Функциональные полимерные системы для высокочувствительного анализа белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Робер, Марина Юрьевна

• Робер, Марина Юрьевна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Робер, Марина Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Макропористые монолитные носители на основе синтетических полимеров.

1.1.1. Общие представления о твердых макропористых полимерных носителях.

1.1.2. Получение макропористых монолитных полимерных носителей.

1.1.2.1. Механизм формирования поровой структуры в процессе микрофазового разделения.

1.1.2.2. Особенности получения макропористых полимерных носителей в блоке.

1.1.2.3. Порообразующие агенты.

1.1.2.4. Мономеры и сшивающие агенты.

1.1.2.5. Побочные реакции циклизации и образования внутримолекулярных сшивок.

1.1.3. Методы исследования морфологической структуры макропористых монолитов.

1.1.4. Химия поверхности полимерных носителей монолитного типа.

1.2. Способы создания носителей для твердофазного биологического анализа.

1.2.1. Способы модификации поверхности носителя биоаффинными зондами (лигандами).

1.2.1.1. Нековалентная иммобилизация.

1.2.1.2. Ковалентная иммобилизация.

1.2.1.3. Ориентационная иммобилизация.

1.2.1.4. Применение подходов твердофазного пептидного синтеза.

1.З.,Микроаналитические системы для анализа белков.

1.3.1. Основные принципы микроанализа.

1.3.2. Общие представления о материалах, используемых для создания операционных слоев микрочипов.

1.3.2.1. Двумерные (2D) носители.

1.3.2.2. Трехмерные (3 D) носители.

1.3.3. Методы детектирования целевого компонента в исследуемом образце.

1.3.3.1. Радиоизотопный анализ.

1.3.3.2. Ферментный анализ.

1.3.3.3. Флуоресцентный анализ.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы.

2.2. Оборудование.

2.3. Методы.

2.3.1. Синтез сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА.

2.3.1.1. Получение N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты.

2.3.1.2. Осуществление процесса свободно-радикальной полимеризации.

2.3.2. Изучение закономерностей иммобилизации аффинного лиганда на поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА и сополимера ЦЭМА-ЭДМА с использованием БСА в качестве модельного белка.

2.3.2.1. Процедура иммобилизации.

2.3.2.2. Аналитические методы определения концентрации белка.

2.3.2.3. Анализ растворимых продуктов реакции.

2.3.3. Создание микроаналитических слайдов (платформы биочипа) на основе полимерной монолитной матрицы и стеклянной поддерживающей среды.

2.3.3.1. Обработка поверхности стекла (кислотное травление и силанизация).

2.3.3.2. Получение монолитных полимерных слоев в подготовленных ячейках слайдов.

2.3.4. Биологический анализ с использованием полученных прототипов биочипа.

2.3.4.1. Тестирование микроаналитических систем с использованием модельной биокомплементарной системы мышиный IgG — антитела против мышиного IgG.

2.3.4.2. Микроанализ на поверхности стеклянного 2-D биочипа.

2.3.4.1.Создание тест-систем для диагностики сифилиса на основе сополимера ГМА-ЭДМА.

2.3.4.4. Определение остеопонтина в клеточном супернатанте.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Синтез и исследование свойств сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА.

3.1.1 Зависимость поровых характеристик сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА от природы используемых порогенных растворителей.

3.2. Исследование закономерностей иммобилизации белка на поверхности макропористых монолитных носителей на основе синтезированных сополимеров.

3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации модельного белка на поверхности сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА.

3.2.2. Иммобилизация модельного белка на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА.

3.2.2.1. Исследование продуктов реакции иммобилизации лиганда на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА.

3.2.2.2. Оптимизация условий проведения реакции иммобилизации лиганда на поверхности сополимера ЦЭМА-ЭДМА.

3.3. Полимерные платформы биочипов на основе макропористых метакрилатных слоев.

3.3.1. Изготовление платформы биочипа.

3.3.2. Биологический анализ с использованием модельной системы мышиный IgG - антитела против мышиного IgG.

3.3.2.1. Оптимизация условий иммобилизации аффинного лиганда на поверхности полимерной матрицы.'.

3.3.2.2. Сравнение эффективности разработанных наноаналитических устройств на основе метакрилатных монолитов и стандартных двумерных стеклянных чипов.

3.3.3. Применение разработанных аналитических устройств на основе сополимера ГМА-ЭДМА для детектирования антител к антигену Т. Pallidum в сыворотке крови человека.

3.3.4. Детектирование остеопонтина в клеточном супернатанте с использованием разработанных наноаналитических устройств.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональные полимерные системы для высокочувствительного анализа белков»

Разработанные в конце 80-х годов макропористые монолитные сорбенты на основе синтетических полимеров в настоящее время успешно используются в проведении широкого ряда динамических сепарационных и биоконверсионных процессов, таких как, высокоэффективная жидкостная хроматография, ферментативные реакции, капиллярная электрохроматография, газовая хроматография, химический катализ. Уникальные особенности поровой структуры макропористых монолитов, обеспечивающие адсорбционную доступность поровой поверхности для крупных и малоподвижных молекул белка, позволили предположить, что данные материалы могут быть использованы для конструирования непроточных микроаналитических устройств (прототипов биочипа), состоящих из инертной поддерживающей среды и ко-валентно связанного с ней слоя полимерного монолита.

В последние годы активное развитие переживает новая биотехнологическая отрасль, направленная на миниатюризацию методов анализа биологических объектов. Применение в различных областях биологии и медицины аналитических тест-систем, выполненных в формате биологических микрочипов, становится все более распространенным явлением. Интерес к этим миниатюрным приборам обусловлен предоставляемой ими возможностью проводить комплексный аналитический скрининг материала с минимальными затратами времени и дорогостоящих реагентов. Действие подобных тест-систем основано на функциональном ответе биообъектов, иммобилизованных на поверхности твердого носителя, на присутствие в растворе соответствующего комплемента. Поскольку свойства стационарной фазы играют важную роль в обеспечении эффективности биоанализа, материалы, используемые в целях иммобилизации биологических молекул должны удовлетворять ряду строгих требований, которые включают в себя механическую и химическую стабильность, отсутствие неспецифического взаимодействия с биологическими объектами, обеспечение хорошего качества наносимых зон (спотов) анализируемого вещества, простоту манипуляций и совместимость с системой детектирования.

При выборе способа создания адсорбционной матрицы, обладающей биоаффинными свойствами, значительную роль играет химическая природа стационарного носителя, поскольку именно она определяет возможность проведения того или иного способа функционализации сорбента аффинными лигандами. Наиболее простой способ иммобилизации может быть осуществлен посредством их физической адсорбции. Этот подход широко используется в таких видах биологического анализа, как имму-ноферментный тест, иммуноблоттинг и дот-иммуноанализ. Однако наличие слабых взаимодействий с матрицей может повлечь за собой потерю аффинной емкости сорбента за счет десорбции лиганда с поверхности при незначительных изменениях в составе жидкой фазы или температуры. Поэтому ковалентное связывание лиганда с поверхностью матрицы считается наиболее предпочтительным с точки зрения обеспечения его устойчивости в аналитических условиях. Следует отметить, что и в этом случае имеются определенные ограничения. Проведение процедуры иммобилизации имеет смысл лишь при условии сохранения биологической активности лиганда, поэтому реакцию необходимо проводить в максимально мягких условиях, а реакционные группы белка, принимающие участие в процессе иммобилизации, не должны располагаться в непосредственной близости от активного сайта биомолекулы.

Таким образом, развитие технологии биологических микрочипов тесно связано с внедрением новых типов носителей, обладающих улучшенными физическими и химическими характеристиками, которые позволили бы повысить их эффективность.

Макропористые монолитные носители на основе синтетических полимеров получают методом свободно-радикальной полимеризации в блоке в присутствие по-рообразующих агентов. Данный тип сорбентов характеризуется неизменной поровой структурой, которая формируется в процессе синтеза и сохраняется в сухом состоянии. Оптимизация условий синтеза обсуждаемых материалов обеспечивает возможность направленного формирования поровой структуры в зависимости от поставленной задачи.

Сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭД-МА) является наиболее известным и широко используемым представителем макропористых монолитных носителей. Наличие эпоксидных групп в химической структуре сополимера позволяет проводить одностадийную ковалентную иммобилизацию молекул белка на поверхности сорбента. Однако существенным недостатком данного носителя является длительность процесса иммобилизации белка с участием оксира-новых циклов и недостаточно высокая аффинная емкость носителя. В свете обозначенной проблемы разработка носителей монолитного типа на основе сополимеров, содержащих функциональные группы, обладающие более высокой реакционной способностью, представляется актуальной задачей.

Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания полимерных микроаналитических платформ, включающих полимерные слои монолитного типа, содержащие реакционно-способные функциональные группы и обладающие поровыми характеристиками, удовлетворяющими условиям проведения анализа в статических условиях, а именно, обеспечивающими свободное и достаточно быстрое проникновение макромолекул белка (или более крупных объектов, например, вирусов) внутрь порового пространства, а также высокую адсорбционную емкость носителя.

В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи:

• поиск мономеров, содержащих функциональные группы, способные к взаимодействию с аминогруппой молекулы белка;

• оценка способности выбранных мономеров к сополимеризации с дивинильным соединением с образованием монолитного макропористого материала и анализ ^ полученных жестко сшитых сополимеров;

• оптимизация условий синтеза сополимеров для получения материала с задан- ; ным размером пор;

• исследование закономерностей иммобилизации лигандов на поверхности полученных носителей на примере модельного белка;

• оптимизация технологии изготовления микроаналитических устройств на основе стеклянной поддерживающей среды и синтезированных полимерных слоев;

• выбор оптимальных условий проведения микроанализа с использованием модельной аффинной пары белков;

• оценка эффективности разработанных микроаналитических устройств на примере решения реальных биомедицинских и биотехнологических задач. Объектами представленного исследования являлись синтетические сополимеры на основе метакрилатных и акрилатных мономеров, несущие на своей поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой молекулы белка.

При выполнении работы были использованы следующие методы исследования:

- свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация для синтеза сополимеров;

- элементный анализ и ИК-спектроскопия для характеристики полученных сополимеров;

- интрузионная ртутная порометрия для определения среднего размера пор полимерных носителей и распределения их по размерам;

- сканирующая электронная микроскопия для качественной оценки поровой структуры полученных материалов;

- тонкослойная хроматография (ТСХ), обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрия и спектроскопии в видимой области поглощения для исследования закономерностей иммобилизации модельного белка на поверхности полученных полимерных носителей;

- люминесцентная микроскопия для осуществления микроанализа на поверхности разработанных полимерно-неорганических платформ с целью оценки эф- »-фективности их практического использования.

Научная новизна работы заключается в следующем:

• Впервые осуществлен синтез двух макропористых материалов на основе сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилме-такрилата и этиленгликольдиметакрилата, а также 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата.

• Разработан принцип конструирования полимер-содержащих платформ, составляющих функциональную основу биочипа, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, силанизацию полученных ячеек и осуществление фотоинициируемой полимеризации непосредственно в изготовленных ячейках.

• Впервые показана возможность высокочувствительного детектирования белка в формате биочипов с использованием макропористых монолитных полимерных носителей.

Практическая значимость работы. Разработаны методы синтеза макропористых полимерных материалов монолитного типа, обладающих функциональными группами и воспроизводимой поровой структурой, пригодной для использования в конструкции биочипа, предназначенного для биологического микроанализа. Разработаны и апробированы методы определения пикомолярных количеств маркерного белка остеопонтина в клеточном супернатанте при тканево-инженерном производстве костной ткани, а также антител против антигена Т. Pallidum в сыворотке крови человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Синтезированные материалы на основе сшитых жесткоцепных сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольди-метакрилата содержат функциональные группы, позволяющие осуществлять быструю модификацию их поверхности белком;

- Поровая структура полученных носителей удовлетворяет требованиям проведения биоанализа в статических условиях, а именно, обеспечивает проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную емкость носителя;

- Макропористые носители на основе синтезированных полимеров являются перспективными материалами для осуществления анализа белка в микроформате.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Санкт-Петербургская конференция молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2007, 2008); International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2008); Monolith Summer School (Порторож, Словения, 2006, 2008); International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). (Москва, Россия, 2006); The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference "Modern Problems of Microbiology and Biotechnology" (Одесса, Украина, 2007); European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes (Euromat 2007)

Нюрнберг, Германия, 2007); Baltic Polymer Symposium 2007 (Друскининкай, Литва)' и 2008 (Отепа, Эстония).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемнадцать печатных работ, включая две статьи в журналах: Журнал Прикладной Химии и Journal of Applied Polymer Science, две статьи в трудах международных конференций «3rd International and 28th European Peptide Symposium» и «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007», а также 14 тезисов устных и стендовых докладов. Результаты работы также обсуждались на научно-практическом семинаре в Институте Технической Химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007).

Вклад автора состоял в осуществлении всех представленных в работе экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 148 страницах, проиллюстрированы 12 таблицами и 49 рисунками, список цитируемой литературы включает 135 источников.

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Робер, Марина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые осуществлен синтез сшитых жесткоцепных сополимеров N - гидро-ксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ГФИАК-ГМА-ЭДМА) и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата (ЦЭМА-ЭДМА). Установлены оптимальные условия получения методом фотоинициируемой полимеризации сополимеров ГМА-ЭДМА, ГФИАК-ГМА-ЭДМА и ЦЭМА-ЭДМА, обеспечивающие получение материалов с заданными поровыми характеристиками.

2. Исследовано влияние условий ковалентного связывания модельного белка (бычьего сывороточного альбумина) с поверхностью синтезированных сополимеров (время реакции, рН, концентрация раствора белка) на степень модификации носителя белком. Показано, что максимальная степень модификации сорбента лигандом в случае сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА достигается за 2 часа и составляет 250 нмоль/г, тогда как для сополимера ЦЭМА-ЭДМА эта величина достигает 350 нмоль/г сорбента при проведении реакции в течение 4 часов.

3. Разработан принцип конструирования полимерно-неорганической основы биочипа на основе стеклянной поддерживающей среды и макропористых полимерных носителей, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, обработку полученных ячеек ненасыщенным силанизирующим агентом и синтез привитого сополимера непосредственно в изготовленных ячейках.

4. С использованием модельной пары комлементарных белков мышиный иммуноглобулин G - козьи антитела против мышиного иммуноглобулина G оптимизированы основные условия осуществления биоанализа, обеспечивающие максимальную эффективность сконструированных микроустройств. Показано, что чувствительность анализа, проводимого на чипе с монолитным полимерным слоем на порядок превышает таковую для планарных стеклянных чипов.

5. На примере выявления антител к антигену бледной трепонемы в сыворотке крови человека, а также детектирования остеопонтина в клеточном супернатан-те продемонстрирована перспективность применения полученных прототипов микроаналитических систем для медицинских и биотехнологических целей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Робер, Марина Юрьевна, 2009 год

1. Д. А. Фридрихсберг. Курс коллоидной химии. JL: Химия, 1974. 352 с.

2. А. М. Шур. Высокомолекулярные соединения. М.: Высшая школа, 1966. 504 с.

3. О. Okay. Macroporous copolymer networks. // Prog. Polym. Sci. 2000. V. 25. P. 711779.

4. K. W. Pepper. Sulphonated cross-linked polystyrene: A monofunctional cation-exchange resin. И J. Appl. Chem. 1951. V. 1. P. 124-132.

5. H. Jacobelli, M. Bartholin, A. Guyot. Styrene Divinyl Benzene Copolymers. I. Texture of Macroporous Copolymers with Ethyl-2-Hexanoic Acid in Diluent. // J. Appl. Polym. Sci. 1979. V. 23. P. 927-939.

6. I. M. Abrams, J. R. Millar, A history of the origin and development of macroporous ion-exchange resins. // React. Polym. 1997. V. 35. P. 7-22.

7. Т. B. Tennikova, M. Bleha, F. Svec, Т. V. Almazova, B. G. Belenkii. High Performance Membrane Chromatography of Proteins: a Novel Method of Protein Separation. II J. Chromatogr. 1991. V. 555. P. 97-107.

8. Т. B. Tennikova, F. Svec. High-performance membrane chromatography: highly efficient separation method for proteins in ion-exchange, hydrophobic interaction and reversed-phase modes. II J. Chromatogr., 646, 1993, 279-288.

9. A. E. Rodrigues, B. J. Ahn, A. Zoulalian. Intraparticle-Forced Convection Effect in Catalyst Duffusivity Measurements and Reactor Design. // AIChE J. 1982. V. 28. P. 541546.

10. A. E. Rodrigues, Z. P. Lu, J. M. Loureiro. Peak resolution in linear chromatography. Effects of intraparticle convection. II J. Chromatogr. A. 1993. V. 653. P. 189-198.

11. J. J. Meyers, A. I. Liapis. Network modeling of the convective flow and diffusion of molecules adsorbing in monoliths and in porous particles packed in a chromatographic column. II J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 3-23.

12. F. Svec, J. M. J. Frechet. New Formats of Polymeric Stationary Phases for HPLC Separations: Molded Macroporous Disks and Rods. // J. Mol. Recogn. 1996. V. 9. P. 326334.

13. F. Svec, E. C. Peters, D. Sykora, C. Yu, J. M. J. Frechet. Monolithic Stationary Phases for Capillary Electrochromatography Based on Synthetic Polymers: Designs and Applications. // J. High Resol. Chromatogr. 2000. V. 23. P. 3-18.

14. F. Svec. Preparation and HPLC applications of rigid macroporous organic polymer monoliths. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 747-766.

15. R. Mallik, T. Jiang, D. S. Hage. High-Performance Affinity Monolith Chromatography: Development and Evaluation of Human Serum Albumin Columns. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 7013-7022.

16. A. Podgornik, J. Jancar, M. Mefhar, S. Kozamernik, D. Glover, К. Cucek, M. Barut, A. Strancar. Large-scale methacrylate monolithic columns: design and properties. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2004. V. 60. P. 179-189.

17. B. Gu, Y. Li, M. L. Lee. Polymer Monoliths with Low Hydrophobicity for Strong Cation-Exchange Capillary Liquid Chromatography of Peptides and proteins. // Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 5848-5855.

18. N. M. Smith, Z. Jiang. Developments in the use and fabrication of organic monolithic phases for use with high-performance liquid chromatography and capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1184. P. 416-440.

19. A. Jungbauer, R. Hahn. Polymethacrylate monoliths for preparative and industrial separation of biomolecules assemblies. // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1184. P. 62-79.

20. A-M. Siouffi. About the С term in the van Deemter's equation of plate height in monoliths. II J. Chromatogr. A. 2006. V. 1126. P. 86-94.

21. E. Vlakh, N. Ostryanina, A. Jungbauer, T. Tennikova. Use of monolithic sorbents modified by directly synthesized peptides for affinity separation of recombinant tissue plazminogen activator (t-PA). //J. Biotechnol. 2004. V. 107. P. 275-284.

22. N. D. Ostryanina, G. P. Vlasov, Т. B. Tennikova. Multifunctional Fractionation of Polyclonal Antibodies by Immunoaffinity High-performance Monolithic Disk Chromatography. II J. Chromatogr. A. 2002. V. 949. P. 163-171.

23. R. Mallik, D. S. Hage. Affinity monolith chromatography. // J. Sep. Sci. 2006. V. 29. P. 1686-1704.

24. G. A. Platonova, Т. B. Tennikova. Affinity processes realized on high-flow-throughmethacrylate-based macroporous monoliths. II J. Chromatogr. A, 1065, 2005, 19-28.в

25. M. Kato, K. Inuzuka, K. Sakai-Kato, T. Toyo'oka. Monolithic Bioreactor Immobilizing Trypsin for High-Throughput Analysis. // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 1813-1818.

26. F. Svec. Organic polymer monoliths as stationary phases for capillary HPLC. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 1419-1430.

27. F. Svec, A. A. Kurganov. Less common applications of monoliths. III. Gas chromatography. И J. Chromatogr. A. 2008. V. 1184. P. 281-295.

28. F. Svec, J. M. Frechet, in: Svec, F., Tennikova, Т. В., Deyl, Z. (Eds.) Monolithic materials: preparation, properties and applications. Amsterdam: Elsevier. 2003. V. 67. P. 19-50.

29. K. Dusek, In:Polumer networks: structure and mechanical properties (A. J. Chompff, S. Newman Eds). New York: Plenum Press. 1971. P. 245-260.

30. O. Okay, U. Akkan. Heterogeneities in polyacrylamide gels immersed in acetone-water mixtures. // Polym. Bull. 1998. V. 41. P. 363-370.

31. J. Urban, D. Moravcova, P. Jandera. A model of flow-through pore formation in methacrylate ester-based monolithic columns. // J. Sep. Sci. 2006. V. 29. P. 1064-1073.

32. E. C. Peters, F. Svec, J. M. J. Frechet. Rigid Macroporous Polymer Monoliths. // Adv. Mater. 1999. V. 11.P. 1169-1181.

33. S. Xie, R. Alington, J. M. J. Frechet, F. Svec, in: Scheper T. {Ed.) Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag. 2002. V. 76. P. 87-125.

34. J. Courtois, E. By strom, K. Irgum. Novel monolithic materials using poly (ethylene glycol) as porogen for protein separation. // Polymer. 2006. V. 47. P. 2603-2611.

35. A. I. Cooper, C. D. Wood, A. B. Holmes. Synthesis of well-defined macroporous polymer monoliths by sol-gel polymerization in supercritical C02- H Ind. Eng. Chem. Res. 2000. V. 39. P. 4741-4744.

36. A. I. Cooper, A. B. Holmes. Synthesis of molded monolithic porous polymers using supercritical carbon dioxide as the porogenic solvent. // Adv. Matter. 1999. V. 11. P. 1270-1274.

37. A. K. Hebb, K. Senoo, A. I. Cooper. Synthesis of porous cross-linked polymer monoliths using 1,1,1,2-tetrafluoroethane (R134a) as the porogen. // Composites Sci. Tech. 2003. V. 63. P. 2379-2387.

38. J. Yin, G. Yang, H. Wang, Y. Chen. Macroporous polymer monoliths fabricated by using metal-organic coordination gel template. // Chem. Comm. 2007. P. 4614-4616.

39. Y. Shi, Y. Sun. Fabrication and Characterization of a Novel Biporous Spherical Adsorbent for Protein Chromatography. // Chromatographia. 2003. V. 57. P. 29-35.

40. J. Dai, Z. Bao, G. L. Baker, M. L. Bruening. High-Capacity Binding of Proteins by Poly(Acrylic Acid) Brushes and Their Derivatives. // Langmuir. 2006. V. 22. P. 42744281.

41. I. N. Savina, B. Mattiasson, I. Y. Galaev. Graft polymerization of acrylic acid onto macroporous polyacrylamide gel (cryogel) initiated by potassium diperiodatocuprate. // Polymer. 2005. V. 46. P. 9596-9603.

42. K-F. Du, D. Yang, Y. Sun. Fabrication of high-permeability and high-capacity monolith for protein chromatogaphy. // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1163. P. 212-218.

43. E. G. Vlakh, Т. B. Tennikova. Preparation of methacrylate monoliths. // J. Sep. Sci. 2007. V. 30. P. 2801-2813.

44. M. Merhar, A. Podgornik, M. Barut, M. Zigon, A. Strancar. Methacrylate monoliths prepared from various hydrophobic and hydrophilic monomers Structural and chromatographic characteristics. II J. Sep. Sci. 2003. V. 26. P. 322-330.

45. A. Strancar, A. Podgornik, M. Barut, R. Necina, in: Scheper T. {Ed.) Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag. 2002. V. 76. P. 49-85.

46. B.Gu, J. M. Armenta, L. Lee. Preparation and evaluation of poly(polyethylene glycol methyl ether acrylate-co-polyethylene glycol diacrylate) monolith for protein analysis. II J. Chromatogr. A. V. 1079. P. 382-391.

47. Т. B. Tennikova, B. G. Belenkii, F. Svec. High-performance membrane chromatography. A novel method of protein separation. // J. Liq. Chromatogr. 1990. V. 13. P. 63-70.

48. O. Okay, M. Kurz, K. Lutz, W. Funke. Cyclization and Reduced Pendant Vinyl Group Reactivity during the Free-Radical Cross-Linking Polymerization of 1,4-Divinylbenzene. // Macromolecules. 1995. V. 28. P. 2728-2737.

49. O. Okay, H. J. Naghash, I. Capek. Free-radical crosslinking copolymerization: effect of cyclization on diffusion-controlled termination at low conversion. // Polymer. 1995. V. 36. P. 2413-2419.

50. H. J. Naghash, O. Okay. Gel formation by chain-crosslinking photopolymerization of metyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate. // Polymer. 1997. V. 38. P. 1187-1196.

51. А. Ю. Билибин. Функциональные свойства полимеров. СПб: СПбГУ, 1998. 136 с.

52. F. Baeuml, Т. Welsch. Improvement of the long-term stability of polyimide-coated fused-silica capillaries used in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. V. 961. P. 35-44.

53. A. Marushka, O. Kornysova. Continuous beds (monoliths): stationary phases for liquid chromatography formed using the hydrophobic interaction-based phase separation mechanism. // J. Biochem. Biophys. Meth. 2004. V. 59. P. 1-48.

54. J-L. Cabral, B. Dirk, C. D. Skinner. Pore size characterization of monolith for electrochromatography via atomic force microscopy in air and liquid phase. // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1108. P. 83-89.

55. S. Brunauer, P. H. Emmett, E. Teller. Adsorption of Gases in Multimolecular Layers. II J. Am. Chem. Soc. 1938. V. 60. P. 309-319.

56. J. Urban, S. Eeltink, P. Jandera, P. J. Schoenmakers. Characterization of polymer-based monolithic capillary columns by inverse size-exclusion chromatography and mercury-intrusion porosimerty. И J. Chromatogr. A. 2008. V. 1182. P. 161-168.

57. M. R. Buchmeiser. Polymeric monolithic materials: Syntheses, properties, functionalization and applications. II Polymer. 2007. V. 48. P. 2187-2198.

58. L. G. Berruex, R, Freitag, Т. B. Tennikova. Comparison of antibody bindnig to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. II J. Pharm. Biomed. Anal 2000. V. 24. P. 95-104.

59. Q. Luo, H. Zou, Q. Zhang, X. Xiao, J. Ni. High-performance affinity chromatography with immobilization of protein A and L-histidine on molded monolith. // Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 80. P. 481-489.

60. R. Mallik, T. Jiang, D. S. Hage. High-performance affinity monolith chromatography: development and evaluation of human serum albumin columns. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 7013-7022.

61. T. Jiang, R. Mallik, D. S. Hage. Affinity monoliths for ultrafast immunoextraction. // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 2362-2372.

62. P. F. Ruhn, S. Garver, D. S. Hage. Development of dihydrazide-activated silica supports for high-performance affinity chromatography. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 669. P. 9-19.

63. H. Xuan, D. S. Hage. Immobilization of aracid glycoprotein for chromatographic studies of drug-protein binding. II Anal Biochem. 2005. V. 346. P. 300-310.

64. G. Mino, S. Kaizerman. A new method for the preparation of graft copolymers. Polymerization initiated by eerie ion redox systems. II J. Polym. Sci. 1958. V. 31. P. 242243.

65. T. Rohr, E. F. Hilder, J. J. Donovan, F. Svec, J. M. J. Frechet. Photografting and the Control of Surface Chemistry in Three-Dimensional Porous Polymer Monoliths. // Macromolecules. 2003. V. 36. P. 1677-1684.

66. V. Pucci, M. A. Raggi, F. Svec, J. M. J. Frechet. Monolithic colomns with a gradient of functionalities prepared via photoinitiated grafting for separations using capillary electrochromatography. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 779-788.

67. K.Kanamori, К. Nakanishi, Т. Hanada. Rigid Macroporous Poly(divinylbenzene) Monoliths with a Weil-Defined Bicontinuous Morfology Prepared by Living Radical Polymerization. // Adv. Mater. 2006. V. 18. P. 2407-2411.

68. E. C. Peters, F. Svec, J. M. J. Frechet, C. Viklund, K. Irgum. Control of Porous Properties and Surface Chemisrty in "Molded" Porous Polymer Monoliths Prepared by Polymerization in the Presence of TEMPO. // Macromolecules. 1999. V. 32. P. 63776379.

69. Я. Туркова. Аффинная хроматография, пер. с англ. М., Мир, 1980. 471 с.

70. И. Лефтковитс, Б. Пернис. Иммунология. Методы исследований, пер. с англ., М., Мир, 1983. 349 с.

71. А. Д. Мирзабеков, Д. В. Прокопенко, В. Р. Чечеткин. Применение матричных биочипов с иммобилизованной ДНК в биологии и медицине, в: Информационные медико-биологические технологии (В.А. Княжев, К.В. Судаков). М.: ГЕОТАР-МЕД, 2002. С. 166-198.

72. М. Nisnevitch, М. A. Firer. The Solid Phase in Affinity Chromatography: strategies for antibody attachment. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 49. P. 467-480.

73. G. Elia, M. Silacci, S. Scheurer, J. Scheuermann, D. Neri. Affinity-capture reagents for protein arrays. // Trends in Biotechnology. 2002. V. 20. P. 19-22.

74. F. Rusmini, Zh. Zhong. Protein Immobilization Strategies for protein biochips. // Biomacromolecules. 2007. V. 8. P. 1775-1789.

75. Q. Xu, K. S. Lam. Protein and Chemical Microarrays-Powerful Tools for Proteomics. J. Biomedicine and Biotechnology. 2003. V. 5. P. 257-266.

76. R. F. Taylor. Protein Immobilization: Fundamentals and Application. New York: Marcel Dekker. 1991.

77. G. T. Hermanson, A. K. Mallia, P. K. Smith. Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, 1992.

78. M. Wilchek, T. Miron. Thirty years of affinity chromatography. React, and Funcsh. Polym. 1999. V. 41. P. 263-268.

79. Z. Bilkova, J. Churacek, Z. Kucerova, J. Turkova. Purification of anti-chimotrypsin antibodies for the preparation of a bioaffinity matrix with oriented chymotrypsin as immobilized ligand. J. Chromatogr. B. 1997. V. 689. P. 273-279.

80. О. Е. Galanina, М. Mecklenburg, N. Е. Nifantiev, G. V. Pazynina, N. V. Bovin. GlicoChip: multiarray for the study of carbohydrate-binding proteins. Lab Chip. 2003. V. 3. P. 260-265.

81. C. S. Lee, B. G. Kim. Improvement of protein stability in protein microarrays. Biotechnology letters. 2002 V. 24. P. 839-844.

82. J. Turkova. Oriented immobilization of biologically active proteins as a tool for revealing protein interactions and function. J. Chromatogr. 1999. V. 722. P. 11-31.

83. R. Frank. Spot-Synthesis: An Easy Technique for the Positionally Addressable, Parallel Chemical Synthesis on a Membrane Support. // Tetrahedron. 1992. V. 48. P. 9217-9232.

84. S. P. Fodor, J. Leighton Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, A. T. Lu, D. Solas. Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. // Science. 1991. V. 251. P. 767-773.

85. W. Kusnezov, T. Pulli, O. Witt, J. D. Hoheisel. Solid Supports for Protein Microarrays an Related Devices. In:Protein Microarrays. M. Schena, Ed. Jones and Barlett Publishers. Sudbury. 2005. P. 247-284. '

86. R. P. Ekins, R. Chu, E. Biggart. The development of microspot, multi-analyte radiometric immunoassay using dual fluorescentlabelled antibodies. // Anal. Clin. Acta. 1990. V. 227. P. 73-96.

87. R. P. Ekins, F. W. Chu. Multianalyte microspot immunoassay-microanalytical "compact disk" of the future. // Clin. Chem. 1991. V. 37. P. 1955-1967.

88. R. P. Ekins. Ligand assay: from electrophoresis to miniaturized microarrays. // Clin. Chem. 1998. V. 44. P. 2015-2030.

89. M. F. Templin, D. Stoll, M. Schrenk, P. C. Traub, C. F. Vohringer, Т. O. Joos. Protein microarray technology. // Trends in Biotechnology. 2002. V. 20. P. 160-166.

90. W. Kusnezow, Y. Syagailo, S. Ruffer, N. Baudenstiel, C. Gauer, J. D. Hoheisel, D. Wild, I. Goychuk. Optimal Design of Microarray Immunoassays to Compensate fo Kinetic Limitations. //Mol. Cel. Proteom. 2006. V. 5. P. 1681-1696.

91. W. Kusnezow, Y. Syagailo, S. Ruffer, K. Klenin, W. Sebald, J. D. Hoheisel, C. Gauer, I. Goychuk. Kinetics of antigen binding to antibody microspots: Strong limitations by mass transport to the surface. // Proteomics. 2006. V. 6. P. 794-803.

92. P. Schuck, A. P. Minton. Analysis of mass Transport-Limited Binding Kinetics in Evanescent Wave Biosensors. // Anal. Biochem. 1996. V. 240. P. 262-272.

93. В. Goldstein, D. Coombs, X. He, A. R. Pineda, C. Wofsy. The influence of transport on the kinetics of binding to surface receptors: application to cells and BLAcore. II J. Mol. Recogn. 1999. V. 12. P. 293-299.

94. W. Kuznezow, J. D. Hoheisel. Solid supports for microarray immunoassays. // J. Mol. Recogn. 2003. V. 16. P. 165-176.

95. G. MacBeath, S. L. Schreiber. Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination. // Science. 2000. V. 289. P. 1760-1763.

96. W. Shao, Z. Zhou, I. Laroche, H. Lu, Q. Zong, D. D. Patel, S. Kingsmore, S. P. Piccoli. Optimization of Rolling-Circle Amplified Protein Microarrays for Multipiexed Protein Profilling. И J. Biomedicine and Biotechnology. 2003. V. 5. P. 299-307.

97. В. B. Haab, M. J. Dunham, P. O. Brown. Protein microarray for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solution. // Genome Biology. 2001. V. 2. P. 0004.1-0004.13.

98. A. Sreekumar, M. K. Nyati, S. Varambally, T. R. Barrette, D. Ghosh, T. S. Lawrence, A. M. Chinnaiyan. Profiling of Cancer Cells Using Protein Microarrays: Discovery of Novel Radiation-regulated Proteins. // Cancer Research. 2001. V. 15. P: 7585-7593.

99. S. Piletsky, E. Pletska, A. Bossi, N. Turner, A. Turner. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. // Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 82. P. 86-92.

100. H. Wenschuh, R. Volkmer-Engert, M. Schmidt, M. Schulz, J. Schneider-Mergerier, U. Reineke. Coherent Membrane for Parallel Microsynthesis and Screening of Bioactive Peptides. // Biopolymers.2000. V. 55. P. 188-206.

101. JI. С. Гальбрайх. Целлюлоза и ее производные. // Соросовский образовательный журнал. 1996. V. 11. Р. 47-53.

102. М. Reck, F. Shtal, J. G. Walter, M. Hollas, D. Melzner, T. Scheper. Optimization of a Microarray Sandwich-ELISA adainst hINF-у on a Modified Nitrocellulose membrane. II Biotechnology Progress. 2007. V. 23 (6). P. 1498-1505.

103. D. Murtinco, A. R. Lagoa, F. A. P. Garcia, M. H. Gil. Cellulose derivatives membranes as supports for immobilization of enzymes. // Cellulose. V. 5. P. 299-308.

104. А. М. Колчинский, Д. А. Грядунов, Ю. П. Лысов, В. М. Михайлович, Т. В. Наседкина, А. Ю. Турыгин, А. Ю. Рубина, В. Е. Барский, А. С. Заседателев.

105. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. // Мол. Биол. 2004. Т. 38. С. 5-16.

106. А. Ю. Рубина, С. В. Паньков, С. М. Иванов, Е. И. Дементьева, А. Д. Мирзабеков. Белковые микрочипы. II Доклады академии наук. 2001. Т. 5. С. 701704.

107. P. Arenkov, A. Kukhtin, A. Gemmell, S. Voloshchuk, V. Chupeeva, А. Mirzabekov. Protein Microchips: Use for Immunoassay and Enzymatic Reactions. // Anal. Biochem. 2000. V. 278. P. 123-131.

108. R. S. Yalow, S. A. Berson. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. // J. Clin. Investig. 1960. V. 39. P. 1157-1175.

109. Г. Фримель. Иммунологические методы, пер. с нем. М.: Медицина, 1987. 472 с.

110. П. С. Барбан, Р. А. Пшеничнов, А. Н. Пантюхина, И. Б. Ившина. Иммунофлуоресцентный анализ, Свердловск, 1988. 174 с.

111. L. A. Ernst, R. К. Gupta, R. В. Mujumdar, A. S. Waggoner. Cyanine dye labeling reagents for a sulfhydryl groups. Cytometry. 1989. V. 10. P. 3-10.

112. P. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М: Мир, 1991.

113. J. Vidic, Ales Podgornik, Ales Strancar. Effect of the glass surface modification on the strength of methacrylate monolith attachment. // J. Chromatogr. A, 2005. V. 1065. P. 51-58.

114. Г. H. Химич, E. H. Рахматуллина, M. Ю. Слабоспицкая, Т. Б. Тенникова. Синтез и исследование поровой структуры полимерных монолитных сорбентов. // ЖПХ. 2005. Т. 78 (4). С. 623-628.

115. Т. А. Алфрей, Дж. Борер, Г. Марк. Сополимеризация. М: Издательство иностранной литературы, 1953. 266 с.

116. JI. Ф. Мерингова, Г. Ф. Леонтьева, Т. В. Гупалова, Т. Б. Тенникова, А. А. Тотолян. Выделение и исследование рекомбинантного IgG-связывающего рецептора стрептококка группы G с использованием макропористых дисков. // Биотехнология. 2000. Т. 4. С. 45-52.

117. С. Kasper, L. Meringova, R. Freitag, Т. Tennikova. Fast Isolation of Protein Receptors from Streptococci G by Means of Macroporous Affinity Disks. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 65. P. 65-72.

118. К. Наканиси. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М.: Мир, 1965.440 с.

119. P. Angenendt, J. Glokler, D. Murphy, H. Lehrach, D. J. Cahill. Toward optimized antibody microarrays: a comparison of current microarray support materials. // Anal. Biochem. 2002. V. 309. P. 253-260.

120. P.Angenendt, J. Glokler, J. Sobek, H. Lehrach, D. J. Cahill. Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications. II J. Chromatogr. A. 2003. V. 1009. P. 97-104.

121. S. Razzouk, J. C. Brunn, C. Qin, С. E. Туе, H. A. Goldberg, W. T. Butler. Osteopontin Posttranslatioanl Modications, Possibly Phosphorylation, Are Required for In Vitro Bone Resorption but Not Osteoblast Adhesion. // Bone. 2002. V. 30. P. 40-47.