Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Иванов, Сергей Михайлович

• Иванов, Сергей Михайлович
• кандидат физико-математических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Иванов, Сергей Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Изготовление микрочипов.

1.2 Иммобилизация белков.

1.2.1 Адсорбционная иммобилизация.

1.2.2 Химическая (ковалентная) иммобилизация белков.

1.2.2.1 Иммобилизация по аминогруппам белка.

1.2.2.2 Иммобилизация по сульфгидрильным группам белка.

1.2.2.3 Иммобилизация через декстрановые спейсеры.

1.2.3 Иммобилизация за счет комплексообразования.

1.2.4 Иммобилизация в пористых средах.

1.2.5 Иммобилизация белков на трехмерных гидрофильных носителях.

1.2.6 Иммобилизация на полимерных носителях.

1.2.7 Иммобилизация в полиакриламидном геле.

1.3 Применение микрочипов.

1.3.1 Аналитические микрочипы.

1.3.2 Функциональные микрочипы.

1.3.2.1 Белок-белковые взаимодействия.

1.3.2.2 Белок-липидные взаимодействия.

1.3.2.3 Белок-ДНК - взаимодействия.

1.4 Модельные белки.

1.4.1 Барназа.

1.4.2 Раково-эмбриональный антиген (РЭА).

1.5 Методы ускорения анализа на микрочипах.

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Приборы и реактивы.

2.2 Изготовление белковых микрочипов.

2.3 Окрашивание белков флуоресцентными красителями.

2.4 Флуоресцентные измерения на чипах.

2.5 Введение метакрильных групп в белок.

2.6 Оценка эффективности иммобилизации барназы на микрочипе.

2.7 Оценка сохранения биологической активности модифицированной барназы на примере взаимодействия с барстаром.

2.8 Модификация белка мономерами геля.

2.9 Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы методом МАЫЖГОР МБ.

2.10 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах.

2.11 Определение содержания рекомбинантного барстара в лизатах клеткок.

2.12 Сэндвич-иммуноанализ РЭА.

2.13 Кинетические измерения на микрочипах.

ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Белковые микрочипы.

3.2 Изготовление гелевых микрочипов.

3.3 Регистрация сигналов гелевых ячеек микрочипа.

3.4 Введение в молекулу барназы непредельных групп.

3.5 Оценка эффективности иммобилизации.

3.6 Исследование влияния введения непредельных групп в молекулу белка на сохранение им биологической активности.

3.7 Метод полимеризационной иммобилизации.

3.8 Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы.

3.9 Количественный флуориметрический анализ барстара на микрочипах.

ЗЛО Определение содержания рекомбинатного барстара в лизатах клеток.

3.11 Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах.

3.12 Разработка процедуры сэндвич-иммуноанализа на белковых микрочипах (на примере РЭА).

3.13 Подбор условий проведения иммуноанализа.

3.14 Одностадийный сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах.

3.15 Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови.

3.16 Ускорение иммуноанализа на микрочипе с помощью механического перемешивания образца.

3.17 Зависимость интенсивности сигнала и времени выхода на насыщение кинетической кривой от скорости перемешивания на перистальтическом насосе.

3.18 Получение калибровочных кривых при проведении анализа с механическим перемешиванием образца.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка гидрогелевых микрочипов с иммобилизованными белками и их применение для количественного анализа»

В настоящее время белковые микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Для закрепления белков на матрице (микрочипе) используются различные носители, такие как стекло, пластик, мембраны, золото, и др. Для иммобилизации белковых молекул на носителях применяют различные способы: белки могут быть адсорбированы на носителе (физическая иммобилизация) или ковалентно связаны с носителем (химическая иммобилизация). В большинстве случаев, основной проблемой при создании белковых микрочипов является тот факт, что для сохранения структуры и биологических функций молекулы белков нуждаются в гидрофильном окружении, максимально приближенном к естественным условиям их функционирования. Поэтому, несмотря на большое количество разработанных способов иммобилизации и предлагаемых для изготовления микрочипов носителей, это ограничение создает большие сложности для создания устойчиво работающих и долго хранящихся двумерных белковых микрочипов.

Трехмерные гидрогелевые микрочипы, разрабатываемые в Институте молекулярной биологии РАН, обладают существенными преимуществами по сравнению с микрочипами на основе двумерных поверхностей, в особенности для иммобилизации белков. Использование трехмерного геля в качестве носителя при иммобилизации позволяет увеличить количество иммобилизуемого зонда и достичь его равномерного распределения в объеме ячеек. Известно также, что иммобилизация белков в гидрогеле способствует их стабилизации, это справедливо и в отношении гидрогелевых микрочипов.

В данной работе предложен новый метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий значительно упростить технологическую процедуру изготовления микрочипов. В результате проведенных исследований показано, что микрочипы, полученные с помощью предлагаемого метода, обеспечивают оптимальное функционирование иммобилизованных в гелевых ячейках белков и сохранение ими исходной биологической активности. Белковые микрочипы, изготовленные методом полимеризационной иммобилизации, позволяют проводить многопараметрический анализ образца и могут найти применение как в клинической практике, так и в области научных исследований.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Иванов, Сергей Михайлович

выводы

1. Разработан метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий проводить иммобилизацию белка без его предварительной модификации.

2. Продемонстрировано сохранение исходной биологической активности иммобилизованных на микрочипах белков на примере белка барназы и антител.

3. Продемонстрирована возможность проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах.

4. Разработана процедура одностадийного сэндвич-иммуноанализа ракового эмбрионального антигена, позволяющая с высокой чувствительностью определять содержание данного онкомаркера в растворах и сыворотках крови.

5. Разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубок) благодарность моему научному руководителю Алле Юрьевне Рубиной за чуткое руководство, внимание и неоценимую помощь в подготовке материалов диссертации. Я искренне благодарен Марии Вадимовне Цыбульской и Екатерине Игоревне Дементьевой за помощь и советы. Выражаю глубокую признательность всей группе белковых микрочипов: Коноваловой Лизе, Филипповой Марине, Савватеевой Лене, Зубцовой Жанне и Зубцову Дмитрию за помощь в работе и дружеское участие. Благодарю Андрея Александровича Стомахина за помощь в получении масс-спектральных данных и их обсуждении, а также за помощь в разработке приборов для исследований. Выражаю признательность группе производства: Сергею Панькову, Маше Грачевой, Кириллу Евсееву и Эдуарду Яковлевичу Крейндлину за подготовку микрочипов для проведения экспериментов; группе математиков: Турыгину Александру, Юрасову Роману и Чечеткину Владимиру за помощь в обсуждении результатов исследований, а так же группе инженеров: Юрасову Дмитрию и Черепанову Алексею за помощь в изготовлении приборов для работы. Выражаю благодарность Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Приношу огромную благодарность моим родителям и всем моим друзьям за дружескую поддержку и участие.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Иванов, Сергей Михайлович, 2007 год

1. Lueking A., Horn М., Eickhov Н., Bussow К., Lehrach Н., Walter G. Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Anal. Biochem 1999, 270:103-111.

2. Macbeth G., Schreiber S.L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science 2000, 289: 1760-1763.

3. Newman J.D., Turner A.P.F. Ink-jet printing for the fabrication of amperometric glucose biosensors. Anal. Chim. Acta. 1992, 262:13-17.

4. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. High-density oligonucleotide arrays. Biosensors&Bioelectronics 1996, 11:687-690.

5. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., van Dedem G.W.K. Picoliter dispensing in wells of a micro-array by means of electrospraying. Journal of Aerosol Science 1999,30:551-552.

6. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., Schalkhammer Т., van Dedem G.W.K. Miniaturized electrospraying as a technique for the production of reproducible micrometer-sized protein spots. Anal Chem. 2001, 73:2183-2189.

7. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method for mass fabrication of mono- and multi-component microarrays of biological and biologically active substance. Anal. Chem. 1999, 71:3110-3117.

8. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method to fabricate functionally active protein films 1999. Anal. Chem., 71:1415-1420.

9. Kumar A., Whitesides G.M. Appl. Phia. Lett. 1993, 63:2002.

10. Lahiri J., Ostuni E., Whitesides G.M. Patterning ligands on reactive SAMs microcontact printing. Langmuir 1999, 15:2055-2060.

11. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug Disc. AOP, published online 17 March 2006; doi:10.1038/nrd2006.

12. Frei E, Levy A, Gowland P, Noll M. Efficient transfer of small DNA fragments from polyacrylamide gels to diazo or nitrocellulose paper and hybridization. Methods Enzymol. 1983:100:309-26.

13. Hengsakul M., Cass A.E.G. Protein patterning whis a photoactivatable derivative of biotin. Bioconjugate Chem 1996, 7: 249-254.

14. Pirrung M.C., Huang, C.Y. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. Bioconjug Chem. 1996 May-Jun;7(3):317-21

15. Van der Veen M, Norde W, Stuart MC. Electrostatic interactions in protein adsorption probed by comparing Iysozyme and succinylated Iysozyme. Colloids SurfB Biointerfaces. 2004 May l;35(l):33-40.

16. Chapman R.G., Ostuni E., Takayama Sh., Holmlin R.E., Yan L., Whitesides G.M. Surveying for surface that resist the adsorption of proteins. J. Am. Chem. Soc. 2000,122:8303-8304.

17. Norde W., Zoungana T. Surface-induced change in the structure and activity of enzymes physically immobilized at solid/liquid interface. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998, 28:133-143.

18. Wu J, Luan M, Zhao J. Trypsin immobilization by direct adsorption on metal ion chelated macroporous chitosan-silica gel beads. Int J Biol Macromol. 2006 Nov 15;39(4-5): 185-91. Epub 2006 Mar 22.

19. Haab B.B., Duhman M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific protein and antibodies in complex solutions. Genom Biology 2001, 2(2) research 0004.1-0004.13

20. Naviroj S., Culler S.R., Koenig J.L., Ishida H. Structure and adsorption characteristics of silane coupling agents on silica and e-glass fiber: dependence on pH. J. Colloid Interface Sci 1984, 97,308-317.

21. Falsey JR, Renil M, Park S, Li S, Lam KS. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays. Bioconjug Chem. 2001 May-Jun;12(3):346-53.

22. Zhang G, Zhou Y, Wu X, Yuan J, Ren S. Covalent attachment of DNA to glass supports using a new silane coupling agent and chemiluminescent detection. J Tongji Med Univ. 2000;20(2):89-91.

23. Elam JH, Nygren H, Stenberg M. Covalent coupling of polysaccharides to silicon and silicon rubber surfaces. J Biomed Mater Res. 1984 Oct;18(8):953-9.

24. Mansur HS, Orefice RL, Vasconcelos WL, Lobato ZP, Machado LJ. Biomaterial with chemically engineered surface for protein immobilization. J Mater Sci Mater Med. 2005 Apr;16(4):333-40.

25. Flemming C, Gobel H, Wand H, Gabert A, Bock W. Synthesis andproperties of immobilized enzymes. X. Covalent binding of polygalacturonase toinsoluble carriers Acta Biol Med Ger (1978) 37(2): 179-89.

26. Liao WH, Lee WC. Immobilization of enzymes on methacrylamide-based copolymers. Prep Biochem Biotechnol. 1997 Feb;27(l):39-46.

27. Гайер Г. Электронная гистохимия. Под ред. Бухвалова И.Б. "Мир" Москва,С 10-14.

28. Nuzzo R.G., Allura D.L. Adsoфtion of bifunctional organic disulfides on gold surface. J. Amer. Chem. Soc. 1983, 105: 4481-4483.

29. Brockman A.H., Orlando R. New immobilization chemistry for probe affinity mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrum. 1996, 10:1688-1692.

30. Duncan RJ, Weston PD, Wrigglesworth R. A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassay. Anal Biochem. 1983 Jul 1; 132(1 ):68-73.

31. Peeters JM, Hazendonk TG, Beuvery EC, Tesser GI. Comparison of four bifunctional reagents for coupling peptides to proteins and the effect of the three moieties on the immunogenicity of the conjugates. J Immunol Methods. 1989 Jun 2;120(l):133-43.

32. Goff DA, Carroll SF Substituted 2-iminothiolanes: reagents for the preparation of disulfide cross-linked conjugates with increased stability. Bioconjug Chem. 1990 Nov-Dec;l(6):381-6.

33. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. Acad. Press: San Diego, New York, Boston 1996.

34. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with

35. DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Dec;74(12):5350-5354;94

36. Scott JE, Hughes EW, Shuttleworth A. An 'affinity' method for preparing polypeptides enriched in the collagen-associated Ehrlich chromogen. J Biochem (Tokyo). 1983 Mar;93(3):921-5.

37. Matsuura K, Akasaka T, Hibino M, Kobayashi K. Facile synthesis of stable and lectin-recognizable DNA-carbohydrate conjugates via diazo coupling. Bioconjug Chem. 2000 Mar-Apr; 11 (2):202-11.

38. Liu XC, Scouten WH. (1996) Studies on oriented and reversible immobilization of glycoprotein using novel boronate affinity gel. J Mol Recognit., 9(5-6):462-467.

39. Lee S.H., Ruckenstein E. Adsorption of protein onto polymeric surfaces of different hydrophylicities a case study with BSA. J. Colloid and Interface Sci 1988,125:365-379.

40. Balcells M., Klee D., Fagry M., Hocker H. Quantitative assessment of protein adsorption by combination of ELISA with radioisotope-based studies. J. Colloid and Interface Sci 1988, 125:365-379.

41. Kulaev DV, Zuevsky VV, Tsybulskaya MV Use of silica matrix for immunosorbent preparation. Artif. Organs (1987), v. 11, № 6, p. 503-504.

42. Хохлова ТД, Гаркавенко ЛГ, Никитин ЮС Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах. Прикл. Биохим. Микробиол. (1991) 27(5):720-4.

43. Hong J, Xu D, Gong P, Ma H, Dong L, Yao S. Conjugation of enzyme on superparamagnetic nanogels covered with carboxyl groups. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Jan 19; Epub ahead of print.

44. Turkova J, Petkov L, Sajdok J, Kas J, Benes MJ. Carbohydrates as a tool for oriented immobilization of antigens and antibodies. J Chromatogr., 500:585593 (1990).

45. Turkova J, Blaha K, Malanikova M, Vancurova D, Svec F, Kalal J. Methacrylate gels with epoxide groups as supports for immobilization of enzymes in pH range 3-12. Biochim Biophys Acta. 1978 May 11;524(1):162-169.

46. Smalla K, Turkova J, Coupek J, Hermann P. Influence of salts on the covalent immobilization of proteins to modified copolymers of 2-hydroxyethyl methacrylate with ethylene dimethacrylate. Biotechnol Appl Biochem. 1988 Feb; 10(1):21-31.

47. Bryjak J, Trochimczuk A, Noworyta A. Effect of polymer matrix on penicillin acylase immobilization on copolymers of butyl acrylate and ethylene glycol dimethacrylate. J Chem Technol Biotechnol.1993;57(l):73-8.

48. Kasper C, Reif OW, Freitag R. Evaluation of affinity filters for protein isolation. Bioseparation (1996), 6(6):373-382.

49. Zaharieva EI, Georgiev GG, Konstantinov CI. Coated reactive carriers based on copolymers of l-vinyl-2-pyrrolidone and maleic anhydride for immobilization of enzymes. Biomaterials. 1996 Aug; 17(16): 1609-1613.

50. Liao WH, Lee WC. Immobilization of enzymes on methacrylamide-based copolymers. Prep Biochem Biotechnol. 1997 Feb;27(l):39-46.

51. Hamarat S, Uslan AH. Immobilization of urease on activated methoxypolyethyleneglycol-5000. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 1996 May;24(3):273-83.

52. Tiller J, Berlin P, Klemm D. A novel efficient enzyme-immobilization reaction on NH2 polymers by means of L-ascorbic acid. Biotechnol Appl Biochem. 1999 0ct;30 (Pt 2): 155-62.

53. Aksoy S, Tumturk H, Hasirci N. Stability of alpha-amylase immobilized on poly(methyl methacrylate-acrylic acid) microspheres. J Biotechnol. 1998 Feb 5;60(l-2):37-46.

54. Yi SJ, Yuk JS, Jung SH, Zhavnerko GK, Kim YM, Ha KS. Investigation of selective protein immobilization on charged protein array by wavelength interrogation-based SPR sensor. Mol Cells. 2003 Jun 30;15(3):333-40.

55. Krysteva MA, Shopova BI, Yotova LY, Karasavova MI. Covalent binding of enzymes to synthetic membranes containing acrylamide units, using formaldehyde. Biotechnol Appl Biochem. 1991 Feb; 13(1): 106-11

56. Allcock HR, Pucher SR, Visscher KB. Activity of urea amidohydrolase immobilized within poIydi(methoxyethoxyethoxy)phosphazene. hydrogels. Biomaterials. 1994 Jun;15(7):502-506.

57. Schnaar RL, Langer BG, Brandley BK. Reversible covalent immobilization of ligands and proteins on polyacrylamide gels. Anal Biochem. 1985 Dec; 151 (2):268-281.

58. Kennedy JF, Kalogerakis B. Immobilization of glucoamylase on gelatin by transition-metal chelation. Biochimie. 1980;62(8-9):549-561.

59. Patel MP, Braden M. Cross-linking and ring opening during polymerization of heterocyclic methacrylates and acrylates. Biomaterials. 1989 May;10(4):277-80.

60. Sipehia R, Chawla AS, Daka J, Chang TM. Immobilization of enzymes on polypropylene bead surfaces by anhydrous ammonia gaseous plasma technique. J Biomed Mater Res. 1988 May;22(5):417-22.

61. Onyezili FN. The enzyme coupling process in urease immobilization on O-alkylated nylon tubes. J Biochem Biophys Methods. 1988 Aug;16(4):255-62.

62. Roig MG, Kennedy JF, Garaita MG. Immobilization of carbohydrases on epoxide-, isocyanate-, acid chloride-, and carboxylic acid-activated plastic supports. J Biomater Sci Polym Ed. 1994;6(7):661-73.

63. Zhou SP, Wang XR, Qin SY, Lin ZX, Liu JH. Preparation andapplication of gel chip. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2003 Sep;19(5):577-80.98

64. Arenkov P. Kukhtin A. Gemmel A. Voloshuk S. Chupeeva V. Mirzabekov A. Protein microchip: use for immunoassay and enzymatic reaction. Anal. Biochem. 2000,278:123-131.

65. Haab, B. B., Dunham, M. J., and Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biol. (2001) 2, 1-13.

66. Huang, R.-P., Huang, R., Fan, Y., et al. Simultaneous detection of multiple cytokines from conditioned media and patient's sera by an antibody-based protein array system. Anal. Biochem. (2001) 294, 55-62

67. Schweitzer, B., Roberts, S., Grimwade, B., et al. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol (2002) 20, 359-365

68. Hall DA, Zhu H, Zhu X, Royce T, Gerstein M, Snyder M. Regulation of gene expression by a metabolic enzyme. Science. 2004 Oct 15;306(5695)

69. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, Mills GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet, 2002, Feb 16;359(9306):572-7

70. Anderson, NL, Anderson, NG The Human Plasma Proteome. Molecular&Cellular Proteomics lA845-867, 2002

71. Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 1995 Mar;59(l):94-123

72. Silzel JW, Cercek B, Dodson C, Tsay T, Obremski RJ. Mass-sensing, multianalyte microarray immunoassay with imaging detection. Clin Chem. 1998 Sep;44(9):2036-43

73. Mitchell P. A perspective on protein microarrays. Nature Biotechnology Vol.20 march 2002 225-229

74. Borrebaeck C.A.K. Antibodies in diagnostics from immunoassays to protein chips. Immunology today. Vol.21 No.8 (2000) 379-382

75. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Дарий E.JI. и др. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухоле-ассоциированных маркеров. ДАН. 2004, т. 395, с. 542-547.

76. Sun Z, Fu X, Zhang L, Yang X, Liu F, Hu G. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. Anticancer Res. 2004 Mar-Apr; 24(2C):1159-65.

77. Rucker VC, Havenstrite KL, Herr AE. Antibody microarrays for native toxin detection.Anal Biochem. 2005 Apr 15;339(2):262-70

78. Hueber W, Utz PJ, Steinman L, Robinson WH Autoantibody profiling for the study and treatment of autoimmune desease. Arthritis Res. 4, 290-295.

79. Hueber W, Utz PJ, Robinson WH. Autoantibodies in early arthritis: advances in diagnosis and prognostication. Clin Exp Rheumatol. 2003 Sep-Oct;21(5 Suppl 31):S59-64.

80. Robinson WH et al. Autoantigem microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature Med., 8, 295-301 (2002).

81. Joos TO, Schrenk M, Hopfl P, Kroger K, Chowdhury U, Stoll D, Schorner D, Durr M, Herick K, Rupp S, Sohn K, Hammerle H. A microarray enzyme-linked immunosorbent assay for autoimmune diagnostics.Electrophoresis. 2000 Jul;21(13):2641-50

82. Zhu H, Hu S, Jona G, Zhu X, Kreiswirth N, Willey BM, Mazzulli T, Liu

83. G, Song Q, Chen P, Cameron M, Tyler A, Wang J, Wen J, Chen W, Compton S,

84. Snyder M. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a Coronavirus protein microarray. Proc Natl Acad Sei USA. 2006 Mar 14; 103(11 ):4011-6. Epub 2006 Mar 7.

85. Kung LA, Snyder M. Proteome chips for whole-organism assays. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Aug;7(8):617-22)

86. Salamat-Miller N, Fang J, Seidel CW, Smalter AM, Assenov Y, Albrecht M, Middaugh CR. A network-based analysis of polyanion binding proteins utilizing yeast protein arrays. Mol Cell Proteomics. 2006 Sep 18

87. Kersten B, Possling A, Blaesing F, Mirgorodskaya E, Gobom J, Seitz H. Protein microarray technology and ultraviolet crosslinking combined with mass spectrometry for the analysis of protein-DNA interactions. Anal Biochem. 2004 Aug 15;331(2):303-13

88. Hall DA, Zhu H, Zhu X, Royce T, Gerstein M, Snyder M. Regulation of gene expression by a metabolic enzyme. Science. 2004 Oct 15;306(5695)

89. Schreiber G. Fersht A.R. Interaction of barnase with its polypeptide inhibitor barstar studied by protein engineering. Biochemistry 1993, 32(19):5145-5150.

90. Schulga A, Kurbanov F, Kirpichnikov M, Protasevich I, Lobachov V, Ranjbar B, Chekhov V, Polyakov K, Engelborghs Y, Makarov A. Comparative study of binase and barnase: experience in chimeric ribonucleases. Protein Eng 1998, ll(9):775-82.

91. Протасевич И.И., Цветков Ф.О., Шульга A.A., Поляков K.M.,

92. Лобачев B.M., Кирпичников М.П., Макаров A.A. Стабилизирующий эффектбелок-белковых взаимодействий: тепловая денатурация комплексов Барназы и Биназы с Барстаром и его мутантами С40,82А. Молекулярная биология 1999,33(3):476-482.

93. Uedo N., Ishikawa Н., Narahara Н. et al. Measurement of carcinoembryonic antigen in colonic effluent as a high-risk marker for colorectal carcinoma. Cancer Detect. Prev.-2000.-Vol.24,N.3.-p.290-294.

94. Ничога В.Д., Добренький M.H., Козина H.A., Спивак А.А. Опухолевые маркеры при раке молочной железы. Тезисы докл. 68-й научн. конф. медиков Астраханской области,- Астрахань, 1987, с. 5-7.

95. Скворцов С.В., Храмченко И.М., Кушлинский Н.Е. Опухолевые маркеры в оценке степени распространенности опухолевого процесса при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта. Клин. лаб. диагн.-1999.-№ 9, с.26.

96. Скворцов С.В., Кушлинский Н.Е., Кадагидзе З.Г. и др. СА-19-9, раково-эмбриональный антиген и а-фетопротеин в сыворотке крови неонкологических больных и их клиническое значение. Бюлл.экспер.биол,-1997- т. 123, № 5, с.566-569.

97. Карпищенко А.И., Антонов В.Г., Бутенко А.Б. и др. Онкомаркеры и их диагностическое значение. Санкт-Петербург, 1999

98. Yuen P.K., Li G., Bao Y, Muller U.R., 2003. Microfluidic devices for fluidic circulation and mixing improve hybridization signal intensity on DNA arrays. Lab Chip. 3,46-50.

99. A. Rida, T. Lehnert, A.M.Gijs Microfluidic mixer using magnetic beads, 2003, 579-582.

100. M. Noerholm, H. Bruus, et al., 2004, Polymer microfluidic chip for online monitoring ofmicroarray hybridizations. Biology and Bioeng. 28-37.

101. Toegl, A., Kirchner, R., Gauer, C., Wixforth, A., 2003. Enhancing results of microarray hybridization through microagitation. J. Biomol. Techn. 14, 197204.

102. Schaupp, S.J., et. al. Active mixing during hybridization improves the accuracy and reproducibility of microarray results. 2005 Biotechniques 38: 117119.

103. Rubina AY, Pan'kov SV, Dementieva EI, Pen'kov DN, Butygin AV,

104. Vasiliskov VA, Chudinov AV, Mikheikin AL, Mikhailovich VM, Mirzabekov AD.104

105. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. Anal Biochem. 2004 Feb 1;325(1):92-106.

106. Zubtsov DA, Ivanov SM, Rubina AY, Dementieva EI, Chechetkin VR, Zasedatelev AS. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips. J Biotechnol. 2006 Mar 9; 122(1): 16-27. Epub 2005 Sep 22.

107. Probstein R F Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction ("Second Edition) (New York: Wiley, 1994