Ген ключевого белка деления FtsZ микоплазмы Acholeplasma laidlawii: Клонирование, экспрессия в клетках E. coli и эволюционный консерватизм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Кукекова, Анна Валерьевна

• Кукекова, Анна Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кукекова, Анна Валерьевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕ РАТУРЫ.

1. Размножение клеток бактерий.

2. Формирование сайта инициации сборки кольца деления.

3. Белок FtsZ.

4. Ингибирование деления клеток бактерий.

5. Цитоскелет-подобные элементы й деление клеток микоплазм.-У

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы и условия культивирования.

2. Плазмиды. Трансформация.

3. Амплификация и клонирование.

4. Гибридизация.

5. Скрининг бактериальных библиотек.

6. Сиквенс.

7 . Компьютерный анализ.

8. Получение и очистка химерного полипептида.

9. Получение и очистка антител.

10 . Иммуноблотинг.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Клонирование гена ftsZ A.laidlawii.

2. Получение поликлональных антител и характеристика белков FtsZ A.laidlawii и S.citri.

3. Экспрессия белка FtsZ A.laidlawii в клетках

Е. coli.

V. ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Клонирование и анализ гена и белка FtsZ микоплазмы А. 1а1с11ам1±.

2. Сравнение последовательностей белка может использоваться для филогенетического анализа прокариот.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ген ключевого белка деления FtsZ микоплазмы Acholeplasma laidlawii: Клонирование, экспрессия в клетках E. coli и эволюционный консерватизм»

Представители класса Mollicutes - мельчайшие прокариотические организмы, способные к самостоятельному воспроизведению. Отсутствие клеточной стенки, минимальный размер генома и ограниченный метаболизм являются основными характеристиками, отличающими представителей класса от других групп прокариот. Всех представителей Mollicutes называют микоплазмами, несмотря на то, что Mycoplasma является только одним из родов класса. К Mollicutes относятся шесть родов: Spiroplasma, Ureaplasma, Anaeroplasma, Asteroplasma и Acholeplasma и собственно Mycoplasma (Maniloff, 1992). Большинство микоплазм узкоспециализированные паразиты, живущие в организмах практически всех животных и растений (Lee, Davis, 1992; Simecka et al. 1992; Krause, Taylor-Robinson, 1992).

Роду Acholeplasma принадлежит 10 видов, широко распространенных в природе. Образцы Acholeplasma laidlawii выделены из почвы, сточных вод, тканей растений, человека и животных (Dybvig, Voelker, 1996). Ахолеплазмы отличаются от других микоплазм рядом особенностей. Размер генома ахолеплазм (около 1600 т.п.н.) всего в два с половиной раза меньше Escherichia coli, но в то же время почти в три раза превышает геном самой мелкой микоплазмы - Mycoplasma genitalium, 580 т.п.н. (Herrmann, 1992). Содержание G+C в ДНК ахолеплазм выше, чем в геномах большинства видов микоплазм и составляет в среднем 32%. A.laidlawii единственная микоплазма, обладающая универсальным генетическим кодом. Все представители Mollicutes используют измененный аминокислотный код, при этом триплет TGA кодирует триптофан, а TA(A/G) - стоп-кодон (Tanaka et al., 1989; Inamine et al., 1990; Muto et al., 1992). Трансляционный аппарат эубактерий позволяет экспрессировать белки A.laidlawii в клетках E.coli V/ (Jarhede et al. , 1995) . В отличи^ от других микоплазм х/ ахолеплазмы способны расти в отсутствии стйролов, они сами синтезируют насыщенные жирные кислоты (Pollack, Tourtellotte, 1967). Желтый цвет осадка клеток A.laidlawii v обусловлен присутствием в их мембране каратиноидов (McElhaney, 1992). Ахолеплазмы используют, как минимум, две системы репарации ДНК бактерий - фотореактивацию и темновую репарацию (Das et al. , 1972). Непосредственное патогенное действие ахолеплазм на организм человека не обнаружено, однако, in vitro показано, что диглюкозилдиацилглицерол, выделенный из мембраны

A.laidlawii, способствует репликации ВИЧ (Arai et al., 1998) .

Геномы двух видов микоплазм M.genitalium и Mycoplasma pneumoniae секвенированы полностью. Почти полностью определена нуклеотидная последовательность ДНК Ureaplasma urealiticum и частично Mycoplasma mycoides, Spiroplasma citry (Herrmann, 1992; Fräser et al., 1995; Himmelreich et al., 1997; Glass et al., 1998; Westberg et al., 1998). Анализ секвенированных последовательностей и определение продуктов открытых рамок считывания (orf) позволили получить множество новых сведений о биологии и эволюционных отношениях микоплазм. Сравнение прочитанных геномов разных микоплазм подтвердило их высокую вариабельность. В составе минимального генома М. genitalium идентифицировано 4 70 генов, тогда как у М.pneumoniae -677. Основные различия генного состава найдены между системами рестрикции, модификации и энергетического метаболизма. В ДНК М.pneumoniae обнаружено 90 orf, отсутствующих в геноме М. genitalium.

Поиск orf, кодирующих белки клеточного деления, выявил в ДНК микоплазм только три гена деления при том, что аппарат деления E.coli и других эубактерий включает не менее 15 белков (Lutkenhaus, Addinall 1997).

О механизме действия генов деления ftsH, ftsY, идентифицированных у микоплазм и других эубактерий, в процессе клеточного деления практически ничего не известно. Исследования продукта гена ftsZ, обнаруженного также в клетках эубактерий, архебактерий и в пластидах растений, показали, что FtsZ является ключевым белком деления прокариот. Полимеризация молекул FtsZ в подмембранные тяжи, опоясывающие бактериальную клетку в области, где затем образуется перегородка, рассматривается как первое событие процесса клеточного деления (Begg, Donachie, 1985; Bi, Lutkenhaus, 1991). FtsZ является тубулин-подобным белком, обладающим ГТФ-связывающей и ГТФазной активностью (de Boer et al. , 1992 ) . Повышение уровня FtsZ в клетках E.coli вызывает нарушения клеточного цикла и приводит к образованию мини-клеток или полинуклеоидных тяжей (сильно удлиненных клеток), называемых в англоязычной литературе филаментами (Lutkenhaus, Addinall, 1997).

Кроме белков, непосредственно отвечающих за клеточное деление, у E.coli известны также системы, предотвращающие размножение бактерий. Белок ингибитор SulA при действии на клетку повреждающих агентов прямо взаимодействует с FtsZ, блокируя пролиферацию клеток (Huang et al., 1996). Белки MinCD, участвующие в формировании кольца деления, вероятно, конкурируют с FtsZ за один и тот же сайт связывания (Lutkenhaus, Addinall, 1997). В геномах микоплазм последовательности, кодирующие белки SOS ответа и системы Min, не обнаружены.

Идентификация ftsZ у микоплазм подтверждает эволюционный консерватизм функции этого гена в процессе деления бактериальных клеток. Микоплазмы, как мельчайшие и наиболее просто устроенные самовоспроизводящиеся организмы, лишенные клеточной стенки и даже пептидогликанового синтеза, являются хорошими объектами для исследования фундаментальных основ деления клеток прокариот.

Нуклеотидные последовательности белков, непосредственно взаимодействующих с FtsZ в процессе формирования перегородки деления в геномах микоплазм не найдены. Как формируется кольцо деления в клетках микоплазм - неизвестно. Какие районы FtsZ являются эволюционно консервативными и необходимыми для функционирования белка? Существуют ли принципиальные различия между FtsZ микоплазм и бактерий с клеточной стенкой? Нам представляется, что для исследования важнейших этапов деления клеток бактерий и роли белка FtsZ в этом процессе одним из наиболее интересных объектов является A.laidlawii, обладающая как характерными особенностями минимальных клеток микоплазм, так и и рядом биохимических систем эубактерий с клеточной стенкой. Характеристика белка FtsZ A.laidlawii, исследование его структурной организации и эволюционного консерватизма были основными задачами работы.

В литературном обзоре подробно охарактеризован ген и белок FtsZ эубактерий. Описан механизм сборки кольца FtsZ в процессе деления прокариотических клеток, исследованный наиболее полно на E.coli.

Для изучения белка FtsZ A.laidlawii и его эволюционного консерватизма мы клонировали ген ftsZ A.laidlawii. Ген был найден в ДНК A.laidlawii методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с вырожденными праймерами. Амплифицированный фрагмент ftsZ длиной 520 н.п. был использован в качестве зонда для гибридизации с геномной ДНК A.laidlawii. HindiII фрагмент ДНК A.laidlawii, содержащий полноразмерную копию гена, был клонирован в низкокопийном векторе pBeloBAC 11 и секвенирован.

В составе клонированного фрагмента находился ген ftsZ, а также последовательности orf 1 и orf 2, фланкирующие ген ftsZ на хромосоме A.laidlawii. С помощью программы BLAST показано сходство ORF1, нуклеотидная последовательность которой предшествует ftsZ, с тРНК гуанин трансгликозилазой, a ORF2 - с гипотетическим 4 0,1 кДа ГТФ-связывающим белком E.coli.

Амплифицированный фрагмент ftsZ A.laidlawii, содержащий в своем составе эволюционно консервативные участки гена, был реклонирован в экспрессирующий вектор pGEX3X. В клетках E.coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой pGEXl7-5, при индукции экспрессировался химерный белок 4 5 кДа, состоящий из пептида глютатион S-трансферазы (GST) и консервативного участка белка FtsZ A.laidlawii. Рекомбинантный белок был использован для получения поликлональных кроличьих антител. С помощью моноспецифически очищенной антисыворотки анализировали клеточные экстракты

A.laidlawii и микоплазм других видов.

Методом Вестерн-блотинга был выявлен белок FtsZ A.laidlawii, мигрировавший в полиакриламидном геле на уровне 4 0 кДа белка. При анализе белковых экстрактов четырех видов микоплазм, Bacillus subtilis и E.coli положительный ответ был получен только на клетках S.citri. Молекулярная масса идентифицированного белка также соответствовала 4 0 кДа.

При сравнительном анализе транслированной последовательности ftsZ A.laidlawii и FtsZ ряда прокариот был выявлен низкий уровень идентичности белка A.laidlawii с FtsZ микоплазм M.genitalium и М.pneumoniae и значительно более высокий с FtsZ других видов эубактерий. Наибольшее сходство обнаружено между FtsZ A.laidlawii и грам-положительных кокков. Полученные результаты согласуются с теорией полифилетического происхождения микоплазм.

В составе белка FtsZ выявлен консервативный N-конец и высоко вариабельный С-концевой домен. Консервативный участок С-конца, найденный у эубактерий, обладающих клеточной стенкой, в белке А.laidlawii не обнаружен. С помощью поликлональных антител показано, что ген ftsZ A.laidlawii, клонированный в низкокопийном векторе, успешно экспрессируется в E.coli, не оказывая негативного влияния на морфологию клеток.

При сравнении FtsZ A.laidlawii, клонированного нами, с опубликованной транслированной последовательностью фрагмента FtsZ A.laidlawii длиной 100 аминокислот (Wang, Lutkenhaus, 1996) было обнаружено три замены и одна делеция аминокислоты. Существование межштаммовых различий в последовательностях FtsZ было также показано при сравнении белков прокариот других видов (Werren et al., 1995; Ofir et al., 1998). Представленные данные свидетельствуют, что в составе белка FtsZ наряду с консервативными участками присутствуют также районы высокой вариабельности. Сравнение последовательностей FtsZ может быть использовано как чувствительный метод для изучения филогенетического родства прокариот.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

II. 1. Размножение клеток бактерий

Наиболее полно размножение бактерий исследовано на клетках культуры E.coli. Есть все основания предполагать, что поддержание стабильных популяций бактериальных клеток обеспечивается работой хорошо регулируемого клеточного цикла, ключевыми событиями которого являются репликация ДНК, нуклеоидная сегрегация и клеточное деление.

В течение клеточного цикла экспрессия генов E.coli, отвечающих за пролиферацию бактерий изменяется (Zhou et al., 1997). Лимитирующим фактором репликации ДНК является белок DnaA (Vinella, de'Ari, 1995), который, связываясь с сайтом начала репликации OriC, делает дуплекс ДНК доступным для инициации репликации (Bramhill et al., 1988) . Терминация при встрече двух репликационных вилок происходит на участке диаметрально противоположном OriC (Vinella, de'Ari, 1995). Сразу после окончания процесса репликации транскрипция гена dnaA в клетках E.coli ингибируется (Theisen et al., 1993). Ген dnaA найден в ДНК всех групп бактерий (Skarstad, Boye, 1994)

Образующиеся в результате деления дочерние клетки должны получить полный реплицированный геном. Между процессами клеточного деления и сегрегацией нуклеоида существует непосредственная связь (Vinella, de'Ari, 1995). Мехенизм сегрегации хромосом до конца не известен, однако несколько белков сегрегации идентифицировано (Vicente, Errington, 1996). Ключевую роль в этом процессе играет белок MukB - механофермент, способный генерировать механическую силу для разделения нуклеоидов. Белок MukB с молекулярным весом 177кДа обладает структурой, сходной с миозином и рассматривается как первый цитоскелетный элемент, найденный в клетках прокариот (Niki et al., 1991; Niki et al., 1992; Vinella, de'Ari, 1995).

Деление бактериальной клетки - сложный процесс, включающий образование перегородки деления (септы) в середине клетки на определенной стадии клеточного цикла и формирование эквивалентных дочерних клеток (Addinall, Lutkenhaus, 1996). Гены клеточного деления E.coli были идентифицированы при исследовании клеток с условными летальными мутациями. Мутации, вызывавшие формирование длинных мультинуклеоидных несептированных филаментов при непермиссивных температурах, были названы fts filamentation temperature sensitive (Hirota et al. , 1968; Vinella, de'Ari, 1995). Отсутствие деления в культуре мутантных клеток не влияет на процессы репликации и сегрегации ДНК. У E.coli известно как минимум 15 генов клеточного деления (Lutkenhaus, Addinall, 1997). Большинство из них объединено в кластер dew (division and cell wall), расположенный на 2x минутном участке хромосомы (Lutkenhaus et. al., 1980). Подобные кластеры найдены и в геномах других бактерий. У грам-положительной B.subtilis гены кластера dew расположены на участке хромосомы, соответствующем 135° (Beall et al. , 1988; Errington, 1993). В большинстве групп бактерий последовательность генов ftsQAZ является постоянной, однако в геноме грам-положительных кокков (и некоторых других групп) ген ftsQ отсутствует. Ген ftsl, кодирующий специфический для деления пенициллин-связываклций белок РВРЗ расположен в начале кластера dew, а ген деления ftsZ - близко к дистальному концу. Промоторы в кластере dew часто локализованы внутри предшествующих структурных генов, что одинаково справедливо как для ftsQAZ участка, так и для mraZWR региона, расположенного в передней части кластера (Vicente, Errington, 1996) .

Температур-чувствительные мутанты E.coli по гену ftsA при непермиссивных температурах образуют длинные филаменты с зачатками септы и межклеточной перетяжки. Подобные мультинуклеарные тяжи формируют также клетки, мутантные по гену ftsl (Taschner et al., 1988). В отличие от филаментов с недостроенной перегородкой деления, мутанты E.coli по ftsZ при непермиссивных температурах образуют филаменты без следов перетяжки и перегородки (Begg, Donachie, 1985; Dai, Lutkenhaus, 1991) В результате исследования мутаций, влияющих на форму клеток E.coli была описана последовательность событий клеточного деления и определены гены, действующие на ранних и на поздних стадиях формирования септы (Begg, Donachie, 1985; Khattar et al., 1994; Begg et al., 1995).

Продукт гена ftsZ необходим для самого раннего описанного этапа деления бактериальных клеток. In vitro показано, что белок FtsZ взаимодействует с N-терминальным доменом MukB (Lockhart, Kendrick-Jones, 1998). В течение роста клетки FtsZ диспергирован в цитоплазме (Bi, Lutkenhaus, 1991). Уровень содержания белка изменяется в течение клеточного цикла и зависит от скорости и фазы роста бактерий (Aldea et al., 1990). Транскрипция гена ftsZ происходит в течение 1/3 клеточного цикла (Garrido et al., 1993). В клетках E.coli идентифицировано пять промоторов ftsZ, расположенных на предшествующем гену участке длиной 3 т.н.п. Однако, количественные рассчеты показывают, что при активации известных промоторов экспрессируется только 60-70% белка FtsZ, представленного в клетке (Aldea et al., 1990; Dai, Lutkenhaus, 1991). Основные сведения, сформировавшие современные представления о делении бактериальных клеток, были получены в результате электронно-микроскопических исследований срезов E.coli, обработанных антителами к FtsZ (Bi, Lutkenhaus, 1991).

Перед появлением видимой инвагинации между будущими дочерними клетками белок FtsZ полимеризуется в протофиломенты, опоясывающие клетку (Lutkenhaus, 1993; Sun, Margolin, 1998). Сборка кольца FtsZ является первым этапом процесса деления в клетках разных, филогенетически далеких, видов бактерий. Предполагают, что сжатие перетяжки регулируется сборкой кольца, и подобная регуляция консервативна среди Eubacteria (Addinall, Lutkenhaus, 1996; Quardokus et al., 1996). Анализ делящихся клеток на разных стадиях показал, что в течение всего процесса деления FtsZ локализован на ведущем крае инвагинирующей перетяжки (Addinall, Lutkenhaus, 1996). При делении бактериальная клетка должна преодолеть осмотическое давление, которое испытывает цитоплазматическая мембрана. Величина осмотического давления внешней среды оценивается как четыре атмосферы для грам-отрицательных клеток и в несколько раз большее для грам-положительных (Mitchell, Moyel, 1956). Предполагается, что для механического сжатия перетяжки бактерии используют цитоскелетную структуру в сайте деления. Имеющиеся данные свидетельствуют, что главным компонентом такой структуры является белок FtsZ. Тяжи FtsZ, окружающие клетку по периферии, называют Z-кольцом (Lutkenhaus, Addinall, 1997) и рассматривают в качестве элемента, направляющего формирование перегородки деления (Bi, Lutkenhaus, 1991). Предложена гипотеза формирования Z кольца в результате полимеризации FtsZ, инициируемой в сайте нуклеации и сопровождающейся гидролизом ГТФ (Lutkenhaus, 1993). Кольцо FtsZ оказывает влияние на форму образующейся перегородки деления. Методом иммунофлюоресцентной микроскопии на клетках температур-чувствительных мутантов E.coli ftsZ26 было изучено образование спирально инвагинирующей перегородки, вызывающей формирование морфологически ненормальных дочерних клеток. В rodASUi мутантных клетках, имеющих форму сфер, ассиметричная перегородка деления появлялась при образовании не полного Z кольца, а арки FtsZ. Достраивание кольца деления и разделение дочерних клеток происходили на более поздней стадии. Вероятно, на первом этапе клеточного деления FtsZ связывается с единичным инициирующим сайтом на внутренней мембране и полимеризуясь перпендикулярно длинной оси клетки одновременно в двух направлениях, формирует Z кольцо. Предполагается, что арка FtsZ является предшественником полного Z кольца (Addinall,

Lutkenhaus, 1996a). Для активирования процесса формирования перетяжки полное кольцо FtsZ не требуется.

Предложены две модели сжатия кольца FtsZ, имеющие аналогии с цитоскелетом эукариот (Bramhill, 1997). Необходимыми компонентами обеих моделей являются сайт инициации и мембранные белки-якоря связывающиеся с концами FtsZ полимера.

Одна из моделей (Рис.1а) предполагает скольжение протофиламентов FtsZ относительно друг друга с помощью моторного белка.

В соответствии со второй моделью (Рис.1в) образование перетяжки является результатом разборки FtsZ протофиламентов на субъединицы в районах соединения полимеров с якорными белками. Данная модель основана на механизме деполяризации тубулина, предложенного для объяснения подвижности мембраны яиц Xenopus (Waterman-Storer, et al., 1995).

Кандидатом на роль элемента, заякоривающего протофиламенты FtsZ и передающего силу сжатия мембране, является белок ZipA. Методом афинного блотинга ZipA был идентифицирован как белок, непосредственно взаимодействующий с меченным FtsZ (Hale, de Boer, 1997). N-конец белка ZipA 50 кДа заякорен в мембране, а С-конец -в цитоплазме. В цитоплазматической части белка находятся участки, обогащенные пролином и глютамином. Участки белков с высоким процентом пролина способны формировать определенные трехмерные структуры (Williamson, 1994). Подобные белки редки у бактерий, и белок ZipA E.coli, возможно, первый белок описанного типа (Pugsley, 1993; Hale, de Boer, 1997).

Рис. 1. Модели сжатия кольца FtsZ (по Bramhill,1997).

Ген, кодирующий ZipA, был найден в результате экспрессионного клонирования и локализован на хромосоме E.coli между геном ДНК лигазы и геном cysZ, функция которого не ясна. Гомологи гена ZipA были идентифицированы в геномах Haemophilus influenzae и Salmonella typhimurium.

Белок ZipA локализован в кольцевой структуре и необходим для формирования перегородки. Истощение ZipA блокирует клеточное деление. При повышенной экспрессии (оверэкспрессии) ZipA происходит ингибирование деления, которое может быть супрессировано повышением уровня FtsZ в клетке. По крайней мере 10 молекул FtsZ доступны для каждой молекулы ZipA. Полимеризация FtsZ в кольцо и образование кольца ZipA наблюдается в клетках одной и той же стадии деления. Вероятно, оба белка становятся структурными компонентами кольца деления на одном этапе клеточного цикла. Последовательность событий до конца не известна. Существуют три возможных варианта сборки органеллы деления: (i) белок ZipA связывает FtsZ; (ii) ZipA активируется когда FtsZ кольцо уже сформировано; (iii) оба белка становятся компонентами кольца в одно и то же время.

После стадии образования кольца FtsZ для формирования в клетке цитоскелетной структуры, обеспечивающей формирование дочерних бактериальных клеток, необходима функциональная активность других белков деления (Рис.2). В отличии от ZipA интегральные белки, представленные на схеме, обладают либо небольшими цитоплазматическими N-концевыми доменами и крупными участками, расположенными в периплазматическом пространстве (Ftsl, L, N и Q) , либо пронизывают липидный бислой клеточной мембраны много раз (FtsW и К) (Hale, de Boer, 1997).

Cell cycle cu

Nucleatlon site

FtsQ, Ftsl FtsW FtsA {FtsL} FtsN

FtsK

Рис. 2. Белки деления бактериальных клеток (по Lutkenhaus, Addinall, 1997).

Среди генов деления, исследованных на E.coli, только ftsZ имеет гомологов в ДНК прокариот, не синтезирующих пептидогликан. Другие гены fts найдены только в геномах бактерий, обладающих элементами клеточной стенки (Bramhill, 1997).

Для исследования взаимодействий между белками деления широкое распространение получил метод тестирования белков на комплиментацию в двугибридной дрожжевой системе (Fields, Song, 1989).

В двугибридной системе показано, что FtsA переферический мембранный белок, также взаимодействует с FtsZ. FtsA локализуется в кольце FtsZ, является компонентом перегородки деления и принадлежит к семейству АТФ-связываклцих белков, включающему актин, DnaK и киназы Сахаров. Предполагается, что белок FtsA является АТФ-азой (Sanchez et al. , 1994). Для клеточного деления важное значение имеет количественное соотношение FtsZ и FtsA, которое в норме составляет 10:1 (Dai, Lutkenhaus, 1992; Dewar et al., 1992). Методом иммунофлюоресцентной микроскопии FtsA обнаружен в составе формирующейся перегородки деления (Addinall, Lutkenhaus, 1996b). Оверэкспрессия FtsA блокирует деление, которое может быть восстановленно при повышении концентрации FtsZ (Dai, Lutkenhaus, 1992; Dewar et al., 1992). Возможно FtsA является моторным белком или белком, стабилизирующим протофиламенты, предотвращая их деполимеризацию (Bramhill, 1997). В отсутствии FtsA в сайте деления может формироваться кольцо, которое, однако, не обладает способностью к сжатию (Addinall, Lutkenhaus, 1996). Белок

FtsA взаимодействует также с продуктом гена ftsl Addinall, Lutkenhaus, 1996b).

Ген ftsl кодирует белок РВРЗ (penicillin-binding protein 3) необходимый для пептидогликанового синтеза клеточной стенки (Botta, Park, 1981). Белок РВРЗ транспептидаза, катализирующая формирование пептидных связей между пептидогликановыми нитями (Nanninga, 1991). РВРЗ присутствует в клетке в течение всего клеточного цикла, но активируется и функционирует только в процессе клеточного деления. Белок РВРЗ имеет один трансмембранный домен, короткую сигнальную последовательность на цитоплазматическом N-конце и периплазматический домен, обеспечивающий транспептидазную активность (Bowler, Spratt, 198 9). Низкие концентрации р-лактамовых антибиотиков специфично ингибируют РВРЗ (Botta, Park, 1981). В первом поколении дочерних клеток в присутствии специфических агентов FtsZ кольцо собирается, однако клетки второй и последующих генераций в присутствии антибиотика формируют длинные филаменты со сниженным числом FtsZ колец (Pogliano et al. , 1997). Методом иммунофлюоресцентной микроскопии на клетках с инактивированным РВРЗ показано, что транспептидазная активность необходима для сжатия FtsZ кольца. Вероятно, белок РВРЗ непосредственно взаимодействует с FtsZ.

Ген ftsQ также кодирует интегральный мембранный белок. Предполагается, что FtsQ не взаимодействует с FtsZ, так как цитоплазматический домен FtsQ не является необходимым для клеточного деления (Dai, Lutkenhaus, 1992). В клетках E.coli содержится примерно 50 молекул

FtsQ (Carson et al., 1991). Белки FtsQ,L,N являются мембранно-цитоплазматическими белками. FtsL кодирует полипептидную цепь из 121 аминокислоты пронизывающую внутреннюю мембрану 1 раз. Большая часть белка FtsN, за исключением единичного трансмембранного домена, локализована в периплазматическом пространстве (Dai et al. , 1996). Ген ftsN является мультикопийным супрессором мутаций двух различных цитоплазматических белков E.coli, продуктов генов ftsA(Ts) и grpE (Wu et al. , 1992; Bramhill, 1997).

Белок ftsW обладает несколькими трансмембранными доменами и вероятно является интегральным мембранным белком (Ikeda et al., 1989; Khattar et al., 1997). Возможно цитоплазматический домен FtsW взаимодействует с FtsZ (Khattar et al. , 1994). Белок FtsW необходим как на ранних, так и на поздних этапах формирования септы и его основной функцией, вероятно, является стабилизация кольца деления (Khattar et al., 1997; Boyle et al., 1997).

Мутации по гену ftsK вызывают образование филаментов с хорошо выраженными перетяжками деления, что свидетельствует о действии ftsK на поздней стадии формирования перегородки. Экспрессия химерного белка FtsK-GFR (Green Fluorescent Protein) E.coli позволила определить локализацию FtsK в клетках. Белок FtsK-GFR был обнаружен в составе септы на этапе замыкания кольца и разделения дочерних клеток. Характер локализация FtsK-GFR позволяет предполагать, что FtsK узнает белок FtsZ или иной компонент аппарата деления, действующего на более ранних стадиях деления (Yu et al., 1998).

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Кукекова, Анна Валерьевна

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате работы клонирована и секвенирована полноразмерная копия гена ftsZ A.laidlawii. Исследована структурная организация гена и соответствующей ему белковой (транслированной) последовательности. Проведен сравнительный анализ белка FtsZ A.laidlawii и FtsZ микоплазм и эубактерий, обладающих клеточной стенкой. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы:

1. В составе белка FtsZ A.laidlawii присутствует консервативный N-концевой домен. Консервативный С-конецевой участок, найденный в белках FtsZ эубактерий, обладающих клеточной стенкой, в составе аминокислотной последовательности FtsZ микоплазмы А.laidlawii не обнаружен.

2. Уровень идентичности белка FtsZ A.laidlawii и FtsZ микоплазм М.pneumoniae и М.genitalium в среднем на 20% ниже, чем с соответствующим белком эубактерий с клеточной стенкой. Наибольшее сходство обнаружено между FtsZ A.laidlawii и грам-положительных кокков.

3. Состав генов на участке ДНК A.laidlawii, содержащем последовательность ftsZ отличается от dcw кластера эубактерий с клеточной стенкой и микоплазм.

4. Молекулярный вес белков, идентифицированных с помощью поликлональных антител в клетках A.laidlawii и S.citri соответствует 4 0кДа. Поликлональные кроличьи антитела, полученные к консервативному участку белка FtsZ A.laidlawii не взаимодействуют с белковыми экстрактами различных видов микоплазм, B.subtilis и E.coli.

5. Ген ftsZ А.laiulawii экспрессируется в клетках E.coli. При клонировании гена в низкокопийном векторе экспрессия FtsZ А.laidlawii не оказывает негативного влияния на морфологию клеток E.coli.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кукекова, Анна Валерьевна, 1999 год

1. Борхсениус С.Н., Чернова О.А. 1989. Микоплазмы. JI. Наука. 156 стр.

2. Вонский М.С., Усоскин Д.Г., Борхсениус С.Н. 1998. Семейство генов белков теплового шока у микоплазм: анализ гена dnaK. ДАН. 359:270-73.

3. Кокоза В.А. Получение и анализ гибридных рекомбинантных белков с использованием экспрессирующих векторов E.coli pUR290-292. В кн.: Методы молекулярной генетики и генной инженериию. Новосибирск: Наука. 1990. Стр.87-91.

4. Кукекова А.В. Ген ключевого белка деления FtsZ

5. A. laidlawii. Труды победителей конкурса грантов 1998 года для студентов, аспирантов и молодых ученых С. Петербурга. 128-9.

6. Кукекова А.В., Малинин А.Ю., Вонский М.С., Борхсениус С.Н. 1999. Клонирование и экспрессия гена ключевого белка деления FtsZ микоплазмы в клетках E.coli. Генетика. 35 (3) :314-21.

7. Addinall SG, Bi Е, Lutkenhaus J. 1996. FtsZ ring formation in fts mutants. J Bacteriol 178(13):3877-84.

8. Addinall SG, Lutkenhaus J. 1996a. FtsZ-spirals and -arcs determine the shape of the invaginating septa in some mutants of Escherichia coli. Mol Microbiol.22(2) :231-7 .

9. Addinall SG, Lutkenhaus J. 1996в. FtsA is localized to the septum in an FtsZ-dependent manner. J Bacteriol. 178 (24) : 7167-72.

10. Adler HI, Fisher WD, Cohen A, Hardigree AA. 1967.

11. Miniature Escherichia coli cells deficient in DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 57:321-6.

12. Aidea M, Garrido T, Pia J, Vicente M. 1990. Division genes in Escherichia coli are expressed coordinately to cell septum requirements by gearbox promoters. EMBO J. 9:3787-94.

13. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman

14. DJ.1990 Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3) :403-10.

15. Arai S, Ono S, Arima Y, Zhang Y, Kuwano K. 1998. Augmentation of human immunodeficiency virus type I replication by diglucosyldiacylglycerol derived from Acholeplasma laidlawii. IOM Abstracts, p.106.

16. Bauman P., Jackson S.P. 1996An archebacterial homoogue of the essention eubacterial cell division protein FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93:6726-6730.

17. Beall B, Lowe M, Lutkenhaus J. 1988. Cloning and characterization of Bacillus subtilis homologs of Escherichia coli cell division genes ftsZ and ftsA. J Bacteriol. 170 (10):4855-64.

18. Begg KJ, Donachie WD. 1985. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutanys. J.Bacteriol. 163:6211-22.

19. Begg KJ, Dewar SJ, Donachie WD.1995. A new Escherichia coli, cell division gene, ftsK. J Bacteriol.177 (21) :6211-22.

20. Begg K, Nikolaichik Y, Crossland N, Donachie WD. 1998. Roles of FtsA and FtsZ in activation of division sites. J Bacteriol. 180 ( 4) :881-4.

21. Bermudes D, Hinkle G, Margulis L. 1994 Do prokariotes contain microtubules? Microbiol.Rev. 58:387-400.

22. Bi EF, Lutkenhaus J. 1991. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354(6349):161-4

23. Botta GA, Park JT. 1981. Evidence for involvement of penicillin-binding protein 3 in murein synthesis during septation but not during cell elongation. J Bacterid. 145(1):333-4 0.

24. Boyle DS, Khattar MM, Addinall SG, Lutkenhaus J, Donachie WD. 1997. ftsW is an essential cell-division gene in Escherichia coli. Mol Microbiol 24(6):1263-73.

25. Bowler LD, Spratt BG. 1989. Membrane topology of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli. Mol.Microbiol. 3:1277-86.

26. Bramhill D, Romberg A. 1988. Cell 54(7): 915-8. A model for initiation at origins of DNA replication.

27. Bramhill D. 1997. Bacterial cell division. Annu.Rev.Dev.Biol. 13:395-424.

28. Carson MJ, Barondess J, Beckwith J. 1991. The FtsQ protein of Escherichia coli: membrane topology, abundance, and cell division phenotipes due to overproduction and insertion muttations. J.Bacteriol. 173:2187-95.

29. Dai K, Lutkenhaus J. 1991. ftsZ is an essential cell division gene in Escherichia coli. J Bacteriol. 173(11):3500-6.

30. Dai K, Lutkenhaus J. 1992. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in

31. Echerichia coli.J Bacteriol. 174 (19) :6145-51.

32. Dai K, Xu Y, Lutkenhaus J. 1996. Topological characterization of the essential Escherichia coli cell division protein FtsN. J Bacteriol. 178(5):1328-34.

33. Das J, Maniloff J, Bhattacharjee SB. 1972. Dark and light repair in ultraviolet-irradiated Acholeplasma laidlawii. Biochim Biophys Acta 31;259 (2) :189-97.

34. Dewar SJ, Begg KJ, Donachie WD. 1992 Inhibition of cell division initiation by an imbalance in the ratio of FtsA to FtsZ. J Bacteriol. 174(19):6314-6.

35. Donachie WD, Begg KJ. 1996. "Division potential" in Escherichia coli. J Bacteriol. 178 (20) :5971-6

36. Donachie WD, Robinson AC. 1987. Cell division: parameter values and the process. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, v.2. pp. 1578-94.

37. Dybvig K., Voelker L.L. 1996. Molecular biology of mycoplasmas. Annu.Rev.Microbiol. 50:25-57.

38. Erickson HP. 1995. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin? Cell. 80 (3) :367-70.

39. Erickson HP, Taylor DW, Taylor KA, Bramhill D. 1996. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc Natl Acad Sei USA.93(1):519-23.

40. Erickson HP. Atomic structures of tubulin and FtsZ. 1998 Trends Cell Biol. 8(4):133-7.

41. Errington J. 1993. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis. Microbiol Rev. 57(1):1-33.

42. Fields S, Song 0. 1989. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature.340 (6230) :245-6.

43. Fisseha M, Popham P, Birkhead K, Krause DC. 1998. Exploring HMW1 and HMW2 function in Mycoplasma pneumoniae. IOM Abstracts. 167-68.

44. Fraser CM, Gocayne JD, White 0, Adams MD, etal.(29 authors). 1995. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science. 270:397-403.

45. Garcia-Lara J, Shang LH, Rothfield LI. 1996. An extracellular factor regulates expression of sdiA, a transcriptional activator of cell division genes in Escherichia coli. J.Bacteriol. 178:2742-48.

46. Gamier M, Clerc M, Bove JM. 1981 Growth and division of spiroplasmas: morphology of Spiroplasma citri during growth in liquid medium. J Bacteriol 147(2):642-52.

47. Garrido T, Sanchez M, Palacios P, Aldea M, Vicente M. Transcription of ftsZ oscillates during the cell cycle of Escherichia coli. EMBO J. 12:3957-65.

48. Glass JL, Lefkowitz EJ, Glass JS, Heiner CR, Nguyen T, Chen EY, Cassel GH. 1998. The Ureaplasma urealyticum Genome. IOM Abstracts, p.148.

49. Gottesman S, Halpern E, Trisler P. 1981. Role of sulA and sulB in filamentation by Ion mutants of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 148 (1) :265-73.

50. Gottesman S, Maurizi MR. 1992. Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol Rev. 56 (4):592-621.

51. Hale CA, de Boer PA. 1997. Direct binding of FtsZ to ZipA, an essential component of the septal ring structure that mediates cell division in E. coli. Cell. 88(2): 175-85 .

52. Harberer K, Frosch D. 1981. Lateral mobility of membrane-bound antibodies on the surface of Acholeplasma laidlawii evidence for virus-induced cell fusion in a prokaryote. J Bacteriol. 152:471-8

53. Herrmann R.1992. Genome structure and organization. Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis.

54. Washington, DC: Am. Soc. Microbiology, p.157-68

55. Hill TM, Sharma B, Valjavec-Gratian M, Smith J. 1997. sfi-independent filamentation in Escherichia coli Is lexA dependent and requires DNA damage for induction. J Bacteriol. 179 ( 6) :1931-9.

56. Himmelreich R, Plagens H, Hilbert H, Reiner B, Herrmann R. 1997. Comparative analysis of the genome of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium. Nucleic Acid Res. 25:701-712.

57. Hirota Y, Ryter A, Jacob F. 1968. Thermosensitive mutants of E.coli affected in the process of DNA synthesis and cell division. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 33:677-94.

58. Huang J, Cao C, Lutkenhaus J. 1996. Interaction between FtsZ and inhibitors of cell division. J Bacteriol. 178(17):5080-5.

59. Inamine JM, Ho KC, Loechel S, Hu PC. 1990. Evidence that UGA is read as a tryptophan codon rather than as a stop codon by Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma genitalium, and Mycoplasma gallisepticum. J Bacteriol 172 (1) :504-6.

60. Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids Gene.96 (1) :23-8.

61. Ivanov V.A., Fel V.Ja. 1980. On some similarity between membrane antigens of the cell of Lajdela hepatoma and liver of rats subjected to a single 4-dimethylaminoazobenzene injection. Neoplasma. 27:745750.

62. Jaffe A, D'Ari R, Norris V. 1986. SOS-independent coupling between DNA replication and cell division in Escherichia coli. J Bacteriol 165(1):66-71.

63. Jarhede T.K., Henaff M.LE, Wieslander A. 1995. Expression of foreign genes and selection of promoter sequences in Acholeplasma laidlawii. Microbiology. 141:2071-2079.

64. Khattar MM, Begg KJ, Donachie WD. 1994. Identification of FtsW and characterization of a new ftsW division mutant of Escherichia coli. J Bacteriol. 176(23):7140-7.

65. Khattar MM, Addinall SG, Stedul KH, Boyle DS, Lutkenhaus J, Donachie WD. 1997. Two polypeptide products of the Escherichia coli cell division gene ftsW and a possible role for FtsW in FtsZ function. J Bacteriol.179 (3) :784-93.

66. Khattar MM. 1997. Overexpression of the hslVU operon suppresses SOS-mediated inhibition of cell division in Escherichia coli. FEBS Lett. 414 (2) :402-4 .

67. Krau.se D, Taylor-Robinson, 1992. Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Washington, DC: Am. Soc. Microbiology.

68. Kukekova AV, Malinin AU, Vonski MS, Borchsenius SN. FtsZ gene of Acholeplasma laidlawii: cloning andevolutionary variability. IOM Abstracts, p.177.

69. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.

70. Laporte ML, Lemercier B, Rawadi G. 1998. Interaction between the Mycoplasma pneumoniae adhesin PI and the the chaperonine GroEL as revealed by the Yeast Two-Hybrid System. IOM Abstracts. p.162-3.

71. Lee, Davis. 1992. Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Washington, DC: Am. Soc. Microbiology.

72. Lockhart A, Kendrick-Jones J. 1998. Interaction of the N-terminal domain of MukB with the bacterial tubulin homologue FtsZ. FEBS Lett. 430 (3):278-82.

73. Lowe J, Amos L. 1998. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391:203-6.

74. Lutkenhaus JF, Wolf-Watz H, Donachie WD. 1980. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J Bacteriol. 142(2):615-20.

75. Lutkenhaus J. 1993. Escherichia coli cell division. Curr Opin Genet Dev. 3(5):783-8.

76. Lutkenhaus J. 1993. FtsZ ring in bacterial cytokinesis. Mol Microbiol. 9(3):403-9. 18.Lutkenhaus J,

77. Lutkenhaus J. Addinall S.G. 1997. Bacterial cell

78. H "I TTI Q i An ^ r~i /H v "i n rr 7\ ri r"> 11 D att OTT! £ * Q —

79. CJ. 1 vU bUii d-livj. Lilt; Zj JLii^j • Jr\ 1111 LA • OA^V* JJ ! W \11 LL • \J \J • -J U116.

80. Ma X, Sun Q, Wang R, Singh G, Jonietz EL, Margolin W. Interactions between heterologous FtsA and FtsZ proteins at the FtsZ ring.J Bacteriol. 179(21):6788-97.

81. Maniloff J, Morowitz HJ. 1967. Ultrastructure and life cycle of Mycoplasma gallisepticum A5969.Ann N Y Acad Sci. 143(1):59-65.

82. Maniloff J. Phylogeny of Mycoplasmas In book: Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. 1992. p.549-561.

83. Margolin W, Long SR. 1994. Rhizobium meliloti contains a novel second homolog of the cell division gene ftsZ. J Bacteriol. 176(7):2033-43.

84. Margolin W, Wang R, Kumar M. 1996. Isolation of an ftsZ homolog from the archaebacterium Halobacterium salinarium: implications for the evolution of FtsZ and tubulin. J Bacteriol. 178 (5) : 1320-7.

85. McElhaney. 1992. Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Washington, DC: Am. Soc. Microbiology.

86. Miyata M, Fukumura T. 1997. Asymmetrical progression of replication forks just after initiation on Mycoplasma capricolum chromosome revealed by two-dimensional gel electrophoresis. Gene 193(1):39-47.

87. Mitchell P, Moyel J. 1956. Osmotic function and structure in bacteria. Symp.Soc.Gen.Microbiol. 6:150.

88. McCormic J.R., Su E.P., Driks A., Losick R. 1994. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ. Mol.Microbiol. 14:24354 .

89. Mukherjee A, Dai K, Lutkenhaus J. 1993. Escherichia coli cell division protein FtsZ is a guanine nucleotide binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (3):1053-7.

90. Mukherjee A, Lutkenhaus J. 1994. Guanine nucleotidedependent assembly of FtsZ into filaments. J Bacterid. 176 (9) :2754-8.

91. Mukherjee A, Lutkenhaus J. 1998. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J 17(2):462-9.

92. Muto A, Andachi Y, Yamao F, Tanaka R, Osawa S. 1992. Transcription and translation. In Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Washington, DC: Am. Soc. Microbiology, pp.331-347.

93. Nanninga N. 1991. Cell division and peptidoglycan assembly in Escherichia coli. Mol Microbiol. 5(4):791-5.

94. Naryzhny S.N. 1996. Upsite-down stopped-flow electrofractionation of complex protein mixtures. Analitical Biochemistry. 238 (1):50-53.

95. Neimark H, London J. 1982. Origins of the mycoplasmas: sterol-nonrequiring mycoplasmas evolved from streptococci. J Bacterid. 150 (3 ): 1259-65 .

96. Niki H, Jaffe A, Imamura R, Ogura T, Hiraga S. 1991. The new gene mukB codes for a 177 kd protein with coiled-coil domains involved in chromosome partitioning of E. coli. EMBO J 10 (1) :183-93.

97. Niki H, Imamura R, Kitaoka M, Yamanaka K, Ogura T, Hiraga S 1992. E.coli MukB protein involved in chromosome partition forms a homodimer with a rod-and-hinge structure having DNA binding and ATP/GTP binding activities. EMBO J.11(13):5101-9.

98. Nordstrom K, Bernander R, Dasgupta S. 1991. The Escherichia coli cell cycle: one cycle or multiple independent processes that are co-ordinated? Mol Microbiol. 5(4) :7 69-7 4.

99. Ofir R, Horowitz S, Wu Q, Weinstein Y. 1998. The ftsZ gene as a tool for detection of Mycoplasma fermentans. Molecular and Cellular Probes. 12:85-92.

100. Ohkubo S, Muto A, Kawauch Y, Yamao F, Osawa S. 1987. The ribosomal protein gene cluster of Mycoplasma capriculum. Mol.Gen.Genet. 210(2):314-22

101. Palacios P, Vicente M, Sanchez M. 1996. Dependency of Escherichia coli cell-division size, and independency of nucleoid segregation on the mode and level of ftsZ expression. Mol Microbiol. 20 (5) :1093-8.

102. Pichoff S, Vollrath B, Touriol C, Bouche JP. 1995. Deletion analysis of gene minE which encodes the topological specificity factor of cell division in Escherichia coli. Mol Microbiol. 18(2):321-9.

103. Pia J, Sanchez M, Palacios P, Vicente M, Aldea M. Preferential cytoplasmic location of FtsZ, aprotein essential for Escherichia coli septation. Mol Microbiol. 5(7):1681-6.

104. Pogliano J, Pogliano K, Weiss DS, Losick R, Beckwith J. 1997. Inactivation of FtsI inhibits constriction of the FtsZ cytokinetic ring and delays the assembly of FtsZ rings at potential division sites. Proc Natl Acad Sei U S A 94 (2) :559-64

105. Pollack JD, Tourtellotte ME. 1967. Synthesis of saturated long chain fatty acids from sodium acetate-1-Cl4 by Mycoplasma. J Bacteriol. 93(2):636-41.

106. Pugsley AP. 1993. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev. 57 (1) :50-108.

107. Quardokus E, Din N, Brun YV. 1996. Cell cycle regulation and cell type-specific localization of the FtsZ division initiation protein in Caulobacter. Proc Natl Acad Sci USA 93 (13):6314-9.

108. Quinlan DC, Maniloff J. 1972. Membrane association of the deoxyribonucleic acid growing-point region in Mycoplasma gallisepticum. J Bacteriol 112(3):1375-9.

109. RayChaudhuri D, Park JT. 1992. Escherichia coli celldivision gene ftsZ encodes a novel GTP-binding protein.Nature. 359(6392):251-4.

110. Razin Sh, Rottem Sh. 1974. Isolation, solubolization and reconstruction of mycoplasma membranes. Meth. Enzymol. 32:459-468.

111. Razin S. 1978. The mycoplasmas. Microbiol Rev. 42(2):414-70.

112. Razin Sh., Tully J.G. 1983. Methods in Mycoplasmology. New York. v.l. 504p.

113. Razin Sh. 1985. Molecular biology and genetics of mycoplasmas (Mollicutes). Microbiol.Rev. 49:419-455.

114. Regula JT, Frank R, Herrmann R. 1998. Protein analysis and composition of the Triton X-100 insoluble fraction from Mycoplasma pneumoniae. IOM Abstracts.p.165-6.

115. Rodwell AW, Peterson JE, Rodwell ES. 1972. Macromolecular synthesis and growth of mycoplasmas. Ciba Found. Symp. P.123-139.

116. Rottem S, Greenberg AS. 1975. Changes in composition, biosynthesis, and physical state of membrane lipids occurring upon aging of Mycoplasma hominis cultures. J1. Bacteriol 121 (2) :631-9.

117. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Lab. Press.

118. Sanchez M, Dopazo A, Pla J, Robinson AC, Vicente M. Characterisation of mutant alleles of the cell division protein FtsA, a regulator and structural component of the Escherichia coli septator. Biochimie. 76(10-11):1071-4.

119. Sassanfar M, Roberts JW. 1990. Nature of the SOS-inducing signal in Escherichia coli. The involvement of DNA replication. J Mol Biol. 212 (1):79-96.

120. Seluanov A, Bibi E. 1997. FtsY, the prokaryotic signal recognition particle receptor homologue, is essential for biogenesis of membrane proteins. J Biol Chem. 272 (4) :2053-5.

121. Seto S, Mij ata M. 1998. Cell reproduction and morphological changes in Mycoplasma capriculum. J.Bacteriol. 180 (2):256-264.

122. Simecka. 1992. Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Washington, DC: Am. Soc. Microbiology.

123. Skarstad K, Boye E. 1994. The initiator protein DnaA: evolution, properties and function. Biochim Biophys Acta. 1217 (2) :111-30.

124. Smith DB, Johnson K.S. 1988. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusion with glutation S-transferase. Gene. 67:31-40.

125. Southern E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

126. Stoller G, Rucknagel KP, Nierhaus KH, Schmid FX, Fischer G, Rahfeld JU. 1995. A ribosome-associated peptidyl-prolyl cis/trans isomerase identified as the trigger factor. EMBO J. 14 (20) :4939-48.

127. Sun Q, Margolin W. 1998 FtsZ dynamics during the division cycle of live Escherichia coli cells. J Bacteriol. 180 (8):2050-6.

128. Tanaka R, Muto A, Osawa S. 1989. Nucleotide sequence of tryptofan tRNA gene in Acholeplasma laidlawii. Nucleic. Acid Res. 17:5842.

129. Taschner PE, Hüls PG, Pas E, Woldringh CL. 1988. Division behavior and shape changes in isogenic ftsZ, ftsQ, ftsA, pbpB, and ftsE cell division mutants of Escherichia coli during temperature shift experiments. J Bacteriol. 170 (4):1533-40.

130. Tatsuta T, Tomoyasu T, Bukau B, Kitagawa M, Mori H, Karata K, Ogura T. 1998. Heat shock regulation in the ftsH null mutant of Escherichia coli: dissection of stability and activity control mechanisms of sigma32 in vivo. Mol Microbiol 30 (3) :583-93.

131. Teather RM, Collins JF, Donachie WD.1974. Quantal behavior of a diffusible factor which initiates septum formation at potential division sites in Escherichia coli. J Bacterid 118 (2) : 407-13 .

132. Theisen PW, Grimwade JE, Leonard AC, Bogan JA, Helmstetter CE. 1993. Correlation of gene transcription with the time of initiation of chromosome replication in Escherichia coli. Mol Microbiol. 10(3):575-84.

133. Thompson, JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4 673-4 680.

134. Vicente M, Errington J. 1996. Structure, function and controls in microbial division. Mol Microbiol. 20(1):17.

135. Vinella D, D'Ari R. 1995. Overview of controls in the Escherichia coli cell cycle.1. Bioessays. 17(6):527-36

136. Voskuil JL, Westerbeek CA, Wu C, Kolk AH, Nanninga N. Epitope mapping of Escherichia coli cell division protein FtsZ with monoclonal antibodies. J Bacterid. 176 (7) :1886-93

137. Voskuil JL, Nanninga N. 1996. How does FtsZ find itslocation? Microb Drug Resist. 2(1):55-61

138. Wang XD, de Boer PA, Rothfield LI. 1991. factor that positively regulates cell division by activating transcription of the major cluster of essential cell division genes of Escherichia coli.EMBO J. 10(11):3363-72 .

139. Wang X, Lutkenhaus J.1996. FtsZ ring: the eubacterial division apparatus conserved in archaebacteria. Mol Microbiol. 21(2):313-9.

140. Wang X, Lutkenhaus J. 1996. Characterization of the ftsZ gene from Mycoplasma pulmonis, an organism lacking a cell wall. J Bacteriol 178 (8):2314-9

141. Wallace DC, Morowitz HJ. 1973. Genome size and evolution. Chromosoma. 40(2):121-6.

142. Wang X, Huang J, Mukherjee A, Cao C, Lutkenhaus J. 1997. Analysis of the interaction of FtsZ with itself,

143. GTP, and FtsA. J Bacteriol. 179 (17) :5551-9.

144. Ward JE Jr, Lutkenhaus JF. 1984. A lacZ-ftsZ gene fusion is an analog of the cell division inhibitor sulA. J Bacteriol. 157 (3):815-20.

145. Weisburg WG, Tully JG, Rose DL, Petzel JP, Oyaizu H, Yang D, Mandelco L, Sechrest J, Lawrence TG, Van Etten J, et al. 1989. A phylogenetic analysis of the mycoplasmas: basis for their classification. J Bacteriol. 171 (12) :6455-67.

146. Westberg J, Persson A, Holmberg A, Bjorkvall E, Johansson K-E, Uhlen M, Petterson B. 1998. Genome sequencing of Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides SC. IOM Abstracts, p.151-2.

147. Werren JH, Zhang W, Guo LR. 1995. Evolution and phylogeny of Wolbachia: reproductive parasites of arthropods.Proc R Soc Lond B Biol Sei. 261(1360):55-63.

148. Wieslander A. Boyer M.J. Wroblewski H. 1992. Membrane protein structure. Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Washington, DC: Am. Soc. Microbiology.

149. Williamson MP. 1994. The structure and function of proline-rich regions in proteins. Biochem.J. 297:24 9260.

150. Woelker B, Messer W. 1993. The structure of the initiation complex at the replication origin, oriC, of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 21 (22):5025-33.

151. Woese C.R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol.Rev. 51:221-71.

152. Wu B, Georgopoulos C, Ang D. 1992. The essential Escherichia coli msgB gene, a multicopy suppressor of a temperature-sensitive allele of the heat shock gene grpE, is identical to dapE. J Bacteriol. 174 (16):5258-64 .

153. Yu XC, Margolin W. 1997. Ca2+-mediated GTP-dependentdynamic assembly of bacterial cell division protein FtsZ into asters and polymer networks in vitro. EMBO J. 16(17):5455-63.

154. Yu XC, Tran AH, Sun Q, Margolin W. 1998. Localization of cell division protein FtsK to the Escherichia coli septum and identification of a potential N-terminal targeting domain.

155. Zhao CR, de Boer PA, Rothfield LI. 1995. Proper placement of the Escherichia coli division site requires two functions that are associated with different domains of the MinE protein. Proc Natl Acad Sci USA.92 (10) :4313-7.

156. Zhou P, Bogan JA, Welch K, Pickett SR, Wang HJ, Zaritsky A, Helmstetter CE. 1997. Gene transcription and chromosome replication in Escherichia coli. J Bacteriol. 179 (1) :163-9

157. Zhulanova E, Mikulik K. 1998. Characterization of ftsZ gene and its protein product from Streptomyces collinus producing kirromycin. Biochem. And Bioph.Res.Com.249:556-61