Гетерологическая экспрессия, выделение и анализ эктодомена рецепторной тирозинкиназы IRR (insulin receptor-related receptor) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Можаев Андрей Александрович

• Можаев Андрей Александрович
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Можаев Андрей Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Тирозинкиназы

1.1. Нерецепторные тирозинкиназы

1.2. Рецепторные тирозинкиназы

1.2.1. Структура рецепторных тирозинкиназ

1.2.2. Механизм активации рецепторных тирозинкиназ

1.2.3. Внутриклеточная передача сигнала рецепторных тирозинкиназ

1.2.4. Инсулиновое семейство рецепторных тирозинкиназ

1.2.5. Рецептор, подобный инсулиновому рецептору

2. Гетерологическая экспрессия белков

2.1. Системы экспрессии

2.1.1. Прокариотические системы экспрессии

2.1.2. Эукариотические системы экспрессии

2.2. Векторы

3. Выделение и очистка рекомбинантных белков

4. Моноклональные антитела

4.1. Получение моноклональных антител

4.2. Применение моноклональных антител

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы

1.1. Реактивы

1.2. Сорбенты

1.3. Антитела

1.4. Клеточные линии

1.5. Растворы

1.6. Оборудование

2. Методы

2.1. Работа с нуклеиновыми кислотами

2.1.1. Создание генетических конструкции для экспрессии

2.1.2. Выделение геномной ДНК из CHO-K1

2.1.3. Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции

2.1.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.1.5. Секвенирование ДНК

3. Работа с эукариотическими клетками

3.1. Скрининг клеточной линии CHO-K1

3.2. Культивирование CHO-K1

3.3. Культивирование HEK293

3.4. Трансфекция эукариотических клеток методом липофекции

4. Работа с белками

4.1. Очистка

4.1.1. Подготовка культуральной среды к очистке

4.1.2. Анионообменная хроматография на DEAE-650

4.1.3. Гель фильтрация на HW-55F

4.1.4. Анионообменная хроматография на Mono Q

4.1.5. Гель-фильтрация на Superose

4.1.6. Аффинная хроматография на CNBr сефарозе 4B

4.1.7. Аналитическая гель фильтрация на Superose

4.2. Активация IRR-GFP

4.3. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле

4.4. Вестерн-блот

4.5. Спектрометрическое определение концентрации белка

4.6. Круговой дихроизм

4.7. Оценка гликозилирования

4.8. Масс-спектрометрия MALDI

4.9. Флуоресцентная микроскопия живых клеток

5. Работа с моноклональными антителами

5.1. Получение моноклональных антител

5.1.1. Иммунизация мышей

5.1.2. Получение гибридом

5.1.3. Выделение моноклональных антител

5.2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ

5.3. Определение изотипа моноклональных антител

5.4. Иммуноцитохимия

5.5. Активация и ингибирование моноклональными антителами

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Объект исследования

2. Система экспрессии

3. Культивирование CHO-K1

4. Очистка

5. Вестерн-блот

6. Аналитическая гель-фильтрация и гель-электрофорез

7. Масс-спектрометрический анализ выделенного препарата эктодомена IRR

8. Оценка уровня гликозилирования IRR

9. Анализ эктодомена IRR методом кругового дихроизма

10. Получение и очистка моноклональных антител

11. Определение изотипа моноклональных антител

12. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ

13. Иммуноцитохимия с моноклональными антителами

14. Доменное картирование участков связывания моноклональных антител

15. Оценка влияния моноклональных антител на активацию IRR

16. Создание системы гетерологической экспрессии полноразмерного IRR

V. ВЫВОДЫ

VI. БЛАГОДАРНОСТИ

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IRR - Insulin receptor-related receptor (рецептор, подобный рецептору инсулина); IR - Insulin receptor (рецептор инсулина);

IGF-IR - Insulin-like growth factor 1 receptor (рецептор инсулиноподобного фактора роста); IRS - Insulin receptor substrate (субстрат инсулинового рецептора); IGF-I - Insulin-like growth factor 1 (инсулиноподобный фактор роста 1); ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота;

PMSF - Phenylmethylsulfonyl fluoride (фенилметилсульфонилфторид);

PBS - Phosphate buffered saline (фосфатно-солевой буфер);

TBST - Tris-buffered saline with Tween 20 (Трис-солевой буфер с Твин 20);

ПЦР - Полимеразная цепная реакция;

ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота;

РНК - Рибонуклеиновая кислота;

кДНК - Комплементарная ДНК;

АТФ - Аденозинтрифосфат;

RTK - Receptor tyrosine kinases (рецепторные тирозинкиназы);

nRTKs - Non-receptor tyrosine kinases (нерецепторные тирозинкиназы);

EGF - Epidermal growth factor (фактор роста эпидермиса);

NGF - Nerve growth factor (фактор роста нервов);

FGF - Fibroblast growth factor (фактор роста фибробластов);

PDGF - Platelet-derived growth factor (тромбоцитарный фактор роста);

CHO - Chinese hamster ovary (клетки яичника китайского хомяка);

GMEM - Glasgow Minimum Essential Medium (минимальная основная среда Глазго);

DMEM - Dulbecco's modified Eagle's medium (модифицированная Дульбекко среда Игла);

FBS - Fetal bovine serum (бычья эмбриональная сыворотка);

dFBS - Dialyzed fetal bovine serum (диализованная бычья эмбриональная сыворотка);

FCS - Fetal calf serum (телячья эмбриональная сыворотка);

MSX - Methionine sulphoximine (метионин сульфоксимин);

ПААГ - Полиакриламидный гель;

SDS - Sodium lauryl sulfate (додецилсульфат натрия);

МА - Моноклональные антитела;

AKT - Протеинкиназа B;

IEC - Ion exchange chromatography (ионообменная хроматография);

SEC - Size exclusion chromatography (эксклюзивная хроматография);

UF - Ultra filtration (ультрафильтрация);

ПЭГ - Полиэтиленгликоль;

АОК - Антителообразующие клетки.

I. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гетерологическая экспрессия, выделение и анализ эктодомена рецепторной тирозинкиназы IRR (insulin receptor-related receptor)»

Актуальность работы.

Рецепторные тирозинкиназы - важное звено в системе передачи сигналов в клетке. Они имеют ключевое значение в процессах развития и жизнедеятельности организма, участвуют в управлении межклеточными взаимодействиями, пролиферацией и клеточной дифференцировкой, клеточной миграцией и метаболизмом, контроле клеточного цикла. Нарушения в работе данных рецепторов способны приводить к возникновению таких социально значимых заболеваний, как рак и диабет.

Для активации большинства рецепторных тирозинкиназ необходим лиганд белково-пептидной природы, способный взаимодействовать с внеклеточной частью (эктодоменом) рецептора одновременно в нескольких местах, приводя к его димеризации и активации, проявляющуюся в автофосфорилировании внутриклеточной части рецептора. Особенным является семейство рецептора инсулина, члены которого существуют изначально в виде димеров, связанных дисульфидными связями, а при взаимодействии внеклеточной части с лигандом меняют свою конформацию и активируются. В это семейство входит три рецептора: рецептор инсулина (IR, Insulin receptor), рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR, Insulin-like growth factor 1 receptor) и рецептор, подобный рецептору инсулина (IRR, Insulin receptor-related receptor). Поскольку все три рецептора высокогомологичны, логично предположить, что механизмы их активации схожи. Изучая механизм активации IRR, мы можем получить новые данные, позволяющие лучше понять механизмы активации IR и IGF-IR.

Физиологическая роль IRR долго оставалась загадкой, так как с момента его открытия для него не было обнаружено ни одного эндогенного лиганда, несмотря на многочисленные попытки, включая полный анализ генома. В нашей лаборатории было впервые продемонстрированно, что рецептор IRR представляет собой сенсор внеклеточной щелочной среды и принимает участие в регулировании кислотно-щелочного баланса в организме. Данный рецептор активируется при защелачивании внеклеточной среды выше pH 7.9, имеет точку 50% эффекта примерно pH 8.5 и выходит на насыщение при рН свыше 9.0. Рецептор экспрессируется в особых клеточных популяциях почек, желудка, поджелудочной железы, спинномозговых ганглиях. Активация IRR приводит к

фосфорилированию каскадных внутриклеточных белков IRS-1 и AKT, и приводит к перестройке клеточного цитоскелета.

Поскольку активация IRR определяется его внеклеточной частью (эктодоменом), выделение и изучение структуры эктодомена IRR представляет особый интерес для понимания фундаментальных основ механизма щелочной чувствительности, а также для развития в будущем новых терапевтических подходов и созданию лекарств для лечения заболеваний, связанных с нарушением кислотно-щелочного равновесия и патологий клеточного деления и дифференцировки, в частности, некоторых форм рака.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось получение эктодомена IRR для проведения структурных исследований. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Получить эффективную систему гетерологической экспрессии внеклеточной части IRR и подобрать оптимальные условия культивирования;

2. Разработать схему очистки внеклеточной части IRR до высокой чистоты;

3. Охарактеризовать выделенный белок спектральными и иммунохимическими методами;

4. Получить и охарактеризовать моноклональные антитела к внеклеточной части IRR.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработан эффективный протокол выделения и очистки внеклеточной части IRR до высокой чистоты. Выделенный белок охарактеризован спектральными (круговой дихроизм) и иммунохимическими методами.

К рекомбинантному эктодомену IRR получена панель из четырех моноклональных антител, которые охарактеризованы: иммуноферментным анализом, иммуноцитохимией, дана оценка влияния антител на активацию рецептора, определен изотип антител. Показано, что полученные антитела специфично взаимодействуют как с эктодоменом IRR, так и с полноразмерным рецептором, при этом одно из антител активирует, а другое ингибирует его аутофосфорилирование.

Данная диссертационная работа является частью комплексного проекта по расшифровке пространственной структуры рецепторной тирозинкиназы IRR проводимого

на базе ИБХ РАН. Разработанная схема очистки позволяет получать высокоочищенный эктодомен IRR в количестве, необходимом для проведения масштабных структурных исследований. В дальнейшем, расширение представлений о структурной организации IRR может использоваться в исследованиях механизма его активации, а также изучении механизмов активации его ближайших гомологов IR и IGF-IR.

Публикации и апробации работы.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах. Результаты настоящего исследования были представлены на следующих российских и международных конференциях: на V Международном съезде биохимиков и физиологов (Сочи-Дагомыс, РФ, 4-8 октября 2016 г.), на XXIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, РФ, 10-14 апреля 2017 г.), на 42 международном конгрессе FEBS (Иерусалим, Израиль, 10-14 сентября 2017 г.), на VIII Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Москва, РФ, 18-22 сентября 2017 г.), на 43 международном конгрессе FEBS (Прага, Чешская республика, 7-12 июля 2018 г.), на 14 конференции XTOP (Бари, Италия, 3-7 сентября 2018 г.).

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Тирозинкиназы.

Тирозинкиназы - ферменты группы фосфотрасфераз, осуществляющие катализ переноса фосфатного остатка от АТФ на гидроксильную группу тирозинового остатка специфичного белка [1, 2]. Фосфорилирование по остаткам тирозина контролирует широкий спектр свойств в белках, таких как активность ферментов, субклеточная локализация и взаимодействие между молекулами, а также имеет ключевое значение в таких процессах как дифференцировка, пролиферация, рост [3].

Фосфорилирование остатков тирозина является общим элементом путей передачи внутриклеточных сигналов, активируемых различными ростовыми факторами [4], цитокинами, нейротрансмиттерами [5].

В результате мутаций, некоторые тирозинкиназы способны становиться конститутивно активными, такое функциональное состояние может способствовать инициированию или прогрессированию рака. Тирозинкиназы задействованы в различных клеточных процессах и отвечают за ключевые события в организме. Активность тирозинкиназ в ядре включает контроль клеточного цикла и свойств транскрипционных факторов.

В зависимости от расположения в клетке и структуры, выделяют две большие группы тирозинкиназ: рецепторные и нерецепторные (рис. 1).

Рецепторные тирозинкиназы (RTKs - receptor tyrosine kinases) осуществляют передачу сигнала через мембрану, а нерецепторные тирозинкиназы (nRTKs - non-receptor tyrosine kinases) отвечают за проведение сигнала в ядро клетки [6].

Рисунок 1. Классификация тирозинкиназ по субсемействам.

1.1. Нерецепторные тирозинкиназы.

Нерецепторные тирозинкиназы находятся в цитоплазме клетки и в основном функционируют в комплексе с рецепторами. В настоящее время у позвоночных найдено порядка 32 nRTKs, которые разделили на 8 различных классов, выделенных на основе структурных и функциональных сходств и варьирующихся по молекулярной массе от 50 до 150 кДа. Данная группа тирозинкиназ регулирует рост клеток, пролиферацию, дифференцировку, адгезию, миграцию, апоптоз, а также они являются критическими компонентами в регуляции иммунной системы. nRTKs не имеют рецептор-подобных признаков, таких как внеклеточный лигандсвязывающий домен и трансмембранный участок. Одним из ключевых доменов является тирозинкиназный каталитический домен, который составляет порядка 275 аминокислотных остатков. Структуру каталитического домена можно разделить на малую долю, взаимодействующую с АТФ и большую долю, взаимодействующую с белковым субстратом. При связывании АТФ и субстрата, катализ переноса фосфатов происходит в расщелине между этими двумя долями. Помимо тирозинкиназного домена, nRTKs также обладают доменами, которые опосредуют белок-белковые, белок-липидные и белок-ДНК-взаимодействия [7] (рис.2).

Рисунок 2. Структурная организация субсемейств нерецепторных тирозинкиназ.

Основной функцией п^^ является осуществление передачи сигналов внутрь клетки от множества рецепторов, таких как рецепторы: эритропоэтина, пролактина, Т-клеток, ГЬ-2, B-клеток [8].

1.2. Рецепторные тирозинкиназы.

Рецепторные тирозинкиназы представляют собой трансмембранные белки. Насчитывается порядка 58 RTKs [9, 10], что составляет 10-15% от общего числа киназ в организме [11]. RTKs являются рецепторами для факторов роста, дифференциации и факторов, вызывающих внутриклеточные метаболические ответы.

Функции RTKs опираются на три основных свойства. Во-первых, экспрессия подавляющего большинства тирозинкиназных рецепторов осуществляется в определенном типе клеток в организме. Профили экспрессии зависят от регуляторных элементов в промоторной и энхансерной зоне гена тирозинкиназы. Во-вторых, в клетках, экспрессирующих определенный рецептор, его функция определяется связывающимся с его внеклеточным доменом лигандом и зависит от его доступности и распределения. В-третьих, ответ на лиганд-зависимую активацию RTKs в клетке зависит от протекающих внутриклеточных процессов. Второе и третье свойства отражают структурные отношения внутри рецепторных подсемейств [12].

Значительные изменения активности тирозинкиназ инициируются различными факторами, главным из которых является обратимое связывание с лигандом. Большинство RTKs, не активируются до тех пор, пока не свяжутся со специфичным лигандом. Активированные RTKs интернализируются (возвращаются обратно в систему) за короткий временной промежуток и в конечном итоге доставляются в лизосомы, где они расщепляются гидролазами. Интернализованные сигнальные комплексы играют разные роли в системах RTKs [13].

1.2.1. Структура рецепторных тирозинкиназ.

RTKs играют основную роль в управлении ростом, развитием и дифференцировкой клеток, имеют общий план строения и состоят из четырех основных частей [14]. Внеклеточная часть отвечает за связывание с лигандом, которое приводит к конформационным перестройкам и вызывает активацию внутриклеточной

тирозинкиназной части, которая определяет биологический ответ. Трансмембранная часть проходит через мембрану и связывает внеклеточную и внутриклеточную части.

На основании структуры RTKs делят по различным семействам [15]. Различие между семействами в основном проявляется в строении их внеклеточной части. Лиганд-связывающий домен состоит из различных последовательностей белков. Так, например, EGFR (epidermal growth factor receptor) имеет два Cys-богатых региона. Также родственные Cys-богатые регионы найдены в семействе инсулиновых рецепторов. Рецепторы семейства PDGFR (platelet-derived growth factor receptors) имеют пять или семь иммуноглобулиноподобных доменов (Ig). Подсемейство рецепторов FGFR (fibroblast growth factor receptors) имеет три Ig-подобных домена, но есть и те, у которых в результате альтернативного сплайсинга их два. Рецепторы NGFR (nerve growth factor receptors) содержат два Ig-подобных домена и Leu-богатый участок, который задействован в процессе адгезии клеток. AXL содержит два FnIn-(fibronectin Ш)-домена и два Ig-подобных домена.

Рисунок 3. Структурная организация субсемейств рецепторных тирозинкиназ.

У всех тирозинкиназ определен родственный каталитический домен, весьма похожий на тот, что отвечает за каталитическую активность у треонин- и серинкиназ. Довольно быстро был обнаружен лиганд, вызывавший быстрое автофосфорилирование тирозинкиназных рецепторов в EGF и PDGF, что позволило предположить важную роль тирозинового фосфорилирования в пролиферации факторов роста. Ключевым фактором для понимания того, как RTKs запускают внутриклеточный сигналинг, явилось то, что остатки фосфотирозина при активации рецепторов идентифицируются SH2 доменом [16]. Связывание белков, включающих Sffi-домен, с активированными тирозинкиназами в

мембране, важно для передачи сигналов внутри клетки. Белки с доменом SH2 могут иметь самые разнообразные функции и выступать в качестве адапторных белков, присоединяющих к себе другие сигнальные белки или в качестве ферментов, действующих на мембранные молекулы (такие, как фосфолипазы), а также в качестве цитоплазматических тирозинкиназ, ЕЗ-убиквитинлигаз и факторов транскрипции.

Последовательности по обе стороны домена и некоторые вставки в нем самом для его активности не требуются и не имеют функций, необходимых для фосфорилирования. Каталитический домен состоит из ~250 аминокислот [17]. В разных RTKs схожесть последовательностей аминокислот лежит в области от 32 до 95%. Было выяснено, что во всех известных киназных рецепторах есть 13 общих для них областей. Есть также некоторые другие остатки, которые можно считать инвариантными, если исключить дивергентные нуклеотидные последовательности тирозинкиназ, происходящих от низших организмов.

1.2.2. Механизм активации рецепторных тирозинкиназ.

Механизм связывания лиганда и активация тирозинкиназ мало изучен. Общепринятой считается модель, в которой связывание с лигандом вызывает димеризацию рецепторов, а затем активацию [18, 4].

В случае таких лигандов, как PDGF, представляющих собой димеры, каждый мономер лиганда может связываться с рецептором и приводить к образованию димера рецептора. Но существуют и мономерные лиганды, такие как EGF, для которых нужно два раных места связывания с рецептором.

Известны рецепторы, которые димеризуются до связывания с лигандом - это представители инсулинового семейства тирозинкиназ. Эти рецепторы образуют (а-Р)2-димер, который при взаимодействии с лигандом претерпевает конформационное изменение в своем исходном состоянии. Есть данные о том, что некоторые RTKs, такие как ^е2, для своей активации требуют образования более крупных олигомеров [19]. Также существует предположение, что у некоторых рецепторов в образовании димера участвуют трансмембранные альфа-спирали. Механизмы димеризации широко изучались с момента первого упоминания о взаимодействии тирозинкиназного рецептора с

лигандом. Выяснилось, что каждое подсемейство рецепторов активируется и взаимодействует со своими лигандами в общем случае по-разному.

Домен Ig-C2 рецептора фактора роста нервов взаимодействует с двумя цепями димера NGF без контакта между рецепторами в димере [20]. Димер фактора роста стволовых клеток взаимодействует с двумя рецепторами KIT, где каждая молекула лиганда связывается с одной молекулой рецептора. После взаимодействия домены D1 -D3 не меняют свою конформацию, а только перекрещиваются, что приводит к структурной перестройке примембранных доменов D4 и D5, которые ориентируют димер рецептора [21]. Рецептор фактора роста фибробластов связывается с лигандом и дополнительным стабилизатором - гепарином [22]. Рентгеноструктурный анализ комплекса показал, что каждая молекула рецептора контактирует с лигандом и гепарином приводя к стабилизации комплекса [23]. На рецепторе ErbB показано, что EGF связывается с одной молекулой рецептора в двух местах [24].

Прикрепление лиганда ведет к стабилизации определенного конформационного отношения между молекулами димера или внутри мономерного рецептора - как было описано выше, для разных рецепторов оно происходит по-разному. Из-за изменения конформации внеклеточных доменов происходит активация тирозинкиназных областей рецептора. Все каталитические домены имеют N-часть и С-часть. Структуры активированных форм каталитических доменов у всех изученных тирозинкиназ очень похожи. Ключевые регуляторные элементы - активационная петля и альфа-С-спираль в киназной N-части. В активированном рецепторе они занимают положение, которое позволяет протекать реакции автофосфорилирования [25]. Напротив, в разных рецепторах строение инактивированных тирозинкиназных доменов абсолютно различно. Каждый из них по-своему цис-автоингибирован набором внутримолекулярных взаимодействий. После димеризации рецептора под действием лиганда, происходит освобождение от цис-ингибирования и запускается активация тирозинкиназы.

Автоингибирование тирозинкиназного рецептора было впервые продемонстрировано на примере инсулинового рецептора. Ключевой тирозин Y1162, расположенный на активационной петле, входит в активный сайт рецептора таким образом, что он оказывается словно автофосфорилирован своим собственным киназным доменом (т.е. в цис-положении). Это взаимодействие стабилизирует конфигурацию,

которая выключает активный сайт, блокирует доступ АТФ и белковых субстратов. Когда инсулин активирует рецептор, тирозин Y1162 в одном из рецепторов, входящих в димер, оказывается вместе с двумя соседними тирозинами фосфорилирован своим партнером (крест-накрест). Таким образом, транс-фосфорилирование убирает цис-ингибиторные взаимодействия. Альфа-С-спираль в N-части домена также переориентируется, что позволяет высвободить сайт связывания АТФ. Фосфорилирование активационной петли ключевой момент активации киназ, так как приводит к стабилизации активированной конфигурации [25].

Автофосфорилирование способствует повышению каталитической активности рецептора в 50-200 раз. Проводились исследования с мутантными тирозинкиназными рецепторами, у которых была подавлена фосфорилирующая активность. При совместной экспрессии с диким типом, сигналы дикого типа RTKs подавлялись в прямо пропорциональной зависимости от концентрации мутанта. Подавление происходило из-за того, что рецепторы-мутанты могут образовывать димеры с киназами дикого типа и фосфорилироваться, но они в свою очередь не могут фосфорилировать киназу-партнера. Этот результат также подтвердил тот факт, что после трансфосфорилирования происходит вторичное конформационное изменение, которое позволяет каталитическому домену фосфорилировать молекулы субстрата. Только после этого происходит собственно фосфорилирование тирозинов, которое и служит катализатором фосфорилирования цитоплазматических субстратов.

Показано, что автофосфорилирование происходит в транс-положении, после чего сайты фосфорилирования активируются в строгом порядке. Например, в инсулиновом рецепторе и IGF-I тирозинкиназы фосфорилируются абсолютно одинаково: Y1162, Y1158 и после них Y1163 (нумерация по инсулиновому рецептору) [26].

Первый ответ на автофосфорилирование RTKs - рекрутинг и активация набора нисходящих сигнальных молекул. Эти молекулы содержат SH2 или PTB-домены, которые специфически связываются с фосфотирозином. Они могут как непосредственно связываться с рецептором, так и использовать для этого посадочные docking-белки [23]. К таким белкам относятся, например, FRS-II, IRS-I или GAB-I. Фосфорилирование посадочных белков функционально эквивалентно второй фазе автофосфорилирования рецептора. Они обычно содержат сайт посадки на мембрану (membrane targeting) на их

N-конце и ряд сайтов фосфорилирования тирозина, которые служат местом посадки для тех самых нисходящих сигнальных белков. Некоторые docking-белки (например, Gab-I) могут присоединяться ко многим RTKs, но большая часть зарезервирована на определенные подмножества рецепторов. Например, два члена семейства FRS2 (FRS2a и FRS2P) являются медиаторами сигналов для рецепторов FGF и NGF [23]. Четыре члена семейства IRS (IRS1-4) играют важнейшие роли в передаче сигналов инсулина и рецептора IGF-I, которые целиком полагаются на эти docking-белки при рекрутинге нисходящих сигнальных молекул.

Таким образом, активированные тирозинкиназные рецепторы являются важнейшим узлом передачи сигналов снаружи клетки во внутриклеточное пространство.

1.2.3. Внутриклеточная передача сигнала рецепторных тирозинкиназ.

Первыми известными Sffi-доменсодержащими белками были Ras-факторы обмена и MAP-киназы. Предполагалось, что RTK участвуют в линейных транспортных сигнальных путях, в качестве гипотезы приводился путь RTK-Grb2-Sos-Ras/MAPK. Некоторые эксперименты подтверждали правоту этой гипотезы [27]. Впрочем, некоторые факты указывали на то, что сигнальный путь должен быть более сложным и разветвленным. Один из таких факторов - тирозинкиназные рецепторы имеют много (512) сайтов автофосфорилирования, на каждый из которых способен сесть SH2 или PTB-доменсодержащий белок. Во-вторых, адаптерные белки могут взаимодействовать с большим количеством сигнальных молекул. Более того, с развитием методов биохимического анализа стало понятно, что ранее считавшиеся линейными пути оказались тесно переплетенными в сложную динамическую сеть сигнальных молекул, причем RTKs в них оказались отведены ключевые регуляторные узлы.

Для понимания функционирования сигнальных путей необходимо не только знать их непосредственных участников и уметь предсказывать качественно компоненты, их активирующие, но и количественно понимать, как работает сигнальная сеть в целом. Подобные опыты проводились даже на ранних стадиях изучения RTKs. Были получены, в частности, выводы о том, что активация заданного рецептора лигандом может быть разнообразна в зависимости от уровня экспрессии RTK и кинетических зависимостей активации. Впрочем, не зная динамики процесса и понимания того, насколько широко

разветвляется эта сеть, сложно предсказать результат сигнального процесса даже качественно. Ключевым пунктом для понимания подобных процессов стали механизмы положительной и отрицательной обратной связи.

Положительная обратная связь повышает чувствительность к входящим сигналам, усиливая входящие стимулы. Это может приводить к «двустабильности» [28] или «переключателеподобному» состоянию, в котором процесс может колебаться между двумя состояниями. Отрицательная обратная связь в сетях служит для подавления шума, что предотвращает возможную, но стохастически малую вероятность рецептора активироваться без участия лиганда. Также отрицательная обратная связь служит для поддержания ширины канала - ответ рецептора должен оставаться постоянным для большого количества входящих сигналов.

Циклы фосфорилирования\дефосфорилирования - универсальный мотив в клеточной передаче сигнала [28]. Автофосфорилирование обратимо - обратный процесс регулируется тирозинфосфатазами (PTP). Таким образом, активация RTK может происходить благодаря лиганд-стимулированной киназной активности, лиганд-ингибированной фосфатазной активности или же благодаря им обеим. Подобный механизм может быть применителен к тирозинкиназным рецепторам в качестве положительной обратной связи.

Механизмы отрицательной обратной связи работают на разных участках сигнальной сети, контролируемой RTK. Одним из примеров служит прямая активация фосфатаз. Всего в геноме человека 108 тирозинфосфатаз (protein tyrosine phosphatase, PTP). Они снимают фосфатную группу с тирозина, дефосфорилируя его. Ни тирозинкиназы, ни фосфатазы не имеют каких-то специфичных предпочтений в плане последовательностей, окружающих тирозиновую мишень, хотя есть киназы, обращающие внимание на 4 прилегающих аминокислоты. Специфичность тирозинкиназ определяется вторичным взаимодействием с потенциальными субстратами и клеточным окружением. То же самое верно и для фосфатаз: лишь малая их часть имеет сайт для вторичного взаимодействия. Кроме того, нет однозначного соответствия киназ и фосфатаз.

Сигнальная специфичность каждой тирозинкиназной рецепторной системы определяется последовательностями, прилегающими к сайтам фосфорилирования

тирозинов на рецепторе или связанных с ним субъединицах. Фосфорилированные остатки опознаются белками из семейств SH2\PTB. Специфический клеточный ответ зависит от комбинации сигнальных путей, активируемых SH2\PTB, и включает цитоплазматический и ядерный ответ. Важные клеточные сигнальные пути, активируемые тирозинкиназами -Ras\ERK MAP киназный каскад и PI-3 киназный путь. Все они были открыты при непосредственном изучении тирозинкиназ.

1.2.4. Инсулиновое семейство рецепторных тирозинкиназ.

В состав этого семейства входит три рецептора: рецептор инсулина (IR - insulin receptor), рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R - insulin-like growth factor 1 receptor) и рецептор, подобный рецептору инсулина (IRR - insulin receptor-related receptor).

Мономер рецептора инсулина кодируется 22 экзонами, при этом синтезируется с сигнальным пептидом из 27 а.о., гликозилируется, димеризуется, а затем протеолизируется во время транспорта к мембране. Два остатка цистеина в рецепторе инсулина ответственны за дополнительные дисульфидные связи, участвующие в формировании димера.

IR, IGF-1R и IRR отличаются от других тирозинкиназных рецепторов тем, что они являются ковалентно связанными димерами в отсутствии лиганда, тогда как все остальные тирозинкиназные рецепторы ди- или олигомеризуются лишь в ответ на связывание лиганда, в результате чего происходит активация киназ за счёт фосфорилирования. Тирозинкиназный домен IRR имеет высокий уровень гомологии с IR и IGF-IR, 79% и 81%, соответственно. Наибольшее разнообразие в пределах семейства наблюдается на хвосте С-конца, с наибольшей дивергенцией в IRR. С-конец IRR на 69 или 76 аминокислотных остатков короче, чем у IR или IGF-1R, соответственно. Этот участок на С-конце IR и IGF-1R, что отсутствует у IRR, включает сайты тирозинового и серин/треонинового фосфорилирования, которые играют определённые роли в клеточных сигнальных каскадах.

Внеклеточная часть этих рецепторов состоит из нескольких доменов. В а-субъединице от N- к С-концу располагаются два лейцин-богатых домена, именуемых L1 и L2, которые, в свою очередь, разделены цистеин-богатым доменом. За этим блоком

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Можаев Андрей Александрович, 2019 год

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Cox M., Nelson D. Lehninger: Principles of Biochemistry (fifth ed.). W H Freeman & Co. 2008.

2. Hanks SK, Quinn AM, Hunter T. The protein kinase family: conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science. 1988. 241 (4861): 42-52.

3. Radha V, Nambirajan S, Swarup G. Association of Lyn tyrosine kinase with the nuclear matrix and cell-cycle-dependent changes in matrix-associated tyrosine kinase activity. European Journal of Biochemistry. 236 (2): 352-9.

4. Schlessinger J., Ullrich A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 1992. 9(3):383-91.

5. Bading H., Greenberg M.E. Stimulation of protein tyrosine phosphorylation by NMDA receptor activation. Science. 1991. 253(5022):912-4.

6. Ruetten H, Thiemermann C. Effects of tyrphostins and genistein on the circulatory failure and organ dysfunction caused by endotoxin in the rat: a possible role for protein tyrosine kinase. British Journal of Pharmacology. 1997. 122 (1): 59-70.

7. Lemmon M.A., Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 2010. 141(7):1117-34.

8. Weiss A, Littman DR. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell. 1994. 76 (2): 263-74.

9. Manning, Duim et al. Evidence for a genetically stable strain of Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol. 2001. 67(3):1185-9.

10. Robinson D.R., Wu Y.M., Lin S.F. The protein tyrosine kinase family of the human genome. Oncogene. 2000. 19(49):5548-57.

11. Plowman, Sudarsanam et al. The protein kinases of Caenorhabditis elegans: a model for signal transduction in multicellular organisms. Proc Natl Acad Sci USA. 1999. 96(24):13603-10.

12. Van der Geer, Hunter et al. Receptor protein-tyrosine kinases and their signal transduction pathways. Annu Rev Cell Biol. 1994. 10:251-337.

13. Wiley H.S., Burke P.M. Regulation of receptor tyrosine kinase signaling by endocytic trafficking. Traffic. 2001. 2 (1): 12-8.

14. Cadena, Gill, Receptor tyrosine kinases. FASEB J. 1992. 6(6):2332-7.

15. Heldin, Segaliny et al. Receptor tyrosine kinases: Characterisation, mechanism of action and therapeutic interests for bone cancers. Bone Oncology. 2015. 23:4 (1):1-12.

16. Pawson T. Specificity in signal transduction: from phosphotyrosine-SH2 domain interactions to complex cellular systems. Cell. 2004. 23;116(2):191-203.

17. Maldonado and Hanks A. cDNA clone encoding human cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit C alpha. Nucleic Acids Res. 1988. 16(16):8189-90.

18. Ullrich, Schlessinger. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell. 1990. 61(2):203-12.

19. Himanen and Nikolov. Eph signaling: a structural view. Trends Neurosci. 2003. 26(1):46-51.

20. Wehrman He et al. Structural and mechanistic insights into nerve growth factor interactions with the TrkA and p75 receptors. Neuron. 2007. 53(1):25-38.

21. Yuzawa, Opatowsky et al. Structural basis for activation of the receptor tyrosine kinase KIT by stem cell factor. Cell. 2007. 130(2):323-34.

22. Plotnikov, Schlessinger et al. Structural basis for FGF receptor dimerization and activation. Cell. 1999. 98(5):641-50.

23. Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 2000. 103(2):211-25.

24. Ferguson, Berger et al. EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibit ectodomain dimerization. Mol Cell. 2003. 11(2):507-17.

25. Nolen, Taylor et al. Regulation of protein kinases; controlling activity through activation segment conformation. Mol Cell. 2004. 15(5):661-75.

26. Favelyukis, Till et al. Structure and autoregulation of the insulin-like growth factor 1 receptor kinase. Nat Struct Biol. 2001. 8(12):1058-63.

27. Noselli and Perrimon Signal transduction. Are there close encounters between signaling pathways? Science. 2000 Oct 6:290(5489):68-9.

28. Kholodenko B.N. Cell-signalling dynamics in time and space, Nat Rev Mol Cell Biol. 2006. 7(3):165-76.

29. Geffner, M.E., Bailey, R.C, Bersch, N., Vera, J.C. & Golde, D.W., Insulin-like growth factor-I unresponsiveness in an Efe Pygmy., Biochem Biophys Res Commun. 1993. 193(3):1216-23.

30. Shier, P., and Watt, V.M. Primary structure of a putative receptor for a ligand of the insulin family. J. Biol. Chem. 1989. 264:14605-14608.

31. Ullrich, A., Bell, J.R., Chen, E.Y., Herrera, R., Petruzzelli, L.M., Dull, T.J., Gray, A., Coussens, L., Liao, Y.C., Tsubokawa, M., et al. Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Nature. 1985. 313:756-761.

32. Ullrich, A., Gray, A., Tam, A.W., Yang-Feng, T., Tsubokawa, M., Collins, C., Henzel, W., Le Bon, T., Kathuria, S., Chen, E., et al. Insulin-like growth factor I receptor primary structure: comparison with insulin receptor suggests structural determinants that define functional specificity. EMBO J. 1986. 5:2503-2512.

33. De Meyts, P. Insulin and insulin-like growth factors: the paradox of signaling specificity. Growth Horm. IGF Res. 2002. 12:81-83.

34. Jui, H.Y., Suzuki, Y., Accili, D., and Taylor, S.I. Expression of a cDNA encoding the human insulin receptor-related receptor. J. Biol. Chem. 1994. 269:22446-22452.

35. Zhang, B., and Roth, R.A. The insulin receptor-related receptor. Tissue expression, ligand binding specificity, and signaling capabilities. J. Biol. Chem. 1992. 267:1832018328.

36. Dissen, G.A., Garcia-Rudaz, C., Tapia, V., Parada, L.F., Hsu, S.Y., and Ojeda, S.R. Expression of the insulin receptor-related receptor is induced by the preovulatory surge of luteinizing hormone in thecal-interstitial cells of the rat ovary. Endocrinology. 2005. 147:155-165.

37. Hirayama, I., Tamemoto, H., Yokota, H., Kubo, S.K., Wang, J., Kuwano, H., Nagamachi, Y., Takeuchi, T., and Izumi, T. Insulin receptor-related receptor is expressed in pancreatic beta-cells and stimulates tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1 and -2. Diabetes. 1999. 48:1237-1244.

38. Mathi, S.K., Chan, J., and Watt, V.M. Insulin receptor-related receptor messenger ribonucleic acid: quantitative distribution and localization to subpopulations of epithelial cells in stomach and kidney. Endocrinology. 1995. 136:4125-4132.

39. Tsujimoto, K., Tsuji, N., Ozaki, K., Ohta, M., and Itoh, N. Insulin receptor-related receptor messenger ribonucleic acid in the stomach is focally expressed in the enterochromaffin-like cells. Endocrinology. 1995. 136:558-561.

40. Kelly-Spratt, K.S., Klesse, L.J., Merenmies, J., and Parada, L.F. A TrkB/insulin receptor-related receptor chimeric receptor induces PC12 cell differentiation and exhibits prolonged activation of mitogen-activated protein kinase. Cell Growth Differ. 1999. 10:805-812.

41. Kelly-Spratt, K.S., Klesse, L.J., and Parada, L.F. BDNF activated TrkB/IRR receptor chimera promotes survival of sympathetic neurons through Ras and PI-3 kinase signaling. J. Neurosci. Res. 2002. 69:151-159.

42. Klammt, J., Garten, A., Barnikol-Oettler, A., Beck-Sickinger, A.G., and Kiess, W. Comparative analysis of the signaling capabilities of the insulin receptor-related receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. 327:557-564.

43. Kitamura, T., Kido, Y., Nef, S., Merenmies, J., Parada, L.F., and Accili, D. Preserved pancreatic beta-cell development and function in mice lacking the insulin receptor-related receptor. Mol. Cell. Biol. 2001. 21:5624-5630.

44. Deyev IE, Sohet F, Vassilenko KP, Serova OV, Popova NV, Zozulya SA, Burova EB, Houillier P, Rzhevsky DI, Berchatova AA, Murashev AN, Chugunov AO, Efremov RG, Nikol'sky NN, Bertelli E, Eladari D, Petrenko AG. Insulin receptor-related receptor as an extracellular alkali sensor. Cell Metab. 2011. 13:679-689.

45. Hernández-Sánchez C., Mansilla A., Pablo F., Zardoya R. Evolution of the insulin receptor family and receptor isoform expression in vertebrates. Mol Biol Evol. 2008. 25(6):1043-1053.

46. Rentería ME, Gandhi NS, Vinuesa P, Helmerhorst E, Mancera RL. A comparative structural bioinformatics analysis of the insulin receptor family ectodomain based on phylogenetic information. PLoS One. 2008. 3(11):3667.

47. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 1999. 10(5): 411-21.

48. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol. Biotechnol. 2000. 16 (1):23-52.

49. Malys N, Wishart JA, Oliver SG, McCarthy JE. Protein production in Saccharomyces cerevisiae for systems biology studies. Methods Enzymol. 2011. 500:197-212.

50. Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R, Bartels J, Visser J, Sinitsyn AP, Emalfarb MA, Verdoes JC, Wery J. Development of a mature fungal

technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1. Indust. Biotechnol. 2011. 7:214-223.

51. Altmann F, Staudacher E, Wilson IB, März L. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycoconjugate J. 1999. 16 (2):109-23.

52. Kost TA, Condreay JP. Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells. Curr. Opin. Biotechnol. 1999. 10: 428-33.

53. Gellissen G (ed.). Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukarytoic Expression Systems: Wiley-VCH. 2005. 429.

54. Balamurugan V, Sen A, Saravanan P, Singh RK. Biotechnology in the Production of Vaccine or Antigen for animal health. J. Anim. Vet. Adv. 2006. 5(6):487-495.

55. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. Recombinant DNA, W.H. Freeman & Co Ltd. 1992.

56. Gellissen G. Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukarytoic Expression Systems: Wiley-VCH. 2005.

57. Snustad DP, Simmons MJ. Principles of Genetics, Wiley. 2010.

58. Brown TA. Gene cloning and DNA Analysis, An Introduction. Blackwell Publishing. 2006. 277-301.

59. Jung E, Williams KL. The production of recombinant glycoproteins with special reference to simple eukaryotes including Dictyostelium discoideum. Biotechnol. Appl. Biochem. 1997. 25:3-8.

60. Leonhartsberger S. E. coli Expression System Efficiently Secretes Recombinant Proteins into Culture Broth. BioProcess International. 2006.

61. Daly R, Hearn MT. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production, J Mol Recognit. 2005. 18:11938.

62. Glick BR, Pasternak JJ, Patten CL. Molecular Biotechnology, Washington, American Society for Microbiology. 2010.

63. DiMiceli L, Pool V, Kelso JM, Shadomy SV, Iskander J. Vaccination of yeast sensitive individuals: review of safety data in the US vaccine adverse event reporting system (VAERS). Vaccine. 2006. 24: 703-707.

64. Antoniukas L, Grammel H, Reichl U. Production of Hantavirus Puumala nucleocapsid protein in Saccharomyces cerevisiae for vaccine and diagnostics. J. Biotechnol. 2006. 124:347-362.

65. Bill RM. Recombinant protein subunit vaccine synthesis in microbes: A role for yeast? J. Pharm. Pharmacol. 2015. 67(3):319-28.

66. Balamurugan V, Reddy GR, Suryanarayana VVS. Pichia pastoris: a notable heterologous expression system for the production of foreign proteins-Vaccine. Indian J. Biotech. 2007. 6:175-186.

67. Wildt S, Gerngross TU. The humanization of Nglycosylation pathways in yeast. Nat. Rev. Microbiol. 2005. 3:119-128.

68. Landowski CP, Mustalahti E, Wahl R, Croute L, Sivasiddarthan D, Westerholm-Parvinen A, Sommer B, Ostermeier C, Helk B, Saarinen J, Saloheimo M. Enabling low cost biopharmaceuticals: high level interferon alpha-2b production in Trichoderma reesei. Microb. Cell Fact. 2016. 15(1):104.

69. Su X, Schmitz G, Zhang M, Mackie RI, Cann IK. Heterologous gene expression in filamentous fungi. Adv. Appl. Microbiol. 2012. 81: 1-61.

70. Balamurugan V, Sen A, Saravanan P, Singh RK. Biotechnology in the Production of Vaccine or Antigen for animal health. J. Anim. Vet. Adv. 2006. 5(6):487-495.

71. Smagghe G, Goodman CL, Stanley D. Insect cell culture and applications to research and pest management. In vitro cellular & developmental biology. Anim. 2009. 45:93-105.

72. Van Oers MM, Lynn DE. Insect Cell Culture in Encycopledia of Life Science. Elsevier. 2010.

73. Bouma A, de Smit AJ, de Kluijver EP, Terpstra C, Moormann RJ. Efficacy and stability of a subunit vaccine based on glycoprotein E2 of classical swine fever virus. Vet. Microbiol. 1999. 66: 101-114.

74. Van Rijn PA, van Gennip HG, Moormann RJ. An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2 of classical swine fever virus (CSFV). Vaccine. 1999. 17:433-440.

75. Sari D, Gupta K, Raj DB, Aubert A, Drncova P, Garzoni F, Fitzgerald D, Berger I. The MultiBac Baculovirus/ Insect Cell Expression Vector System for Producing Complex Protein Biologics. Adv. Exp. Med. Biol. 2016. 896:199-215.

76. Kost TA, Condreay JP. Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells. Curr. Opin. Biotechnol. 1999. 10:428-33.

77. Marheineke K, Grünewald S, Christie W, Reiländer H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Lett. 1998. 441:49-52.

78. Donald L Jarvis. Developing baculovirus-insect cell expression systems for humanized recombinant glycoprotein production. Virol. 2003. 310:1-7.

79. Chen Q, Davis KR. The potential of plants as a system for the development and production of human biologics. F1000Res. 2016. 19: 5.

80. Wang Y., Zhao S, Bai L, Fan J, Liu E. Expression systems and species used for transgenic animal bioreactors. Biomed. Res. Int. 2013. 1-9.

81. Yin J., Guangxing Li, Xiaofeng Ren, Georg Herrler. Select what you need: A comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes. J. Biotechnol. 2007. 127:335-347.

82. Khan K.H. Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications. Adv. Pharm. Bull. 2013. 3: 257-263.

83. Geisse S., Gram H., Kleuser B., Kocher H.P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 1996. 8:271-282.

84. Castro P.V., de Freitas M.C., Bomfim Ade S, de Sousa Russo E.M. Patents in therapeutic recombinant protein production using mammalian cells. Recent Pat. Biotechnol. 2014. 8(2):165-71.

85. Nagpal M.L., Chen Y., Lin T. Effects of overexpression of CXCL10 (cytokine-responsive gene-2) on MA-10 mouse Leydig tumor cell steroidogenesis and proliferation. J. Endocrinol. 2004. 183: 585-594.

86. Griffin T.J., Seth G., Xie H., Bandhakavi S., Hu W.S. Advancing mammalian cell culture engineering using genome-scale technologies. Trends Biotechnol. 2007. 25(9):401-8.

87. Lee J.S., Park H.J., Kim Y.H., Lee G.M. Protein reference mapping of dihydrofolate reductase-deficient CHO DG44 cell lines using 2-dimensional electrophoresis. Proteomics. 2010. 10(12):2292-302.

88. Wurm F.M., Hacker D. First CHO genome. Nat Biotechnol. 2011. 29(8):718-20.

89. Huh S.H., Do H.J., Lim H.Y., Kim D.K., Choi S.J., Song H., et al. Optimization of 25 kDa linear polyethylenimine for efficient gene delivery. Biologicals. 2007. 35(3):165-71.

90. Boyce FM, Bucher NL. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 93(6):2348-52.

91. Dukkipati A., Park H.H., Waghray D., Fischer S., Garcia K.C. BacMam system for highlevel expression of recombinant soluble and membrane glycoproteins for structural studies. Protein Expr Purif. 2008. 62(2):160-70.

92. Verma R., Boleti E., George A.J. Antibody engineering: comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J Immunol Methods. 1998. 216(1-2):165-81.

93. Paborsky L.R., Fendly B.M., Fisher K.L., Lawn R.M., Marks B.J., Mccray G., et al. Mammalian cell transient expression of tissue factor for the production of antigen. Protein Eng. 1990. 3(6):547-53.

94. Gorman C.M., Gies D.R., McCray G. Transient production of proteins using an adenovirus transformed cell line. DNA Prot Eng Tech. 1990. 2:1-28.

95. Jalah R., Rosati M., Kulkarni V., Patel V., Bergamaschi C., Valentin A., et al. Efficient systemic expression of bioactive IL-15 in mice upon delivery of optimized DNA expression plasmids. DNA Cell Biol. 2007. 26(12):827-40.

96. Solomon A., Weiss D.T., Wall J.S. Therapeutic potential of chimeric amyloid-reactive monoclonal antibody 11-1F4. Clin Cancer Res. 2003. 9:3831S-8S.

97. Bebbington C.R., Renner G., Thomson S., King D., Abrams D., Yarranton G.T. Highlevel expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 1992. 10(2):169-75.

98. Birch JR., Racher A.J. Antibody production. Adv Drug Deliv Rev. 2006. 58(5-6):671-85.

99. Kober L., Zehe C., Bode J. Optimized signal peptides for the development of high expressing CHO cell lines. Biotechnol Bioengin. 2013. 110:1164-1173.

100. Stern B., Olsen L.C., Trobe C., Ravneberg H., Pryme I.F. Improving mammalian cell factories: the selection of signal peptide has a major impact on recombinant protein synthesis and secretion in mammalian cells. Trends Cell Mol Biol. 2007. 2:1-17.

101. Frenzel A., Hust M., Schirrmann T. Expression of recombinant antibodies. Front Immunol. 2013. 4:217.

102. Liu H.F., Ma J., Winter C., and Bayer R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production mAbs. 2010. 2(5):480-499.

103. Jiskoot W., Van Hertrooij, Gebbinck T., Van der Velden-de Groot, Crommelin D.J.A., and Beuvery EC. Two-step purification of a murine monoclonal antibody intended for therapeutic application in man. optimisation of purification conditions and scaling up. Journal of Immunological Methods. 1989. 124(1):143-156.

104. Chatterjee S., Schoepe J., Lohmer S., and Schomburg D. High level expression and single-step purification of hexahistidinetagged L-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase making use of a versatile expression vector set. Protein Expression and Purification. 2005. 39(2):137-143.

105. Hage D.S. Affinity chromatography: a review of clinical applications. Clinical Chemistry. 1999. 45(5):593-615.

106. Einhauer A. and Jungbauer A., The FLAGU peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2001. 49(1-3):455-465.

107. Schmidt T.G.M. and Skerra A. The random peptide library assisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment. Protein Engineering. 1993:6(1):109-122.

108. Witte C.P., Gielbert J., Parker J.E. and Romeis T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Molecular Biology. 2004. 55(1):135-147.

109. Duellman S.J., Thompson N.E., and Burgess R.R. An epitope tag derived from human transcription factor IIB that reacts with a polyol-responsive monoclonal antibody. Protein Expression and Purification. 2004. 35(1):147-155.

110. Thompson N.E., Arthur T.M., and Burgess R.R. Development of an epitope tag for the gentle purification of proteins by immunoaffinity chromatography: application to epitope-tagged green fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 2003. 323(2):171-179.

111. Chatterjee D.K. and Esposito D. Enhanced soluble protein expression using two new fusion tags," Protein Expression and Purification. 2006. 46(1):122-129.

112. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 2003. 60(5):523-533.

113. Raines R.T., McCormick M., Van Oosbree T.R., and Mierendorf R.C. The S.tag fusion system for protein purification. Methods in Enzymology. 2000. 362-376.

114. Stubenrauch K., Bachmann A., Rudolph R., and Lilie H. Purification of a viral coat protein by an engineered polyionic sequence. Journal of Chromatography B. 2000. 737(1-2):77-84.

115. Green E.A., Botting C., Webb H.M., Hirst T.R., and Randall RE. Construction, purification and immumogenicity of antigen-antibody-LTB complexes. Vaccine. 1996. 14(10):949-958.

116. Wyborski D.L., Bauer J.C., Zheng C.F., Felts K., and Vaillancourt P. An Escherichia coli expression vector that allows recovery of proteins with native N-termini from purified calmodulin-binding peptide fusions. Protein Expression and Purification. 1999. 16(1):1-10.

117. Scheich C., Sievert V., and Bussow K. An automated method for high-throughput protein purification applied to a comparison of His-tag and GST-tag affinity chromatography. BMC Biotechnology. 2003. 3(12).

118. Eliseev R., Alexandrov A., and Gunter T. High-yield expression and purification of p18 form of Bax as an MBP-fusion protein. Protein Expression and Purification. 2004. 35(2):206-209.

119. Brown L., Yin J.L., and Hambly B. Direct cloning of polymerase chain reaction products into the pinpoint Xa1-T vector protein expression system. Electrophoresis. 1998. 19(5):860-866.

120. Kavoosi M., Meijer J., Kwan E., Creagh A. L., Kilburn D.G., and Haynes C.A. Inexpensive one-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with the family 9 carbohydrate-binding module of xylanase 10A from T. maritima. Journal of Chromatography B. 2004. 807(1):87-94.

121. Xu Z., Li J., and Zhou J. X. Process development for robust removal of aggregates using cation exchange chromatography in monoclonal antibody purification with

implementation of quality by design. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 2012. 42(2):183-202.

122. Yigzaw Y., Hinckley P., Hewig A., and Vedantham G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Current Pharmaceutical Biotechnology. 2009. 10(4):421-426.

123. Arakawa T., Tsumoto K., Nagase K., and Ejima D., The effects of arginine on protein binding and elution in hydrophobic interaction and ion-exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 2007. 54(1):110-116.

124. Yang Y., Hebron H. R., and Hang J. High performance DNA purification using a novel ion exchange matrix. Journal of Biomolecular Techniques. 2008. 19(3):205-210.

125. Regnier F.E. High-performance liquid chromatography of biopolymer. Science. 1983. 222(4621):245-252.

126. Stulik K., Pacakova V., and Ticha M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2003. 56(1-3):1-13.

127. Welling G.W., Groen G., Slopsema K., and Welling-Wester S. Combined size-exclusion and reversed-phase highperformance liquid chromatography of a detergent extract of Sendai virus. Journal of Chromatography A. 1985. 326:173-178.

128. Bhut B.V., Christensen K.A., and Husson S.M. Membrane chromatography: protein purification from E. coli lysate using newly designed and commercial anion-exchange stationary phases. Journal of Chromatography. 2010. 1217(30):4946-4957.

129. Boi C., Dimartino S., Hofer S. et al. Influence of different spacer arms on Mimetic Ligand A2P and B14 membranes for human IgG purification. Journal of Chromatography. 2011. 879(19):1633-1640.

130. Orr V., Scharer J., Moo-Young M. et al. Simultaneous clarification of Escherichia coli culture and purification of extracellularly produced penicillin G acylase using tangential flow filtration and anion-exchange membrane chromatography (TFFAEMC). Journal of Chromatography. 2012. 900:71-78.

131. Kurnik R.T., Yu A.W., Blank G.S. et al. Buffer exchange using size exclusion chromatography, countercurrent dialysis, and tangential flow filtration: models,

development, and industrial application. Biotechnology and Bioengineering. 1995. 45(2): 149—157.

132. Mehta A. and Zydney A.L. Effect of membrane charge on flow and protein transport during ultrafiltration. Biotechnology Progress. 2006. 22(2):484-492.

133. Van Reis R. and Zydney A.L. et al. Protein ultrafiltration. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. JohnWiley & Sons. 1999. 2197-2214.

134. Cui Z. Protein separation using ultrafiltration: an example of multi-scale complex systems. China Particuology. 2005. 3(6):343-348.

135. Aspelund M.T. and Glatz C.E. Purification of recombinant plant-made proteins from corn extracts by ultrafiltration. Journal of Membrane Science. 2010. 353(1-2): 103-110.

136. Kohler G., and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975. 256:495-497.

137. Galfre G. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 1977. 266(5602):550-2.

138. Bernett M.J., Karki S.G., Moore G.L., Leung I.W.L., Chen H., Pong E., Nguyen D.H.T., Jacinto J., Zalevsky J., Muchhal U.S., et al. Engineering Fully Human Monoclonal Antibodies from Murine Variable Regions. J Mol Biol. 2010. 396(5):1474-1490.

139. Ghosh S., Ansar W. Monoclonal Antibodies: A Tool in Clinical Research. Indian J Clin Med. 2013. 4:9-12.

140. Li J., Zhu Z. Research and development of next generation of antibody-based therapeutics. Acta Pharmacol. 2010. 31(9):1198-1207.

141. Reff M.E., Hariharan K., Braslawsky G. Future of monoclonal antibodies in the treatment of hematologic malignancies. Cancer Control. 2002. 9(2):152-66.

142. Kurosawa N., Yoshioka M., Fujimoto R., Yamagishi F., Isobe M. Rapid production of antigen-specific monoclonal antibodies from a variety of animals. BMC Biology. 2012. 10(1):80.

143. Rodrigues M.E., Costa A.R., Henriques M., Azeredo J., Oliveira R. Technological progresses in monoclonal antibody production systems. Biotechnol Prog. 2010. 26(2):332-351.

144. Brezski R.J., Almagro J.C. Application of Antibody Engineering in the Development of Next Generation Antibody-Based Therapeutics. Antibody-Based Therap. 2012. 4(29):65-93.

145. O'Brien L.M., Goodchild S.A., Phillpotts R.J., Perkins S.D. A humanised murine monoclonal antibody protects mice from Venezuelan equine encephalitis virus, Everglades virus and Mucambo virus when administered up to 48h after airborne challenge. Virology. 2012. 426(2):100-105.

146. Lin W., Kurosawa K., Murayama A., Kagaya E., Ohta K. Bcell display-based one-step method to generate chimeric human IgG monoclonal antibodies. Nucleic Acids Res. 2011. 39(3):1-10.

147. Mak T.M., Hanson B.J., Tan Y.J. Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza A H5N1 clades. Antiviral Res. 2014. 107(1):76-83.

148. Wang S. Advances in the production of human monoclonal antibodies. Antib Technol J. 2011. 1:1-4.

149. Chandel P., Harikumar S.L. Pharmaceutical monoclonal antibodies: Production, guidelines to cell engineering and applications. Int J Pharm Pharm Sci. 2013. 5(2):13-20.

150. Harding F.A., Stickler M.M., Razo J., DuBridge R.B. The immunogenicity of humanized and fully human antibodies: Residual immunogenicity resides in the CDR regions. MAbs. 2010. 2(3):256-265.

151. Bernett M.J., Karki S.G., Moore G.L., Leung I.W.L., Chen H., Pong E., Nguyen D.H.T., Jacinto J., Zalevsky J., Muchhal U.S., et al. Engineering Fully Human Monoclonal Antibodies from Murine Variable Regions. J Mol Biol. 2010. 396(5):1474-1490.

152. Steinitz M. Human Monoclonal Antibodies. Methods in molecular biology. 2014. 1060:111-22.

153. Medecigo M., Manoutcharian K., Vasilevko V., Govezensky T., Munguia M.E., Becerril B., Luz-Madrigal A., Vaca L., Cribbs D.H., Gevorkian G. Novel amyloid-beta specific scFv and VH antibody fragments from human and mouse phage display antibody libraries. J Neuroimmunol. 2010. 223(1):104-114.

154. Solforosi L., Mancini N., Canducci F., Clementi N., Sautto G.A., Diotti R.A., Clementi M., Burioni R. A phage display vector optimized for the generation of human antibody

combinatorial libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments. New Microbiol. 2012. 35(3):289-294.

155. Ahmad Z.A., Yeap S.K., Ali A.M., Ho W.Y., Alitheen N.B.M., Hamid M. ScFv antibody: Principles and clinical application. Clin Dev Immunol. 2012. 1-15.

156. Chandel P., Harikumar S.L. Pharmaceutical monoclonal antibodies: Production, guidelines to cell engineering and applications. Int J Pharm Pharm Sci. 2013. 5(2):13-20.

157. Wang S. Advances in the production of human monoclonal antibodies. Antib Technol J.

2011. 1:1-4.

158. Liu J.K.H., The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Ann Med Surg. 2014. 3(4):113-116.

159. Rülker T., Voß L., Thullier P., Brien L.M., Pelat T., Perkins S.D., Langermann C., Schirrmann T., Dübel S., Marschall H.J. et al. Isolation and characterisation of a humanlike antibody fragment (scFv) that inactivates VEEV in vitro and in Vivo. PLoS One.

2012. 7(5):1-12.

160. Solforosi L., Mancini N., Canducci F., Clementi N., Sautto G.A., Diotti R.A., Clementi M., Burioni R. A phage display vector optimized for the generation of human antibody combinatorial libraries and the molecular cloning of monoclonal antibody fragments. New Microbiol. 2012. 35(3):289-294.

161. Chadd H.E., Chamow S.M. Therapeutic antibody expression technology. Curr Opin Biotechnol. 2001. 12(2):188-194.

162. Hu W.G., Phelps A.L., Jager S., Chau D., Hu C.C., O'Brien L.M., Perkins S.D., Gates A.J., Phillpotts R.J., Nagata L.P. A recombinant humanized monoclonal antibody completely protects mice against lethal challenge with Venezuelan equine encephalitis virus. Vaccine. 2010. 28(34):5558-5564.

163. Pal P., Dowd K.A., Brien J.D., Edeling M.A., Gorlatov S., Johnson S., Lee I., Akahata W., Nabel G.J., Richter M.K.S. Development of a Highly Protective Combination Monoclonal Antibody Therapy against Chikungunya Virus. PLoS Pathog. 2013. 9(4):1-16.

164. Ahmad Z.A., Yeap S.K., Ali A.M., Ho W.Y., Alitheen N.B.M., Hamid M. ScFv antibody: Principles and clinical application. Clin Dev Immunol. 2012. 1-15.

165. Pavlou, A.K., and Belsey, M.J. The therapeutic antibodies market to 2008. Eur J Pharm Biopharm. 2005. 59:389-396.

166. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. 1989.

167. Cosgrove L., Lovrecz G.O., Verkuylen A., Cavaleri L., Black L.A., Bentley J.D., Howlett G.J., Gray P.P., Ward C.W., and McKern N.M. Purification and Properties of Insulin Receptor Ectodomain from Large-Scale Mammalian Cell Culture. 1995. 6:789-798.

168. Bebbington C.R., and Hentschel C.C.G. The use of vector based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells. DNA Cloning. Academic Press. 1987. Vol. III.

169. Gray P.P., Crowley J.M., and Marsden W.L. Growth of a recombinant Chinese hamster ovary cell line and high-level expression in protein-free medium. Trends in Animal Cell Technology. 1990. 265-270.

170. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. 227:680-685.

171. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976. 72:248254.

172. Reaction protocols for protein deglcosylation mix II (P6044), New England Biolabs.

173. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975. 256:495-497.

174. Erokhina T.N., Zinovkin R.A., Vitushkina M.V., Jelkmann W., Agranovsky A.A. Detection of beet yellows closterovirus methyltransferase-like and helicase-like proteins in vivo using monoclonal antibodies. J. General Virology. 2000. 81:597-603.

175. Deyev I.E., Mitrofanova A.V., Zhevlenev E.S., Radionov N., Berchatova A.A., Popova N.V., Serova O.V., Petrenko A.G. Structural Determinants of the Insulin Receptor-related Receptor Activation by Alkali. Journal of Biological Chemistry. 2013. 288:33884-33893.

176. Deyev I.E., Chachina N.A., Shayahmetova D.M., Serova O.V., Petrenko A.G. Mapping of alkali-sensing sites of the insulin receptor-related receptor. The role of L2 and fibronectin domains. Biochimie. 2015. 111:1-9.

177. Deyev I.E., Popova N.V., Petrenko A.G. Determination of Alkali-Sensing Parts of the Insulin Receptor-Related Receptor Using the Bioinformatic Approach. Acta Naturae. 2015. 7:80-86.

178. Petrenko A.G., Zozulya S.A., Deyev I.E., Eladari D. Insulin receptor-related receptor as an extracellular pH sensor involved in the regulation of acid-base balance. Biochim Biophys Acta. 2013. 1834:2170-2175.

179. Deyev I.E., Popova N.V., Serova O.V., Zhenilo S.V., Regoli M., Bertelli E., Petrenko A.G. Alkaline pH induces IRR-mediated phosphorylation of IRS-1 and actin cytoskeleton remodeling in a pancreatic beta cell line. Biochimie. 2017. 138:62-69.

180. McKern N.M., Lawrence M.C., Streltsov V.A., Lou M.Z., Adams T.E., Lovrecz G.O., Elleman T.C., Richards K.M., Bentley J.D., Pilling P.A., et al. Structure of the insulin receptor ectodomain reveals a folded-over conformation. Nature. 2006. 443:218-221.

181. Menting J G., Whittaker J., Margetts M.B., Whittaker L.J., Kong G.K., Smith B.J., Watson C.J., Zakova L., Kletvikova E., Jiracek J., et al. How insulin engages its primary binding site on the insulin receptor. Nature. 2013. 493:241-245.

182. De Meyts P., The Insulin Receptor and Its Signal Transduction Network, in Endotext, L.J. De Groot, et al., Editors. 2016. South Dartmouth (MA).

183. Kavran et al. eLife 2014;3:e03772.

184. Sparrow L.G., Lawrence M.C., Gorman J.J., Strike P.M., Robinson C.P., McKern N.M., Ward C.W. N-linked glycans of the human insulin receptor and their distribution over the crystal structure. Proteins. 2008. 71(1):426-39.

185. Sparrow L.G., Gorman J.J., Strike P.M., Robinson C.P., McKern N.M., Epa V.C., and Ward C.W. The Location and Characterisation of the O-Linked Glycans of the Human Insulin Receptor. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 2007. 66:261-265.

186. Greenfield N.J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 2006. 1:2876-2890.

187. Milesa A.J., Wallace B.A. Circular dichroism spectroscopy of membrane proteins. Chem. Soc. Rev. 2016. 45:4859-4872.

188. Schaefer E.M., Ericksons H.P., Federwisch M., Wollmer A., Ellis L. Structural Organization of the Human Insulin Receptor Ectodomai. Journal of biological chemistry. 1992.

189. Kovacina K.S., Roth R.A. Characterization of the endogenous insulin receptor-related receptor in neuroblastomas. J Biol Chem. 1995. 270:1881-1887.

190. Nimmerjahn F., Ravetch, J.V. Divergent immunoglobulin g subclass activity through selective Fc receptor binding. Science. 2005. 310:1510-1512.

191. Beck O.E. Distribution of virus antibody activity among human IgG subclasses. Clin. Exp. Immunol. 1981. 43:626-632.

192. Baudino L. et al. Differential contribution of three activating IgG Fc receptors to IgG2a-and IgG2b-induced autoimmune hemolytic anemia in mice. J. Immunol. 2008. 180:19481953.