Исследование мембранно-связанного белкосинтезирующего аппарата хлоропластов гороха тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Безсмертная, Ирина Николаевна

• Безсмертная, Ирина Николаевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Безсмертная, Ирина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ОСНОВНЫЕ СВЕЩЕНШ О МЕМЕРАН0-СВЯЗАНН0М

АППАРАТЕ ТРАНСЛЯЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ.

1.1. Мембрано-связанные рибосомы хлоропластов

1.2. Вопрос о продуктах синтеза мембрано-связанных рибосом

1.3. Участив цитоплазматической и хлоро-пластной белоксинтезирующих систем в организации внутренних мембран хлоропластов

1.4. Формирование белоксинтезирующей системы при дифференцировке пластид.

1.5. Структурная организация и химический состав внутренних мембран хлоропластов в онтогенезе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Выделение хлоропластов

2.3. Получение фракций хлоропластных мембран.

2.4. Обработка мембран хлоропластов детергентами

2.5. Обработка мембран хлоропластов ферментными препаратами.

2.5.1. Обработка мембран хлоропластов трипсином.

2.5.2. Обработка субмембранных фракций хлоропластов рибонуклеазой.

2.5.3. Обработка субмембранных фракций хлоропластов дезоксирибонуклеазой.

2.6. Определение белка и хлорофилла во фракциях мембран хлоропластов.

2.7. Определение РНК во фракциях мембран хлоропластов

2.8. Включение ^С-аминокислот в белки мембранных фракций хлоропластов.

2.9. Получение надосадочной жидкости 200000 g из хлоропластов гороха.

2.10.Выделение рибосом из клеток е. coli штамм MRE

2. II. Выделение высокомолекулярной РНК из мембран хлоропластов.

2.12. Фракционирование РНК в полиакриламидном геле.

2.13. Выделение PHKr-маркера из рибосом E.coli штамм MRE

2.14. Электронно-микроскопические методы.

2.15.Используемые реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ' ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

3.1. Исследование локализации белоксинтезирующего аппарата, связанного с мембранами зрелых хлоропластов.

3.1.1. Выделение и электронно-микроскопическое исследование двух типов мембран хлоропластов

3.1.2. Содержание белка и РНК в мембранных фракциях хлоропластов.

3.1.3. Белоксинтезирующая функция двух типов мембран хлоропластов

3.1.4. Электронно-микроскопическое исследование мембранных фракций хлоропластов, полученных после обработки детергентами

3.1.5. Выделение рибосом из мембранных фракций хлоропластов.

3.1.6. Электрофоретическое разделение РНК, выделенной из мембран хлоропластов.

3.1.7. Обсуждение результатов.

3.2. Исследование белоксинтезирующего аппарата , связанного с первичными мембранами хлоропластов гороха.

3.2.1. Выделение из хлоропластов фракции первичных мембран.

3.2.2. Электронно-микроскопическое исследование изолированных первичных мембран хлоропластов

3.2.3. Выделение из первичной мембраны хлоропластов предфрет и их электронночмик-роскопическое исследование

3.2.4. Исследование химического состава изолированных предфрет

3.2.5. Белоксинтезирующая функция структур, изолированных из первичных мембран хлоропластов

3.2.6. Обсувдение результатов

ВЫВОДЫ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование мембранно-связанного белкосинтезирующего аппарата хлоропластов гороха»

В общем ходе исследований синтеза белка хлоропластов в настоящее время прослеживаются три основных направления: продолжается изучение особенностей изолированных из хлоропластов компонентов белоксинтезирующей системы; определяется вкдад двух геномов (ядерного и пластидного) и двух белоксинтезирующих систем (цитоплазматической и пластидной) в общий фонд белков этих органелл и изучается организация белоксинтезирующего аппарата в тонкой структуре хлоропластов.Настоящая работа посвящена последнему из перечисленных направлений исследований. Данная проблема возншша в связи с тем, что в хлоропластах за синтез белков ответственны, главным образом, рибосомы, связанные с мембранами, Ош1 входят в гигантские полирибосомы, состоящие из колец, 1Шждое из которых закяючено в тилакоиде граны, Такая структурная организация полирибосом в мембранах хлоропластов свидетельствует о существовании тесной связи белоксинтезирующего аппарата и процессов фотосинтеза и слулит указанием на участие локализованных в тилшюидах гран полирибосом в гранообразовании, Прямым подтверждением этого явилось обнаружение в первичных мембранах содержащих полирибосомы кольцевых структур, которые предшествуют тилшсоидам гран и поэтому названы предтилакоидами.В данной работе представлены результаты исследований, направленных на решение двух взаимосвязанных задач : I, Выявить, существуют ли в хлоропластах полирибосомы, свя-] занные с мелогранными ламеллами-фретами, - 6 2. Исследовать белоксинтезирующии аппарат, связанный с первичными мембранами хлоропластов.Решение этих задач необходимо для выяснения путей регуляции синтеза белка в хлоропластах. -.7^ О Б З О Р Л И Т Е Р А Т У Р Ы I . ОСНОВНЫЕ с в в д н и я О ШУШРАНОСВЯЗАБНОМ АППАРАТЕ ТРАНСЛЯЦИЙ иЮРОПЛАСТОВ I.I. Мембраносвязанные рибосомы хлоропластов На долю пластидных рибосом приходится до 50% от общего содернсания их в ткани листьев / Ellis, Hartley, 1974; Ellis, 1978/.Популяция рибосом хлоропластов по своей топографии внутри органелл неоднородна. Рибосомы пластид разделяются на два класса свободные, находящиеся в стреме, и рибосомы, ассоциированные с мембранами, В матриксе пластид свободные рибосомы представлены, главным образом, мономерами / Jacobson, et al., 1963/, однако, на ранних стадиях развития пластид в строме удавалось видеть полирибосомные структуры спиралеви.цнои конфигурации в этиопластах пшеницы / Baxtels, Weier, 1967/ и в развивающихся хлоропластах клеток мезофилла листьев тритикале / Oliveira, 1975/. Полирибосомоподобные структуры наблюдали также в строме этиопластов овса. В этом случае полшрибосомы организованы в ряды , примыкающие к тилакоидам / Wellburn, Wellburn, I97I/. Обнаружение кластеров свободных рибосом в этиопластах пшеницы позволило авторам сделать вывод, что "несущие РШ{ частицы только примыкают к образующимся мембранам, но никогда не связываются с последВШМИ" /bartels, Weier, 19б7).Мембране, -связанные рибосомы хлоропластов были показаны как в работах по электронномикроскопическому исследованию ультратонких срезов листьев Дккульска и др., 1962; Palfc, 1969; Chua et al., 1973/, laii и путем исследования белоксинтезирующей шстивности изолированных мембран хлоропластов /Сисакян и ^ 8 др., 1962; Spencer, 1965; Bamie, Yagendorf, 1966; Филиппович и др., 1967; Marguiies, Parent!, 1968/. В дальнейшем существование мембраносвязанных рибосом было подтверждено непосредственным выделением их из мембран хлоропластов с помощью детергентов /Филиппович и др., 1970; Chen, Wildman, 1970; Blair, Ellis, 1973; Tao, Jagendorf, 1973; Marguliea, Michaels, 1974/, a таК/Ке агентами, снимающими рибосомы с мембран - KGI в высокой концентрации и пуромицином / Michaels, Margulies, 1975; Chua et al., 1976/. Ha связь рибосом с мембраной указывала таюш возможность экстракции РНК из мембран / Gnanam, Kahn, 1967; Hagzieyw, Zalik, 1970; Phylippovich et al., 1973/. Вопрос о доли ;рибосом, находящихся в свободном и связанном состоянии, изучался рядом исследователей, но он все еще остается открытым. Разрешение его затруднено в связи с выходом части свободных рибосом при выделении пластид вследствие слгатия органелл при центрид^гировшпш в растворах сахарозы и частичного разруше1шя оболочки хлоропластов. Выделение хлоропластов в неводной среде в смеси органических растворителей гексан-четыреххлористый углерод /stoclcing, I97I/ сохраняет пул свобо.дных рибосом, однако, загрязнение фрагментами цитоплазмы столь велико, что не позволяет получить корректные данные /Bird et al., 1973/.По этшл причинам имеющиеся в литературе скудные данные следует рассматривать 1шк весьма приблизительные. Так, в хлоропластах гороха количество мембраносвязанных полирибосом оценено в 10-20^ от общего их содер}йания в органеллах /Тао, Yagendorf, 1973/, а в хлоропластах табака и Clamidomonas reinhardi имеется примерно равное отношение обоих классов рибосом / Chen, VJ'ildman, 1970; Margulies, Michaels, 1974/.Наиболее полное освобождение полирибосом от фрагментов мембран достигается при совместном действии протеаз с детергентами и одних протеаз /Alsher et al., 1978; Margulies, Weistrop, 1980/. При сравнительном изучении воздействия трипсина и химотрипсина на мембрану хлоропластов было установлено, что первый значительно эффективнее, чем второй / Махguiles, 1980/.Изучение роли мембрано-связанных рибосом в белковом синтезе, их структуры и особенностей функционирования невозможны без исследования локализации их в сложной системе внутренних мембран хлоропластов. Сведения об их локализации, полученные ранее, главным образом, при электронно-микроскопическом исследовании срезов листьев противоречивы: по одним данныгл, они расположены на боковой поверхности тилакоидов хлоропластов кдивии УМикульска и др., 1962/, что было подтверждено в других работах и, в частности, при исследовании срезов листьев ряда папортниковидных, например, Encephalaxtos altensteinii. В случае прохождения среза поперек стопки гранальных тилакоидов хорошо видно, что рибосомы располагаются по кольцу и входят в структуру тилакоида /Кислякова и др., 1976/.Ряд других исследователей обнаруживают связанные полирибосомы в виде кластеров на поверхности тилакоидов гран /Gunning, 1965; -г 32 Falk, 1969; Yamomoto et al., I98I/, a также на внешней поверхности ламелл стремы /chua et al., 1973; Молчанов, Мезенцев, 1978/.Наиболее плодотворным решением задачи локализации и организации мембрано-связанных полирибосом оказалось выделение их из фракции мембран хлоропластов путем постепенной "разборки" мембран с помо11р»ю детергентов. Изолированные мембраны хлоропластов обрабатывали детергентами и затем центрифугировали в линейном или ступенчатом градиенте сахарозы и полученные фракции структур исследовали под электронным микроскопом. Таким путем были выявлены основные стадии постепенного освобождения тилакоидов гран от липопротеидного материала. Оказалось, что при действии детергентов центральная часть тилакоидов гран гораздо более уязвима, чем периферическая. Вследствие этого обработка 0,5% DOX-Na приводит к получению из гран кольцевых структур, из которых при действии 0,1^ тритона X-IOO освобождаются имеющие ту же форму структуры, состоящие из частиц. Эти состоящие из частиц кольцевые структуры быди идентифицированы как полирибосомы по всем, существующим тестам (коэффициент седиментации (70s ) , величина частиц, соотношение ШК/белок, чувствительность при мягкой обработке РНК-азой, окрашиваемость уранилацетатом, способность к обратимой диссоциации на две неравные субчастицы и функция ) /Филиппович и др., 1970; 1976/. •Это дало возможность сфорлулировать положение о том, что полирибосомы локализованы не на поверхности мембран, а внутри тилакоидов гран.В принципе, это вполне согласуется с теми электронномикроскопичесшши данными, согласно которым рибосомы тяготеют к боковой поверхности тилакоидов Д1икульска и др., 1962; Кислякова и др., 1976/. Такое расположение рибосом скорее всего является следствием примененных при подготовке срезов обработок (многократное обез-> 13 воживание этанолом и ацетоном, экстрагирующих липиды и липопротеиды и денатурирукшще белки), приводящих к истончению мембран. В результате рибосомы частично или полностью освобождаются от материала мембран периферической части тилакоидов гран и оказываются на границе тилакоидов и стремы, Имеющиеся в литературе сведения лишь о частичном освобождении рибосом из мембран хлоропластов chlamydomonas reinhardi при действии агентов, снимающих рибосомы с поверхности мембран (высокая концентрация солей и пуромицин ), также подтверждают это положение /Alsher et al,, 1978; Michaels, Sexton, 1980/.Солюбилизацня липидного материала мембран хлоропластов молодых растений позволила обнаружить гигантские полирибосомы, состоящие из большого числа колец, каждое из которых локалдзовано внутри гранального тилакоида и составляет его остов. Такая структурная организация мембраносвязанных полирибосом в зрелых хлоропластах является уникальной и характерна только для определенного вида мембран хлоропластов - тилакоидов гран, которые в природе также неповторимы /Филиппович и др., I97I; Филиппович, 1975; Phylippovich et al., 1976/. He исключено, что кроме этих полирибосом , "вмонтированных" в тилакоиды гран, в зрелых хлоропластах существует другой или другие виды связанных с мембранами полирибосом. Однако, определенных доказательств их существования в литературе пока нет, 1.2. Вопрос о продуктах синтеза мембраносвязанных полирибосом В изолированных хлоропластах синтез белка осуществляется, в основном, мембрано-связанными полирибосомами /Филиппович и др., 1967; Chen, Wildman, 1970; Blair, Ellis, 1973; Bottomley et al., - 1 4 1974; Margulies, Michaels, 1974; Chua, Gillham, 1977/. Белоксинтезирущая активность свободных рибосом хлоропластов слаба. Только IQffo свободных рибосом входит в состав полирибосом. Основная их часть находится в виде мономеров, которые не несут насцентных полипептидов и, следовательно, не являются программированными / Chua et al., 1973/.Несмотря на это, некоторые исследователи считают, что именно в строме находятся полирибосомы, ответственные за синтез большой субчастицы РДФ-карбоксилазы /Margulies, Michaels, 1975; Baumgartei, Howell, 1976/. Предполагается, что эти полирибосомы образованы мРНК I2-I4S и всего несколькими (3-5) рибосомами /Sagher et al., 1976; Howell et al., 1977; Gelwin, Howell, 1977/. Однако, эти работы пока не получили подтверждения и, кроме того, недавно появилось сообщение об обнаружении мРНК большой субчастицы РДФ-карбоксилазы в тилакоидах шпината /Hattoxi, Ma2?gulies, 1982; Leu et al., 1984/.В литературе нет прямых данных о продуктах синтеза изолированными мембрано-связанными полирибосомами хлоропластов. Сейчас рассматривается вопрос о том, какие хлоропластные белки синтезируются в данных органеллах. В какой-то мере это способствует и выяснению вопроса о продуктах мембрано-связанных полисом, поскольку именно ими могут быть эти, синтезирующиеся в хлоропластах белки или их часть, Исследование мутантов, имеющих определенные структурные аномалии и нарушения в синтезе белка, а также применение ингибиторов белкового синтеза привело к выводу о том, что большинство хлоропяастных белков синтезируется вне органелл на цитоплазматических рибосомах и кодируются ядерным геномом. К ним относятся, главным образом, белки, локализованные в строме хлоропластов, такие, - 1 5 как ферменты цикла Кальвина, малая субчастица РДФ-карбоксилазы, ферменты, участвующие в синтезе пигментов, РНК-полимераза, аминоатщл-тРЖ-синтетазы, большинство рибосомных белков, а также значительное количество мембранных полипептидов. Доля белков, синтезируемых в самих хлоропластах, значительно ниже /largulies , Parent! , 1968; Machold, Aurich, 1972; Remy et al., 1972; Eytan, Ohad, 1970; 1972; НооЪег, Stegeman, 1973; Schiff, 1974; Nielsen, 1975; Anderson, 1975; Cohen, Schiff, 1976; Chua, Gillham, 1977; Gillham, 1978/, Применение ингибиторов белкового синтеза привело к установлению л.окализации трансляции ряда полипептидов, но наиболее достоверная информация о функции пластидной белоксинтезирующей системы получена при идентификации продуктов белкового синтеза, осуществляемого изолированными хлоропластами и фракциями субструктур, выделенных из них. Современные методы позволяют получать дискретные продукты, синтезированные не только интактными хлоропластами, но и лизированными хлоропластами, а также свободными и мембрано-связанными пластидными рибосомами в гетерологическои белоксинтезирующей системе (рибосомы и кофакторы белкового синтеза из E.coii, зародышей пшеницы или ретикулоцитов кролика, м Ш К из хлоропластов), а также в сопряженной транскрипционно-трансляционной системе.Связанный с мембранами белоксинтезирукяций аппарат активируется при добавлении растворимых кофакторов белкового синтеза из E.coii.В этом случае фракция тилакоидных мембран также довольно активна и новосинтезированные продукты прочно связаны с мембраной. Половина из них переваривается проназой. После обработки детергентами становятся чувствительными к проназе еще 25% меченых продуктов. ОстаЕзщиеся полипептиды, по-видимому, являются сильно гидрофобными, интегральными мембранными белками Alscher et al., 1978/, С этим хорошо согласуются данные о том, что 20^ новосинтезированных ( in vitro ) продуктов являются внутренними мембранными белками и не удаляются из мембран хлоропластов при различных их обработках / Chen, Wildraan, 1970/. Это сильно отличает мембрано-связшпше полирибосомы хлоропластов от рибосом эндоплазматического ретикулума животных кяеток, продуцирующих, главным образом, растворимые белки на "экспорт". Причина недоступности новосинтезированных полипептидов протеолитическим ферментам, по-видиьюму , кроется именно в том, что интенсивно функционирующие мембрано-связанные полирибосомы находятся не на поверхности, а внутри тилакоидов гран /Филиппович и др., 1970/.Известно, что его присутствие в мембранах необходимо для нормального гранообразования. У мутантов гороха, лишенных этого белка, вместо обычных гран образуются плотноупакованные макрограны /Филиппович и др., I98I/, Показано, что он связан с активным центром ФС II и, возможно, регулирует поток электронов к восстанавливающему центру ФС II /Mattо et al., I98I/. Синтез его предшественника показан в хлоропластах ку1б/'рузы /Grebanier et al., 1978/, гороха /Ellis, 1975 /Barrachough, 1978/, ряски /Edelman, Reinsfeld, 1980/. Обнаружено, что изолированные хлоропласты теряют способность превращать предшественник в зрелые молекулы /Grebanier et al.,I979/. Белок II32 был транслирован в бесклеточной системе из зародышей пшеницы на выделенной из хлоропластов - 1 9 ряски и кукурузы глРНК, которая, как и другие пластидные мРНК, не содержит поли (А) последовательностей. Величина ее в 1,5-2 раза превышает теоретически необходимую /Reinsfeld et al., 1978; Grebaniei? et al., 1979; Edelman, Reinsfeld, 1980/. В этиопластах эта мРНК отсутствует / Bedbrook et al.,I978/, но судя по раннему появлению этого белка при освещении (через 3 часа), она является одной из первых мРНК, появляющихся при зеленении растений /Reinsfeld et al., 1978/. Ген белка П32 локализован в виде е одной копии во фрагмент Ват 8 в молекуле ДНК хлоропластов кукурузы /Bedtrook et al., 1978/ и шпината /Driesel et al., 1980/.Помимо белка П32 в хлоропластах синтезируются другие интегральные мембранные полипептиды - апобелки активного центра ФС I, несущие хлорофилл "а" и пигмент II700 /Ellis, 1975; Machold, 1975; Green, 1980/, мол.массы двух полипептидов составляют 70 и 58 кДа / Greetа, Gnanam,I980; Zielinski, Price, 1980/.Для этих белков недавно были обнаружены соответствующе мРНК /Westhaff et al., 1983/. В изолированных хлоропластах шпината показан также синтез апобелков 2 дополнительных хлорофиллбелковых комплексов СР II и СР 1У /Chua , Blomterg, 1979; Delepelaire, Chua, 1979); в хлоропластах гороха - цитохрома f /Doherty, Gray, 1979/, в хлоропластах шпината - цитохрома в^дд/Zielinski, Price, 1980/.Синтез цитохрома C552 белка с мол.массой 12 кДа, несущего гем, требует для своего синтеза участия как хлоропластной, так и цитоплазматической белоксинтезирующих систем. Обнаружено, что образование его в зеленеющих клетках Eugiena тесно сопряжено с синтезом хлорофилла и в равной степени блокируется и циклогексимиДОМ и ХЛОрамфениколом /Wildner, 1976; Preyssinet et al. , 1979/.К перечисленным мембранным белкам, синтезируемым в органел- 20 лах, следует отнести еще 2-3 полипептида оболочки хлоропластов / Joy, Ellis, 1975; Moxgenthaler et al., 1976/.Получены данные о том, что изолированные хлоропласты, неспособны интегрировать некоторые новосинтезированные белки в мембранные структуры. Основная часть новообразованных субчастиц сопрягающего фактора CFI и предшественник полипептида П32 не внедряются в мембраны / Grebanier et al.,I979/. Причина, по-видимому, заключается в лимитировании необходимых компонентов мембран, поставляемых из цитоплазмы.В заключение можно сказать, что в хлоропластах синтезируются мембранные полипептиды различной топографии - как поверхностные, так и интегральные. Продолжающиеся сейчас исследования направлены на выяснение места синтеза других мембранных белков хлоропластов и не только на органелльном, но и внутриорганелльном уровне. В перспективе остается все еще нерешенный вопрос о том, какие именно синтезирущиеся белки являются пррдуктами мембрано-связанных полирибосом. Решение его важно для создания представлений о роли мембрано-связанного аппарата трансляции в биогенезе мембран хлоропластов.1,3. Участие цитоплазматической и хлоропластной белоксинтезирующих систем в организации внутренних мембран хлоропластов Биогенез мембран хлоропластов представляется в настоящее время сложным процессом постепенной сборки этих многокомпонентных систем, включающим последовательное внедрение хлорофилла и других пигментов в мембранные структуры, состоящие из полипептидов, синтезированных как на хлоропластных, так и на щтоплазматических рибосомах. - 21 Установлено, что при развитии хлороплаотов часть белков, появлящихся при освещении сразу, синтезируется на щтоплазматических рибосомах под контролем ядра; вторая группа белков требует для своего появления продолжительного освещения и синтез их чувствителен к хлорамфениколу / Bingheim, Schiff, 1979/. В проДессе светоиндущруемого развития пластид зависимость формирования хлороплаотов от участия щтоплазматического аппарата меняется. Начальные этапы развития хлороплаотов обеспечиваются, главным образом, за счет цитоплазмы, о чем свидетельствует сильное ингибирование их циклогексимидом. Последующее развитие требует вовлечения собственной белоксинтезирующей системы и ингибируется хлорамфениколом /Еасыров, Алиев, 1970; Насыров и др., 1974/. Аналогичные результаты получены в работе с зеленеющими клетками Eugiena gracilis, где первые 12 часов хлоропласты получают источники энергии и другие необходимые компоненты из цитоплазмы / Schiff, 1974; Cohen, Schiff, 1976/. Отсутствие белков цитоплазматического происхождения тормозит развитие хлороплаотов / Ohad, 1975; Gershoni, Ohad, 1977/.Свет является главным внешним фактором для развития хдоропластов, но это не единственное условие, необходимое для синтеза всех хлоропдастных компонентов, т.к. многие из них способны синтезироваться в темноте. Хотя после нескольких часов освещения происходит заметное развитие первичных мембран, существенных изменений в полипептидном составе не обнаруживается / Remy, 1973/.Синтез и сборка мембранных компонентов отличаются от растворимых тем, что имеется контроль их синтеза мембранными компонентами Taic, что ингибирование одного . из них (хлорофилла, каротиноидов или белков) может вызвать остановку синтеза других компонентов. Например, синтез апобелка светособирающего комплекса и синтез хлорофилла ингибируются в равной степени хлорамфениколом и циклогексимидом. Остановка синтеза каротиноидов сильно уменьшает число тилакоидных полипептидов /Bingham, Schiff, 1979/. Сравнение полипептидного состава мембран пластид, находящихся на разных стадиях развития, позволило разделить их на 3 группы, на долю основной группы приходится 2/3 общего белка мембран и к ней относятся белки, присутствующие в этиопластах с мол, массами 12 кДа - 37 кДа. Ко второй группе были отнесены полипептиды, свойственные только этиопластам, исчезающие во время зеленения. И, наконец, третья грухша образована белками, появлящимися в результате светозависимой дифференцировки хлоропластов с мол. массами 42; 32; 27,5; 27; 26; 25; 24; 16 и 13 кДа / Grebanier et al.,I979/. Среди этих белков ПОЛИпептиды с мол. массами 27,5; 27 и 26 кДа - субчастицы светособирающего комплекса, составляющего до 50^ белка мембран зрелых хлоро- 23 г пластов. Этот, индуцируемый светом белок, синтезируется на цитоплазматических рибосомах на полиА"*" РШС в виде предшественника, который на 4000 дальтон превосходит зрелые молекулы / Machold, Aurich, 1972; Apel, E3oppstech, 1978/.Транскрипция инфо1мационной РНК для этого белка индуцируется фитохромной системой /Apel, 1979/. Внедрение апобелка в меммбраны происходит при длительном освещении, т.к. для его стабилизации необходимы хлорофилл "а" и "в" /Aimond, Arntzen, 1977/, в определенных условиях, когда нарушена корреляция синтеза белка и пигмента, эти полипептиды не накапливаются.На долю полипептидов, входящих в ФС1 и ФСП, синтезируемых в цитоплазме, приходится до 10% белка мембран хлоропластов У Anderson, 1975/. Мембранный полипептжд, входящий в фотосистему I, с мол.массой 22 кДа кодируется ядерной ДНК и синтезируется на полиА"*" РНК. Как все уже известные белки, синтезируемые в цитоплазме и транспортируемые в хлоропласт, этот белок синтезируется в виде предшественника с большим молекулярным весом. Транзитная последовательность этого белка составляет 4 кДа и сходна по размеру с полипептидом светособирающего комплекса /westhaff et al., 1983/.Железосодержащий белок мембран хлоропластов ферредоксин также кодируется в ядре и транслируется на полиА''ТЖ высших растений и водорослей в виде молекулы, на 3-4 кДа больше нативного ферредоксина / Huisman et al., 1978/. Синтез другого мембранного белка, переносчика электронов, пластоцианина, также происходит в цитоплазме / Good enough, Lev ine, 1970/. Точно установлено, ЧТО I субчастица АТР-азы синтезируется в цитоплазме /Nelson et al., 1980/.Светоиндуцированное развитие хлоропластов Eugiena приводит как к количественному возрастанию уже имеющихся в этиопластах полипеп- 2 4 тидов, так и появлению 10 новых, которые к концу развития становятся основными. Отсутствие этих белков в мембранах мутанта w,BUL , лишенного пластидной ДЕК, свидетельствует о синтезе их на хлоропдастных рибосомах /Bingham , Schiff, 1979/. Самое заметное изменение, происходящее в первые часы освещешш - быстрое истощение, а затем исчезновение основного внутреннего белка этиопластов - фермента протохлорофнллоксидоредуктазы, белка с мол. массой 36 кДа, каждая молекула которого связана с 2-3 молекулами протохлорофилла /Apel et al. Д980/. Светоиндуцированное уменьшение и исчезновение этого белка не связано с активацией специфических протеаз /Denesh, Apel, 1983/, как это предполагали ранее /Натр, Filipps, 1980/.Синтез мембранных белков, появляющихся при зеленении, сопряжен с превращением протохлорофилла в хлорофилл и можно полагать, что новосинтезирующиеся при зеленении белки являются, главным образом, апобелкаыи хлорофиллбелковых комплексов / НооЪег, stegeman, 1973/. Молекулярные основы механизма, осуществляющего контроль этого кооперативного процесса, довольно сложны и недостаточно изучены. В настоящее время известно, что апобелки ФСП синтезируются на щтоплазматических рибосомах, т.к. ингибируются цнкдогексимидом, однако, их синтез контролируется фотовосстановлением протохлорофшышда, т.е. реакцией, протекающей в хлоропласте /bar-Nun, Chad, 1974; Hachtel, 1976/. Сопражение синтеза мембранных белков и хлорофилла необходимо для нормального биогенеза мембран. Так, например, в клетках chlamydomonaa reinhardi, выращенных при высокой температуре, происходит активный синтез мРНК для апобелков светособирагощего комплекса, ее транскрипция и переход молекул-предшественников 31,5 кДа и 30 кДа в зрелые апобелки 29,5 кДа и 26 кДа, но внедре1шя их в мембраны в отсут- 25 • СТВИе молекул хлорофилла не происходит / НооЪег et al. , 1982/.Таким образом, биогенез пластидных мембран регулируется на уровне процессов транскрипции и трансляции, протекающих в разных компартментах клетки и сопряжен с синтезом многих других компонентов мембран (пигментов, липидов), от присутствия которых зависит сборка функциональных компонентов.Вместе с тем, формирование фотосинтетических мембран в настоящее время нельзя рассматривать только как последовательную сборку пигментов, липидов и белков, синтезированных в обоих компартментах клетки без учета структурной роли самого белоксинтезирующего аппарата, ассоциация которого с мембраной, по имеющимся данным, происходит на самых ранних этапах развития мембран хлоропластов /Филиппович и др., 1975; Филиппович, 1979; Apel, Bogorad, 1976/.1.4, Формирование белоксинтезирующей системы при дифференцировке пластид Светоиндуцированное превращение этиопластов в хлоропласты наряду с синтезом de novo пигментов, фотосинтетических ферментов и ламеллярных белков характеризуется быстрым возрастанием синтеза всех типов пластидной РНК и активацией пластидной ДРШ-зависимой РНК-полимеразы /Bottomley, 1970;Apel, Bogorad, 1976/. Наблюдаемое увеличение количества хлоропластной РНК опережает синтез пластидоспецифичных белков. Из электронно-микроскопических и аналити-: 26 ческих исследований известно, что не только хлоропласты зеленых листьев, но и этиопласты этиолированных листьев содержат рибоСОМНЫе частицы /Jacobaon et al., 1963; Clark, 1964; Boaxdman, 1966; Bartels and v/eier, 1967; Dyer et al., 1971 /. Очень молодые, зародышевые листья содерлат большое количество щтоплазматической РНК и трудно улавливаемое количество пластидной рибосомной РНК /ingle, 1968; Smith, 1970/. Во время роста листьев или семядолей в темноте количество пластидной р Р Ж на клетку и этиопласт постепенно возрастает /smith, 1970 /.В этиопластах редиса /ingle, 1968/ листьев конских бобов /Dyer et al., I97I/, верхушечных почек гороха /Ellis, Hartley, I97I/, семядолях тыквы /Mikulovich, 1978/ уровень пластидной РНК значительно ниже, чем в хлоропластах. Клетки водоросли Eugiena, выращенные в темноте, таюке содержат небольшое количество пластидной РНК, но при освещении после короткого лаг-периода происходит резкое его увеличение /Cohen, Schiff, 1976/. Однако, в ряде случаев количество рРНК в этиопластах достигает уровня, характерного для растений, выращенных на свету. Такие сведения получены для листьев фасоли /Boardman, 1966/, огурца /smith et al.,1970/, пшеницы /Scott et al., I97I; Pateraon, Smillie, I97I/. Поэтому можно зактшчить, что свет не является единственным необходимым фактором для синтеза рРНК, хотя он сильно стимулирует ее синтез в этиолированных тканях.Заметное увеличение содержания пластидной рРНК под действием света происходит только в молодых листьях. В случае развитых листьев этот эффект проявляется слабее /smith et al., 1970/. В значительно меньшей степени стимулируется синтез цитоплазматической рРНК /Ellis, Hartley, I97I; Milculovich, 1978/, а иногда, например, в листьях конских бобов свет почти не оказывает дейст- 27 ВИЯ на синтез цитоплазматической рЕНК / Dyer et al. ,1971/. Наряду с рШК, обнаружено светостимулируемое возрастание уровня транспортной Ш К при сравнении этиопластов и хлоропластов фасоли / Burkaxd et al., 1972/, Обнаружено, что в клетках Euglena gracilis, содержание некоторых видов пластидной тРНК увеличивается в 2-3 раза, других - в 20-30 раз /Partier, Krauspe, 1973/.Светозависимал стимуляция синтеза и пластидной, и цитоплазматической р Р Ж находится под контролем фитохромной системы и не зависит от степени развития фотосинтетической функции хлоропластов / Scott et al. ,1971; Thien, Schopfer, 1975; Apel, 1979; Link, 1981/.Светоиндуцируемый синтез пластидной рЕНК происходит в очень ограниченное время на стадии превращения этиопласта в хлоропласт /ingle et al.,I970; Munns et al.,I972/, последующий рост не приводит к заметному возрастанию цитоплазматической или хлоропластной рИПС, при этом обмен пластидной рРНК происходит значительно медленнее, чем цитоплазматической /Paterson, Smillie, I97I/. В ряске половина пластидной р Ш К обменивается за 12 дней, а цитоплазматическая - за 4 дня / Trewawaa, 1970/. В старых листьях обмен рРНК резко ослабевает и становится едва уловимым / ?/ollgiehn et al., 1976/.Хотя гены рибосомной РНК и 40 транспортных РНК занимают всего лишь 10^ всей молекулы ДНК / Palmer, Thompson, I98I; Chua et al., I98I; Meeker, Tewary, 1982/, на ДОЛЮ транскриптов рибосомной РНК и транспортные РНК приходится 90^ и Ъ% транскрибируемой РНК соответственно и всего 2-3^ на информационные РНК / Partier, Krauspe, 1974/.Такая преимущественная транскрипция in vitro фрагментов - 2 8 Eco Ri,несущего последовательности для pFHK, как обнаружилось, зависит от присутствия S фактора, полипептида с мол.массой 27 кДа в составе ДНК-зависимой РНК-полимеразы хлоропластов кукурузы, транскрибирующей только суперспиральные участки хлоропластной ДНК /jolly, Bogorad, 1980/.Данные о том, что ДНК- и РНК-полимераза хлоропластов локализованы в мембранной системе, позволили предполагать, что предшественники рибосомной РНК синтезируются в мембране /woligiehn et ai., 1966; Tewary, Wildman, 1969; Woligiehn,Munache, 1972 /. Специально проведенные исследования по локализации предшественников рибосомной РНК хлоропластов подтвердили это предположение, а также установили тесную связь новообразованней Р Ж с мембраной. Значительное количество РНК оставалось в связанном с мембраной состоянии даже при солюбилизации мембран Z% тритоном-Хюо /Lerbs, Woligiehn, 1975/. Имеются также сведения о связи с мембраной хлоропластов таких компонентов белоксинтезирующей системы, как тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы. Обнаружено, что Ъ0% тРНК и 35^ аминоацил-тРНКсинтетаз хлоропластов прочно ассоциированы с мембраной и могут быть удалены из нее только при действии детергентов /Филиппович и др., 1974/.Формирование пластидных рибосом, как и многих других сложных надмолекулярных комплексов хлоропластов, осуществляется при взаимодействии двух генетических систем.Имеювдеся сведения о том, что в изолированных хлоропластах новосинтезированные рРНК накапливаются в виде предшественников / Hartley, Head, 1979/, по-виддаому, из-за лимитирования рибосомных белков цитоплазматического лроисхождения, наводит на мысль о том, что процессинг молекулы-предшественника р Ш К возможен при условии ассоциации ее с полным набором рибосомных белков, как это имеет место в бактериальной клетке /Расе, 1973/, По этой же причине может быть затруднено связывание с рибосомными частицами некоторых рибосомных белков, синтезирующихся в изолированных хлоропластах и это осложняет интерпретирование данных / Eneas-Filho et al., I98I/. - 30 Такие важные вопросы, как регуляция синтеза рибосомных белков в обоих компартментах клетки, определение места форьшрования рибосомных частиц и выяснение механизма их сборки еще ждут своего разрешения. Остается невыясненными также последние стадии образования функционально актршной белоксинтезирующей системы, а именно, формировшше полирибосомочлембранного комплекса и организация его в системе внутренних мембран хлоропластов, 1,5, Структурная организация и химический состав внутренних мембран хлоропластов в онтогенезе Рассмотрение локализации аппарата трансляции в мембранной системе хлоропластов невозмолгно без описания особенностей морфологии и структурной организации мембран этих органелл. Давно известно, что система внутренних мембран хлоропластов вктшчает два вида мембран: плотно упакованные мембраны-тилакоиды гран и ламеллы стромы.Однако вопрос о взаимном их расположении в трехмерном пространстве окончательно еще не решен.Наиболее ранней модели структурной организащш внутренних мембран хлоропластов насчитывается более 20 лет / Мепке,I960/, Согласно ей, тилакоиды гран представлены уплощенными мешками и "прослоены" протяженными во всю длину хлоропласта межграннывш ламеллами. Следующая модель /I'leier, 1963/ дает первые представления о трехмерном строении внутренних мембран хлоропластов. В ней межгранные ламеллы заменены на фреты - структуры в виде трубок, которые непосредственно связаны с тилакоидами граны и сообщаются друг с другом по вертикали. К этому лю времени относится модель ХеслонХаррисона , которая отличается от предыдущей тем, что межгранные ламеллы (фреты) в ней изображены уплощенными пластинчатыми образованиями различных диаметров, которые сообщаются друг с другом - 31 / Heslop-Haxrison, 1962/. Дальнейшие наблюдения позволили этому автору видоизменить первоначальную модель - согласно его новым представлениям, одиночная межгранная ламелла пересекает стопку гран под углом и, таким образом, объединяет несколько гранальных тилакоидов /Heslop-Harrison, 1963/. Несмотря на некоторую упрощенность, эта модель сыграла важную роль в развитии исследований по структуре мембран хлоропластов благодаря постулированию принципа объединения компартментов нескольких тилакоидов гран, который привел к упрочившемуся теперь взгляду на мембраны хлоропластов как на единую целостную систему. Эта идея была поддержана Вермеером, который представил доказательство того, что вокруг граны располагается одна спирально закрученная ламелла /wermeyer, 1964/. Далее Паолило и Фанк подтвердили спиральную организацию ламелл стромы и обнаружили ее правонаправленность (Paolilo , Falk, 19.66/. По их данным, каждый компартмент граны контактирует с восемью ламеллами стромы, которые, в свою очередь, могут взаимодействовать со всеми другими стопками гран /Paolilo, Reinhard, 1967/.В дополнение к этой модели, в недавней работе Мастаджн и Джаносси в результате исследования изолированных гран хлоропластов кукурузы в сканирующем микроскопе авторы показали спиралевидную организацию самих тилакоидов в гране /Musturdy, Janossy, 1979/. По их мнению, такие , спирально уложенные тилакоиды, соединяются друг с другом с помощью одиночных ламелл в единую систему. Имеется также работа, где предложена модель организации внутренних мембран на основе наблюдения хлоропластов в световом микроскопе /wildman et al., 1980/. В этой довольно простой, по сравнению с предложенными ранее, модели, граны, подобно бусам, нанизаны на нить межгранной лаглеллы и расположены по спирали в объеме хлоропласта. 3?раны не перекрывают друг друга, а соседние витки спирали соединяются друг - 32 с другом немногочисленными связующими тилакоидами. По мнению авторов, в данном случае легко представить рост такой спиральной конструкции как наращивание в оба конца, Общим для всех рассмотренных моделей является принцип тесного взаимодействия обоих типов внутренних мембран хлоропластов. Обнаруженная в последние годы спиральная организация гран и мела?ранных ламелл предполагает максимальную интеграцию обеих систем, что, возможно, обеспечивает обмен продуктами световых и темновых реакций. Тесный контакт двух типов мембран хлоропластов также очевиден при электронно-11Ш1^роскопическом исследовании изолированных мембран хлоропластов. Kaic видно на рис. 18,и в этом случае, тилакоиды гран остаются связанными с межгранными ла1\леллами, имеющими вид фрет, и таким образом, входят в состав единого мембранного комплекса.Итак, накопленный к настоящему времени материал по структурной организации мембранной систеглы хлоропластов, позволяет наметить некоторые общие ее принципы (тесная взаимосвязь двух типов мембран, целостность мембранной системы, спиралевидное строение тилакоидов гран и межгранных ламелл), но они еще недостаточны для создания единой модели трехмерного строения мембран хлоропластов, в которой были бы учтены все известные нам сейчас морфологические особенности этих мембран.Наличие двух типов мембран, наблюдаемых в хорошо дифференцированных хлоропластах, предполагало различия в их химическом составе и функции. Совокупность экспериментальных данных позволяет констатировать, что структурной гетерогенности внутренних мембран хлоропластов , действительно, соответствует их функциональная гетерогенность, Молекулы бешсов и пигментов не распределены в мембране равномерно, а образуют различные функциональные комплексы, по- 33 груженные в довольно жидкую белково-липидную мембрану. Лштщ представляют собой существенный компонент внутренних мембран хлоропластов, т.к. они содержатся почти в равном к белку отношении / Lichtenthaler, Рахк, 1963/» Изучение молекулярного состава и особенностей организации функциональных комплексов фотосинтетических мембран является важным направлением в исследовании внутренних мембран органелл и в настоящее время проводится довольно широко. Полученные данные о функциональных различиях двух основных типов мембран зрелых хяоропластов можно обобщить следующим образом.В стромальных межгранных ламеллах локализованы комплексы фотосистемы I (ФС I) и АТР-синтетазы и этот вид мембран является центром циклического фосфорилирования / ВегаЪош et al. ,1974; Miller, Staehelin, 1976; Anderson, 1982/. В свою очередь, комплексы фотосистемы П и связаннае с нивли светособирающие комплексы входят в гранальные мембраны, представляющие активные центры нециклического фосфорилировашш. Комплекс цитохрома Ь -f равномерно распределен в стыкованных и нестыкованных мембранах / Anderson, 1982/.Такие методические подходы, кахс воздействие протеолитических и липолитических ферментов на различные мембраны и фотосинтетические комплексы, а также химичесхсая модификация определенных компонентов дали информацию о взаимном расположении ряда мембранных комплексов и полипептидов. Обнарулилось, что сопрягающий фахстор СР и ферредоксин-НАНФ-редуктааа являются наиболее открытыми, поверхностными комплексами мембран органелл. В противоположность этовлу , активные центры обоих фотосистем экранированы от действия протеаз /Renger et al.,I976; Sovrova et al., 1976/, Ha ДОЛЮ устойчивых к протеолизу белков приходится 50-60/^ белка мембран хло-. 34 ропластов. После удаления липидов и пигментов белки становятся чувствительнБМи к протеолизу, что свидетельствует о важной роли пигмент-белковых взаимодействий и о структурной роли молекул хлорофилла в стабилизации хлорофиллбелковых комплексов /Jennings et al., 1979; Carter, Staehelin, 1980; Lazlo, Gross, 1981/. Эти данные легли в основу схемы молекулярной организации функциональных комплексов фотосинтетических мембран / Wettatein, 1980/ (рис. I ) .При рассмотрении описанных мембранных комплексов необходимо учитывать динамичность их соотношения, что является отражением способности растений адаптировать свой фотосинтетический аппарат к такому важнейшему внешнему фактору, как освещенность. Изменение его приводит к формированию мембран различной ультраструктуры и, следовательно, с различными фотохимическими свойствами, проявляющимися в разном соотношении ФС I и ФС П. В условиях высокой интенсивности света в хлоропластах формируются, главным образом, нестыкованные мембраны - тилшюиды стромы с высокой активностью ФС I и высоким отношением хлорофилла "а" к хлорофиллу "в" 4,2-4,7 /Melis, Brown, 1980; Meier, Lichtenthaler, I98I/. Хлоропласты растений, выращенных при низкой интенсивности света, содержат, главным образом, стыкованные гранальные тилакоиды с высокой активностью ФС П, большим содержанием светособирающего комплекса и низким отношением хлорофилла "а" к хлорофиллу "в" /Andersson, Anderson, 1980; Melis, Brown, 1980; Lichtenthaler et al., 1982/.Мембраны пластид на ранней стадии развития перфорированы. Дтш них характерно содержание небольшого количества протохлорофиллида с максимумом поглощения 630-635 мкм /Klein, Schiff, 1972 /.В зависимости от условий освещения развитие внутренних мембран может протекать различныгли путями, В условиях постоянного освещения первичные мембраны превращаются непосредственно в содержащие хлорофилл, способные к фотосинтезу тилакоиды /Kirk, Tilney-BassetД9б7/. BviecTe с тем, в этиопластах растений, выдерживаемых в темноте, наряду с первичными листками возникает комплекс трубчатых структур, биологический смысл и детали формирования которых до сих пор не ясны. Их образование сопршкено с интенсификацией ряда синтетических процессов. Со временем число трубок возрастает и из хаотически расположенных, они превращаются в регулярные структуры, так называемые проламеллярные тела / Weier, 1970/. Проламелдярные - 37 тела могут образовываться не только в темноте, но и на слабом белом и красном свету /ireffi, 1978/. Стадия образования проламеллярного тела не является обязательной, но она часто имеет место и при нормальном развитии пластид. Некоторые авторы рассматривают появление пролаглеллярных тел как следствие нарушения баланса между синтезом ряда мембранных компонентов и количеством хлорофшла, что делает невозможЕшм организацию их в фотохимически активные мембраны, т.е. они предполагают, что эти структуры являются временным хранилищем мембранного материала.Этиопласты представляют собой удачную модель для изучения развития фотосистем. Естественно возникал вопрос, кшше структуры этиопластов являются центрами их образования. Было обнаружено, что проламеллярные тела содержат стероиды и белки низкого молекулярного веса, а в первичных мембранах локализованы протохлорофиллредуктаза, АТР-синтетаза, каротин, гликолипиды и протохлорофилл /Lutz, 1978, I98I; Ltitz, Klein, 1979/. Однако сведения о локализации в первичных мембранах протохлорофнллредуктазы, по-видимому, являются ошибочными, полученными вследствие сильного загрязнения этих структур проламеллярными телами. Недавно вышедшая работа японских ученых, исследовавших высоко очищенные фракции проламеллярных тел и протилакоидов этиопластов тыквы, привела их к заключению, что проламеллярные тела являются местом локализации фотоактивного протохлорофиллидоксидоредуктазного комплекса, содержащего 95% протохлорофиллида этиопластов /ifeeuchi, Murakami, 1983/.На долю этого фермента, имеющего молекулярную массу 33 кДа / Ryberg, Sundqvist, 1982/ или 36 кДа /ikeuchi, Murakami, 1982/, приходится более 70% белка этих структур /ikeuchi, Murakami,1982/.Наряду с этим, основным белком в пролаглеллярных телах имеется несколько минорных полипептидов и значительное количество каротинои- 38 дов. в свою очередь, первичные мембраны, на долю которых приходится до ЪЪ% белка этиопластов, являются центрами формирования фото+2 систем. В этих структурах обнаружена высокая активность Са -зависимой АТР-синтетазы, субчастицы которой с мол.массой 55 кДа были идентифицированы среди 20 полипептидов /wellburn, 1977; Ryberg, Sundqvist, 1982/.Уже через полчаса освещения в первичных мембранах развивается способность к синтезу АТР /Wellbiirn, Натр, 1979/. Хлорофилл "а" появляется очень рано и через 24 часа освещения его содержание достигает максимума, в то врегля как хлорофилл "в" накапливается медленнее. Активность фотосистемы I фиксируется также после получасового освещения и возрастает в течение 8 часов. Фотосистема П формируется позднее, - через 4 часа освещения / Henningsen,Boardraaii, 1972/. Одновременно усиливается выделение кислорода и это усиление коррелирует с увеличением числа стыкованных тилакоидов /Piesnicar, Bendall, 1973; Strasser, Bulter, 1976; Backer, Leech, 1977/.Значительно активизируются синтетические процессы (синтез хлорофилла, синтез пластидоспецифичных РНК и белков) .Необходимые для этого затраты энергии в первые часы освещения, по-видимому, восполняются за счет окислительного фосфорилирования в. .митохондриях /Wellburn, Hampp, 1979/.Наиболее ранним признаком перехода этиопластов в зрелые хлоропласты является резкое усиление синтеза РНК, которое предшествует образованию хлоропластных пигментов и белков. Растения, в которых при этиолировании пластидная Р Ж не накапливается, при экспонировании на свету зеленеют медленнее. Таким образом, предполагается, что быстрота превращения этиопласта в хлоропласт зависит от числа предсуществувэщих пластидных рибосом /вуег et al., 1971/. - 39 Сейчас есть все основания считать, что проламеллярные тела непосредственно в организацию тилакоидов не вовлекаются. Они являются центрами фотопревращения протохлорофиллида, а также источником ^-каротина и некоторых полипептидов, необходимых для развивающихся первичных мембран /WelllDurn, Hampp, 1979/.Светоиндуцированное превращение этиопластов в хлоропласты, содержащие развитые мембраны обоих типов - тилакоиды гран и тилакоиды стромы происходит в условиях продолжительного освещения растений (порядка 8 часов). Изменение светового режима, температуры и других внешних факторов могут привести к формированию агранальных хлоропластов или, наоборот, к появлению гигантских гран /Klein, 1982/.Приведенные здесь данные свидетельствуют о существенных и теперь уже неоспоримых различиях двух типов мембран зрелых хлоропластов - тилакоидов гран и ламелл стромы по химическим и функциональным свойствам. Развитие этих работ привело к наступлению нового этапа в исследовании фотосинтетических мембран, при котором они ведутся с учетом локализации и пространственной организации входящих в эти мембраны функционально активных комплексов. Вместе с тем, несмотря на интенсификацию работ в этом направлении, причины возникновения констатируемых различий в литературе не обсуждаются.2.2. Выделение хлоропластов В а р и а н т I.В а р и а н т 2.Для получения хлоропластов использовали буфер, описанный Сидделом и Эллисом для выделения интактных хлоропластов: (25 Ый Хепес- NaO^ рН 7,6 , 2 мМ ЭДТА (динатриевая соль), 2 мМ изоаскорбата Na , 0,35 М сахарозу /siddel, Ellis, 1975/. - 4 1 Условия гомогенизирования и центрифугирования описаны в варианте I. Полученный осадок хлоропластов переводили в буфер А и переосаждали хлоропласты как описано в варианте I.Для освобождения хлоропластов от загрязняющей ядерной ДЕК суспензию хлоропластов в 0,5 М сахарозе обрабатывали ДНК-азой ( Wort|g.ngton ) , 100 мкг/мл во льду при периодическом встряхивании 30 мин. Для удаления ферлента хлоропласты двалсды переосшкдали в 0,5 М сахарозном трис-НС1 буфере (рН 7,6), содер}кащвм 50 Ш ЭДТА при 4000 g 7 мин, а затем I раз в буфере А.

2,3. Получение фракций хлоропластных мембран Осадок хлоропластов подвергали осмотическому шоку, суспендируя его в ТША буфере без сахарозы в гомогенизаторе. На I г веса сырого осадка хлоропластов добавляли 7 мл буфера, через 2 мин гомогенизированш! к суспензии добавляли 2 М сахарозу в ТШ буфере до концентрации сахарозы 0,5 М.

2,4. Обработка мембран хлоропластов детергентами Суспензию мембран хлоропластов (0,5 мг бел1ш/мл) в 0,5 М сахарозе (ТШД буфер), обрабатывали последовательно 0,5^ дезоксихолатом Na при постоянном встряхивании во ль.ду 15 мин, затем добавляли 10^ тритон X-I00 до конечной концентрации 0,4^ и продолжали обработку еще 15 мин.2.5. Обработка мембран хлоропластов ферментньми препаратами 2,5.1. Обрабоиса мембран хлоропластов трипсином Суспензию осмотически разрушенных хлоропластов или фракции мембран хлоропластов после раскапьшания ступенчатого градаента и разведения их до концентрации сахарозы 0,5 М обрабатывали трипсином 100 и 50 мкг/мл,соответственно, 30 мин во ль.ду при встряхивании.2.5.2, Обработка субмембранных фракций хлоропластов рибону1слвазой К полученной из градаента фракции добавляли РНК-азу (Wor^ngton ) 500 мкг/мл и инкубировали с ферментом во льду 30 мин, При исследовании влияния РНК-азной обработки на включение С-аминоююлот в белок, суспензию мембран перед внесением меченых аминокислот прединкубировали с ферментом 25 мкг/мл во льду 15 мин.2.5.3. Обработка субмембранных фракций хлоропластов дезоксирибонуклеазой К мембранной фракции хлоропластов, отобранной шприцем из градиента и разведенной до концентрации сахарозы 0,5 М, добавляли ^ 4 3 ДЕК-азу ( Wortl^ngton), 100 мкг/мл и обрабатывали во льду при встряхивании 30 мин.2.6. Определение белка и хлорофилла во фракциях мембран хлоропластов К суспензии хлоропластных мембран добавляли холодный ацетон до конечной концентрации Ъ0% и оставляли при -20*^ на I час. Затем центрифугировали при 3000 g 15 мин на холоду. Надосадочную жидкость использовали для определения хлорофилла по Арнону /АХПОП, 1949/. Осадок мембран экстрагировали I раз смесью этанол: эфир: хлороформ /2:1:1/ и центрифугировали в том же режиме.Осадок использовали для определения белка по методу Лоури в модификации для нерастворимых белков /Lowry et al., I95I/. Для построения калибровочной кривой использовали сьшороточный альбугл1Ш человека. Измерения проводили при 500 нм на спектрофотометре СФ-4А.

2.7. Определение РНК во фракциях мембран хлоропластов В а р и а н т I.В а р и а н т 2.Осадок удаляли центрифугированием при 3000 g 10 мин, а надосадочную жидкость исследовали на содержание РШС Измерение оптической плотности проводили при 260 нм и рассчитывали содержание РНК, исходя из того, что I ед. опт. плотности соответствует концентрации РНК, равной 31,7 мкг/мл. - 45 2.8, В1д1ючение С-агжнокислот в белки мембранных фракций хлоропластов В а р и а н т I .В а р и а н т 2.2.9. Получение надосадочнои Ш1Дкости 200000 g из хяоропластов гороха Хлоропласты выделяли из 20-25 г двухнедельных проростков гороха, выращенных при 12 часовом релшме освещения, перед опытом проростки выдер:кивали сутки в темноте для удаления крахглаяа. Хлоропласты проглывали два раза буфером А, затем разрушали осмотическим шоком в ТША буфере (без сахарозы) 15 мин во льду на 1^чалке.Затем центрифугировали при 20000 s 20 мин, осадок отбрасывали, надосадочную лщдкость центрифугировали при 200000 s 1,5 часа. Проводили диализ полученной лсидкости в I л ТИЛ буфере во льду 23 часа. Д^гализат имел концентрацию белка 310-320 мкг белка в I мл.2,10. Выделение рибосом из кяеток Е. coli штамм МКЕ боо 20 г заморолсенных клеток растирали в ступке на холоду с равным количеством окиси алюмшшя в 100 мл буфера 0,01М трис-НС1 (рН 7,1), 0,02 MgClg , 50 мМ NH^ci , I мМ /-глеркап то этанола.К концу растирания добавляли 0,5 мл раствора ДНК-азы (500 мкг/мл, Wortington ). Центрифугировали гомогенат 30 мин при 16000 об/мин на холоду. Из надосадочнои жидк;ости осалздали рибосомы центрифугированием в роторе А^ 192 на центрифуге СКБ-40 при 38000 об/мин 90 мин. Осадок рибосом суспендировали в том же буфере и осалсдали из суспензии агрегаты рибосом при 20000 об/мин 25 мин. Очищенные рибосомы получали из надосадочнои ла1Д1юсти центрифугированием при lOSOOOg 90 мин. - 4 8 2.II, Выделение высокомолекулярной РШС из мембран хлоропластов Р Ж из мембран хлоропластов выделяли по методу, описанноглу Ленингом с некоторыми модификациями /Loening, 1967/. Осадок мембран гомогенизировали в Т Ш буфере, содержащем 1% ДЦС-На , добавляли равный объем фенольнои смеси: свежеперегнанный фенол, насыщенный Т Ш буфером, 10^ m -крезола и 0,1^ 8-оксихинолина, рН 7,4.2.12, Фракционироваьше Р Ж в полиакрилаглидном геле Разделение нукяеиновых кислот проводили в вертикальных трубках размером 5,5 мм х 75 в/М в комбинированном геле, содержащем 2,5^ полиакриламид и 0,5^ агарозу, как описано у Боркыо и Нейлора / Bouxgue, Naylor, I97I/. ЭлектроДный буфер содерл-сал 0,03бМ трио, 0,03 М NaHgPD^ , 0,001 М ЭДТА, DDC-Na 0,2^ (рН 7,8). « 4 9 Электрофорез проводили 2-2,5 часа при силе Toica 5 мА на труб:^.На гель наносили 10-50 мкг РШС в электродном буфере с 10^ сахарозой и маркером бромфенол синим (0,001^) в объеме 50 мкл. Электрофорез проводили в камере Еио-2-Рэд Модель 155, США.. После электрофореза гели помещали в 1% уксусную 1сислоту, сканировали при 265 нм в Длюйс-Лоэбл-Хромоскане, Англия. Гели окрашивали 0,2^ раствором метиленового синего в смеси равных частей 0,4 М ацетата Na и 0,4 М уксусной 1ШСЛ0ТЫ (рН 4,7). Окрашивание проводили в течение 2-16 часов после 15 мин иш^бации в I М уксусной кислоте.Ддя решения этого вопроса необходшло было разделить мембраны зрелых хлоропластов на фракцию, обогащенную тилакоидами гран и фракцию, представленную, главным образом, ламеллами стромы. Как уже было отмечено в обзоре литературы, для мембранной системы хлоропластов характерно тесное взаимодействие двух видов мембран, объединяющее их в единую, целостную систему и это явилось существенным осложнением поставленной задачи, тем более, что мембранную систему необходимо было расфракционировать без применения детергентов и сильных механических воздействий, приводящих к фрагментации мембран. Поэтому мы пошли по пути поиска стадии развития хлоропластов, когда такое разделение оказывается возможным, сознавая, что полное отделение мембран двух типов практически недостийшло и рассчитывали на получение мембранных фракций, в значительной степени обогащенных каким-либо одним ишом мембран.Такое разделение мембран хлоропластов о1сазалось возможным - 52 при использовании 11-дневных проростков гороха, экспонированных на свету 19 часов при интенсивности освещения 2500 люкс. Центрифугирование суспензии разрушенных осмотическим шоком хлоропластов в ступенчатом градиенте сахарозы (А) приводит к разделению субструктур хлоропластов на три слоя: I - опалесцирующий бесцветный слой и две зеленые мембранные фракции, лежащие на границе I М 1,5 М сахарозы (фракция П) и на границе 1,5 М - 2 М сахарозы (фракция Ш) (рис.2).1.0 М 1.5 М 2.0 М ZZZZZZZZZ g» ч1/ и III Рис.2. Схема разделения суспензии осмотически разрушенных хлоропластов в ступенчатом градиенте сахарозы А Условия выделения хлоропластов см. в разделе 2.2 вариант I, условия центрифугирования см. в разделе 2.3. Возраст растенийII дней, освещение - 19 часов.Электронно-микроскопическое исследование полученных фракций показало, что фракция I представлена мономерами рибосом, которые из-за большого количества отромального белка удается увидеть только при IO-15-кратном разведении фракции. В верхней мембранной фракции П обнаружены связанные друг с другом и отдельные ламеллы, - 5 3 многие из которых перфорированы и лишены центральной части. Такие связанные по нескольку штук мембраны образуют обширные сети, На рис.3 представлены фрагменты такой сети. Низший, основной темнозеленый слой (фракция Ш) неоднороден по составу. Он содержит два вида структур: электронно-прозрачные мембраны, в которых находятся отдельные (рис.4,а) и связанные друг с другом тилакоиды (рис.4,б), а также крупные фрастленты хлоропластов, состоящие из слипшихся тилакоидов гран (рис.4,в) и отдельные тилакоиды (рис.4,г).Таким образом, в результате центрифугирования довольно агарные ламеллы, не содержащие плотных вюшчений, располагаются в верхней части градиента, а мембраны, нагруженные тилакоидами гран,опускаются в нижний слой. Повторное центрифугирование в градиенте сахарозы с целью улучшения отделения различных мембран друг от друга оказалось малоэффективным вследствие дополнительного резкого изменения осмотических условий, приводящих к необратимому сжатию и слипанию структур. Лучшее разделение суспензии разрушенных хлоропластов с наигленьшим взаимным загрязнением структур достигается при центрифугировании в градиенте малого количества материала (1-2 мг белка мембран на центрифу}шую пробирку).3.1.2. Содержание белка и РНК в мембранных фракциях хлоропластов При определении химического состава описанных мембранных фракций оказалось, что oiffi существенно отличаются по соотношению белка и РНК (табл.1). Фракция, обогащенная гранадьными тилакоидами, в 2 раза богаче РШ^ по отношению к белку, чем фракция ламеллярных мембран. Повышенное содержание во фракции тилакоидов гран Р Ж указывало на возможную связь рибосом с этим видом мембран. - 54 « Рис. 3 . Элексронно-микроскопическде фотография типичных структур фракции I I . Возраст растений - II дней, освещение 19 часов. -- 55 Рис, 4. Электронно-микроскопические фотографии типичных структур фракции III.Возраст растений - II дней, освещение 19 часов. -» 56 — Таблица I Содержание белка и РНК в мембранных фракщшх хлоропластов Фршсция Белок РНК РЖ, в ^ к их сумме мкг на мг белка I 92,8 8,0 87,3+3,6 п 91,3 8,7 95,3+8,2 Ш 84,2 15,8 188,8+9,1 Па 78,3 21,7 245,7+41 Ша 87,0 13,0 145,8+9,7 Шс 83,6 16 4 193,5+15 Хлоропласты выделяди из 11-дневных проростков, экспонированных на свету перед опытом 19 часов (вариант I). Разделение мембран в ступенчатом градиенте сахарозы описано в разделе 2.3. Обработка мембранных фракций детергентами описана в разделе 2.4. Определение белка, РНК описано в разделах 2.6 и 2.7.3.1,3. Белоксинтезирующая функция двух типов мембран хлоропластов Предположение о преимущественной связи рибосом с фракцией, обогащенной гранами, подтвердилось в экспериментах по исследованию белоксинтезирущей активности мембранных фракций. После инкубации фрагментов хлоропластов (осадок при 40000 g из суспензии осмотически разрушенных хлоропластов) с С-аминокислотами и последующего разделенияшмбран в градиенте сахарозы А, радиоактивность, в основном, связана с белками фракции Ш, т.е. фракций, обогащенной гранами (табл.2, опыт I). Это включение осуществляется белоксинтезирующей системой, локализованной в данной фракции, т.к. - 57 ^ при инкубации с С-аминокислотами мембран, предварительно разделенных в градиенте (табл.2, опыт 2). Фракция Ш также включает метку в белки значительно интенсивнее фракции П. Еююченная метка прочно связана со структурами этой фракции и не удаляется из них после обработки детергентами (0,5% DOX-Na 0,4% тритон Х-ЮО) и последующего повторного центрифугирования в градиенте сахарозы. Структуры, получающиеся после обработки детергентами и прочно удерживающие насцентные белки, будут описаны ниже (табл.2, Ш с).Сравнение ингибирующего действия хлорамфеникола и циклогексимида в белхш фракции Ш показало, что хлорамфеникол подавляет интенсивность включения на 56-72%, а циклогексимид снижает его лишь - 58 на 8-10^ (табл.3). Это позволяет заключить, что включение ведется, в основном, не загрязняющими фракцию цитоплазматическими, а хлоропластными рибосомами.Возраст растений - II дней, освещение - 19 часов.Включение в белки этой фракции чувствительно к РНК-азе и требует экзогенных АТР и GTP . Фосфоэнолпируват и РЕР-киназа действуют на включение отрицательно (табл.4).В противоположность этому, включение -^"^С-аминокислот фракцией Ш при добавлении смеси немеченых аминокислот не изменяется.Возраст растений - 12 дней, освещение - 19 часов. рат существует в обеих фршщиях, но его структурная организация в этих мембранах, по-видимому, различна. В случае тилакоидов полирибосомы находятся внутри замкнутой структуры, в которой могут содержаться а1линокислоты, а в мембранной фракции П полирибосомы, или, по крайней мере часть из них, возможно, в большей степени экспонированы на поверхность мембраны. Если это так, то за белоксинтезирующую функцию мембран фракции П ответственны не только полисомы тилакоидов, неизбе^шо попадающие в данную фракцию, но и полисомы иной структурной организации. Наконец, в настоящее время нельзя полностью исключить возможность присутствия во фракции мембран П примеси некоторого количества свободных полисом, Данные о высоком содержании Р Ж и биологической активности фракции мембран Ш, указывающие на связь белоксинтезирующего аппарата с тилакоидами гран, согласуются с ранее полученными сведениями о локализации полисом внутри тилакоидов гран /Филиппович и др., 1970/. Что же касается фршщии мембран П, то в белковом синтезе она менее активна и содержание РШ{ в ней существенно ниже, чем во фракции Ш. Вместе с тем, не исключено, в этой фракции присутствует некоторое количество полисом, не принадлежащих тилакоидам гран, структурная организация которых еще не ясна.3.1.4. Электроннонмикроскопическое исследование мембранных фракций хлоропластов, полученных после обработки детергентами После обработки верхней мембранной фракции П детергентами (0,5^ DOX-Na и 0,4^ тритон X-IOO) и повторного центриф71^рования в аналогичном градиенте сахарозы, солюбилизированные липиды и хлорофилл локализуются в верхней части градиента, а остающиеся бесцветные и бледно-зеленые структурные компоненты располагаются в той же области градиента, что и исходная фракция (рис.5 Б, фракция Па). В отличие от исходной фракции, в ней практически нет целых, неповрежденных ламелл. Она представлена сетевидными структурами, с которыми связаны тилакоиды гран и их фрагменты (рис,6).При этом в данной фракции изменяется соотношение белка и Ш К в пользу РНК, Ее содеркание по отношению к белку в среднем увеличивается в 2-2,5 раза (табл.1). По-видимому, основная масса РНК, связанная с этими мембранами, находится в устойчивой к детерген- 62 А [ В 1,0 М t.SM 2,0М L ав&г тттп ^ йа sm • I8X нао.у/, [ j -wo V—/ TpumiHX ш J o.nv, Рис* 5<» Распределение мембранных фракций хлоропластов при центрифугировании в ступенчатом градиенте сахарозы (описано в разделе 2.3).А - разделение осмотически разрушенных хлоропластов без обработки; Б - разделение мембранных фракций хлоропластов II и III после обработки детергентами (описано в разделе 2,4).Возраст растений - II дней, освещение 19 часов. -» 63 •• J i^ "0,5 МИЛ"? Рис; 6, Эяектронно-микросконические фотографии типичных структур фракции II а; Обработка детергентами описана в разделе 2*4, разделение в ступенчатом градиенте А в разделе 2.3.Возраст растений - II дней,, освещение 19 часов» 64 там ее части. ТакшУ! образом, указанные детергенты солюбилизируют, главным образом, липиды и липопротеиды и не затрагивают структуры, содержащие РНК. Структуры фракции Ш в результате обработки детергентами и центрифугирования в градиенте сахарозы разделяются на две фракции (рис.5 Б), Структуры, располагающиеся в них, однотипны, В вышележащем слое находятся отдельные ламеллы, с которыми соединены сравнительно небольшие, оставшиеся от гран цепи, а в нилсней фракции эти структуры значительно обширнее и представлены длинными, разветвленными цепями, достигающими большой величины (рис.7 а,б).На фотографии (рис.7) виден фрагмент, составляющий, примерно, одну пятую часть от целой сети. Обработка мембранной фракции , обогащенной, гранами, детергентами, кроме того, приводит к интенсивному выходу из мембран РШ^-содержащих структур в виде 1сольцевых полирибосом, которые были исследованы ранее в линейном градиенте сахарозы 5-20^ /Филиппович и др., 1970/. Выход полирибосом из тилакоидов гран, по-видимому, является одной из причин лишь незначительного увеличения содерзсания РНК во фршщии Ш с по сравнению с исходной фракцией мембран III при существенных морфологических изменениях субструктур. Второй причиной этого может быть удаление сопутствующим мембранам фракции Ш цитоплазматических рибосом, происходящее в результате обработки детергенталш и повторного центрифугирования. Обнарулюнные нами во фракции Шс структуры, пс. -видимому, представляют остов мембраны, несущий белок и РНК. Это позволяет предполагать, что новообразованные полипептиды преимущественно локализуются в этих структурах, а то , что включенная метка не удаляется детергентами, указывает на возможную гидрофобную природу этих полипептидов.Центрифугировали в интервале ускорений 40000-150000^. Рибосохлы центрифугировали в линейном градиенте сахарозы 5-50^ при 24 ОООоб/мин, ротор 25, 2 часа.Возраст раотений - 12 дней, освещение - 19 часов. - 68 3.1,6. Электрофоретическое разделение РШС, выделенной из мембран хлоропластов Выше было показано, что фракция мембран П, представленная, главныгл образом , ламеллами, содержит 8-10^ РНК по отношению к белку. Эта РНК практически не освобождается из мембран при действии детергентов в составе рибосом, а остается связанной с неподдающимися воздействию детергентов областями мембран, имеющими вид сетей (рис.6).Настоящее исследование представляет собой первую попытку выявить рибосомы, связанные с разными изолированныгуЩ мембраналш зрелых хлоропластов. Мембранную систему развитых органелл оказалось возможным разделить на две морфологически различающиеся фрашдаи при использовании хлоропластов определенной стадии развития, которые были выделены из 11-дневных проростков гороха, экспонированных на свету 19 часов.Из полученных данных следует, что обе фракции мембран содержат рибосомные РШ{, способны включать С-аминокислоты in vitro и при обработке тритоном X-I00 из них могут быть изолированы рибосомы. Одншш, по всем этим свойствам мембранная фракция, обогащенная тилакоидами гран, существенно превосходит фракцию, содержащую ламеллы стромы. Данные о приуроченности белоксинтезирующего аппарата к гранальным тилакоидам вполне согласуются с ранее полученныгли сведениями о существовании в тилакоидах гран полирибосом кольцевой форлы /Филиппович и др., 1970/, Что же касается фракщш ламелл стромы (фракция мембран П ) , то на основа- 7 3 НИИ имеющихся данных можно высказать лишь предпологсение.Некоторое количество РНК, определяемое во фракции этих мембран, и слабо проявляющаяся белоксинтезирующая функция могут быть следствием попадания в данную фракцию части свободных полирибосом и (или) тилакоидов гран, в которых заключены. полирибосомы. Пожалуй, единственным указанием на существование полисом, связанных с данным типом мембран является разный эффект смеси аг/ишокислот и диализованной надосадочной фршодии хлоропластов на включение С-аминокислот фракцией П и Ш, что может свидетельствовать о неодинаковой топографии белоксинтезирующего аппарата в разных типах мембран, то. что опоообнооть к включению "с_ашнокиолот в белки этой фракции заметно стимулируется в присутствии указанных добавок указывает на большую экспонированность полирибосом ламеллярных мембран на поверхность. Кроме того, вероятно, что в процессе выделения эти мембраны теряют не только аминокислоты, но и некоторые другие необходшлые кофакторы белкового синтеза (табл.5). Не исключено, что в данном типе мембран могут присутствовать полирибосомы, поразному с ней связанные. Из литературы известно, что часть рибосом слабо связана с мембранами органелл и может быть удалена из них обработкой 0,5 М KCI и пуромицином, причем такие слабосвязанные рибосомы обнару:шваются преимущественно на ранних ста.диях формирования мембран хлоропластов /Филиппович и др., 1975; Ledoight, Lowell, 1979/. Другой клдсс полирибосом, более прочно ассоциированный с мембранами, требует ,для своего освобождения воздействия детергентов / Chua et al., 1973; Margulies, Michaels, 1974; Ledoight, Lowell, 1979; Tamomoto et al., 1981/.Проведенное нами изучение действия детергентов показало, что в мембранах помимо РНК, освобождаемой в виде рибосом и полисом (рис.8), существуют структуры в виде сетей (рис.7), которые несут - 74 в себе РНК, не удаляющуюся при обработке DOX-Na и тритоном Х100 (табл.1). То, что часть РНК мембран (20-30^) не удаляется из мембран при любых комбинациях обработок, было обнаружено в ряде других работ / Chua et al., 1973; Margulies, Michaels, 1974; Филиппович и др.,1976; Yaraomoto et al.,1981/. Результаты наших исследований приводят к выводу, что РНК, прочносвязанная с мембранами, принадлежит выделенным из мембран сетевидным структурам.Морфология структур , несущих прочносвязанную РНК, описана нами впервые. То, что они прочно удерживают радиоактивную метку, включенную в полипептиды даже после обработки мембран детергентами (табл.2), соответствует данным литературы, согласно которым 20^ новосинтезированных in vitro продуктов являются внутренними мембранными белками хлоропластов табака / Chen, Wiidman, 1970/. По-видимому, именно эти белки (25% меченых белков) хлоропластов гороха не удаляются протеолизом даже после предварительной обработки мембран детергентами / Alscher et al., 1978/. Однако пока неизвестно, какие рибосомы - освобождаеглые детергентами, или остающиеся в мембране после такого воздействия, ответственны за синтез этих полипептидов.Обнаруженное нами включение - 75. •^^G-аминокислот в белки, осуществляется главным образом,70 s рибосома^ли, т.к. оно сильно подавляется хлорамфениколом и слабо - щ шюгексимидом (табл.З), Вдесте с тем, низкая чувствительность включения к циклогексимиду не является достаточныгл тестом на отсутствие загрязнения мембранных структур хлоропластов цитоплазматическими рибосомами,т.к. они могут быть "непрограммнрованными" и в этом случае ингибирующий эффект цикдогексимида не должен быть высоким.Последнее нашло подтверждение в наших опытах, показавших наличие вполне ощутимого количества Ш К цитоплазматических рибосом в мембранных фракциях при слабом ингибировании включения циклогексимидом.Во многих работах по изучению мембрано-связанных полирибосом оценка выхода РЛК-содержалщх структур из мембран проводится исключительно по химическому определению РНК, остающейся в мембранах. Из приведенных данных следует, что достоверная оценка содержания Ш К в изолированных мембранах возможна только в опытах с интактными хлоропластами при обязательном контроле на загрязнение их цитоплазматическими рибосомами путем разделения препарата ШК в полиакриламидном геле, В последнее время к такому же выводу приходят другие исследователи /Hattori, Margulies, 1982/.Полученные нами фракции, обогащенные мембранами разного типа, характеризуются не только различной морфологией. Им также свойственны различия в химическом составе, белоксинтезирующей активности и прочности связи РНК с мембранами. Исследования прочносвязанных с мембраной полирибосом находятся еще в начальной стадии изучения. Эти полирибосомы, как и связанные с тилакоидами гран, представляют интерес в связи с возможностью формировать в зависимости от условий освещения мембранную систему хлоропластов в сторону преимущественного образования кшюго-либо одного типа мембран /Melis, Brown, 1980; Meier, Lichtenthaler, I98I/. Формирование нестыкованнБК, ламеллярных мембран, обладающих, главным образом, фотосистемой I, или, наоборот, гранальных тилаксидов с активностью фотосистеглы П, предполагает синтез различных полипептидов и, следовательно, участие их в образовании различных классов полирибосом. Такшл образом, изучение особенностей функционирования полирибосом, связанных с разными типагли мембран хлоропластов, представляется перспективным для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе биогенеза фотосинтетических мембран. Важным направлением в этих исследованиях мы считаем изучение формирования мембран хлоропластов и мембрано-связанного аппарата трансляции на самых ранних этапах развития, когда мембранная система пластид представлена одним типом мембран - первичными мембранами.Существование на ранних этапах развития хлоропластов в мембранах колец с полирибосомами - предтилакоидов свидетельствует о том, что образование тилакоидов гран теснейшим образом связано с формированием полирибосом и образованием особых, несущих полирибосомы надмолекулярных комплексов, которые свойственны только хлоропластам /Филиппович и др., 1976, 1983/. Значительно меньше в настоящее время известно о формировании второго типа мембран хлоропластов - ламеллярных мембран (фрет) и структурной организации в них белоксинтезирующего аппарата. Следующая часть работы посвящена исследованию полирибосом, связанных с первичными мембранами хлоропластов и структур, в которых они ло1сализованы. - 7 7 3,2. Исследование белоксинтезирующего аппарата, связанного с первичными мембранами хлоропластов гороха 3.2,1. Выделение из хлоропластов фракции первичных мембран При исследовании мембрано-связанных рибосом хлоропластов, находящихся на ранней стадии развития, было получено указание на то, что, по крайней мере, часть из них связана с мембранами, которые присутствуют в пластидах еще до образова1-шя тилакоидов гран и лшлелл стромы /Филиппович и др., 1976/. Эти мембраны, образующиеся в этиопластах после стадии проламеллярного тела и существукшще до фор1Ушрования мембранной системы зрелых хлоропластов, называются первичными мембранаг^ш или первичными листками (рис.II), Рис.11. Электронная микрофотография среза хлоропласта Lolium multiflorum (Brangeon, Musturdy, 1979)« В виде фрашдаи первичные мембрш-ш были получены из тло^опластов гороха. Одновременно было установлено, что обработка аген-•78 тами, снимающитли рибосомы с мембран (0,5 М KCI и пуромицин), приводит к выходу из них части (30^) РНК /Филиппович и др., 1976/.Фршщия первичных мембран была выделена из хлоропластов листовой почки IO-11-днввных проростков гороха, экспонированных на свету перед опытом 24 часа. При центрифугировании таких разрушенных осмотическим "шоком" хлоропластов в многоступенчатом градиенте концентраций сахарозы основная часть мембран, кшс правило, находится в нижней области градиента - на границе 1,75-2 М сахарозы.Электронно-мшсроскопические исследования показали, что этот основной компонент мембран представлен фрагментами первичных мембран, которые существенно отличаются от мембран зрелых хлоропластов. Эти мембраны морфологически неоднородны. Они состоят из электроннопрозрачной основы, в которой находятся разнообраз1ше электронноплотные включения /Филиппович и др., 1976; Фил^шпович, Ноздрина 1983/. Мембраны зрелых хлоропластов при центрифугировании в тех же условиях находятся в области 1,5-1,25 М сахарозы и эта фракция представлена крупныгли фрагментами развитой мембранной системы хлоропластов - фретами, с которыми связаны тилакоиды гран.Таким образом, было установлено, что первичные мембраны существенно отличаются от мембран зрелых хлоропластов по седиментационным свойствам. Благодаря этому, по положению в градиенте сахарозы молгно судить 0 стадии развития мембран хлоропластов. Кроме того, было показано, что седиментационная характеристика является тестом на сохранность изолированных первичных мембран при выделении, поскольку в случае разрушения фрагменты мембран равномерно распределяются по всем областям градиента /Филиппович, Ноздрина, 1983/.Наши эксперименты были начаты с повторения опытов с первичны->79 ми мембранами, выделенными из хлоропластов листовой почки. В них мы еще раз убедились в четком соответствии морфологических и седиментационнБХ свойств мембран хлоропластов, т.е. первичные мембраны (рис.12) локализуются при центрифугировании в градиенте сахарозы в области 2-1,75 М сахарозы (рис.12, I ) .Кроме того, основные фрашщи молодых и зрелых хлоропластов заметно отличаются по содержаьпш в них хлорофилла и РШ^ (табл.6).Таблица 6 Содержание хлорофилла и РНК в мембранных фракциях , полученных из листьев разных ярусов Ярус Вид мембраны !Лкг хлорофилла на мг белка М1СГ РШ{ на мг белка о п ы т ы Почка Первичные мембраны 89+4 77+3 24+2 186+10 170+8 Нижний Мембраны лист зрелых хлоропластов 190+7 II8+7 173+9 III+8 98+4 Разделение мембран' хлоропластов в ступенчатом градиенте сахарозы Б описано в разделе 2.3, Ддя определения химического состава взяты основные мембранные фракции: фракции J^ 4-6 хлоропластов, выделенных из листовой почки и фракции i^ 19-21 хлоропластов, выделенных из нижнего листа. Определение хлорофилла, белка и РНК описано в разделах 2.6 и 2.7.Возраст растений - II дней, освещение 24 часа.Дяя первичных мембран характерно сравнительно низкое содерл^ ание хлорофилла и довольно высокое - РНК по отношению к белку. В случае мембран зрелых хлоропластов количество хлорофилла увеличивается, а РНК - падает. '652 - 80 2,0 • I 2' I.Cb .Электронно-микроскопические исследования, результаты которых приведены ниже, показали, что основной мембранный компонент, полученный из хлоропластов проростков, освещавшихся 5-6 часов, состоит из фрагментов первичных мембран.3.2.2, Электронно-микроскопическое исследование изолированных первичных мембран хлоропластов Электронно-микроскопическое исследование фракции первичных мембран показало, что она состоит из фрагментов мембран, отличающихся друг от друга по величине и форме, но построенных по единому плану. Ш. осно^ всегда составляет электронно-прозрачная мембрана, в которой просвечивают разнообразные электронно-плотные включения. Среди этого разнообразия включений можно выделить несколько их типов: сети, образованные двумя параллельно идущши тяжами (рис.15,а); сети, в которых эти тяжи переплетены (рис.15,6); сети, разделенные на фрагменты (рис.15,в); кольцевые структуры, равные по диаметру новообразованным тилакоидам гран (рис.15, г) и новообразованные еще не стыкованные тилакоиды гран (рис.15д,е).Все названные локализованные в первичной мембране субструктурн генетически связаны д и г с другом и формируются одна из другой в порядке их перечисления. На ранней стадии развития в первичных мембранах видны образующие петли два параллельных тяжа . (рис. 16,а). Затем они перекручиваются и вследствие этого в сетях образуются регулярно повторяющиеся утолщения длиной 0,1-0,2 мкм и толщиной 0,04-0,12 мкм (рис.16,б). Такие сети по своей общей архитектонике напоминают фреты зрелых хлоропластов, которые также образованы повторяющимися утолщениями. Поэтому справедливо назвать их фретоподобннми структурами, а поскольку они находят- 85 Рис, 15. Электро1Шо--шкроскопйческие фотографии типичных структур основной фракции мембран, полученной при центрифугировании осмотичес1Ш разрушенных хлоропластов.Возраст растений - I I дней, освещение 6 часов с после.нушдам выдерживанием в телшоте 15 часов. - 86 а в Д • 0,5 мкм е РЕС^ '^ 16* См* подаясь к рис. 15. . 87 г СЯ в первичной мембране и на их основе еще не сфоршрованы тшшкоидн гран- их можно рассматривать как предшественники фрет - предфреты.В ходе дальнейшей диффервшщювкн утолщения фрет трансформируются в кольцевые предтидакоидные структуры, как это видно на рнсЛб в,г,д . Последние служат основой для формирования тилакоидов гран (рнс.16,д,е), В том, что предтилакоиды формируются на основе утолщений фрет, убеждает также характер их расположения в первичных мембранах. Как видно на рис. 17 (а, б) они входят в состав фрет, как их органическая часть.Процесс формирования предтилакоидов на основе утолщений фрет растянут во времени. Во фретоподобных сетях, как правило, обнаруживается лишь несколько цредтилакоидов (ирис.17,в). Реже наблюдается образование предтилакоидов из всех или почти всех утолщений фретоподобных сетей. В таких случаях вместо петли фретоподобной сети обнаруживаются расположенные по кольцу предтилакоиды (рис.16в, 17г) или тЕдакоиды гран (рис.17д).Следует отметить, что даже в мембранной системе зрелых хдоропластов далеко не все утолщения фрет превращаются в предтилакоиды. На рис.18 представлен типичный фрагмент мембранной системы зрелых хлоропластов. Он образован тилакоидами гран и фретами, причем тилакоиды расположены на фретах, вследствие чего значительная часть фрет ими закрыта. Однако, и здесь часть утолщений фрет нетрансформирована. Полное превращение утолщений фрет в тилакоиды гран, очевидно, может происходить лишь в особых условиях, например, при выращивании растений на синем свету, когда на ультратонких срезах в хлоропластах видны одни граны и практически отсутствуют не только фреты, но и строма /Вдасова и др., I97I/.Возраст растений - I I дней, оснещетше 19 часов. - 90 разованию велика ж ответственные за этот процесс органельные и внворганельные системы при необходимости способны обеспечить формирование гран в количестве, достаточном для заполнения ими всего внутреннего объема хлоропластов, Примечательно, что процесс трансформации утолщений фрет в предтилакоиды и затем в тилакоидн гран происходит только в первичной мембране. Об этом свидетельствует то, что в системе внутренних мембран зрелых хлоропластов существуют либо утолщения фрет, либо сформированные тилакоидн и никогда не бывает предтилакоидов, тогда как в первичной мембране существуют все три типа генетически связанных субструктур: утолщения фрет, предтилакои- . ды и тилокоиды гран. Проследить за последовательностью превращений структур, локализованных в первичной мембране и их причастность к гранообразованию нам удалось благодаря тому, что, во-первых, была уловлена стадия развития хлоропластов, содержащих, в основном, данный тип внутренних мембран /Филиппович, Ноздрина, 1983/; во-вторых , оказалось, что эти мембраны существенно отличаются от мембран зрелых хлоропластов по седиментационным свойствам /Филиппович и др., 1976/ и это позволило выделить их в виде фракции; и, в-третьих, изолированные мембраны удалось увидеть под электронным микроскопом сверху как бы "на просвет".Поскольку такие структуры в литературе еще не описаны, их нельзя сопоставить с уже известными. Следует, однако, отметить, что на срезах хлоропластов ранних стадий развития, в первичной мембране хлоропластов уже давно были обнаружены утолщения (см. рис. II), придающие этим мембранам "гофрированность", которые близки по своим размерам утолщениям в изолированных фретоподобных структурах. Существование в первичных мембранах фретоподобных сетей подкрепляется тем, что их архитектоника совпадает с таковой - 9 1 изолированных фрагментов фрет мембранной системы зрелых хлоропластов, а существование цредтилакоидов подтверждается совпадением их диаметров с тилакоидами гран /Филиппович и др., 1976/, а также прослеженной нами генетической связи их с утолщениями фрет и зрелыми тилакоидами. Что же касается тилакоидов гран, то в первичной мембране и в мембранной системе зрелых хлоропластов они идентичны.3.2.3, Выделение из первичной мембраны хлоропластов предфрет и их электронно-микроскопическое исследование Как было показано в предыдущем разделе, первичные мембраны неоднородны. Их основу составляет электронно-црозрачная мембрана, в которой просматриваются электронно-плотные включения. Эти электронно-плотные образования были систематизированы и в результате этого оказалось возможным разделить их на четыре основных генетически связанных между собой типа: I - тонкие сети, образованные паралдельноидущими тяжами; 2 - фретоподобные структуры (предфреты), которые также имеют вид сетей, но отличавзтся от предыдущих структур тем, что состоят из регулярно повторяющихся утолщений; 3 - кольца, равные по диаметру тилакоидам гран; и, наконец, 4 - сформированные в виде дисков тилакоиды.Среди обнаруженных в первичной мембране электронно-плотных образований наибольший интерес представляют кольцевые структуры , предшествующие тилакоидам гран - предтилакоиды и сетевидные структуры - предфреты.Предтилакоиды были изолированы из первичных мембран путем обработки их 0,5 М KCI и пуромицином /Филиппович и др., 1976/ и позднее трипсином /Филиппович, Геловани, 1984/ с последующим х^ентрифугированием в линейном градиенте сахарозы (5-20^). изолированные из первичных мембран хлоропластов предтилакоиды совпадают по диаметру с -.92 кольцевыми структурами, локализованными в первичной мембране и новообразованными тилакоидами зтран /Филиппович и др», 1976/, Предтилакоиды, изолированные из мембран хлоропластов ранних стадий развития, были идентифицированы как кольцевые полисомы, покрытые материалом первичных мембран /Филиппович и др. , 1976/. Сведения о химической природе существующих в первичной мембране сетей отсутствовали. В связи с этим возникла задача: выделить их из мембран и получить данные об их составе и функции. Перед описанием выделения и изучения предфрет мы несколько подробнее рассмотрим их строение в изолированных первичных мембранах (рис.15 а,б,в; рис.16 а,б; рис.17 а,б). Также как и фреты, они имевм? вид больших, соединенных друг с другом колец и петель, образованных тяжами, состоящими из регулярно повторявзщихся утолщенных образований длиной 0,1-0,2 шт и толщиной 0,04-0,12 мшл. Величина таких петель широко варьирует и может достигать 15 мкм и более. В некоторых случаях в изолированных мембранах нарушается их электронно-прозрачная часть и вследствие этого сети оказываются открытыми (рис.15 в), что дает возможность, во-первых, увидеть и описать их морфологию более детально и, вовторых, использовать их в качестве эталона при электронно-микроскопическом изучении сетей, изолированных из первичных мембран при действии разных агентов.Для выделения фретоподобных структур (цредфрет) необходимо было освободить их от основной массы первичной мембраны,а именно, от ее электронно-прозрачной части, а также от других освобождающихся из этих мембран структур. Ранее сходные по строению структуры были выделены из первичных мембран с помощью 0,5 М ECI. При такой обработке наблюдалось смещение фракции первичных мембран в ступенчатом градиенте в область менее концентрированной сахарозы и под электронным микроскопом были обнаружены сетевидные структуры, в значитель^ 93 ной степени еще покрытые материалом первичных мембран /Филиппович, Ноздрина, 1983/, Для выделения из первичных мембран предфрет мы сначала использовааи обработку тритоном Х100 (0,4^) и дезоксихолатом Na (0,5^).Эти опыты были проведены еще до разработки метода выделения первичных мембран и поэтому мы использовали растения, выращенные на свету 19 часов, В этом случае электронно-плотные включения первичных мембран, в основном, представлены зрелыми тилакоидами, а не их предшественниками, Тем не менее, при центриф71Щ)овании мембран хлоропластов в градиенте сахарозы в средней части располагалась фракция, в которой под электронным микроскопом были обнаружены фрагменты фрето

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Безсмертная, Ирина Николаевна

1. Р1з зрелых хдоропластов проростков гороха выделены две фракции мембран, одна из которых обогащена иьяакоидами гран, а другая - ламеллами стромы. Фракция, обогащенная тилакоидамж гран, содержит в два раза больше РШ{ и с нею связано значительно боль ше интенсивно фушщпонирующих рибосом, чем с фракцией, обогащен ной ламеллами стромы.2. С помощью обработки детергентами ( Dox-Ыа и тритона X-IOO) из фракции ламелл стромы выделены устойчивые к детерген там, содер}кащив РНК сетевидные структуры, а из фршщни, обога щенной гранами - интенсивно включающие С-аминокислоты полирибо сомоподобные структуры.3. Из интш^тных хлоропластов выделены мембраны, практически свободные от цитоплазматических рибосом. Показано, что состав рибосомных РШС является тестом на загрязнение мембран цитоплазма твяеоюшш. рибосомами.4. В результате электронно-микроскопического изучения выде ленных из хлоропластов первичных мембран прослежена генетичемсая связь между локализованными в первичной мембране электронно-плот ными ультраструктурами. На paifflnx стадиях развития в первичной мембране существуют скрученные в петли л кольца два параллельно идущих тяжа, которые переплетаются и превращаются во фретоподоб ные сети. Регулярно повторяющиеся утолщения фретоподобных сетей трансформируются в кольцевые структуры - предтилакоиды, на основе которых формируются тилакоиды гран.5. Показана неоднородность первичных мембран хлоропластов по структуре, проявляющаяся в разделении их на две части - элек тронно-прозрачную и электронно-плотную, по чувствительности бел ков этих частей к протеолизу трипсином, содерл^анию РНК и хлоро филла. 6. Обработкой трипсином с последующим ультрацентри^О^гирова нием в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы получена фрак ция фретоподобных сетей (предфрет), морфологически идентичных фретоподобным сетям, обнаруженным в первичных мембранах.7. Фретоподобные сети содер^кат прочносвязанную РШ{ , (150 мкг/мг белка), которая необходима .для сохранения целостнос ти изолированных сетей. Охш устойчивы к действию трипсина и чув ствительны к РШ^-азе, Чувствительность к РНК-азе сохраняется у фрет в зрелых хлоропластах.8. Во фретоподобных сетях заключен интенсивно функцно1шрую щий белоксинтезирующй аппарат и сосредоточена основная часть хлорофилла первичных мембран. Формирование на основе фретоподоб ных сетей предтилакоидных и тилакоидных структур сопровождается интенсификацией синтеза белка.Полученные сведения позволяют рассматривать фретоподобные сети как раннюю в онтогенезе структуру, в которой белоксинтези рующая функция объединена с процессами фотосинтеза,

9. Развито представление об изменениях структурной организа ции полирибосом, связанных с первичными мембранами и их роли в формировании мембранной системы зрелых хлоропластов.ДНК-аза РШ{-аза РЕР-киназа РДФ-карбоксилаза ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ информационная рибонуклеиновая кислота рибосомная рибонуклеиновая кислота транспортная рибонуклеиновая Кйслота дезоксирибонуклеаза рибоиуклеаза дезоксихолат натрия додещ1лсульфат натрия фосфоэнолпировиноградная кислота фо сфо энолпируваткнназ а трихлоруксусная кислота линейный градиент сахарозы аденозинтрифосфорная кислота гуанозинтрифосфорная кислота Дальтон кнлодальтон рибулозо-1,5-дифосфат-карбоксилаза Выражаю самую сердечную и глубокую благодарность моему научному руководителю Ирине Иосифовне Филиппович за постоянную заботу, участие и помощь в проведении этой работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Безсмертная, Ирина Николаевна, 1984 год

1. Кислякова Т.Е. ,Богачвва Й.И. ,Голубкова Б.М.,Шлыкова И.М.1976.

2. Структура и функция фотосинтетического аппарата у некоторых видов папортниковидных и голосеменных.-Журнал общей биологии, т .ХХХУ11 ,)Ю, с. 870-885.

3. Мйжульска Е.И.,Одинцова М.С,Сиоакян Н.М. 1962. Выделение и характеристика рибосом хлоропластов.-Биохимия,т.27, №&, 1. C.I06I-I070.

4. Молчанов М.И. .Мезенцев В.В. 1978. К изучению функциональной ролиаминоацилфосфатавдилглицеринов в ламеллярной системе хлоропластов.-Биохимия, т .43,.Ш, с. I429-I437.

5. Насыров Ю.С,Алиев К.А.1970. О двух системах синтеза белков вформировании хлоропластов проростков гороха.-Докл. АН Тадж. 1. ССР,т.13,Н,с.50-53.

6. Насыров Ю.С,Алиев К.А.,Абдулаев X.А.1974. О взаимодействии генетических факторов растительной клетки в формировании структуры и функции хлоропластов.-М.:Наука,с.40-44.

7. Новоселов А.А.1955. Комнатное растениеводство методом водныхкультур.-М.:Учпедгиз,112 с.

8. Одинцова М.С.,Микульска Е.О.,Турищева М.С. 1970. Электронномикроскопическое исследование ДНК хлоропластов и митохондрий гороха.-Мол. биология,т.4,вып.6,с.889-898.

9. Сиоакян Н.М.,Филиппович И.И.,Светайло Э.Н.1962. Участие рибосомхлоропластов в синтезе белка.-Докл. АН СССР,т.147,№2, с.488-489.

10. Филиппович Ю/1^, Ноздрина В, Н.,1983» Изолирование и электронно^микроскопическая характеристика первичных мембран хлоропластов гороха*. Физиол. раот., т. ЗО,, вып. 2, с» 233-240, --130.

11. Филлипович И.И.1979.Изучение белокоинтезирующей системы хлоропластов. -Дисс. докт. биол. наук. М.: с. 295-310.

12. Филиппович И.Й.,Алина Б.А.,Тонгур A.M. .Опарин А.И.1971. Исследование структурной организации белоксинтезирующей системы хлоропластов.-В сб.:Генетические функции органоидов цитоплазмы . Л. : Наука , с . 52-59 .

13. Филиппович Й.И.,Ноздрина В.Н.,Опарин А.Й.1975. Структурная организация полирибосом хлороплаотов в связи с биогенезом тилакоидов гран.-Докл. АН СССР,т.225,JH,о.223-226.

14. Филиппович Й.И.,Ноздрина В.Н.,Ку11чиненко В.В.,Опарин А.И.1976.

15. Изучение мембрано-связанных рибосом в связи с формированием хлороплаотов гороха.-Биохимия,т.41,вып.4,с.708-717.

16. Филиппович Й.И. .Полякова Г.Н. ,Гостимский G.A.I98I. Особенностистроения и белкового состава мембран хлороплаотов мутанта гороха хлорофилл 1.-Еиохимия,т.46,вып.10,с.1787-1794.

17. Филиппович й.й. ,Скопинская Н.,Опарин А.И. 1974. Выделение тРНКи аминоацил-тРНК синтетаз из мембран хлороплаотов проростков гороха.-Докл.АН СССР,т.217,№5,0.1207-1209.

18. Филиппович й.й, ,Спандарьян О.А. ,Светайло Э.Н. ,Сисакян H.M.I967.

19. Состояние рибосом в хлоропластах.-Докл. АН СССР,т. 172,Л5,1. C.I2I4-I2I7.

20. Филиппович й.й. ,Тонгур A.M. ,Алнна Б.А.,Опарин А.Й.1970. Структурная организация белоксинтезирующей системы хлороплаотов.-Биохимия, т. 35, вып. 2, с. 247-256.

21. Шлык А.А.,Чайка М.Т.,Ключарева E.A.I976. Сопряжение локализацииновых молекул хлорофиллов и белков в мембранной системе хлороплаотов.-Докл. АН СССР,т.226,№5,0.1232-1235.

22. Филлипович и.и.,Геловани К.Т. (Неопубликованные данные).- 131

23. Alscher,R.,R.Patterson,А.Т, Jagendorf •1978,Activity of thylacoidbound ribosomes in pea chloroplasts,-Plant Physiol.,v.62, 1. N1,p.88-93.

24. Alscher-Herman,R,,A,T.Jagendorf,P.Grumet.197 9.Hibosome-thylacoidassociation in peas.Influence of anoxia.-Plant Physiol., v.64,N2,p.232-235.

25. Anderson,J.M.I980.P-700 content and polypeptide profile of chlorophyll-protein complexes of spinach and barley thylacoid.

26. Biochira. et Biophys.Acta,v.591,N1,p.113-121.

27. Anderson,J.M.I982.The role of chlorophyll-protein complexes inthe function and structure of chloroplast thylacoids,

28. Mol. and Cell. Biochem.,v.46,H3,p.l6l-172.

29. Andersson,B.,J.M.Anderson.1980.Lateral heterogenity in the distribution of chlorophyll-protein complexes of the thylacoid membranes of spinach, chloroplasts.-Biochim. et Biophys. 1. Acta,v.593,N3,p.427-440.

30. Apel,K.1979.Phytochrome-induced appearence of mRUA activity forthe apoprotein of the light-harvesting chlorophyll a/b protein of barley (Hordeum vulgare)•-Eur.J.Biochem.,v.97, 1. N1,p.193-198.

31. Apel,K.,L.Bogorad.1976.bight-induced increase in the activityof maize plastid DNA-dependent-RNA polymerase.-Bur,J,Biochem. , V. 67 ,П2 ,p. 615-620.

32. Apel,K.,K.Kloppstech.1978.The plaated membranes of barley (Hordeum vulgare). bight-induced appearence of mRNA coding for the apoprotein of the light-harvesting chlorophyll a/b protein.-Bar.J.Biochem.,v.85,N2,p.581-599.

33. Apel,K. ,H.-J.Santel,ID.E.Reglinger,H.Palk. 1980.The protochlorophyllide holochrome of barley (Hordeum vulgare b.). -JBur. - 132

35. Amon,D,J, 1949.Copper enzymes in isolated chloroplasts.Polyphenol oxidase in Beta vulgaris.-Plant Physiol.,v.24,N1,p,709720.

36. Armond,P.A.,C.J,Amtzen.1977.Localization and characterizationof photosystem II in grana and stroma lame Пае.-Plant

38. Armond, P. A., J. Amt zen, J. M. Briant ais, Vemott e. 1976. Dif f erent iation of chloroplast lamellae. I.Light harvesting efficiency and grana development.-Arch,Biochem.Biophys.,v.175» 1. N1,p.54-63.

39. Backer,Er,R.,R.M,Leech. 1977,Development of photosystem I and IIactivity in leaves of light-grown maize (Zea mays),-Plant

41. Bamje,M,S,,A,T,yagendorf,1966,Amino acid incorporation by wheatchloroplasts.-Plant Physiol,,v.41,1Г5,р.7б4т770.

42. Bar-ITxm,S., J.Ochad, 1974,Cytoplasmic and chloroplastic origin ofchloroplast membrane proteins associated with PC II and

43. PC I active centers in Chlamidomonas reinhardi y-1,

44. Proc.Third Intern.Congress of Photosynthesis (Ed.by M,Amon)

45. Elsevier/Forth Holland,Amsterdam,p.1627-1638.

46. Bartels,P.O.,T,E.Weier.1967.Particle arrangement in proplastidsof Triticum vulgare L, seedlings.-J.Cell Biol.,v.33,N1, p.243-253.

47. Baumgartel,D.M.,S.H.Howell. 1976.a?he isolation and characterization of intact polyribosomes from a cell wall mutant of

48. Chlamidomonas reinhardi.-Biochim, et Biophys.Acta,v,464,1. H3,p.338-348,

49. Becker,W,M, ,C, J,Leaver,E.M,Weir,H,Riezman. 1978.Regulation of- 133 glyo3cymal enzymes during germination of cucumber,-Plant

51. Bedbrook,J.E.,Q.Ii±nk,D.Coen,b.Bogorad,A.Rich,1978,Maize plastidgene expressed during photoregulated development.-Proc.

52. Hat. Acad.Sci,USA,v,75,117,p.3060-3064,

53. Berzbom,R, J. ,P.Kopp,K.Muhlethaler, 1974.Mobility of chloroplastcoupling factor (CP-) at the thylacoid surface as reviled by freeze-etching after antibody labeling,-Z,Haturforsch,, a?,B,,v,29C,n2,p.694-699.

54. Bingham,S.,J.A,Schiff.1979.Events surrounding the early development of Euglena chloroplasts. 15.Origin plastid thylacoid polypeptides in wild type and mutant cells.-Biochim. et

56. Bird,J,P,,M,J,Cornelius,!,A,Dryer,A,J,Keys,1973.The purity ofchloroplasts isolated in non-aqueus media.-J.Exp.Bot,,v,24, 1. N78,p.211-215.

57. Bisalputra,5D. ,H,Burton, 1969.The ultrestructure of chloroplastsof a brown alga Sphacelaria Sp, II.Association between the chloroplast DNA and the photosynthetic lamellae.

59. Blair,G.E,,R.G.Ellis.1973.Protein synthesis in chloroplasts.

60. Idght driven synthesis of a large subunit of fraction Iprotein in isolated chloroplasts.-Biochim, et Biophys, 1. Acta,v,319,N1,p.223-234.

61. Boardman,N,K,1966,Ribosomes composition of chloroplasts in

62. Phaseolus vulgaris,-Exp,Cell,Res.,vol.43,N2,p,474-481,

63. Boardman,N,K,,J,M,Anderson, 1967•Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis, II,Cytochrome and carotenoid contents in particles isolated from spinach chloroplasts,- 134

64. Biochim. et Biophys.Acta,v. U3,HI,p. 187-203.

65. Bogorad, L., J.R. Bedbrook, D.M. Coen,R.Kolonder, G. Mnk. 1978. Genesfor chloroplast proteins and rRKAs,-In:Chloroplast development (Akoyunoglou, G., Arguroudi-Akoyunoglou, J. H., eds.),

66. Amsterdam Elsevier/North Holland Biomedical Press,p.541-551.

67. Bottomley,W,1970.Deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleicacid polymerase activity of nuclei and plastids from ethiolated peas and their response to red light in vivo.-Plant

69. Bottomley,W.,Spencer,D,,P.R.Whitfield. 1974.Protein synthesisin isolated chloroplasts.Comparison of light-driven and

70. Aa?P-driven synthesis.-Arch.Biochem.Biophys. ,v.l64,N1 ,p,106117.

71. Bourque,D.P. ,W.iraylor,1971.A simple electrophoretic procedurefor separation of ENA on mixed agarose-acrylamide gel columns. -J. Chromatogr. ,v.56,N1,p.79-86.

72. Bourque,D.P.,S.G.Wildman.1973.Evidence that nuclear genes codefor several chloroplast ribosomal proteins.-Biochem.Biophys.

74. Bradbeer,J.W.,D.Shesratt.1971.The light-induced binding ofplastid ribosomes to thylacoids in developing leaves of

75. Phaseolus vulgaris.-4-th Int.Congress of Photosynthesis,p.52.

76. Brangeon,J.,b,Mustardy.1979.The ontogenetic assembly of intrachloroplastic lamellae viewed in 3-dimension.-Biologie

78. Burkard,G.,J.P.Vaultier,J.H.Weil.1972.Differences in the levelof plastid-specific tENAs in chloroplasts and ethioplasts of Phaseolus vulgaris,т Phytochemistry,v. 11,116,p. 1351-1353. - 135

79. Burton,K,1956, A study of condition and mechanisms of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyrihonucleic acid.-Biochem.J.,v.62,N1,p.315-323.

80. Garde,J.P.,J.Joyaid,R,Dooce.1982.Electron microscopic studiesof the envelope membranes from spinach plastids,-Biol, of 1. Cell.,v.44,N3,p.315-324.

81. Carter,D,P.,b,A,Staehelin,1980, Proteolys of chloroplast thylacoid membranes. I,Selective degradation of thylacoid pigment-protein complexes at the outer membrane surface.

82. Arch.Biochem,Biophys.,v.200,N2,p.364-373.

83. Casagoro,G.,U,Rascio.1979.Patterns of thylacoid system formation,

84. J.Ultrastruct.Res.,V,69,N1,p.307-315.

85. Chen, J.b. ,S,G.Wildman,1970, Free and memerane-bound ribosomesand nature of protein ducts formed by isolated tobacco chloroplasts incubated for protein synthesis.-Biochim, et

87. Chua,lI,H,,G.Blobel,P.Siekevit2;,G,E.Palade,1973. Attachment ofchloroplast polysomes to thylacoid membranes in Chlamidomonas reinhardi.-Proc.Nat.Acad,Sci,USA,V,70,П5,p.1554-1558.

88. Chua,lI,H. ,G,Blobel,P.Siekevitz,G.E.Palade. 1976,Periodic variations in the ratio of free and thylacoid-bound chloroplast ribosomes during the cell cycle of Chlamidomonas reinhardi.-J,Cell.Biol.,v.71,N2,p.497-514.

89. Chua,II,H, ,Q?,Blomberg, 1979. Immunochemical studies of thylacoidmembrane polypeptides from spinach and Chlamidomonas reinhardi,-J.Biol,Chem,,v,254,N1,p,215-223.

90. Ghua.N.H, ,II.W,Gillham,1977. The sites of synthesis of principalthylacoid membrane polypeptides in Chlamidomonas reinhardi,'

91. J,Cell CBiol,,v.74,N2,p,441-452.- 136

92. Chua,IT.E. ,K,Oi0hi,K.K.Q?evmri,1981. Physical mapping of pea chloroplast DHA and localization of the ribosomal RHA. genes,1. Plasmid,v.6,N2,p.279-292,

93. Clark,N,P»1964, Polyribosomes from chloroplasts.-Biochim. et

95. Cohen,D, ,J,A,Schiff,1976, Events surrounding the early development of Euglena gracilis chloroplasts:photoregulation of the transcription of chloroplastic and cytoplasmic ribosomal RlIA,-Arch,Biochem.Biophys.,v,177,N1,p,201-2l6,

96. DamsZjB. ,E,Milculska,1976, Ontogenesis of photosynthetic membranesin the plastids of Cattleya sp. leaves grown in the light,

97. Biochem.Physiol.Pflanzen.,v.169,HI,p.257-263.

98. Denesh,0,,K,Apel,1983, The function of proteases during thelight-dependent transformation of ethioplasts to chloroplast in barley (Hordeum vulgare b,).-Planta,v.157,П2,р,381-383,

100. Characterization of two additional chlorophyll a-proteincomplexes,-ProcBfat, Acad, Sci,USA, v,76,HI ,p, 111-115.

101. Detchon,P,,J,Y,Possihgham,1973. Chloroplast ribosomal ribonucleic acid synthesis in cultured spinach leaf tissue.-Biochem,J,,v,136,N2,p,829-836,

102. Doherty,A,,J,C.Grey.1979. Synthesis of cytochrome f by isolatedpea chloroplasts,-Eur,J,Biochem,,v,98.H1,p,87-92,

103. Driesel,A,J,,J,Spreirs,H,J.Bohnert,1980, Spinach chloroplastmRHA for a 32 Kd polypeptide.Size and localization on the physical map of chloroplast DHA,-Biochim, et Biophys,Acta, v,6lO,H1,p,297-310,

104. Дуег,T,A,,R,H,Miller,A,D,Greenwood,1971, Leaf nucleic acids,-. 137 -*

105. Characteristic and role in the differentiation of plastids,-J.Exp.Bot,,v,22,N1,p.125-136,

106. EagleBham,A,R,J,,R,J,Ellis,1974, Protein synthesis in chloropplasts, Il.Idght-driven synthesis of membrane proteins by isolated pea chloroplasts.-Biochim, et Biophys.Acta,v,335, 1. N1,p,396-407.

107. Edelman,M,,A,ReinBfeld,1980, Synthesis,processing and functionalprobing of P-32000,the major membrane protein translated within the chloroplast,-In:Genome Organization and Expression in Plants (beaver,С J, ,ed,),Plenum,Hew-York - london, p,353-372,

108. Ellis,R,J,1975, The synthesis of chloroplast membranes in Pisumsativum,-In:Membrane biogenesis,Mitochondria,Chloroplast,

109. Bacteria (Tzagloff ,A, ,ed, ),lTew-York - London,Plenum Press,1. V,2,p,247-278,

110. Ellis,R,J,1977, Protein synthesis by isolated chloroplasts,

111. Biochim. et Biophys,Acta,v,463,N1,p,185-215.

112. Ellis,R,J,1978, Chloroplast proteins and their synthesis,-In:

113. Plant proteins (.iTorton,G, ,ed, ),Iiondon:Butterworth,p,25-40.

114. Ellis,R,J,,M,R,Hartley,1971,Sites of synthesis of chloroplastproteins,-Nature (Hew Biology),v.233,N5,p,193-196,

115. Ellis,R,J,,M.R.Hartley,1974,Biochemistry of nucleic acids.-In:1.t,Rev,Sci,Biochem, ,ser,1, (Burton,K, ,ed,),Lancaster/London:

116. Med,Tech,Publ.Co, and Butterworths,v,6,p,323-348,

117. Eneas-Filho,J,,M,R,Hartley,R,Masche,1981, Pea chloroplast ribosomal proteins:characterization and site of synthesis,

118. Mol,Gen,Genetics,V,184,N3,p,484-488,

119. Eytan,G,,I,Ohad,1970, Biogenesis of chloroplast membranes,

120. VI,Cooperation between cytoplasmic and chloroplast riboso- 138 raes in the synthesis of photosynthetic lamellae proteins during process in a mutant of Chlamidomonas reinhardiy-I.

121. J.Biol. Chem.,v.245,H17,p. 4297-4307.

122. Eytan,G,,I.Ohad.1972. Biogenesis of chloroplast membranes. VII.

123. The preservation of. membrane homogeneity during development of the photosynthetic lamellae system in the algae mutant (Chlamidomonas reinhardi y-1).-J.Biol.0hem.,v.247, 1. HI,p.112-121.

124. Palk,H.1969.Rough thylacoids:polysomes attached to chloroplastmembranes.-J.Cell Biol. ,v.42,112,p.582-587.

125. Pish,L,E,,Yagendorf,A.T.I982. Light-induced increase in thenumber and activity of ribosomes bound to pea chloroplast thylacoids in vivo.-Plant Physiol.,v.64,N3,p.814-824.

126. Preyssinet,G.I977.Characterization of cytoplasmic and chloroplastribosomal proteins of Euglena gracilis.-Biochem,,v.59,K2, p.597-610.

127. Preyssinet,G.1978, Determination of the site of synthesis ofsome Euglena cytoplasmic and chloroplast ribosomal proteins.

129. Preyssinet,G.,G.C.Harris,M.Nasart,J.A.Schiff.1979. Events surrounding the early development of Euglena chloroplast.

130. Biosynthesis of cytochrome c-552 in wild type and mutantcells.-Plant Physiol.,v.63,H2,p.908-915*

131. Geeta,V.,A.Gnanam,1980,Identification of P 700 chlorophyll-aprotein complex as a product of chloroplast protein synthe sis.-PEBS-Letters,v, 111,N1,p.272-276.

132. Gelwin,S.,S.H.Howell,1977, Identification and precipitation ofthe polyribosomes in Chlamydomonas reinhardi,Involved in the synthesis of the large subunit of d-ribulose-1,5-bi-^ 139 phosphate carboxylase.-Plant Physiol,,v.59,N3,p.471-477.

133. Gillham,N,W,1978, Biogenesis of thylacoid membrane polypeptidesand ribulose biphosphate carboxylase.-In:Organelle heridity,

135. Gnaham,A,,J,S,Kahn,1967. Biochemical studies on the inductionof chloroplast development in the Euglena gracilis, II,Pro tein synthesis during induction,-Biochim, et Biophys,Acta, 1. V, 142,112,p,486-489.

136. Goodenough,U, ,R,P,Iievine,1970, Chloroplast structure and function in ac-20,a mutant strain of Chlamidomonas reinhardi,

137. I,Chloroplast ribosomes and membrane org€uiization,-J,Cell1. Biol.,v,44,N2,p.547-562.

138. Grebanier,A,E.,G,C,Steinback,L,Bogora4,1979. Comparison of themolecular weight of proteins synthesized by isolated chloroplasts with those which appear during greening in Zea mays.-Plant Physiol.,v.63,N2,p,436-439.

139. Green,B.R,1980. Protein synthesis by isolated Acetobulariachloroplast,In vitro synthesis of the apoprotein of the

140. P 700 chlorophyll-a-protein complex (CPI),-Biochim. et

142. Green,B,R,,H,Burton,1970, Acetobularia chloroplast DNA electronmicroscopic vizualisation,-Science,v,168,p.981•

143. Grierson,D,,U,Loening,1974. Ribosomal RHA precursors and thesynthesis of chloroplast and cytoplasmic ribosomal ribo- 140 nucleicacid in leaves of Phaseolus aureus.-Eur,J,Biochem,, v.44,lT2,p.501-507.

144. Gunning,B,E,S,1975• The fine structure of chloroplast stromafollowing aldehyde osmium-tetroxide fixation,-J,Cell. Biol., 1. V.62,HI,p,88-93.

145. Hachtel,W,1982. Biosynthesis and assembly of thylacoid membraneproteins in isolated chloroplasts from Vicia faba Ь,:

146. The P 700 chlorophyll-a-protein.-Z,Pflantphysiol.,v, 107,115,p.383-394.

147. Hadziev,D,,S,Zalic,1970, Amino acid incorporation by ribosomesand polyribosomes from wheat chloroplasts.-Biochem.J.,v.116, 1. N1,p.111-124.

148. Hamp,R.,L.P,De Filipps.1980. Plasted protease activity and prolamellar body transformation during greening,-Plant Physiol,, v,65,N2,p,663-668,

149. Hartley,M,R,,R,J,Ellis,1973. Ribonucleic acid synthesis in chloroplasts,-Biochem. J, ,v, 134,N1,p,249-262,

150. Hartley,M,R,,C,Head,1979, The synthesis of chloroplast high-molecular weight ribosomal ribonucleic acid in spinach,

151. Eur, J,Biochem,,v,96,lT1,p,301-309,

152. Hattor,T,,Margulies,M,M, 1982, Distribution on m-RETAs betweenstroma and thylacoids,-J,Cell Biol,,v,95,N2,p.277-283,

153. Hemiihgsen,K,W, ,IT,K,Boardman,1972, Development of photochemicalactivity and the appearance of the high potential form of cytochrome b559 in greening bean seedlings,-Plant Physiol, ,v,51 ,N8,p,1117-1126,

154. Heslop-Harrison,J,1962, Evanescent and persistent modificationof chloroplast ultrastructure induced by an unnatural pyrimidine.-Planta,v,58,lf3,p,237-256, -. 141.

155. Heslop-Harrison,J,1963» Structure and morphogenesis of lamellarsystem in grana-containing chloroplasts, I.Membrane structure and lamellar architecture.-Planta,v.60,П2,р,242-2бО,

156. Hoober,J,K,,D,B.Marks,B.J.Keller,M.M.Margulies.1982. Regulationof accumulation of the major thylacoid polypeptides in

158. Hoober,J.K,,W.J,1973. Control of the synthesis of a major polypeptide of chloroplast membrane in Chlamidomonas reinhardi,

160. Howell,S.H.,P.S.Heismann,S.Gelvin,b.b.Walker.1977. Identificationand properties of the messenger RITA activity in Chlamidomonas reinhardi coding for the large subunit of d-ribulose1,5-biphosphate carboxylase.-Plant Physiol,,v.59,N3,p.464470.

161. Huchtel,W.1976. Sites of synthesis of chloroplast membrane proteins. -In: Genetics and Biogenesis of Chloroplasts and 1. Mitochondria.

162. The properties of chloroplast ribosomal RNA,-In:»'Controlof Organell Development",Cambridge Iniversity Press,p,303316, -.142.

163. Plant Cell.Physiol. ,v,24,IT1,p.71-80.

164. Jacobson,A.B.,H.Swift,,b.Bogorad.1963. Cytochemical studiesconcerning the occurence and distribution of ribonucleic acids in plastids of Zea mays.-J.Cell Biol.,v.17,N2,p.557563.

165. Jennings,R.C.,P.M.Garlaschi,G.Porti,P.D.Gerola.1979. Evidencefor a structural role for chlorophyll-protein complexes.

166. Biochim. et Biophys.Acta,v.581,H1,p.87-95.

167. Jolli,S.O.,b.Bogorad.1980. Preferential transcription of clonedmaize chloroplast DHA sequences by maize chloroplast 1ША polymerase.-Proc. Nat.Acad.Sci.USA,v.77,K2,p.822-826.

168. Joy,K.W.,R.J.Ellis.1975. Protein synthesis in chloroplasts.1..Polypeptides of chloroplast envelope.-Biochim.Biophys.

170. Kirk,J,a?.0. ,R.A.E.a}ilney-Basset.1967, The plastids,W.H.Preemanand Oo,,London,

171. Klein,S.I982. Diversity of chloroplast structure.-In:On theorigins of chloroplasts (Schiff,J.A.,ed.),p,35-53.

172. Klein,S,,Schiff,J,1972, The correlation appearence of prolamellaibodies protochlorophyll(ide) species and the shibata shift during development of bean ethioplasts in the dark,-Plant

174. Kloppstech,K,,E.G.Schweiger.1973. Nuclear genome codes for chloroplast ribosomal protein in Acetobularia. I.Isolation - 143 and characterization of chloroplast ribosomal particles•

176. Kloppstech,K, ,H.G,Schweiger.1974. The site of synthesis of chloroplast ribosomal proteins .-Plant Sci, betters,г.2,1Г2,р» 101105.

177. Kolodner,R,,K,K,Tewari.1975. The molecular size and conformation of the chloroplast DNA from higher plants.-Biochim. et

179. Kreibich,G, ,C.M.Prienstein,B.lI.Pereyra,B.b.Ulrich,D,D,Sabatini.1978, Protein of rough microsomal membranes related to ribosome binding. II.Cross-linking of bound ribosomes to specific membrane proteins exposed at the binding sites,

180. Ih: Chloroplast development (Akoyonoglou G, and Arguroudi

181. Akoyonoglou,J,H,,eds,),Amsterdam,Elsevier-Horth Holland

182. Machold,0.1975. On the molecular nature of chloroplast thylacoidmembranes.-Biochim,et Biophys.Acta,v.382,112,p.494-505»

183. Machold,0,,O.Aurich,1972. Sites of synthesis of chloroplastlamellae proteins in Vicia faba.-Biochim, et Biophys.Acta, v.281,ni,p.103-112.

184. Mantai,K,E.1970, Some effects of hydrolytic enzymes on coupledand uncoupled electron flow in chloroplasts.-Plant Phy siol.,v.45,H2,p.563-566.

185. Masche,R.,A.M.DornfM.R.Battle.1980. Characterization of spinachplastid ribosomal proteins by two dimentional gel electrophoresis.-Mol. Gen. Genetics, v. 177,Ю,p.333-338.

186. Margulies,M.M.1980. Release of ribosomes from thylacoids andendoplasmic reticulum with trypsin.-Biochim. et Biophys. 1. Acta,v,606,N1,p.13-19.

187. Margulies,M.M.,A.Michaels. 1974. Ribosomes boimd to chloroplastmembrane in Chlamidomonas reinhardi.- J.Cell Biol., v.60, 1. N1,p.65-77.

188. Margulies,M.M.,A.Michaels. 1975. Free and membrane-boimd chloroplast polyribosomes in Chlamidomonas reinhardi.-Biochim. et Biophys.Acta,vol.402,iri,p.297-308.

189. Margulies,M.M.,P.Parenti,1968. In vitro synthesis by plastids146 of Phaseolus vulgaris. III,Formation of lamellar and soluble chloroplast proteins,-Plant Physiol, ,v,43,ЕГЗ,р,504514.

190. Margulies,M,M,,J,S,Weistrop,1980. Sub-thylacoid fractions containing ribosomes,-Biochim,et Biophys,Acta,v,606,H1,p,3033.

191. Mcintosh,P,R,,K,0,Toole,1976, The interaction of ribosomes andmembranes in animal сells,-Biochim,et Biophys,Acta,v,457, 1. HI,p.171-212,

192. Mache,R,,E,R,Waygood,1970, Conformation of chloroplast Ш А inwheat leaves,-Can.J,Bot,,v.48,N1,p,173-184.

193. Mendiola-Morgenthaler,b,K,, J,-J,Morgenthaler,C,A,Price, 1976,

194. Synthesis of coupling factor CP- protein by isolated spinach chloroplasts,-PEBS-Letters,v,62,N1,p,96-100,

195. Meier,D,,H,K,Lichtenthaler,1981, Ultrastructural developmentof chloroplasts in radish seedlings grown at high and low light conditions,-Protoplasma,v,107,HI,p,195-207,

196. Melis,A,,J,S,Brown,1980, Stoichiometry of system I and system1. reaction centers and of plastoquinone in different photosynthetic membranes,-Proc,Hat,Acad,Sci,USA,v,77, 1. N7,p,4712-4716,

197. Menke,W,W,I960,. Untersuchungen zur Entwicklung der Plastidenvon Oenothera hokeri,-Z,lsraturforsh, ,v, 15b,p,479-482,

198. Mejbaum,W, 1939. tJber die Bestimmung klener Pentosemengen,insbesondere inDerivaten der Adenylsayre,-Hoppe-Seyler*s Z,

199. Physiol.Chem,,Bd,258,N2-3,S.I17-120,

200. MichaelSjA,,M,M,Margulies,1975. Amino acid incorporation intoprotein by ribosomes boimd to chloroplast thylacoid membranes : formarion of discrete products,-Biochim, et Biophys,Acta, v,390,N2,p,352-362, - 147

201. Michaels,A,,J,T,Sexton,1980, Triptic digestion of membrane proteins synthesized on chloroplast ribosomes in Chlamidomonas reinhardi,-Biochim,et Biophys,Acta,v,6lO,lT1 ,p,l67-173.

202. Mikulovich,T,P.1978, Synthesis of plastid and cytoplasmic ribosomal RUA in isolated pumpkin cotyledons, I,Effect of detachment and light,-Biochem,Physiol,Pflanz,,v,172,N1, p.93-100,

203. Miller,K,R,,b,A,Staehelin,1976, Analysis of the thylacoid outersurface,Coupling factor in limited to unstaked membrane regions,-J,Cell Biol,,v,68,N1,p,30-47,

204. Munns,R, ,IT,S,Scott,R,M,Smillie, 1972, RITA synthesis during chloroplast development in Euglena gracilis,-Phytochemistry, 1. V, 11,111,p.45-52,

205. Mustardy,L,A,,A,G,Janossy,1980, Evidence of helical thylacoidarrangement by scunning electron microscopy,-Plant Sci, 1.tters,V,16,иг,p.281-284,

206. Helson,!!, ,H,lTelson,G,Schatz,1980, Biosynthesis and assemblyof the proton-translocating adenosine triphosphotase complex from chloroplasts,-Proc,IIat,Acad,Sci,USA,v,77,N3,p.136l 1364,

207. Nielsen,.?,©, 1975. Electrophoretic characterization of membraneprotein during chloroplast development in barley,-Eur,J,

208. Biochem,,v,50,N2,p,6l1-623«0had,I,1975, Biogenesis of chloroplast membranes,-InsMembrane biogenesis mitochondria,chloroplast and bacteria,(Tzagloff, 209. A,,ed,),M,N,Y,sPlenum Press,p,279-347,01iveira,L,1975. On the occurence of helical polysomes in developing chloroplasts of mesophyll leaf cell of Triticale,-Caryologia,v,23,H4,p.467-476, --.148

210. Расе,II#R.3973. Struture and synthesis of the ribosomal ribonucleic acid of procaryotes.-Bacter.Rev,,v.37,K2,p#562-603#

211. Palmer,J.D,,W.P.Thompson.1981.Rearrangements in the chloroplastgenomes of raung bean and pea.-Proc.Iirat.Acad,Sci.USA,v.78, 1. F7,p.5533-5537.

212. Paolillo,D.J.,R.H,Falk,1966, The ultrestructure of grana inmesophylplastids of Zea mays.-Am, J,Bot,,v.53,N1 ,p 1,173-180.

213. Paolillo,D,J., J,Reinhard.1967. On the relationship between maturstructure and ontogeny in the grana of chloroplasts.

215. Partier,B,,R.Krauspe.1973. Assignement to chloroplast and cytoplasm of the Euglena gracilis aminoacyl-tRNA synthesis with ambiguous specificity for transfer RITA.-Plant Sci.L 1.tters,V.1,N1,p.221-227.

216. Partier,B.,R.Krauspe.1974. Chloroplast and cytoplasmic transfer

217. UNA of Euglena gracilis.-Biochem.Phys.Pflanz.,v.165,N1,p.1-17.

218. Paterson,B.D.,R.M.Smillie.1971. Developmental changes in ribosomal ribonucleic acid and fraction I protein in wheat leaves.-Plant Physiol.,v.47,N1,p.196-198.

219. Philippovich,I.I. ,V.ir.lirozdrina,I.lT.Bezsmertnaya,A.I,Oparin.1976.

220. Polyribosomes bound to chloroplast membranes (localisation,relation to the formation of thylacoids of the grana).

221. Acta Histochemica,Suppl.,Bd.XX7II,p.141-152.

222. PhylippovichjI.I.,I.n.Bezsmertnaya,A.I.0parin.1973. On the localization of polyribosomes in the system of chloroplast lamellae.-Exp,Cell Res.,v.79,П1,p.159-168.

223. Plesnicar,M,,D.S.Bendall.1973. The photochemical activitiesand electron carriers of developing barley leaves.-Biochem.J.,V.136,N3,P.803T812. -•149

224. Reinsfeld,A,,J.Gressel,K.M.Jacob,M.Edelman.1978. Characterization of the 32000 dalton membranes proteins, I.Early synthesis during photoinduced plastid development of Spirodella,-Photochem,Photobiol,,v,27,111 ,p. 161-165,

225. Remy,R,1973, Pre-existence of chloroplast lamellar proteins inwheat ethioplast,Functional and protein changes during greening imder continuous or intermittent light,-FEBS betters,v.31,N3,p.308-312,

226. Remy,R. ,S,Phung lIhu-Hung,A,Mouse.1972, Functional and structuraldifferentiation during ethioplast greening,-Physiol,Vegetable,v.lO,N2,p.269-290.

227. Renger,G.,K.Erixan,G.Doring,G.Wolff.1976. Studies on the natureof the inhibitory effect of trypsin on the photosynthetic electron transport of system II in spinach chloroplasts.

228. Biochim.Biophys.Acta,V,440,П2,p.278-286.

229. Rolleston,P.C.1974. Membrane-bound and free ribosomes.-Sub-Cell,1. Biochem.,v.3,N1,P»91-117.

230. RybergjM, ,0,SundqtiiBt,1982, Characterization of prolamellarbodies and prothylacoids fractionated from wheat ethioplast s , -Physiol, Plant ., v. 56 ,W1 , p. 1 35-1 32 .

231. Sagher,D,,H,Grosfeld,M,Edelman,1976, barge subunit ribulosebiphosphate carboxylase messenger RHA from Euglena chloroplast, -Proc,Nat, Acad, Sci,USA, v.73,N3, p. 722-726.

232. Schiff,J.A.I974. The control of chloroplast differentiation in

233. Euglena,-In: Procthe 3-d Int,Cong,Photosynthesis(Avron,

234. M,,ed,),Amsterdam:Elsevier Scientific Publ,Co,,p,l6911717,

235. Scott,TI,S,,H.lTair,R.M,Smillie, 1971, The effect of red irradiation on plastid ribosomal ША synthesis in dark-^own -. 150 « pea seedlings .-Plant Physiol., v. 47,.J2, p. 385-388. 236. Siddel.S.G.,R.J.Ellis.1975. Protein synthesis in chloroplasts.

237. Characterization and products of protein synthesis invitro in ethioplasts and developing chloroplasts from pea leaves.-Biochem.J.,v.146,ПЗ,p.675-685.

238. Smith,H.1970. Changes in plastid rihosomal RNA and enzjnnes during the growth of barley leaves in darkness.-Phyt©chemistry, v. 9,H5 , p. 965-975.

239. Smith,W.P.,P.C.Tai.,B.D.Davis.1978. Nascent peptide as soleattachment of polysomes to membranes in bacteria.-Proc.Hat.

241. Sovrova,D. ,'V,Vilim,S.Leblova,1976. Effect of trypsin on photochemical reactions of the blue-green alga Pletonema boryanum.-Photosynthetica,v.10,N1,p,40-46.

242. Spencer,D.1965. Protein synthesis by isolated spinach chloroplasts. -Arch. Biochem, Biophys, ,v.Ill,N3,p.381-385.

243. Stocking,C.R.1971. Chloroplasts:nonaqueous.-In:Methods in Enzymology (San Pietro,A. ,ed, ),irew York and London:Academic 1. Press,v,23A,p.221-228.

244. Tewari,K.K.,S.G.Wildman.1969. Function of chloroplast Шк.1..Studies in DHA-dependent Шк polymerase activity of tobacco chloroplasts.-Biochim.et Biophys.Acta,v,186,N3, p.358-372. --I5I

245. Thien,W,,P,Schopfer,1975. Control by phytochrome of cytoplasmicand plastid rRUA accumulation in cotyledons of musturd seedlings in the absence of photоsynthesis,-Plant Physiol,, v.56,N3,p.660-664.

246. Treffy,T,1978, Biogenesis of the photochemical apparatus,-Int,

248. Trewavas,A.1970. The turnover of nucleic acids in bexma minor,

250. Weier,T,E,,D,L.Brown, 1970.Formation of prolamellar body in 8day,dark grown seedlings.-Am. J.Bot. ,v.57,lT1 ,р,2б7-275.

251. Weier,T.E.,C,R.Stocking,W.W.ThompBon,H,Drewer.1963. The granaas structural units in chloroplasts of mesophyll of Hicotiana rustica and Phaseolus vulgaris.-J,Ultrastruct.Res., v.8,N1,p.122-143.

252. V/ellbum,A.R, 1977. Distribution of chloroplast coupling factor(CP^) particles on plastid membranes during development.

254. Wellbum,A.R.,R.Hamp.1979. Appearance of photochemical functionin prothylacoids during plastid development.-Biochim.et

256. Wellbum,P.A.M,Wellbum,A.R. 1971. Developmental changes occuringin isolated intact ethioplasts.-J.Cell -Sci. ,v.9,IiГ2,p,271287.

257. Wermeyer,W,1964. Zur Klarung der Structurellen Variabilitat der

258. Chloroplasten Grana des Spinats in Profol und Aufsicht,

260. Wertz,G,,G,Keliner,1968. Molecular characteristics of chloroplast D M of Acetobularia cells,-J,Ultrastruc.Res.,v.24, - 152

261. Wettstein,D,von,1981. Chloroplast and nucleus:concerted interplay between genomes of different cell organelles,-In: 1.t.Cell Biol,(Schweiger,H,G,,ed,),Springer,Berlin-Heidelberg-New York,p,250-271.

262. Wildman,S.G,,0,A.Jope,K,Atchison,1980, Light microscopic analysis of the three-dimentional structure of higher plant chloroplasts,Position of startch grains and probable spiral arrangement of starch lamellae and grana,-Bot,Gazette, v,141,N1,p.24-36.

263. Wildner,G,P,1976, The kinetics of appearance of chloroplastproteins and the effect of cycloheximide and chloramphenicol on their synthesis,-Z,Naturforsch,,v,31(c),p,157-162,

264. Wollgiehn,R,,S,Lerbs,D,b^tfische»1976, Synthesis of ribosomal

265. RNA in chloroplasts from tobacco leaves of different age,

266. Biochem.Physiol.Pflanz,,v,170,N2,p,381-387.

267. Wollgien,R, ,D,.y6m.sche,1972, RNS-synthesis in isolierten Chloroplasten von Nicotiana rustica,-Biochem,Physiol,Pflanzen,, v,l63,M1,p.137-155.

268. Wollgien,R,,B,Partier,1980,BNA and protein synthesis in plastiddifferentiation,-In:Results and problems in cell differentiation (Reinert,J,,ed.)Springer-Verlag,Berlin-Heidelberg1. New York,

269. Woodcock,C,L,F,,H,Peniandez-Moran,1968, Electron microscopy of

270. DNA conformation in spinach chloroplasts,-J,Mol,Biol,,v.31,N4,p.627-635. - 153

271. Wollgieim,R.,M.Ruees,D,Munsclie,1966, Ribonucleinsauren in

272. Chloroplasten,-Plora,Abt.A.,v.157,ni,p.92-108.

273. Yamomoto,T,,J,Barke,G,Autz,A,T,Jagendorf,1981. Bound ribosomesof pea chloroplast thylacoid membranes:location and release in vitro by high salt,puromycin and EHase.-Plant Physiol., 1. V.67,N5,p.940-949.

274. ZielinskijR.E.,C.A.Price.1980, Synthesis of thylacoid membraneproteins by chloroplasts isolated from spinach.-J.Cell 1. Biol.,v.85,N2,p.435-445.