых молекулярно-биологических исследовательских инструментов. Примерами таких инструментов являются гибридизационные [47], белковые [60], экспрессионные [29], ПЦР- [74], тканевые [20] микрочипы. Одновременно происходило развитие методов мониторинга и скрининга живых микроорганизмов. Наиболее приближенным по своему формату и возможностям к микрочипу методом явился высокопроизводительный скрининг с использованием микроплашек [24]. Несмотря на многообразие семейства биочипов и неослабевающий интерес к ним, исследования в этом направлении далеки от завершения. В частности, метод разработан лишь для объектов неживой природы: биополимеров, мертвых тканей. В качестве альтернативы микроплашкам с одной стороны, и как продолжение развития технологии микрочипов - с другой, нами создан гидрогелевый клеточный микрочип (ГКМ) - инструмент, элементы матрицы которого содержат живые объекты: бактерии и дрожжи. Очевидно, что создание микрочипа с живыми клетками открывает новые возможности как в плане изучения самих клеток, так и использования их биосенсорных свойств. Инициатива создания ГКМ принадлежит академику Мирзабекову А.Д.

Разработка исследовательских инструментов, содержащих биологический элемент, в значительной степени зависит от наличия методик, позволяющих его стабилизировать и сохранять. Зачастую, в результате иммобилизации в ячейках микрочипов, биологические объекты меняют свои свойства вплоть до полной потери искомой активности. По-видимому, с этим связана малочисленность работ, посвященных иммобилизации живых объектов в микрочипах. Существующие же работы [76, 90, 88] являют собой частные решения проблемы, либо имеют узкую область применения. На наш взгляд, одним из наиболее соответствующих специфике клеток, как живых объектов, вариантов микрочипа является гидрогелевый клеточный микрочип, представляющий собой подложку, с закреплёнными на ней микрокаплями геля, в которых иммобилизованы живые клетки. Для реализации этого замысла необходима разработка процедуры изготовления ГКМ, позволяющей сохранять жизнеспособность большинства видов иммобилизуемых клеток.

Одной из основных проблем, возникших на пути создания ГКМ, явился поиск условий иммобилизации клеток в нанообъемах (0.3-60 нл) полиакриламидного геля. Технология, применяющаяся для белковых и НК-микрочипов [89, 60] не могла быть использована для изготовления ГКМ в связи с губительностью для клеток большинства этапов изготовления. Разработка специальной технологии и составила научно-техническую проблему, решение которой стало одной из целей диссертационной работы. В частности большая часть третьей главы диссертационной работы посвящена исследованию влияния отдельных компонентов акриламидного гелеобразующего раствора и этапов изготовления КМ на жизнеспособность иммобилизуемых клеток.

Исходя из изложенного целью данной работы являлась разработка способов изготовления ГКМ, изучение влияния иммобилизации клеток в микрообъёмах гелей на их жизнеспособность и создание методов исследовательской работы с помощью ГКМ. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить возможность создания микрочипа путем иммобилизации клеток в геле.

2. Подобрать оптимальную гелевую основу и добиться сохранения жизнеспособности микроорганизмов при иммобилизации в микрообъёмах геля.

3. Изучить факторы, влияющие на жизнеспособность микроорганизмов в процессе их иммобилизации в элементах ГКМ, определить степень влияния каждого из факторов и установить для них оптимальные значения.

4. Адаптировать методику изготовления ГКМ для применения в автоматизированном серийном производстве.

5. Определить исследовательские возможности ГКМ в области молекулярной биологии.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Фесенко, Денис Олегович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана технология изготовления гидрогелевых клеточных микрочипов на основе агарозного, полиакриламидного и альгинатного гелей, позволяющая в качестве объектов для иммобилизации использовать бактериальные и дрожжевые клетки.

2. Гидрогелевый клеточный микрочип обладает следующими свойствами: каждый гелевый элемент изолирован от других и содержит клетки одного штамма; гелевый носитель, удерживая клетки, является проницаемым для органических и неорганических веществ и светового сигнала.

3. На модельных экспериментах показано, что с помощью ГКМ можно исследовать внутриклеточные процессы, используя флюоресцентные красители, проводить качественный и количественный анализ веществ, подавляющих метаболизм клеток, а также индуцирующих флюоресцентные и люминесцентные репортеры сенсорных клеток, причём каждая ячейка микрочипа выступает как индивидуальный элемент биосенсорной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе впервые показана возможность создания гидрогелевого биологического микрочипа, содержащего живые микроорганизмы, разработана и описана процедура ее реализации. На базе ГКМ разработан ряд оригинальных методов:

- мониторинг синтеза нуклеиновых кислот (НК), флюоресцентных белков и белков клеточной стенки в живых клетках;

- определение параметров роста культуры микроорганизмов, исходя из динамики синтеза НК и белков;

- обнаружение индукторов люминесцентных и флюоресцентных репортеров на примере соли мышьяка и изопропил P-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), установление корреляции уровня экспрессии репортёрного белка с концентрацией индуктора;

- обнаружение, идентификация и количественный анализ антибиотиков;

- оценка влияния исследуемого вещества на синтез НК и белков в клетках выбранных штаммов.

Что касается практического применения, разработан оригинальный метод обнаружения химических веществ в исследуемых объектах, путем использования сенсорных свойств микроорганизмов, иммобилизованных в элементах ГКМ, как показано на примере антибиотиков, мета-арсенита натрия, ИПТГ. В этой связи ГКМ может быть использован в качестве платформы для изготовления мульти-элементных биосенсоров, значительно упрощающих анализ объектов окружающей среды.

Материалы диссертации представлены на 5-й Международной конференции им. В.А.Энгельгардта по молекулярной биологии (Москва, 2001); 1-м (2002) и 2-м (2003) Международном конгрессе «Биотехно-логия — состояние и перспективы развития», Москва. Отдельные фрагменты дис-сертационной работы многократно докладывались на научных семинарах Центра биологических микрочипов ИМБ РАН. По теме диссертации опубликованы две печатные работы, подана патентная заявка.

Автор выражает благодарность своим научным руководителям — академику А.Д.Мирзабекову и Т.В.Наседкиной, коллегам - Чудинову А.В. за руководство в работе по синтезу ПАА-г и химической модификации полимеров, Прокопенко Д.В., Турыгину А.Ю., Древалю Е.В., Юрасову Р.А., Петухову В.В. за техническую поддержку, разработку ПО и помощь в математической обработке данных, А.И.Грядунову за изготовление термовлагостата, операторам роботов Крейндлину Э.Я. и Евсееву К.Б. за нанесение микрочипов, Чупеевой В.В., Панькову С.В.,

A.Ю.Рубиной, Тимофееву Э.Н., Жаринову B.C. за ценные советы, Бабановой Т.А., Струниной С.М., А.Н.Решетилову, И.А.Кошелевой, Курятовой М.В. и Тютяевой

B.В. за предоставленные культуры, Фесенко О.Е. и Чечеткину В.Р. за ценные критические замечания и помощь в подготовке публикаций. Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Интеграция» (И0884/898), Российской программы "Геном человека" (5/01) и Российского фонда фундаментальных исследований (02-04-48952, 02-04-48814, 02-04-49109, 02-0408067 и 03-04-49355).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фесенко, Денис Олегович, 2004 год

1. Andersen J.B., Heydorn A., Hentzer М., Eberl L., Geisenberger О., et al. gfp-based N-acyl homoserine-lactone sensor systems for detection of bacterial communication. Appl Environ Microbiol 2001.67: 575-585.

2. Aoyagi H., Tanaka H. Development of simple methods for preparation of yeast and plant protoplasts immobilized in alginate gel beads. Biotechnology Techniques 1999.13: 253-258

3. Applegate B.M., Kehrmeyer S.R., Sayler G.S. A chromosomally based tod-luxCDABE whole-cell reporter for benzene, toluene, ethybenzene, and xylene (BTEX) sensing. Appl Environ Microbiol 1998.64:2730-2735.

4. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., et al, eds. Short protocols in molecular biology, 1995. Wiley

5. Aykut G., Hasirci V.N., Alaeddinoglu G. Immobilization of yeast cells in acrylamide gel matrix. Biomaterials 1988.9: 168-172.

6. Beske O.E., Goldbard S. High-throughput cell analysis using multiplexed array technologies. Drug Discovery Today 2002.7: S131-S135

7. Branyik Т., Kuncova G., Раса J. The use of silica gel prepared by sol-gel method and polyurethane foam as microbial carriers in the continuous degradation of phenol. Appl Microbiol Biotechnol 2000.54: 168-172.

8. Brocklehurst T.F., Piggott R.B., Smith A.C., Steer D.C. An apparatus for studiyng the effect of transient temperature on growth of bacteria in a gel matrix. Food Microbiology 1996.13:109114

9. Cai J., DuBow M.S. Use of a luminescent bacterial biosensor for biomonitoring and characterization of arsenic toxicity of chromated copper arsenate (CCA). Biodegradation 1997.8: 105-111

10. Camelin I., Lacroix C., Paquin C., Prevost H., Cachon R., Divies C. Effect of chelatants on gellan gel rheological properties and setting temperature for immobilization of living bifidobacteria. Biotechnol Prog 1993.9: 291-297.

11. Castet J.C., Craynest M., Barbotin J.N., Truffaut N. Improvement of plasmid stability of recombinant Bacillus-subtilis cells in continuous immobilized cultures. FEMS Microbiol Rev 1994.14: 63-67.

12. Causton H.C., Quackenbush J., Brazma A. Microarray Gene Expression Data Analysis: A Beginner's Guide. 2003. Blackwell

13. Chee M., Yang R., Hubbell E., Berno A., Huang X.C., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science 1996.274: 610-614.

14. De Zwart D., Sloof W. The Microtox as an alternative assay in the acute toxicity assessment of water pollutants. Aquat. Toxicol. 1983.4:129-138

15. Doran P.M., al. e. 1985. Presented at VIII Intern. Conf. Enzyme Engin.

16. Farghali H., Kamenikova L., Martinek J., Lincova D., Hynie S. Preparation of functionally active immobilized and perfused mammalian cells: an example of the hepatocyte bioreactor. Physiol Res 1994.43:121-125

17. Fejzo M.S., Slamon D.J. Frozen tumor tissue microarray technology for analysis of tumor RNA, DNA, and proteins. Am J Pathol 2001.159: 1645-1650.

18. Freeman A., Abramov S., Georgiou G. Site-protected fixation and immobilization of Escherichia coli cells displaying surface-anchored beta-lactamase. Biotechnol Bioeng 1999.62: 155-159.

19. Freeman A., Aharonowitz Y. Immobilization of microbial cells in crosslinked, prepolymerized, linear polyacrylamide gels: antibiotic production by immobilized Streptomyces clavuligerus cells. Biotechnology and Bioengineering 1981.23: 2747-2759

20. Galun E., Aviv D., Dantes A., Freeman A. Biotransformation by plant cells immobilized ic cross-linked polyacrylamide-hydrazide. Journal of Medicinal Plant Research 1983.49: 9-13

21. Gaspani F., Mariani M., Sola F., Galvani A. Quantification of the proliferation index of human dermal fibroblast cultures with the ArrayScan high-content screening reader. JBiomol Screen 2004.9: 232-243

22. Guyomard C., Rialland L., Fremond В., Chesne C., Guillouzo A. Influence of alginate gel entrapment and cryopreservation on survival and xenobiotic metabolism capacity of rat hepatocytes. Toxicol Appl Pharmacol 1996.141: 349-356.

23. Hansen L.H., Sorensen S.J. Detection and quantification of tetracyclines by whole cell biosensors. FEMS Microbiol Lett 2000.190: 273-278.

24. Hardimann G. Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts. 2003. DNA Press

25. Harrington C.A., Rosenow C., Retief J. Monitoring gene expression using DNA microarrays. Curr Opin Microbiol 2000.3:285-291.

26. Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. 1996.

27. Holland G.J., Green A. Development of a gross pollution detector: laboratory studies. Water Treatment Exam. 1975.4: 81-99

28. Hong-Je Park, Khang Y.-H. Production of cephalosporin С by immobilized Cephalosporium acremonium in polyethyleneimine-modified barium alginate. Enzyme and Microbial Technology 1995.17:408-412

29. Imoto M., Ouchi Т., Inaba M., al. e. Bull. Chem. Soc. Japan 1980.53: 1112-1114

30. Inama L., Dire S., Carturan G., Cavazza A. Entrapment of viable microorganisms by Si02 sol-gel layers on glass surfaces: trapping, catalytic performance and immobilization durability of Saccharomyces cerevisiae. JBiotechnol 1993.30: 197-210.

31. Jamai L., Sendide K., Ettayebi K., Errachidi F., Hamdouni-Alami O., et al. Physiological difference during ethanol fermentation between calcium alginate-immobilized Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett 2001.204: 375-379

32. Khrapko K.R., Lysov Yu P., Khorlin A.A., Ivanov I.B., Yershov G.M., et al. A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. DNA Seq 1991.1: 375-388

33. Khrapko K.R., Lysov Yu P., Khorlyn A.A., Shick V.V., Florentiev V.L., Mirzabekov A.D. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing. FEBS Lett 1989.256:118-122.

34. Lohmeier-Vogel E.M., Hahn-Hagerdal В., Vogel H.J. Phosphorus-31 and carbon-13 nuclear magnetic resonance study of glucose and xylose metabolism in agarose-immobilized Candida tropicalis. Appl Environ Microbiol 1995.61: 1420-1425.

35. Maaloe O. 1962. Synchronous growth. In The bacteria. A treatise on structure and function, ed. I.C. Gunsalus, R.Y. Stainer, pp. 459. London: Academic Press Inc.

36. Mattiasson B.0.1978. In Immobilized microbial cells, pp. 203-220: American chemical society

37. Min J., Lee C.W., Moon S.H., LaRossa R.A., Gu M.B. Detection of radiation effects using recombinant bioluminescent Escherichia coli strains. Radiat Environ Biophys 2000.39: 41-45.

38. Mirzabekov A.D., Rubina A.Y., Pan'kov S.V., Chernov B.K.Method of immobilization of oligonucleotides containing unsaturated bonds in polymer gels during microchip manufacturing 2001. Russia Patent No. 99127744/04

39. Mori A. Proc. Biochem. 1985.20: 67-74

40. Mota-Meira M., LaPointe G., Lacroix C., Lavoie M.C. MICs of mutacin B-Ny266, nisin A, vancomycin, and oxacillin against bacterial pathogens. Antimicrob Agents Chemother 2000.44: 24-29.

41. Nasedkina Т., Domer P., Zharinov V., Hoberg J., Lysov Y., Mirzabekov A. Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays. Haematologica 2002.87: 363-372.

42. Neilson J. W., Pierce S.A., Maier R.M. Factors influencing expression of luxCDABE and nah genes in Pseudomonas putida RB1353(NAH7, pUTK9) in dynamic systems. Appl Environ Microbiol 1999.65: 3473-3482.

43. O'Connor S.M., Stenger D.A., Shaffer K.M., Ma W. Survival and neurite outgrowth of rat cortical neurons in three- dimensional agarose and collagen gel matrices. Neurosci Lett 2001.304: 189-193.

44. Oliveira E.A., Costa A.A., Figueiredo Z.M., Carvalho Junior L.B. L-malic acid production by entrapped Saccharomyces cerevisiae into polyacrylamide gel beads. Appl Biochem Biotechnol 1994.47: 65-72.

45. Park H. J., Khang Y.H. Production of cephalosporin С by immobilized Cephalosporum acremonium in polyetyleneimine-modified barium alginate. Enzyme and Microbial Technology 1995.17:408-412

46. Pinheiro H.M., Cabral J.M. Screening of whole-cell immobilization procedures for the delta 1 -dehydrogenation of steroids in organic medium. Enzyme Microb Technol 1992.14: 619-624.

47. Pope N.M., Kulcinski D.L., Hardwick A., Chang Y.-A. New application of silane coupling agents for covalently binding antibodies to glass and cellulose solid supports. Bioconjugate Chem. 1993.4: 166-171

48. Raihan S., Ahmed N., Macaskie L.E., Lloyd J.R. Immobilisation of whole bacterial cells for anaerobic biotransformations. Appl Microbiol Biotechnol 1997.47: 352-357.

49. Ravi K., Lansing T.D. 2000. Presented at 219th ACS National Meeting, San-Francisco, CA

50. Rees D.A., Morris E.A., Thorn D., Madden L.K. 1982. The polysacca. ed. G.O. Aspinall. New York: Academic Press

51. Riesselman M.H., Hazen K.C., Cutler J.E. Determination of antifungal MICs by a rapid susceptibility assay. J Clin Microbiol 2000.38: 333-340.

52. Roger D., David A., David H. Immobilization of flax protoplasts in agarose and alginate beads. Correlation between ionically bound cell-wall proteins and morphogenetic response. Plant Physiol 1996.112:1191-1199.

53. Rosen R., Davidov Y., LaRossa R.A., Belkin S. Microbial sensors of ultraviolet radiation based on recA'::lux fusions. Appl Biochem Biotechnol 2000.89: 151-160.

54. Rubina A., Pan'kov S.V., Ivanov S.M., Dement'eva E.I., Mirzabekov A.D. Protein microchips. Dokl Biochem Biophys 2001.381:419-422.

55. Rubina A. Y., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., et al. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques 2003.34: 10081014,1016-1020,1022

56. Ryu H.W., Wee Y.J. Characterization of bioconversion of fumarate to succinate by alginate immobilized Enterococcus faecalis RKY1. Appl Biochem Biotechnol 2001.91-93: 525-535.

57. Schena M. Microarray Biochip Technology. 2000. Eaton Pub

58. Schena M. Microarray Analysis. 2002. Hoboken, NJ: J. Wiley & Sons

59. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995.270: 467-470.

60. Schraml P., Kononen J., Bubendorf L., Moch H., Bissig H., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res 1999.5: 1966-1975.

61. Scnabl H., Youngman R. Plant Science 1985.40: 65-69

62. Scott C.D. Immobilized cells: a review of recent literature. Enzyme Microb Technol 1987.9: 6673

63. Selifonova O., Burlage R., Barkay T. Bioluminescent sensors for detection of bioavailable Hg(II) in the environment. Appl Environ Microbiol 1993.59: 3083-3090.

64. Shiloh M.U., Ruan J., Nathan C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect Immun 1997.65: 3193-3198.

65. Siess M.H., Devies C. Behaviour of Saccharomyces cerevisiae cells entrapped in polyacrylamide gel and performing alcoholic fermentation. Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1981.12:10

66. Smidsrod O., Skjak-Braek G. Alginate as immobilization matrix for cells. Trends Biotechnol 1990.8: 71-78.

67. Sonomoto O.K., al e. J. Ferm. Technol. 1981.59: 465-471

68. Tamponnet C., Boisseau S., Lirsac P.N., Barbotin J.N., Poujeol C., et al. Storage and growth of neuroblastoma cells immobilized in calcium- alginate beads. Appl Microbiol Biotechnol 1990.33:442-447.

69. Taylor L.C., Walt D.R. Application of high-density optical microwell arrays in a live-cell biosensing system. Anal Biochem 2000.278:132-142.

70. Timofeev E., Kochetkova S.V., Mirzabekov A.D., Florentiev V.L. Regioselective immobilization of short oligonucleotides to acrylic copolymer gels. Nucleic Acids Res 1996.24: 3142-3148.

71. Tucker C.L. High-throughput cell-based assays in yeast. Drug Discovery Today 2002.7: SI 25-S130

72. Van Dyk Т.К., DeRose E. J., Gonye G.E. LuxArray, a high-density, genomewide transcription analysis of Escherichia coli using bioluminescent reporter strains. J Bacteriol 2001.183: 54965505.

73. Varfolomeev S.D., Rainina E.I. Cryoimmobilized enzymes and cells in organic synthesis. Indian Journal of Chemistry 1993.32: 202-204

74. Venkatasubramanian K. 1979. Immobilized microbial cells. In ACS, pp. 257

75. Vieth W.R., Venkatasubramanian K. 1979. Immobilized microbial cells in complex biocatalysis. In Immobilized microbial cells., pp. 1. Washington: H.J.Heinz Company and Rutgers University

76. Voitisik, Sirku V. Folia Microbiol. CSSR 1983.28:309-340

77. Willardson B.M., Wilkins J.F., Rand T.A., Schupp J.M., Hill K.K., et al. Development and testing of a bacterial biosensor for toluene-based environmental contaminants. Appl Environ

78. Microbiol 1998.64:1006-1012.с

79. Yershov G., Barsky V., Belgovskiy A., Kirillov E., Kreindlin E., et al. DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips. Proc Natl Acad Sci USA 1996.93:4913-4918.

80. Ziauddin J., Sabatini D.M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature 2001.411: 107-110.

81. Zlatanova J., Mirzabekov A. Gel-immobilized microarrays of nucleic acids and proteins. Production and application for macromolecular research. Methods Mol Biol 2001.170: 17-38

82. Аркадьева 3.A., Безбородое A.M., Блохина И.Н., др. и. Промышленная микробиология. 1989. Москва: Высшая школа. 688 pp.

83. Расторгуев С.М., Завильгельский Г.Б. Lux-биосенсор для детекции ионов мышьяка. Биотехнология 2001. 77-82

84. Бекер М.Е., Лиепиныл Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. 1990. Москва: Агропромиздат. 334 pp.

85. Вдовина Н.В., Бухар М.И., Кощеенко К.А. Влияние условий полимеризации на трансформационную активность культуры Tieghemella orchidis. Прикладная биохимия и микробиология 1980.16: 309-314

86. Вудворд Д. ed. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. 1988. Москва: Мир. 215 pp.

87. Вукалович М.П., Ривкин С.П., Александров А.А. Таблицы тепло-физических свойств воды и водяного пара. 1969. Москва: Издательство стандартов

88. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. 1994. М. Изд-во МГУ. 512 pp.

89. Егоров Н.С., Ландау Н.С., Борман Е.А., Котова И.Б. Биосинтез биологически активных веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов (обзор). Прикладная биохимия и микробиология 1984.20: 579-592

90. Кощеенко К.А. Живые иммобилизованные клетки как биокатализаторы процессов трансформации и биосинтеза органических соединений. Прикладная биохимия и микробиология 1981.17:477-493

91. Кощеенко К.А., Аврамова Т.Г., Суходольская Г.В. Влияние условий полимеризации на 3-кетостероид Dl-дегидрогеназную активность включенных в гель клеток Mycobacterium globiforme. Изв. АН СССР, сер. биол 1981.2: 174

92. Кощеенко К.А., Суходольская Г.В. 1987. Иммобилизация клеток микроорганизмов. In Иммобилизованные клетки в биотехнологии, ed. К.А. Кощеенко, pp. 174. Пущино

93. Ландау Н.С., Горнова И.Б., Туликова О.М., Егоров Н.С. Образование протеиназ свободными и иммобилизованными клетками Bacillus firmus 44б. Микробиология 1997.66: 371-377

94. Луста К.А., Старостина Н.Г., Фихте Б.А. Микробиология 1982.51: 937-940

95. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. 1981. Москва: Наука

96. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. 1994. Изд-во МГУ. 288 pp.

97. Скрябин Г.К., Кощеенко К.А., Могильницкий Г.М., Суровцев В.И., Тюрин B.C., Фихте Б.А. Изучение жизнеспособности и ферментативной активности иммобилизованныхклеток микроорганизмов, трансформирующих стероиды. Известия АН СССР, Сер. биол. 1974.6: 867

98. Старостина Н.Г., Пуста К.А., Фихте Б.А. Влияние некоторых факторов иммобилизации в полиакриламидном геле на жизнеспособность популяции клеток Escerichia coli. Прикл. биох. микроб. 1982.18: 225-229

99. Шур A.M. Высокомолекулярные соединения. 1981. Москва: Высшая школа