Сравнительная характеристика белков FtsZ Escherichia coli и микоплазм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Ведяйкин Алексей Дмитриевич

• Ведяйкин Алексей Дмитриевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Ведяйкин Алексей Дмитриевич

1.1. Актуальность работы

1.2. Методы исследования

1.3. Цель и задачи работы

1.4. Научная новизна и практическая ценность работы

1.5. Положения, выносимые на защиту

1.6. Апробация работы и публикации

1.7. Личный вклад автора

1.8. Структура и объем работы

1.9. Финансовая поддержка работы

2. Литературный обзор

2.1. Механизмы деления бактерий

2.1.1. Гены деления в бактериальном геноме

2.1.2. Структура и состав бактериальной дивисомы E. coli

2.1.3. Структура и состав дивисомы других видов бактерий

2.1.3. Свойства белка FtsZ в условиях in vitro

2.1.3. Механизмы регуляции бактериального деления

2.1.4. FtsZ как мишень для новых антибактериальных препаратов

2.1.5. Механизмы деления микоплазм

2.2. Методы микроскопии сверхвысокого разрешения

2.2.1. Детерминистские методы визуализации

2.2.2. Стохастические методы визуализации

3. Материалы и методы

3.1. Подготовка фиксированных клеток E. coli для микроскопии сверхвысокого разрешения

3.2. Подготовка живых клеток E. coli для микроскопии сверхвысокого разрешения

3.3. Подготовка фиксированных клеток M. gallisepticum и A. laidlawii для микроскопии сверхвысокого разрешения

3.4. Подготовка фиксированных клеток M. gallisepticum и A. laidlawii для иммуноэлектронной микроскопии

3.5. Микроскопия сверхвысокого разрешения (методы SMLM и SRRF)

3.5.1. Двухмерная и трехмерная микроскопия SMLM, SRRF, а также стандартная флуоресцентная микроскопия фиксированных клеток E. coli, M. gallisepticum и A. laidlawii

3.5.2. Локализационная микроскопия и микроскопия SRRF с использованием живых клеток E. coli

3.5.3. Анализ размеров кластеров FtsZ

3.6. Электронная микроскопия

3.7. Ко-иммунопреципитация белков, взаимодействующих с белками FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii

3.8. Со-осаждение белков, взаимодействующих с белками FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii в клетках E. coli

3.9. Получение поликлональных антител к белкам FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii

3.9.1. Очистка рекомбинантных белков FtsZ

3.9.2. Иммунизация животных

3.9.3. Очистка и тестирование антител

3.9.4. Оценка концентрации белков FtsZ в клетках микоплазм

3.10. Визуализация FtsZ в живых клетках M. gallisepticum при помощи эндогенно-экспрессируемой флуоресцентной метки

4. Результаты и обсуждение

4.1. Визуализация структур, формируемых белком FtsZ в клетках E. coli

4.1.1. Метод локализационной микроскопии позволяет визуализировать белок FtsZ и другие структуры внутри клетки E. coli с разрешением до 20 нм

4.1.2. Z-кольцо - неоднородная структура

4.1.3. Анализ структур, формируемых белком FtsZ в ходе восстановления деления после филаментации клеток

4.3. Тестирование антител к белкам FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii, оценка концентрации FtsZ в клетках микоплазм

4.4. Структуры, формируемые белками FtsZ в клетках M. gallisepticum и A. laidlawii

4.5. Белки, взаимодействующие с белками FtsZ в клетках M. gallisepticum и A. laidlawii

4.6. Структуры, формируемые белками FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii в клетках E. coli

4.7. Белки, взаимодействующие с белками FtsZ микоплазм в клетках E. coli

4.8. Локализация белка FtsZ в живых клетках M. gallisepticum

5. Заключение

6. Выводы

7. Список сокращений и условных обозначений

8. Список литературы

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная характеристика белков FtsZ Escherichia coli и микоплазм»

1. Введение 1.1. Актуальность работы

В данной работе были исследованы некоторые свойства белков FtsZ трёх видов бактерий — Escherichia coli, Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma gallisepticum. FtsZ относится к белкам цитоскелета — структурным элементам клеток, которые участвуют в осуществлении жизненно важных функций, таких как поддержание формы клетки, внутриклеточный транспорт, деление, движение клетки. FtsZ является одним из наиболее консервативных белков цитоскелета: он обнаружен у большинства бактерий, у многих архей, а также в хлоропластах и митохондриях некоторых видов эукариот. Кроме того, FtsZ считается эволюционным предшественником тубулина: оба белка содержат консервативный мотив, связанный с гидролизом ГТФ, имеют похожую трехмерную структуру и участвуют (следует отметить, по-разному) в процессе деления, формируя динамичные полимерные структуры, служащие каркасом для аппарата деления клетки. FtsZ и тубулин полимеризуются с образованием однонитевых полимеров, которые затем могут ассоциироваться в более сложные структуры: микротрубочки в случае тубулина и пучки в случае FtsZ. Для большинства хорошо изученных видов бактерий, включая E. coli, FtsZ является жизненно необходимым белком, поэтому он рассматривается как перспективная мишень для новых антибактериальных препаратов. В настоящее время описано множество антибактериальных веществ естественного и искусственного происхождения, ингибирующих активность белка FtsZ, причём некоторые из этих веществ демонстрируют ингибирующие концентрации на уровне хороших антибиотиков.

В большинстве изученных видов бактерий белок FtsZ формирует Z-кольцо, которое выступает как каркас для дивисомы - комплекса белков, участвующих в делении бактерий. Несмотря на интенсивное изучение, на настоящий момент

существует достаточно много вопросов, касающихся механизмов работы данного белка, на которые только предстоит ответить. Даже в таком хорошо изученном модельном организме, как E. coli, до сих пор неизвестна точная структура Z-кольца: большинство работ свидетельствует в пользу слабо упорядоченного массива протофиламентов, из которых состоит Z-кольцо, в то же время часть работ говорит о том, что протофиламенты в Z-кольце хорошо упорядочены и формируют замкнутое кольцо или спираль. Информация о точной структуре Z-кольца имеет принципиальное значение для понимания как механизмов цитокинеза в целом, так и роли белка FtsZ в этом процессе. Например, продолжительное время обсуждается вопрос, вносит ли существенный вклад в цитокинез так называемая сократительная сила, которую Z-кольцо может генерировать в условиях in vitro, или Z-кольцо является лишь каркасом для белков, которые отвечают за синтез клеточной стенки в области деления. Для ответа на этот вопрос важно понять, как организованы однонитевые филаменты в составе Z-кольца. В данной работе была осуществлена субдифракционная визуализация Z-кольца в E. coli при помощи методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, что позволило охарактеризовать структуру Z-кольца с высокой точностью.

У представителей класса Mollicutes, часто также собирательно называемых микоплазмами, роль белка FtsZ плохо изучена и может существенным образом отличаться от таковой в E. coli. Микоплазмы лишены клеточной стенки, с синтезом которой связана основная роль белка FtsZ в E. coli, кроме того, в редуцированном геноме этих бактерий отсутствует большинство гомологов известных белков деления. Это делает представителей данного класса интересными с точки зрения концепта минимальной клетки, а именно выявления минимального набора белков, обеспечивающих деление клетки. Многие микоплазмы являются важными патогенами (например, A. laidlawii является возбудителем фитоплазмозов - воспалительных заболеваний растений, а M. gallisepticum — респираторных заболеваний птиц), борьба с которыми затруднена, потому что арсенал антибиотиков ограничен (например, большая

группа антибиотиков, ингибирующих синтез клеточной стенки, по понятным причинам не действует на микоплазмы). Кроме того, вследствие высокой изменчивости микоплазмы довольно быстро вырабатывают устойчивость к используемым препаратам. Поэтому изучение их организации, в том числе механизмов деления, является важной задачей с практической точки зрения.

1.2. Методы исследования

В НИК «Нанобиотехнологии» СПбПУ [1] были внедрены (в том числе в ходе выполнения данной работы) и успешно используются методы флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (локализационной микроскопии), которые позволяют осуществлять визуализацию с разрешением до 20 нм в различных режимах (двухмерная, трехмерная, многоцветная микроскопия; визуализация в фиксированных и живых клетках). Эти методы были успешно использованы в данной работе для изучения структур, формируемых белками FtsZ видов E. coli, A. laidlawii и M. gallisepticum.

В дополнение к флуоресцентной визуализации белков FtsZ в клетках A. laidlawii и M. gallisepticum, в работе был использован также классический метод иммуноэлектронной микроскопии, что позволило более надежно интерпретировать данные, полученные двумя независимыми методами.

Так как в данной работе было показано, что структуры, формируемые белками FtsZ видов A. laidlawii и M. gallisepticum, существенно отличаются от таковых для белка FtsZ E. coli, следует предположить, что механизмы деления микоплазм (и роль FtsZ в этом процессе) довольно сильно отличаются от механизмов деления E. coli. По-видимому, гомологи белка FtsZ микоплазм имеют другой набор белков-партнеров, однако литературных данных на этот счёт практически нет. Для того, чтобы более точно интерпретировать структуры, формируемые белками FtsZ указанных видов микоплазм в клетках E. coli, A. laidlawii и M. gallisepticum, в данной работе наряду с методами микроскопии сверхвысокого разрешения были

использованы методы анализа белок-белковых взаимодействий. Методы ко-иммунопреципитации и со-осаждения позволили впервые идентифицировать белки - партнеры белков FtsZ видов A. laidlawii и M. gallisepticum, что вносит существенный вклад в понимание роли белка FtsZ указанных видов бактерий, в том числе в делении.

1.3. Цель и задачи работы

Цель работы — выявление свойств белков FtsZ Escherichia coli, Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma gallisepticum.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Анализ структур, формируемых белком FtsZ в фиксированных и живых клетках E. coli, при помощи методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения.

2. Получение и тестирование поликлональных антител к белкам FtsZ бактерий A. laidlawii и M. gallisepticum.

3. Анализ структур, формируемых белками FtsZ видов A. laidlawii и M. gallisepticum в фиксированных клетках E. coli, A. laidlawii и M. gallisepticum.

4. Получение штамма M. gallisepticum с эндогенно-экспрессируемым флуоресцентно-меченым белком FtsZ и визуализация структур, формируемых этим белком, в живых клетках.

5. Идентификация белков - партнеров FtsZ A. laidlawii и M. gallisepticum в клетках E. coli, A. laidlawii и M. gallisepticum.

1.4. Научная новизна и практическая ценность работы

Результаты, изложенные в данной работе, получены впервые и носят фундаментальный характер. Впервые выявлено утолщение Z-кольца в ходе его сокращения в E. coli, что поддерживает гипотезу о том, что Z-кольцо сокращается за счёт перераспределения протофиламентов FtsZ в его составе, а не за счёт их

укорочения или исключения из Z-кольца. Оценены размеры кластеров на изображениях структур FtsZ в норме и при нарушении деления под действием белка SulA. Впервые визуализированы структуры, формируемые белками FtsZ в клетках A. laidlawii и M. gallisepticum. Эти структуры существенно отличаются от классического Z-кольца, что может говорить о вовлечении белков FtsZ в отличные от цитокинеза процессы. Впервые были идентифицированы белки -партнеры FtsZ в клетках A. laidlawii и M. gallisepticum; среди них не было выявлено гомологов известных белков деления, однако было установлено, что FtsZ микоплазм взаимодействует с белками, участвующими в различных метаболических путях, в фолдинге и деградации белков, трансляции.

В большинстве хорошо изученных видов бактерий, включая E. coli, FtsZ является жизненно необходимым белком для большинства изученных бактерий, поэтому он рассматривается как перспективная мишень для новых антибактериальных препаратов [2]. В настоящее время описано значительное количество антибактериальных веществ естественного и искусственного происхождения, ингибирующих активность белка FtsZ, причём некоторые из этих веществ демонстрируют ингибирующие концентрации на уровне хороших антибиотиков. В будущем результаты работы могут способствовать созданию новых антибактериальных препаратов.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. Z-кольцо, формируемое белком FtsZ в Escherichia coli, представляет собой неоднородную структуру и утолщается в процессе цитокинеза.

2. Гомологи FtsZ в клетках Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma gallisepticum не формируют Z-колец и локализуются иначе, чем FtsZ в клетках E. coli.

3. Гомологи FtsZ в клетках M. gallisepticum и A. laidlawii взаимодействуют с наборами белков, состав которых значительно отличается от набора белков-партнеров FtsZ E. coli.

1.6. Апробация работы и публикации

Промежуточные результаты работы докладывались на ряде международных и всероссийских конференций. В ходе выполнения работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах, а также 12 тезисов конференций.

1.7. Личный вклад автора

Автором самостоятельно выполнен основной объем работы. Анализ образцов при помощи масс-спектрометрии осуществляла Артамонова Т.О. в НИК «Нанобиотехнологии» СПбПУ. Эксперименты с использованием электронной микроскопии выполнены Вишняковым И.Е. в Институте Цитологии РАН. Иммунизацию животных осуществлял Иванов В.А. в Институте Цитологии РАН.

1.8. Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста и включает: введение, литературный обзор, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (141 источник) и благодарности. Работа содержит 39 иллюстраций и 7 таблиц.

1.9. Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 15-04-07472, № 18-04-01074), Российского научного фонда (проекты № 17-74-20065, № 14-34-00023) и государственного задания № 3.8742.2017/8.9.

2. Литературный обзор

2.1. Механизмы деления бактерий

В данной главе рассматриваются основы бактериального деления. Основное внимание уделено нескольким модельным организмам, главным образом

Escherichia coli и Bacillus subtilis.

2.1.1. Гены деления в бактериальном геноме

В середине XX века генетические исследования позволили открыть в геноме E. coli локусы, которые содержат гены, ответственные за процесс деления, в том числе за септообразование (септа - перегородка между дочерними клетками, образующаяся в ходе деления бактерий) [3]. Ключевой вклад в открытие этих генов внесла методология, предполагающая использование температурно-чувствительных мутантов в сочетании с фаговой трансдукцией: бактерии с определёнными мутациями в указанных генах оказывались не способными к делению при повышении температуры окружающей среды выше критической и образовывали вытянутые клетки-филаменты. Эти мутанты, а затем и сами гены, в которых были картированы мутации, стали обозначать с использованием аббревиатуры fts (от англ. «filamentous temperature-sensitive mutants» -температурно-чувствительные мутанты, образующие филаменты). Важно отметить, что в некоторых мутантах процессы репликации и сегрегации (распределения между будущими дочерними клетками) ДНК нарушены не были, что позволило связать соответствующие этим мутациям гены именно с цитокинезом, а не с репликацией или сегрегацией ДНК. Среди этих генов были идентифицированы такие гены, как ftsA, ftsQ, ftsL, ftsZ и другие. Последний ген кодирует соответствующий белок FtsZ — первый обнаруженный бактериальный белок цитоскелета. Использование указанной выше методологии позволило показать, что большинство генов, отвечающих за процесс деления, расположено

компактно в составе так называемого кластера dcw (англ. division and cell wall — деление и клеточная стенка) в районе 2 минуты на хромосоме E. coli, что было существенным прорывом в понимании устройства аппарата деления бактериальной клетки [4]. Схематически кластер dcw на примере нескольких модельных видов представлен ниже (см. Рисунок 1).

Escherichia coli:

I mraZ^mra^)| /й/^Хшот^ mur^)| тгар^тигР^ /й^тиг^ш^ <р*С/>

Bacillus subtilis:

mra^^mra

Neisseria gonorrhoeae:

mraZ^тгаЩ^ftsl^y\ murE^ murF^)[ mraY^miu-D^)

Caulobacter crescerttus: ffMf^ mr^muJp^ | fts ^ ffwrC> ftsA^

mraZji mra

Deinococcus radiodurans:

Гтн7Р>| ftsWyI I murG^ wwg^ ./f.vg)|

Staphylococcus aureus: wroZ)I тгдЦ>)| mr^\ muri^JhQ^)| ftsZ

ma

Helicobacter pylori:

гагаП murD

Mycoplasma gallisepticum:

Acholeplasma laidlawii:

mraZ

fisA*>I ftsZ

Рисунок 1. Схематическое расположение генов, связанных с процессом деления, в кластере dcw на примере нескольких видов бактерий. Жёлтыми стрелками обозначены гены деления и синтеза клеточной стенки, белыми - гены транскрипционных регуляторов кластера dcw, серыми прямоугольниками - области генома в составе кластера, не содержащие генов деления

Среди указанных на Рисунок 1 генов, ftsL, ftsW, ftsQ, ftsA, ftsZ, как известно на настоящий момент, относятся к генам деления, играющих структурную и регуляторную роль, ftsI, mraY, murC, murD, murE, murG, ddlB отвечают за синтез клеточной стенки [5, 6], lpxC связан с синтезом липида А, mraZ и mraW относятся к регуляторам транскрипции данного кластера [7].

Кластер dcw в том или ином виде присутствует в геноме большинства видов бактерий, что говорит о его высокой консервативности, что очевидным образом связано с критической ролью генов, входящих в него. Одним из наиболее консервативных генов является ftsZ, кодирующий ключевой белок деления FtsZ, он обычно присутствует даже в видах, потерявших большинство генов кластера dcw, например, в таких видах, как Helicobacter pylori, Mycoplasma gallisepticum и Acholeplasma laidlawii (см. Рисунок 1). В то же время часть генов, также связанных с процессом деления, обычно расположена вне кластера dcw, например, гены ftsK, ftsN и некоторые другие.

2.1.2. Структура и состав бактериальной дивисомы E. coli.

Процесс деления бактерий предполагает формирование особого комплекса белков - дивисомы, которая обычно представляет из себя кольцеобразную структуру и обеспечивает рост септы - перегородки между будущими дочерними клетками. Среди белков, имеющих отношение к процессу деления, порядка двадцати входит в состав дивисомы. Ниже (Рисунок 2) представлена схема, иллюстрирующая процесс бинарного деления бактерий. После репликации ДНК и её разделения на 2 нуклеоида, сначала происходит формирование Z-кольца (или прото-кольца), состоящего из филаментов — линейных полимеров (и, возможно, пучков из филаментов) ключевого белка деления FtsZ, а также якорных белков FtsA и ZipA, обеспечивающих прикрепление филаментов FtsZ к внутренней мембране. Затем Z-кольцо обрастает множеством дополнительных белков, в результате чего формируется зрелая дивисома, которая обеспечивает формирование септы и в конечном счёте разделение клетки надвое.

Рисунок 2. Схематическое изображение бинарного деления бактерий. В процессе деления происходит репликация и сегрегация (разделение по дочерним клеткам) генетического материала, после чего происходит образование 2-кольца, состоящего в основном из полимеров белка затем 2-кольцо обрастает вспопогательными белками, которые

обеспечивают формирование септы

FtsZ считается ключевым белком деления, так как первым привлекается в сайт деления и выступает (в комплексе с якорными белками) в качестве своеобразного каркаса для других белков дивисомы. Ген ftsZ впервые был идентифицирован в ходе изучения температурно-чувствительных мутантов штамма K-12 E. coli (Escherichia coli) [8]. Ранее мутации, связанные с геном ftsZ, ошибочно относились к гену ftsA. Кроме более точного картирования ftsZ на бактериальной дивисоме, в указанной работе было выявлено морфологическое различие между мутантами ftsA и ftsZ: если первые образовывали клетки-филаменты с незавершенными септами (перегородками между дочерними клетками), то во вторых септы полностью отсутствовали. Это позволило авторам предположить, что продукт гена ftsZ вовлекается в процесс образования септы на более ранней стадии, чем ftsA, однако реальная ситуация оказалась несколько сложнее. Действительно, в работе 1985 года было показано, что FtsZ первым

среди нескольких белков (рассматривались FtsA, FtsI, FtsQ и FtsZ) вовлекается в процесс деления и таким образом инициирует процесс образования септы [9]. Однако на сегодняшний день известно, что FtsZ, FtsA и ZipA начинают включаться в Z-кольцо примерно в одинаковое время, т.к. формирование Z-кольца невозможно как без полимеров FtsZ, так и без якорных белков FtsA и ZipA, прикрепляющих Z-кольцо к мембране, функции которых, впрочем, частично перекрываются [10]. Например, в работе 2002 года было показано, что для сборки и стабилизации Z-кольца в бактерии E. coli необходим хотя бы один из двух белков, ZipA или FtsA, тогда как для дальнейших этапов септообразования и, соответственно, вовлечения в этот процесс других белков (в частности, в работе обсуждается FtsK) требуется наличие обоих белков [11].

Позже было показано, что во многих видах, в том числе E. coli, FtsZ является жизненно необходимым, иными словами, удаление ftsZ из генома является летальным [12, 13]. В настоящее время известно, что гомологи FtsZ присутствуют как среди грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, а также в некоторых видах архей и пластидах эукариот [14, 15]. Интересно, впрочем, отметить, что у некоторых бактерий (например, хламидий и у некоторых микоплазм) ftsZ отсутствует [16, 17].

В конце 1991 года впервые методом иммуноэлектронной микроскопии было показано, что белок FtsZ в делящихся бактериях E. coli концентрируется посередине клетки и образует так называемое Z-кольцо [18]. Следует отметить, что FtsZ стал первым элементом цитоскелета, обнаруженным у бактерий. В дальнейшем формирование Z-кольца было подтверждено с использованием флуоресцентной микроскопии, как при помощи иммунофлуоресценции в фиксированных клетках, так и с использованием экспрессируемых в живых клетках флуоресцентных белков слияния [19, 20].

В настоящее время известно, что линейные полимеры FtsZ каким-то образом собираются в кольцевую структуру на цитоплазматической поверхности внутренней мембраны в месте будущей септы. В ходе формирования септы Z-кольцо сокращается, образуя более плотную структуру. Сборка кольца является

первым этапом и одновременно лимитирующей стадией всего процесса септообразования [14].

Значительный интерес представляет организация протофиламентов FtsZ в составе Z-кольца. Для её изучения в последние годы были использованы несколько методов, в том числе флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения и криоэлектронная томография. Разработка методов микроскопии сверхвысокого разрешения (англ. super-resolution microscopy) стала одним из наиболее важных достижений последнего десятилетия в области флуоресцентной микроскопии. Эти методы активно применяются в настоящее время для исследования внутренней организации бактериальной клетки. Возлагаются надежды на то, что эти методы позволят понять, каким именно образом протофиламенты FtsZ формируют Z-кольцо, а также прояснить роль FtsZ в процессе деления (две конкурирующие модели рассматриваются ниже). Среди этих методов наиболее привлекательными представляются метод локализационной микроскопии SMLM (англ. Single-Molecule Localization Microscopy - одномолекулярная локализационная микроскопия) [21], а также метод микроскопии структурированной засветки (SIM). Такие методы были использованы для визуализации FtsZ и других белков дивисомы в клетках E. coli, B. subtilis, C. crescentus, S. pneumoniae и других видов [22-28]. Это позволило в значительной степени уточнить организацию дивисомы в частности и процесс деления в целом. Следует отметить, что данные, полученные с использованием методов флуоресцентной микроскопии, говорят о том, что Z-кольцо представляет собой неоднородную и относительно слабоупорядоченную структуру. Этот результат находится в противоречии с данными, полученными с использованием другого современного метода — криоэлектронной томографии [29], которые свидетельствуют о том, что Z-кольцо состоит из выровненных друг относительно друга протофиламентов FtsZ, которые образуют существенно более однородную структуру, чем это было показано методами флуоресцентной микроскопии. В целом, ультраструктура Z-кольца по-прежнему вызывает ряд вопросов, поэтому одной из задач данной работы была его визуализация в клетках E. coli с

субдифракционным разрешением при помощи локализационной микроскопии. Ультраструктура Z-кольца имеет большое значение для описания функций FtsZ в составе дивисомы, в том числе в рамках обсуждаемых ниже моделей.

В настоящее время рассматриваются две основные модели, описывающие роль Z-кольца в бактериальном делении. Первая модель рассматривает Z-кольцо как каркас для вспомогательных белков, в особенности тех, которые вовлечены в синтез клеточной стенки. В рамки этой модели хорошо укладывается довольно неоднородная структура Z-кольца, визуализированная с использованием современных методов микроскопии сверхвысокого разрешения [25, 27]. Другая модель предполагает существование так называемой сократительной роли Z-кольца, что хорошо подтверждается результатами in vitro исследований. Было показано, что FtsZ в искусственных мембранных пузырьках, имитирующих клетку — липосомах — способен формировать Z-кольцо и обеспечивать сжатие мембраны липосомы вплоть до полного разделения «клетки» [30]. Также эта модель косвенно подтверждается данными визуализации, осуществленной криоэлектронной томографией: было показано, что Z-кольцо состоит из выровненных друг относительно друга филаментов FtsZ и представляет собой практически непрерывную структуру [29]. В рамках этой непрерывной структуры возможно проскальзывание филаментов FtsZ друг относительно друга, при этом, как предполагается, сокращение Z-кольца оказывается энергетически выгодным, что приводит к формированию сократительной силы, распределенной по окружности септы [31]. С другой стороны, в случае неоднородной структуры Z-кольца также возможно формирование сократительной силы, например, за счёт изменения кривизны филаментов FtsZ [32]. Следует отметить, что в настоящее время наиболее важной ролью Z-кольца считается именно привлечение в сайт деления вспомогательных белков, а не сократительная роль [33]. Одним из аргументов против сократительной роли Z-кольца является величина возможной сократительной силы, оценки которой (обычно не более 100 пН) оказались намного меньше, чем требуется для сжатия относительно жесткой оболочки бактериальной клетки [33]. Другой аргумент, ставящий под сомнение роль

скоратительной силы, связан с наблюдением того, что FtsZ покидает сайт деления до полного формирования септы [34]. Наконец, ещё один аргумент против сократительной силы основан на том, что в бактериях, искусственно лишенных клеточной стенки (так называемая L-форма), FtsZ перестает быть жизненно необходимым [35]. С другой стороны, отмеченные выше результаты, полученные на липосомах, убедительно свидетельствуют в пользу сократительной роли FtsZ в составе Z-кольца, поэтому обе модели могут сосуществовать в бактериальной клетке. Интересным объектом для изучения в данном контексте представляются микоплазмы, сохранившие белок FtsZ, но потерявшие не только клеточную стенку, но и большинство партнеров FtsZ. Возможно, в микоплазмах сократительная роль FtsZ существенно в большей степени выражена, чем, например, в E. coli.

Среди вспомогательных белков в E. coli после сборки Z-кольца в дивисому вовлекается около 20 белков, в том числе FtsB, FtsL и FtsQ, каждый из которых имеет короткий N-концевой цитоплазматический домен, один трансмембранный домен и больший периплазматический домен (см. Рисунок 3). Точная функция этих белков на настоящий момент до конца неясна, однако предполагается, что эти белки функционируют как связующее звено между Z-кольцом и комплексом белков, синтезирующих пептидогликан в составе клеточной стенки [10, 5]. FtsI и FtsW являются частью этого комплекса. FtsK представляет собой ДНК-транслоказу с трансмембранным доменом, содержащим 4 трансмембранных сегмента, слитых с доменом ДНК-транслоказы длинным линкером. Основная роль FtsK связана с процессом сегрегации ДНК, в том числе разрешением так называемых димеров хромосом, образующихся при гомологической рекомбинации между растущими дочерними цепями ДНК [36]. FtsK вместе с комплексом белков ZapA, ZapB и MatP, а также системой нуклеоидной окклюзии помогает координировать деление с процессом сегрегации дочерних хромосом [37]. FtsK взаимодействует с несколькими белками дивисомы, в том числе FtsZ, FtsB, FtsL и FtsQ. Одна из других возможных ролей FtsK в процессе деления может быть связана с его трансмембранным доменом, который, как считается,

может участвовать в разрешении мембраны на финальном этапе деления [5]. является последним белком деления, вовлекаемым в дивисому, его вовлечение в этот комплекс, по-видимому, является своеобразным сигналом окончания формирования зрелой дивисомы, после чего осуществляется процесс септообразования и разделение дочерних клеток [5].

Рисунок 3. Состав бактериальной дивисомы на примере E. coli. Межбелковые взаимодействия отражены контактом белков, а также стрелками

2.1.3. Структура и состав дивисомы других видов бактерий

FtsZ демонстрирует высокую консервативность среди различных видов бактерий, однако другие элементы дивисомы отличаются в большей степени. Интересным представляется отметить, в частности, отличия от E. coli дивисомы другого модельного организма - B. subtilis, который относится к грамположительным видам бактерий. Особенности механизмов деления,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ведяйкин Алексей Дмитриевич, 2019 год

/ - •w»

1 pm

б

Рисунок 19. Многоцветная локализационная микроскопия с одновременной визуализацией FtsZ и ДНК (а) или FtsZ и клеточной оболочки (б). TL - проходящий свет; SR FtsZ - локализационная микроскопия FtsZ; DL FtsZ - ; DL DNA - ; SR DNA -локализационная микроскопия ДНК; Composite - комбинированное изображение; SR WGA - локализационная микроскопия клеточной оболочки

Для более полного и глубокого понимания механизмов бактериального деления, в том числе функционирования FtsZ, в ходе выполнения данной работы была разработана методика локализационной микроскопии в живых клетках E. coli. При помощи этой методики была успешно осуществлена динамическая визуализация структур, формируемых белком FtsZ, в живых клетках (см. Рисунок 20). Были протестированы различные генетические конструкции (С-концевой белок слияния, а также белок слияния типа «сэндвич») и различные флуоресцентные белки (фотопереключаемые Eos3.1, mMaple2, mMaple3, фотоактивируемый Dreiklang, а также перспективные с точки зрения использования в локализационной микроскопии флуорогенные белки Dib3 и UnaG [118]). Наиболее продуктивные результаты дало использование штамма с белком слияния по типу «сэндвич» FtsZ:mMaple2.

Рисунок 20. Кинетические серии субдифракционных изображений нормально делящихся клеток E. coli. Представлены комбинированные изображения, состоящие из изображений в проходящем свете (градации серого) и ЛМ-изображения FtsZ (зелёный цвет) для трёх временных точек. Шкала соответствует 1 мкм

Проведение исследований потребовало также разработать методику, позволяющую осуществлять субдифракционную визуализацию структур FtsZ в живых клетках E. coli с использованием полностью функционального белка слияния FtsZ с флуоресцентным белком [130]. Для этого, наряду с методом локализационной микроскопии (см. Рисунок 20), был использован родственный ему, недавно разработанный [119] метод микроскопии радиальных флуктуаций (SRRF, см. Рисунок 21). В основе последнего лежит анализ изображений с большой плотностью флуоресцентных молекул, которые невозможно анализировать при помощи метода локализационной микроскопии, так как изображения флуоресцентных молекул накладываются друг на друга.

Визуализация структур, формируемых белком FtsZ в живых клетках E. coli, с помощью метода SRRF позволила добиться разрешения не хуже 100 нм.

0 min 20 min 40 min 60 min 80 min 100 min

Рисунок 21. Микроскопия сверхвысокого разрешения (метод SRRF) белка FtsZ в живых клетках E. coli. a, c, e - последовательные изображения с интервалом 20 мин, полученные в канале FtsZ; b, d, f - то же, но изображения комбинированы с изображениями в проходящем свете для лучшей демонстрации морфологии клетки. Шкала - 1 мкм

4.1.2. Z-кольцо - неоднородная структура

Используя разработанную методику локализационной микроскопии, была визуализирована с субдифракционным разрешением и охарактеризована структура Z-кольца, образованного белком FtsZ в клетках E. coli.

Ниже приведены изображения этих колец на разных стадиях деления клетки (Рисунок 22). Анализ этих изображений показывает, что структура колец неоднородна, а толщина их зависит от диаметра кольца. Впервые для бактерии E. coli удалось показать утолщение Z-кольца в ходе его сокращения (см. Рисунок 23), что хорошо согласуется с данными, полученными при исследовании бактерии Streptococcus pneumoniae [25]. Толщина кольца в среднем оказалась существенно меньше, чем было показано ранее при использовании флуоресцентного белка слияния [23], что, по-видимому, отчасти объясняется более высоким разрешением (оценка на уровне не хуже 20 нм), так как нами был использован более яркий краситель Alexa 647, но также в значительной степени это различие объясняется тем, что использование флуоресцентного белка слияния серьёзно влияет на способность белка FtsZ к мультимеризации, что могло приводить в указанной работе к искажению нативных структур FtsZ (что подтверждается в том числе и нашими наблюдениями с использованием флуоресцентного белка, см. ниже). Z-кольца организованы в виде цепочек, состоящих из кластеров белка FtsZ со средним размером кластера порядка 100 нанометров (см. Рисунок 24). Понятие кластера применительно к структурам, формируемым белком FtsZ, было введено в литературе относительно недавно в связи с высокой неоднородностью этих структур. Кластером в данной работе считалось пятно на субдифракционном изображении, по размерам существенно превышающее оценку разрешения (около 20 нм). Полученные впервые данные о структуре Z-кольца со столь высоким пространственным разрешением существенным образом дополняют имеющиеся в литературе сведения о неоднородности Z-кольца и поддерживает гипотезу, что оно является лишь каркасом для других белков деления, в котором протофиламенты FtsZ слабо упорядочены, а их перераспределение в процессе

цитокинеза ведет к изменению толщины /-кольца. По результатам данной части исследования была опубликована работа [131].

Рисунок 22. Визуализация белка в фиксированных клетках Е.еоМ при помощи метода локализационной микроскопии. Строки последовательно демонстрируют изображения клеток, находящихся на разных стадиях цитокинеза: от начала процессаделения (А) до его фактического завершения (О). Столбцы слева направо: (1) изображения в проходящем свете; (2) дифракционно-ограниченные флуоресцентные изображения (3) изображения в

режиме локализационной микроскопии; (4) изображения 2-колец, полученные при помощи локализационной микроскопии (зелёный цвет) с дополнительной визуализацией ДНК (фиолетовый); (5) дифракционно-ограниченные флуоресцентные изображения ДНК. Шкала - 1 мкм

Диаметр (О), нм

Рисунок 23. Зависимость толщины 2-кольца от его диаметра (Б) на основании анализа изображений, полученных в режиме локализационной микроскопии. Черные круги -экспериментальные точки, красная линия - линейная аппроксимация экспериментальных данных. Каждая экспериментальная точка соответствует результату измерения диаметра и средней толщины 2-кольца в одной из клеток. Над графиком приведены результаты линейной регрессии: зависимость w (Б), коэффициент корреляции Я, а также р-значение, характеризующее уровень значимости наблюдаемого эффекта

Рисунок 24. Диаграмма, демонстрирующая распределение по размерам кластеров белка в составе /-кольца. Средняя длина кластеров составляет (108±41) нм, а средняя толщина -(63±12) нм

Было проанализировано влияние диаметра /-кольца (т.е. стадии цитокинеза) на размер кластеров (см. Рисунок 25). Оказалось, что при сокращении /-кольца средняя толщина кластеров остается постоянной, однако средняя длина кластеров увеличивается. С учетом выявленного среднего утолщения /-кольца в ходе цитокинеза (см. Рисунок 23), следует предположить, что по крайней мере часть кластеров направлена не вдоль, а поперек /-кольца, что подчеркивает низкую упорядоченность полимеров в /-кольце, и именно их удлинение (и,

возможно, изменение ориентации кластеров относительно оси клетки) приводит к утолщению /-кольца. Также данное наблюдение в значительной степени ставит под сомнение возможность сократительной роли /-кольца, по крайней мере, в рамках модели упорядоченных филаментов. В целом размер кластеров находится в хорошем согласии с литературными данными. Например, недавно при помощи

метода STED были оценены размеры кластеров в составе Z-кольца E. coli, а также было показано, что эти размеры не изменяются даже при существенном изменении морфологии клетки [132].

Рисунок 25. Влияние толщины Z-кольца на размеры кластеров FtsZ

4.1.3. Анализ структур, формируемых белком FtsZ в ходе восстановления

деления после филаментации клеток

В целом, метод локализационной микроскопии в сочетании с иммунофлуоресцентным мечением показал себя как мощный и универсальный метод визуализации, позволяющий достичь разрешения порядка 20 нм в горизонтальной плоскости. Этот метод был нами также использован для изучения структур, формируемых белком FtsZ в процессе восстановления деления клеток E. coli после его нарушения под действием экспрессии белка SulA - ингибитора FtsZ в ходе SOS-ответа. Это позволило показать, что формирование функциональных Z-колец происходит через промежуточную стадию формирования спиралевидных структур (см. Рисунок 26), и что основным механизмом позиционирования Z-кольца при восстановлении деления является нуклеоидная окклюзия, тогда как при нормальном делении основным механизмом считается Min-система [133].

Кроме того, анализ размеров кластеров при экспрессии SulA показал, что в этом состоянии, хотя и происходит некоторое уменьшение средних размеров кластеров, однако эти размеры всё же остаются сопоставимыми с размерами кластеров в нормально делящихся клетках (см. Рисунок 27). Это наблюдение согласуется с нашими прошлыми наблюдениями о том, что в ходе SOS-ответа продолжает формировать некоторые структуры, хотя /-кольца не образуются [122], и находится в противоречии с моделью, согласно которой ингибируется белком SulA посредством секвестрации — снижения его эффективной концентрации ниже критического значения [134]. Новые данные требуют дополнительной проверки гипотезы о секвестрации, и возможно, уточнения модели блокирования деления при SOS-ответе.

Рисунок 26. Изображения структур, формируемых белком на разных стадиях

восстановления деления после его блокирования белком Би1А: а - 0 мин; б - 35 мин; в - 70 мин. Приведены изображения в проходящем свете (ПС), субдифракционные изображения FtsZ (FtsZ), дифракционно-ограниченные изображения ДНК (ДНК), а также их комбинация (FtsZ+ДНК), при этом фиолетовый цвет соответствуют ДНК, зелёный - белку FtsZ. Стрелками отмечены спиралевидные структуры. Шкала — 1 мкм

Рисунок 27. Размеры кластеров FtsZ при нормальном делении клеток E. coli и при нарушении деления в результате накопления белка SulA. «- SulA» - в условиях нормального деления, «+ SulA» - в результате экспрессии белка-ингибитора SulA. Представлены диаграммы «ящик с усами». На диаграммах верхняя и нижняя границы прямоугольника («ящика») соответствуют перцентилям 25% и 75%, концы отрезков, выходящих из прямоугольника («усы») — перцентилям 5% и 75%. Внутри прямоугольника кружок обозначает среднее значение, горизонтальная черта — медиану. Крестиками обозначены экстремальные значения

4.3. Тестирование антител к белкам FtsZ М. gallisepticum и А. 1а1й1ам>и, оценка

концентрации FtsZ в клетках микоплазм

Тестирование антител методом иммуноблотинга показало, что оба вида полученных антител демонстрируют достаточно высокую специфичность по отношению к белку интереса (см. Рисунок 28). В обоих случаях на пластинах видна 1 мажорная полоса, по размеру приблизительно соответствующая целевому белку.

Рисунок 28. Оценка специфичности антител к белку FtsZ методом иммуноблотинга. AL — A. laidlawii, MG — M. gallisepticum

Оценка концентрации (см. Рисунок 29) показала, что в клетках A. laidlawii находится примерно 300 молекул FtsZ (концентрация 6 мкМоль), а в клетках M. gallisepticum — примерно 150 молекул FtsZ (концентрация 3 мкМоль/л). Обе концентрации соотносятся с измеренной концентрацией FtsZ в клетках E. coli (310 мкМоль/л). Так как критические концентрации для обоих белков неизвестны, то можно сравнить полученные значения только с критической концентрацией для FtsZ E. coli (1-2 мкМоль/л). Оценка концентрации поддерживает предположение о том, что эти белки полимеризуются в клетках микоплазм, в случае если их критическая концентрация сравнима с указанным выше значением.

Рисунок 29. Оценка концентрации белка FtsZ в клетках видов A. laidlawii и M. gallisepticum с помощью полуколичественного иммуноблотинга. М - маркер молекулярного веса (PageRuler Plus). Слева направо - клеточный лизат от известного количества клеток и возрастающие количества очищенного белка FtsZ

4.4. Структуры, формируемые белками FtsZ в клетках M. gallisepticum и A.

laidlawii

Данные, полученные при помощи метода локализационной микроскопии (см. Рисунок 30 и Ошибка! Источник ссылки не найден.), а также при помощи метода иммуноэлектронной микроскопии (см. Рисунок 32) для визуализации белка в фиксированных клетках микоплазм, свидетельствуют о том, что

поведение белков в клетках двух видов микоплазм — А. laidlawii и М. gallisepticum — значительно отличается от поведения в бактериях,

демонстрирующих «классическое» деление с формированием 7-кольца. в клетках микоплазм не формирует привычного 7-кольца. На указанных рисунках приведена только часть характерных вариантов локализации что не

отражает частоту встречаемости различных вариантов. Лишь в отдельных клетках А. laidlawii и М. gallisepticum наблюдается локализация посередине клеток, а в подавляющем большинстве клеток - отсутствие выраженной локализации. В большинстве случаев распределен по клетке неравномерно, в виде кластеров. Локализация белка в септальной области может говорить о вовлечении белков микоплазм в процесс цитокинеза, хотя для проверки этой гипотезы требуется дальнейшее изучение.

Рисунок 30. Изображения структур, формируемых белком в клетках А. laidlawii, полученные методом локализационной микроскопии в сочетании с иммунофлуоресценцией. Приведены изображения клеток с локализацией посередине клетки (сверху), а также с другими вариантами локализации белка

(внизу). ЛМ — изображение полученное методом

локализационной микроскопии; ПС — изображение в проходящем свете. Жёлтыми пунктирными линиями отмечены приблизительные границы клеток. Шкала соответствует 1 мкм

Рисунок 31. Изображения структур, формируемых белком в клетках М. gallisepticum, полученные методом локализационной микроскопии в сочетании с иммунофлуоресценцией. Приведены изображения клеток с локализацией посередине клетки (сверху), а также с другими вариантами локализации белка (внизу). ЛМ — изображение полученное методом

локализационной микроскопии; ПС — изображение в проходящем свете. Жёлтыми пунктирными линиями отмечены приблизительные границы клеток. Шкала соответствует 1 мкм

Acholeplasma laidlawii Mycoplasma gallisepticum

Рисунок 32. Изображения клеток A. laidlawii (слева) и M. gallisepticum (справа), полученные методом иммуно-электронной микроскопии с использованием антител к белкам FtsZ микоплазм (метка - коллоидное золото). Стрелками отмечены клетки с локализацией белка FtsZ в области перетяжки. Шкала - 500 нм

Анализ размеров кластеров белка FtsZ в клетках Mycoplasma gallisepticum и Acholeplasma laidlawii, а также сравнение с аналогичными размерами в клетках E. coli показывает, что размеры кластеров FtsZ микоплазм сопоставимы с размерами кластеров FtsZ E. coli (см. Рисунок 33). Это наблюдение может говорить о том, что в клетках микоплазм белки FtsZ действительно находятся в виде полимеров, что согласуется с полученными в данной работе оценками концентраций FtsZ в клетке и поддерживает формирование FtsZ цитоскелет-подобных структур. Несмотря на сопоставимость размеров, всё же имеются довольно значительные отличия размеров, например, средняя длина кластеров FtsZ M. gallisepticum оказалась существенно меньше. Поэтому требуется дальнейшее изучение биохимических свойств FtsZ микоплазм, которое, однако, выходит за рамки данной работы.

Рисунок 33. Сравнение размеров кластеров FtsZ, наблюдаемых в клетках бактерий E. coli, A. laidlawii и M. gallisepticum. EC - E. coli, AL - A. laidlawii, MG - M. gallisepticum

4.5. Белки, взаимодействующие с белками FtsZ в клетках М. gallisepticum и А.

1а1й1ат1

Для более надежной интерпретации структур, формируемых белками в клетках М. gaШsepticum и А. laidlawii и более глубокого понимания роли микоплазм в ходе данной работы были идентифицированы белки-партнеры в указанных видах микоплазм. Анализ белок-белковых взаимодействий (использовались ко-иммунопреципитация через антитела к микоплазм и со-осаждение за рекомбинантный белок со стреп-тагом) позволил показать, что белок FtsZ А. laidlawii взаимодействует с шаперонами (Hsp20, DnaK), факторами элонгации трансляции (EFTu, EFG), транскрипционным регулятором семейства XRE, участниками метаболических путей (ферменты С-ацетилтрансфераза, фитоен десатураза) (Таблица 1 и

Таблица 2). М. gaШsepticum взаимодействует с фактором элонгации EFTu, липопротеином А, АТФ-синтазой, белком-транспортером OppA, а также РНК-полимеразой (

Таблица 3). Интересно отметить, что среди идентифицированных белков нет известных гомологов белков деления, присутствующих в А. laidlawii и М. gaШsepticum и взаимодействующих с белками FtsZ в других бактериях (например,

FtsK, FtsA, SepF). Данное наблюдение не подтверждает вовлечение FtsZ в процесс деления, хотя и не опровергает его. В то же время, некоторые взаимодействия, возможно, проливают свет на вовлеченность FtsZ в формирование каркаса микоплазменной клетки. Например, белок EFTu - фактор элонгации трансляции -по литературным данным способен взаимодействовать с другими белками бактериального цитоскелета, включая Mreb [135] и FtsZ [136], а также формировать фибриллярные структуры in vitro [137]. Интересно, что в базе данных STRING на основе гомологии предсказано взаимодействие EFTu с белками FtsZ обеих микоплазм [138, 139]. Выявленное взаимодействие может свидетельствовать о совместном формировании EFTu и FtsZ микоплазм структур цитоскелета в клетках микоплазм. Для более глубокого понимания роли указанных белков требуется изучение структур, формируемых данными белками in vitro и in vivo.

DnaK также способен формировать цитоскелет-подобные структуры. Принадлежность DnaK к белкам цитоскелета подтверждается исследованием, которое позволило выявить этот белок среди других цитоскелет-подобных белков (неопубликованные данные нашей научной группы). Взаимодействие FtsZ с белком DnaK, возможно, также отражает вовлечение FtsZ в многокомпонентный комплекс белков цитоскелета микоплазменной клетки. Связь белка FtsZ микоплазм с другими предполагаемыми белками цитоскелета (например, малым белком теплового шока Hsp20 или IbpA вида A. laidlawii), возможно, отражает сложный характер взаимодействий между различными белками цитоскелета микоплазм, а также многообразие функций этих белков.

Таблица 1. Белки A. laidlawii, взаимодействующие с белком FtsZ A. laidlawii по данным со-осаждения за стреп-таг. MW — молекулярная масса_

Название MW, Да Идентификатор

Bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase 95048 WP_012242134.1

Molecular chaperone DnaK 65643 WP_012242499.1

Dihydrolipoyllysine acetyltransferase 57225 WP_012243236.1

Таблица 2. Белки A. laidlawii, взаимодействующие с белком FtsZ A. laidlawii по данным ко-

иммунопреципитации. MW — молекулярная масса

Название MW, Да Идентификатор

Hsp20/alpha crystallin family protein, IbpA 16054 WP_012242373.1

Formate C-acetyltransferase 84730 WP_012242002.1

Elongation factor Tu 42860 WP_012242145.1

Elongation factor G 76350 WP_012242144.1

XRE family transcriptional regulator 23390 WP_012242530.1

Molecular chaperone DnaK 65690 WP_012242499.1

Endopeptidase La 86710 WP_012242485.1

Phytoene desaturase 56910 WP_012243338.1

ABC transporter ATP-binding protein 25210 WP_012243340.1

Таблица 3. Белки M. gallisepticum, взаимодействующие с белком FtsZ M. gallisepticum по

данным ко-иммунопреципитации. MW — молекулярная масса

Название MW, Да Идентификатор

Lipoprotein A 81912 WP_011883657.1

Elongation factor Tu 43130 WP_014885939.1

ATP synthase B/B' CF(0) 52090 WP_023893658.1

DNA-directed RNA polymerase subunit beta' 145080 WP_011884029.1

ABC-type oligopeptide transport solute binding protein OppA 118770 WP_011884746.1

4.6. Структуры, формируемые белками FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii в

клетках E. coli

С целью получения дополнительных данных о свойствах белков FtsZ видов A. laidlawii & M. gallisepticum и более точной интерпретации их роли в клетках микоплазм были исследованы структуры, формируемые этими белками в клетках E. coli. Кроме того, были идентифицированы белки E. coli, с которыми

взаимодействуют белки указанных видов микоплазм (см. ниже) в клетках кишечной палочки. Было показано, что белки FtsZ из этих двух видов микоплазм взаимодействуют с аппаратом деления E. coli, формируя упорядоченные структуры (см. Рисунок 34 и Рисунок 35).

s*t >

ЕС EtsZ SMIM , А я - -Ч. * Vi f

» jS * t. i

1? •

Ч» (У

а .**» * шг (• (Л «i* V Ц * ч - ft7*

- induction

+ induction

: с

+ induction

Рисунок 34. Экспрессия FtsZ M. gallisepticum. Верхний ряд - изображения структур, формируемых белком FtsZ E. coli. Нижний ряд - изображения структур, формируемых белком FtsZ M. gallisepticum в клетках E. coli. Изображения a, c и f получены методом локализационной микроскопии, изображения b, d, e - методом традиционной ФМ. Шкала - 2 мкм

Рисунок 35. Экспрессия FtsZ A. laidlawii. Верхний ряд - изображения структур, формируемых белком FtsZ E. coli. Нижний ряд - изображения структур, формируемых белком A. laidlawii в клетках E. coli. Изображения a, c и f получены методом локализационной микроскопии, изображения b, d, e - методом традиционной ФМ. Шкала - 2 мкм

Оказалось, что белок FtsZ A. laidlawii в клетках E. coli на ранней стадии экспрессии (т.е. при небольшой концентрации) ко-локализуется с белком FtsZ E. coli и не нарушает нормальное деление (см. Рисунок 36). Впоследствии он блокирует деление и локализуется на полюсах клетки вблизи ее оболочки, а потом белок FtsZ A. laidlawii накапливается в увеличивающихся по неустановленной пока причине промежутках между нуклеоидами, демонстрируя при этом выраженную мембранную локализацию.

30 мин

60 мин

120 мин

Рисунок 36. Изображения структур, формируемых белком А. ШШамп, полученные

методом локализационной микроскопии, на ранней (30 мин), средней (60 мин) и поздней (120 мин) стадии экспрессии белка

Полярная локализация и локализация между нуклеоидами белка FtsZ A. laidlawii в принципе могла бы быть объяснена взаимодействием с системами позиционирования Z-кольца: с Min-системой в случае полярной локализации и нуклеоидной окклюзией в случае локализации между нуклеоидами. Однако нам не удалось идентифицировать ни один из белков систем позиционирования Z-кольца, с которым бы взаимодействовал белок FtsZ A. laidlawii в клетках E. coli (см. ниже). Чтобы дополнительно проверить, взаимодействует ли данный белок с белками нуклеоидной окклюзии и Min-системы E. coli, была осуществлена визуализация структур, формируемых FtsZ A. laidlawii как в штамме E. coli, близком к дикому типу (Rosetta), так и в штаммах с нарушенными системами нуклеоидной окклюзии или Min-системы. Различий в паттернах локализации FtsZ A. laidlawii не выявлено (см. Рисунок 37), поэтому указанная локализация белка FtsZ A. laidlawii не может быть объяснена взаимодействием с данными системами.

Rosetta

60 минут__120 минут

% / \

v ,, * * t * Л" , ( -

1 _

v \ / \ 1 ' f: —iXÜT >

AminC AslmA

60 минут 120 минут 60 минут 120 минут

Рисунок 37. Структуры, формируемые белком FtsZ A. laidlawii в клетках E. coli штаммов Rosetta, JW1165-1 (AminC, нарушенная Min-система) и JW5641-1 (AslmA, нарушенная нуклеоидная окклюзия) на ранней (слева) и поздней (справа) стадиях экспрессии. Зеленый цвет - канал FtsZ (метод локализационной микроскопии), фиолетовый - канал ДНК (дифракционно-ограниченная флуоресценция). Шкала - 1 мкм

В случае экспрессии белка FtsZ M. gallisepticum в клетках кишечной палочки блокирования деления не происходит, но также имеет место ко-локализация с белком FtsZ E. coli. По результатам данных наблюдений можно предположить, что в клетках E. coli белок FtsZ A. laidlawii способен полимеризоваться, что похоже на поведение белка FtsZ E. coli, что в свою очередь косвенным образом

может говорить о схожей роли этого белка в клетках A. laidlawii. Однозначный вывод о способности белка FtsZ M. gallisepticum полимеризоваться по результатам этих наблюдений сделать нельзя, хотя способность его взаимодействовать с белком FtsZ E. coli косвенно подтверждает эту гипотезу.

4.7. Белки, взаимодействующие с белками FtsZ микоплазм в клетках E. coli

Идентификация белков-партнёров FtsZ микоплазм в клетках модельного микроорганизма E. coli, процесс деления которого в значительной степени изучен, а состав белков так называемой дивисомы, опосредующей цитокинез, хорошо известен, позволила, с одной стороны, прояснить влияние белков FtsZ данных видов микоплазм на процесс деления E. coli, а с другой стороны - предсказать (базируясь на высоком уровне гомологии), с какими белками способны взаимодействовать белки FtsZ в клетках самих микоплазм. Для этого были использованы две основных методики - ко-иммунопреципитация белков из экстракта E. coli с антителами к белкам FtsZ микоплазм и со-осаждение за стреп-таг белков из экстракта E. coli при экспрессии рекомбинантных белков FtsZ микоплазм в клетках штамма-продуцента. Результаты представлены в таблицах 4 - 7.

Таблица 4. Белки E. coli, взаимодействующие с белком FtsZ A. laidlawii по данным ко-иммунопреципитации_

Название MW, Да Идентификатор

Chromosome partition protein MukB 170230 WP_000572698.1

Ribonuclease E 118197 WP_000827360.1

Cell division protein FtsZ 40324 WP_000462776.1

Elongation factor Tu, partial 43284 WP_000031783.1

Таблица 5. Белки E. coli, взаимодействующие с белком FtsZ M. gallisepticum по данным ко-иммунопреципитации

Название MW, Да Идентификатор

ATP-dependent chaperone ClpB 95585 WP_001235102.1

DNA gyrase subunit B 89950 WP_000072067.1

Molecular chaperone DnaK 69115 WP_000516135.1

Cell division protein FtsZ 40324 WP_000462776.1

Elongation factor Tu, partial 43284 WP_000031783.1

Таблица 6. Белки E. coli, взаимодействующие с белком FtsZ A. laidlawii по данным со-осаждения за стреп-таг_

Название MW, Да Идентификатор

Molecular chaperone DnaK 69115 WP_000516135.1

Cell division protein FtsZ 40324 WP_000462776.1

Preprotein translocase subunit SecA 102023 WP_001637416.1

Outer membrane porin OmpF 39333 WP_000977920.1

Таблица 7. Белки E. coli, взаимодействующие с белком FtsZ M. gallisepticum по данным со-осаждения за стреп-таг_

Название MW, Да Идентификатор

Molecular chaperone DnaK 69115 WP_000516135.1

Методами ко-иммунопреципитации и со-осаждения за стреп-таг было показано, что белки FtsZ микоплазм A. laidlawii и M. gallisepticum взаимодействуют с белком FtsZ E. coli, что, по-видимому, объясняет ингибирование деления E. coli при экспрессии этих белков. Метод ко-иммунопреципитации также показал, что FtsZ A. laidlawii взаимодействует с белком сегрегации ДНК MukB в E. coli. Предыдущие наблюдения предоставили данные о том, что AL FtsZ каким-то образом взаимодействует с системой сегрегации нуклеоидов E. coli, поскольку его экспрессия приводила к появлению

необычно больших промежутков между нуклеоидами в клетках-филаментах. MukB играет ключевую роль в сегрегации нуклеоидов в E. coli, поэтому такое взаимодействие представляется правдоподобным объяснением появления необычно больших промежутков между нуклеоидами. Также это взаимодействие может отражать существование аналогичного белка-партнера в A. laidlawii, хотя таковой еще не был идентифицирован. Мы нашли только один гомолог белка MukB среди известных видов Mollicutes - белок MukB в Candidatus Phytoplasma oryzae (GenBank KXT29462.1), который показывает самую высокую гомологию с двумя гипотетическими белками в A. laidlawii - WP_012242387.1 (99% -ное покрытие и 41% идентичность в соответствии с выравниванием BLAST) и WP_094586857.1 (покрытие 83% и идентичность 37%). В будущем планируется проверить, взаимодействует ли FtsZ A. laidlawii с этими предполагаемыми гомологами MukB.

Белки FtsZ микоплазм взаимодействуют также с несколькими шаперонами E. coli. Один из этих шаперонов - DnaK - взаимодействует как с FtsZ A. laidlawii, так и с FtsZ M. gallisepticum. Помимо DnaK, FtsZ M. gallisepticum взаимодействует с ClpB и GroEL. Возможно, FtsZ M. gallisepticum требуется помощь шаперонов для правильного сворачивания при продукции в клетке E. coli. Более того, это наблюдение поддерживает существование предполагаемых телец включения, обнаруженных нами ранее. Образование телец включения является распространенной проблемой при экспрессии рекомбинантных белков, однако удивительно, что FtsZ M. gallisepticum, который гомологичен цитозольному белку FtsZ E. coli, формирует тельца включения. Возможно, этот белок проявляет сходное поведение и в клетках M. gallisepticum с точки зрения зависимости от дополнительных шаперонов. Это наблюдение требует дальнейшего изучения.

Кроме того, FtsZ M. gallisepticum взаимодействует с ДНК-гиразой E. coli. Взаимодействие FtsZ с субъединицей B ДНК-гиразы в M. gallisepticum было предсказано в базе данных STRING, и наше наблюдение косвенно подтверждает это взаимодействие. Основываясь на гомологии ДНК-гираз M. gallisepticum и E. coli, можно заключить, что FtsZ M. gallisepticum может участвовать в

предсказанном взаимодействии с ДНК-гиразой M. gallisepticum, для надежного доказательства планируется проверить это взаимодействие другими методами, например, двухгибридной системой.

Выявлено взаимодействие FtsZ A. laidlawii с белками OmpF (белок наружной мембраны) и SecA (белок-транслоказа полипептидных цепей). На данном этапе сложно объяснить эти взаимодействия, в особенности взаимодействие с OmpF, так как FtsZ является цитоплазматическим белком. Взаимодействие SecA с белком FtsZ E. coli по литературным данным показано экспериментально, однако роль и механизмы этого взаимодействия неизвестны. SecA также присутствует в A. laidlawii, поэтому в будущем планируется проверить взаимодействие FtsZ и SecA вида A. laidlawii.

Таким образом, результаты, полученные в ходе визуализации структур, формируемых рекомбинантными белками FtsZ видов M. gallisepticum и A. laidlawii в клетках E. coli, а также анализ белок-белковых взаимодействий с участием этих белков предоставили дополнительную информацию о свойствах данных белков, что нашло отражение в двух публикациях [140, 141].

4.8. Локализация белка FtsZ в живых клетках M. gallisepticum

В ходе выполнения работы был создан штамм, который позволил осуществить субдифракционную визуализацию белка FtsZ в живых клетках M. gallisepticum. Использование эндогенно-экспрессируемой флуоресцентной метки (белок mMaple 2) позволило визуализировать структуры, формируемые белком FtsZ, в живых клетках M. gallisepticum (Рисунок 38), в том числе с субдифракционным разрешением (Рисунок 39). Следует отметить, что изображения структур, полученные данным методом, существенно отличаются от полученных методом иммунофлуоресцентного мечения. Это можно объяснить артефактами, вносимыми одним и другим методами. Например, плотные структуры на указанных рисунках можно интерпретировать как тельца включения вследствие экспрессии белка слияния. В то же время, преимущественная

локализация этих плотных структур на одном из концов клетки выглядит интригующе и позволяет предположить их взаимодействие с терминальной органеллой, хотя известные белки терминальной органеллы не были выявлены методами ко-иммунопреципитации и со-осаждения.

Рисунок 38. Изображения структур, формируемых белком FtsZ в живых клетках M. gaШsepticum, полученные с использованием флуоресцентного белка тМар1е 2 (зеленый цвет). Для представления о морфологии клетки дифракционно-ограниченное флуоресцентное изображение FstZ объединено с изображением в проходящем свете (оттенки серого). Шкала - 1 мкм

Рисунок 39. Изображения структур, формируемых белком FtsZ в живых клетках М. gallisepticum, полученные с использованием флуоресцентного белка тМар1е 2. Субдифракционное изображение FtsZ (зеленый цвет) объединено с дифракционно-ограниченным изображением ДНК (фиолетовый цвет). Шкала - 1 мкм

5. Заключение

В ходе выполнения данной работы получены новые данные о роли белка FtsZ таких видов, как E. coli, A. laidlawii и M. gallisepticum. Наибольшее внимание было уделено исследованию структур, формируемых данным белком, так как с ними напрямую связаны известные функции FtsZ. В значительной степени достижение результатов работы стало возможным благодаря разработке методик визуализации клеточных структур при помощи микроскопии сверхвысокого разрешения. Для более глубокого понимания роли белка FtsZ видов A. laidlawii и M. gallisepticum также был осуществлен поиск белков-партнеров данного белка с использованием ко-иммунопреципитации.

Было показано, что Z-кольцо, формируемое белком FtsZ E. coli, представляет собой неоднородную структуру, состоящую из кластеров размером порядка 100 нм каждый. Впервые для бактерии E. coli было показано, что Z-кольцо утолщается в ходе сокращения его диаметра. Несмотря на то, что в микоплазмах не удалось наблюдать структуру, аналогичную Z-кольцу, было показано, что в некоторых клетках A. laidlawii и M. gallisepticum белок FtsZ может локализоваться в области перетяжки, хотя в других клетках имеют место другие варианты распределения FtsZ по клетке. Благодаря высокому разрешению метода локализационной микроскопии, удалось охарактеризовать размеры кластеров в составе структур, формируемых белком FtsZ всех трёх видов.

Помимо фундаментального значения, результаты работы весьма полезны с методологической точки зрения. В частности, для визуализации клеток микоплазм был впервые использован метод локализационной микроскопии, который может быть полезен для изучения других структур, например, так называемой терминальной органеллы некоторых видов микоплазм, что открывает большие возможности для будущих исследований этой структуры, играющей значительную роль в патогенезе подвижных микоплазм, в том числе, M. gallisepticum. Кроме того, большой интерес представляет изучение структур, формируемых цитоскелет-подобными белками (например, отмеченными выше

белками DnaK, Hsp20, EFTu и GapD), для этого метод локализационной микроскопии также представляется востребованным.

6. Выводы

1. Z-кольцо Escherichia coli представляет собой неоднородную структуру, наблюдаемую в виде кластеров белка FtsZ, средняя длина и толщина которых составляют 108±41 и 63±12 нм соответственно. Z-кольцо E. coli утолщается в ходе его сокращения в процессе цитокинеза, при этом средняя длина кластера FtsZ увеличивается.

2. При нарушении деления в результате экспрессии белка-ингибитора SulA E. coli не происходит значительного уменьшения размеров кластеров FtsZ.

3. В клетках A. laidlawii и M. gallisepticum белок FtsZ не формирует классическое Z-кольцо. В некоторых клетках FtsZ локализуется посередине клетки, тогда как в других клетках наблюдается относительно равномерное распределение FtsZ по клетке.

4. Кластеры FtsZ, наблюдаемые в клетках Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma gallisepticum, имеют размеры, сопоставимые с размерами кластеров FtsZ E. coli.

5. Концентрация FtsZ в клетках A. laidlawii и M. gallisepticum сравнима с таковой в клетках E. coli.

6. Белки FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii взаимодействуют с белками, участвующими в клеточном метаболизме, фолдинге и деградации белков, но взаимодействие FtsZ микоплазм с гомологами известных белков деления выявить не удалось.

7. Список сокращений и условных обозначений

CLEM (англ. Correlated Light and Electron Microscopy) — коррелированная световая и электронная микроскопия

CRAMP (англ. çathelin-related_antimicrobial peptide) — подобный кателину антимикробный пептид

dcw (англ. division and cell wall) — деление и клеточная стенка

FtsZ (англ. filamentous temperature sensitive mutant Z) — белок деления, филаментный температурочувствительный мутант Z

FWHM (англ. Full Width at Half of Maximum) — полная ширина на половине высоты

GFP (англ. Green Fluorescent Protein) — зелёный флуоресцентный белок

MEF (англ. Multi-Emitter Fitting) — анализ множества флуорофоров, изображения которых накладываются друг на друга

MRSA (англ. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) — устойчивый к метициллину золотистый стафилококк

PALM (англ. photoactivated localization microscopy) — фотоактивируемая локализационная микроскопия

PBS (англ. phosphate buffered saline) — фосфатно-солевой буфер

SIM (англ. Structured illumination microscopy) — микроскопия структурированного освещения

SMLM (англ. Single-Molecule Localization Microscopy) — локализационная микроскопия

SOS-ответ - стрессовый механизм, активирует механизмы репарации ДНК и повышает частоту мутагенеза

SPT (англ. Single Particle Tracking) — отслеживание одиночных частиц

SRRF (англ. Super-Resolution Radial Fluctuations) — микроскопия радиальных флуктуаций

STED (англ. STimulated Emission Depletion) — микроскопия на основе

подавления спонтанного испускания

STORM (англ. stochastic optical reconstruction microscopy) — микроскопия на основе стохастической оптической реконструкции

TIRF (англ. total internal reflection fluorescence) — метод микроскопии полного внутреннего отражения

VREF (англ. vancomycin-resistant Enterococcus faecium) — устойчивый к ванкомицину энтерококк

ГДФ — гуанозиндифосфат

ГТЭ — глюкоза, трис, ЭДТА

ГТФ — гуанозинтрифосфат

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛМ - локализационная микроскопия

НО — нуклеоидная окклюзия

п.о. — пары оснований

РНК — рибонуклеиновая кислота

ФМ — флуоресцентная микроскопия

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

8. Список литературы

1. Научно-исследовательский комплекс «Нанобиотехнологии» (НИК «НаноБио»). 2018 [cited 2018 30.11.2018]; Available from: http: //www.nanobio. spbstu.ru/.

2. D. Panda, D. Bhattacharya, Q.H. Gao, P.M. Oza, H.Y. Lin, B. Hawkins, D.E. Hibbs, P.W. Groundwater. Identification of agents targeting FtsZ assembly. // Future Med Chem, 2016. 8(10): p. 1111-32.

3. Y. Hirota, A. Ryter, F. Jacob. Thermosensitive mutants of E. coli affected in the processes of DNA synthesis and cellular division. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1968. 33: p. 677-93.

4. J. Lutkenhaus. Regulation of cell division in E. coli. // Trends Genet, 1990. 6(1): p. 22-5.

5. J. Lutkenhaus, S. Pichoff, S. Du. Bacterial cytokinesis: From Z ring to divisome. // Cytoskeleton (Hoboken), 2012. 69(10): p. 778-90.

6. D.J. Scheffers, M.G. Pinho. Bacterial cell wall synthesis: new insights from localization studies. // Microbiol Mol Biol Rev, 2005. 69(4): p. 585-607.

7. J.M. Eraso, L.M. Markillie, H.D. Mitchell, R.C. Taylor, G. Orr, W. Margolin. The highly conserved MraZ protein is a transcriptional regulator in Escherichia coli. // J Bacteriol, 2014. 196(11): p. 2053-66.

8. J.F. Lutkenhaus, H. Wolf-Watz, W.D. Donachie. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). // J Bacteriol, 1980. 142(2): p. 615-20.

9. K.J. Begg, W.D. Donachie. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants. // J Bacteriol, 1985. 163(2): p. 61522.

10. D.P. Haeusser, W. Margolin. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. // Nat Rev Microbiol, 2016. 14(5): p. 305-19.

11. S. Pichoff, J. Lutkenhaus. Unique and overlapping roles for ZipA and FtsA in septal ring assembly in Escherichia coli. // EMBO J, 2002. 21(4): p. 685-93.

12. B. Beall, J. Lutkenhaus. FtsZ in Bacillus subtilis is required for vegetative septation and for asymmetric septation during sporulation. // Genes Dev, 1991. 5(3): p. 447-55.

13. K. Dai, J. Lutkenhaus. ftsZ is an essential cell division gene in Escherichia coli. // J Bacteriol, 1991. 173(11): p. 3500-6.

14. H.P. Erickson, D.E. Anderson, M. Osawa. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. // Microbiol Mol Biol Rev, 2010. 74(4): p. 504-28.

15. A.D. TerBush, Y. Yoshida, K.W. Osteryoung. FtsZ in chloroplast division: structure, function and evolution. // Curr Opin Cell Biol, 2013. 25(4): p. 461-70.

16. R. Bernander, T.J. Ettema. FtsZ-less cell division in archaea and bacteria. // Current Opinion in Microbiology, 2010. 13(6): p. 747-52.

17. S.Y. Miyagishima, M. Nakamura, A. Uzuka, A. Era. FtsZ-less prokaryotic cell division as well as FtsZ- and dynamin-less chloroplast and non-photosynthetic plastid division. // Front Plant Sci, 2014. 5: p. 459.

18. E.F. Bi, J. Lutkenhaus. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. // Nature, 1991. 354(6349): p. 161-4.

19. S.G. Addinall, E. Bi, J. Lutkenhaus. FtsZ ring formation in fts mutants. // J Bacteriol, 1996. 178(13): p. 3877-84.

20. X. Ma, D.W. Ehrhardt, W. Margolin. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(23): p. 12998-3003.

21. E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, H.F. Hess. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. // Science, 2006. 313(5793): p. 1642-5.

22. J. Buss, C. Coltharp, T. Huang, C. Pohlmeyer, S.C. Wang, C. Hatem, J. Xiao. In vivo organization of the FtsZ-ring by ZapA and ZapB revealed by quantitative super-resolution microscopy. // Mol Microbiol, 2013. 89(6): p. 1099-120.

23. G. Fu, T. Huang, J. Buss, C. Coltharp, Z. Hensel, J. Xiao. In vivo structure of the E. coli FtsZ-ring revealed by photoactivated localization microscopy (PALM). // PLoS One, 2010. 5(9): p. e12682.

24. S.J. Holden, T. Pengo, K.L. Meibom, C. Fernandez Fernandez, J. Collier, S. Manley. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentus in vivo Z-ring organization. // Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(12): p. 4566-71.

25. M. Jacq, V. Adam, D. Bourgeois, C. Moriscot, A.M. Di Guilmi, T. Vernet, C. Morlot. Remodeling of the Z-Ring Nanostructure during the Streptococcus pneumoniae Cell Cycle Revealed by Photoactivated Localization Microscopy. // MBio, 2015. 6(4).

26. Z. Lyu, C. Coltharp, X. Yang, J. Xiao. Influence of FtsZ GTPase activity and concentration on nanoscale Z-ring structure in vivo revealed by three-dimensional Superresolution imaging. // Biopolymers, 2016. 105(10): p. 725-34.

27. L. Turnbull, M.P. Strauss, A.T.F. Liew, L.G. Monahan, C.B. Whitchurch, E.J. Harry. Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM). // J Vis Exp, 2014(91): p. 51469.

28. A.D. Vedyaykin, I.E. Vishnyakov, V.S. Polinovskaya, M.A. Khodorkovskii, A.V. Sabantsev. New insights into FtsZ rearrangements during the cell division of Escherichia coli from single-molecule localization microscopy of fixed cells. // Microbiologyopen, 2016. 5(3): p. 378-386.

29. P. Szwedziak, Q. Wang, T.A. Bharat, M. Tsim, J. Lowe. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. // Elife, 2014. 3: p. e04601.

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

M. Osawa, H.P. Erickson. Liposome division by a simple bacterial division machinery. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013. 110(27): p. 11000-11004.

I. Horger, E. Velasco, J. Mingorance, G. Rivas, P. Tarazona, M. Velez. Langevin computer simulations of bacterial protein filaments and the force-generating mechanism during cell division. // Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys, 2008. 77(1 Pt 1): p. 011902.

H.P. Erickson, M. Osawa. FtsZ Constriction Force - Curved Protofilaments Bending Membranes. // Subcell Biochem, 2017. 84: p. 139-160.

C. Coltharp, J. Xiao. Beyond force generation: Why is a dynamic ring of FtsZ polymers essential for bacterial cytokinesis? // Bioessays, 2017. 39(1): p. 1-11.

B. Soderstrom, K. Skoog, H. Blom, D.S. Weiss, G. von Heijne, D.O. Daley. Disassembly of the divisome in Escherichia coli: evidence that FtsZ dissociates before compartmentalization. // Mol Microbiol, 2014. 92(1): p. 1-9. J. Errington. Cell wall-deficient, L-form bacteria in the 21st century: a personal perspective. // Biochem Soc Trans, 2017. 45(2): p. 287-295. W. Steiner, G. Liu, W.D. Donachie, P. Kuempel. The cytoplasmic domain of FtsK protein is required for resolution of chromosome dimers. // Mol Microbiol, 1999. 31(2): p. 579-83.

J. Mannik, M.W. Bailey, J.C. O'Neill, J. Mannik. Kinetics of large-scale chromosomal movement during asymmetric cell division in Escherichia coli. // PLoS Genet, 2017. 13(2): p. e1006638.

J. Errington, L.J. Wu, Cell Cycle Machinery in Bacillus subtilis, in Prokaryotic Cytoskeletons: Filamentous Protein Polymers Active in the Cytoplasm of Bacterial and Archaeal Cells, J. Löwe and L.A. Amos, Editors. 2017, Springer International Publishing: Cham. p. 67-101.

R. Mercier, Y. Kawai, J. Errington. General principles for the formation and proliferation of a wall-free (L-form) state in bacteria. // Elife, 2014. 3. N. Ouzounov, J.P. Nguyen, B.P. Bratton, D. Jacobowitz, Z. Gitai, J.W. Shaevitz. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. // Biophys J, 2016. 111(5): p. 1035-43.

D. Jakimowicz, G.P. van Wezel. Cell division and DNA segregation in Streptomyces: how to build a septum in the middle of nowhere? // Molecular Microbiology, 2012. 85(3): p. 393-404.

N. Leisch, N. Pende, P.M. Weber, H.R. Gruber-Vodicka, J. Verheul, N.O.E. Vischer, S.S. Abby, B. Geier, T. den Blaauwen, S. Bulgheresi. Asynchronous division by non-ring FtsZ in the gammaproteobacterial symbiont of Robbea hypermnestra. // Nat Microbiol, 2016. 2: p. 16182.

N. Jacquier, P.H. Viollier, G. Greub. The role of peptidoglycan in chlamydial cell division: towards resolving the chlamydial anomaly. // Fems Microbiology Reviews, 2015. 39(2): p. 262-275.

M. Pilhofer, K. Aistleitner, J. Biboy, J. Gray, E. Kuru, E. Hall, Y.V. Brun, M.S. VanNieuwenhze, W. Vollmer, M. Horn, G.J. Jensen. Discovery of chlamydial

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

peptidoglycan reveals bacteria with murein sacculi but without FtsZ. // Nat Commun, 2013. 4: p. 2856.

P. de Boer, R. Crossley, L. Rothfield. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. // Nature, 1992. 359(6392): p. 254-6.

D. RayChaudhuri, J.T. Park. Escherichia coli cell-division gene ftsZ encodes a novel GTP-binding protein. // Nature, 1992. 359(6392): p. 251-4. A. Mukherjee, J. Lutkenhaus. Guanine nucleotide-dependent assembly of FtsZ into filaments. // J Bacteriol, 1994. 176(9): p. 2754-8.

M. Osawa, D.E. Anderson, H.P. Erickson. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. // Science, 2008. 320(5877): p. 792-794. H.P. Erickson, D.E. Anderson, M. Osawa. FtsZ in Bacterial Cytokinesis: Cytoskeleton and Force Generator All in One. // Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2010. 74(4): p. 504-528.

J. Lowe. Crystal structure determination of FtsZ from Methanococcus jannaschii. // J Struct Biol, 1998. 124(2-3): p. 235-43.

K.A. Gardner, D.A. Moore, H.P. Erickson. The C-terminal linker of Escherichia coli FtsZ functions as an intrinsically disordered peptide. // Mol Microbiol, 2013. 89(2): p. 264-75.

H.I. Adler, W.D. Fisher, A. Cohen, A.A. Hardigree. MINIATURE escherichia coli CELLS DEFICIENT IN DNA. // Proc Natl Acad Sci U S A, 1967. 57(2): p. 321-6.

Z. Hu, J. Lutkenhaus. Topological regulation of cell division in Escherichia coli involves rapid pole to pole oscillation of the division inhibitor MinC under the control of MinD and MinE. // Mol Microbiol, 1999. 34(1): p. 82-90. J. Lutkenhaus, S. Du. E. coli Cell Cycle Machinery. // Subcell Biochem, 2017. 84: p. 27-65.

A.L. Marston, H.B. Thomaides, D.H. Edwards, M.E. Sharpe, J. Errington. Polar localization of the MinD protein of Bacillus subtilis and its role in selection of the mid-cell division site. // Genes Dev, 1998. 12(21): p. 3419-30. M. Thanbichler, L. Shapiro. MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. // Cell, 2006. 126(1): p. 147-162. V.W. Rowlett, W. Margolin. The bacterial Min system. // Curr Biol, 2013. 23(13): p. R553-6.

L.J. Wu, J. Errington. Coordination of cell division and chromosome segregation by a nucleoid occlusion protein in Bacillus subtilis. // Cell, 2004. 117(7): p. 91525.

T.G. Bernhardt, P.A. de Boer. SlmA, a nucleoid-associated, FtsZ binding protein required for blocking septal ring assembly over Chromosomes in E. coli. // Mol Cell, 2005. 18(5): p. 555-64.

J. Mannik, F. Wu, F.J. Hol, P. Bisicchia, D.J. Sherratt, J.E. Keymer, C. Dekker. Robustness and accuracy of cell division in Escherichia coli in diverse cell shapes. // Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(18): p. 6957-62. J. Mannik, M.W. Bailey. Spatial coordination between chromosomes and cell division proteins in Escherichia coli. // Frontiers in Microbiology, 2015. 6: p. 306.

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

V.W. Rowlett, W. Margolin. The Min system and other nucleoid-independent regulators of Z ring positioning. // Frontiers in Microbiology, 2015. 6: p. 478. J.F. Lutkenhaus. Coupling of DNA replication and cell division: sulB is an allele of ftsZ. // J Bacteriol, 1983. 154(3): p. 1339-46.

C. Janion. Inducible SOS response system of DNA repair and mutagenesis in Escherichia coli. // Int J Biol Sci, 2008. 4(6): p. 338-44.

J.J. Weigle. Induction of Mutations in a Bacterial Virus. // Proc Natl Acad Sci U S A, 1953. 39(7): p. 628-36.

I.B. Holland, C. Jones. The role of the FtsZ protein (SfiB) in UV-induced division inhibition and in the normal Escherichia coli cell division cycle. // Ann Inst Pasteur Microbiol, 1985. 136A(1): p. 165-71.

T.T. Qin, H.Q. Kang, P. Ma, P.P. Li, L.Y. Huang, B. Gu. SOS response and its regulation on the fluoroquinolone resistance. // Ann Transl Med, 2015. 3(22): p. 358.

K.A. Hurley, T.M. Santos, G.M. Nepomuceno, V. Huynh, J.T. Shaw, D.B. Weibel. Targeting the Bacterial Division Protein FtsZ. // J Med Chem, 2016. 59(15): p. 6975-98.

N.R. Stokes, N. Baker, J.M. Bennett, J. Berry, I. Collins, L.G. Czaplewski, A. Logan, R. Macdonald, L. Macleod, H. Peasley, J.P. Mitchell, N. Nayal, A. Yadav, A. Srivastava, D.J. Haydon. An improved small-molecule inhibitor of FtsZ with superior in vitro potency, drug-like properties, and in vivo efficacy. // Antimicrob Agents Chemother, 2013. 57(1): p. 317-25.

N. Sun, Y.J. Lu, F.Y. Chan, R.L. Du, Y.Y. Zheng, K. Zhang, L.Y. So, R. Abagyan, C. Zhuo, Y.C. Leung, K.Y. Wong. A Thiazole Orange Derivative Targeting the Bacterial Protein FtsZ Shows Potent Antibacterial Activity. // Frontiers in Microbiology, 2017. 8: p. 855.

J.E. Rubin, K.R. Ball, M. Chirino-Trejo. Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus and Staphylococcus pseudintermedius isolated from various animals. // Can Vet J, 2011. 52(2): p. 153-7.

B. G.F., C. C., Mollicutes: Molecular Biology and Pathogenesis. 2014, Norfolk, UK: Horizon Scientific Press. 333

C.Н. Борхсениус, О.А. Чернова, В.М. Чернов, И.Е. Вишняков, Микоплазмы в биологии и медицине начала XXI века. 2016, СПб: Наука.

G.W. Liechti, E. Kuru, E. Hall, A. Kalinda, Y.V. Brun, M. VanNieuwenhze, A.T. Maurelli. A new metabolic cell-wall labelling method reveals peptidoglycan in Chlamydia trachomatis. // Nature, 2014. 506(7489): p. 507-10. M. Mizutani, I. Tulum, Y. Kinosita, T. Nishizaka, M. Miyata. Detailed Analyses of Stall Force Generation in Mycoplasma mobile Gliding. // Biophys J, 2018. 114(6): p. 1411-1419.

D.G. Gibson, J.I. Glass, C. Lartigue, V.N. Noskov, R.Y. Chuang, M.A. Algire, G.A. Benders, M.G. Montague, L. Ma, M.M. Moodie, C. Merryman, S. Vashee, R. Krishnakumar, N. Assad-Garcia, C. Andrews-Pfannkoch, E.A. Denisova, L. Young, Z.Q. Qi, T.H. Segall-Shapiro, C.H. Calvey, P.P. Parmar, C.A. Hutchison,

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

3rd, H.O. Smith, J.C. Venter. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. // Science, 2010. 329(5987): p. 52-6. C.A. Hutchison, R.-Y. Chuang, V.N. Noskov, N. Assad-Garcia, T.J. Deerinck, M.H. Ellisman, J. Gill, K. Kannan, B.J. Karas, L. Ma, J.F. Pelletier, Z.-Q. Qi, R.A. Richter, E.A. Strychalski, L. Sun, Y. Suzuki, B. Tsvetanova, K.S. Wise,

H.O. Smith, J.I. Glass, C. Merryman, D.G. Gibson, J.C. Venter. Design and synthesis of a minimal bacterial genome. // Science, 2016. 351(6280).

I.E. Vishnyakov, S.N. Borchsenius, Y.I. Basovskii, S.A. Levitskii, V.N. Lazarev, E.S. Snigirevskaya, Y.Y. Komissarchik. Localization of division protein FtsZ in Mycoplasma hominis. // Cell and Tissue Biology, 2009. 3(3): p. 254-262.

E. Ramond, C. Maclachlan, S. Clerc-Rosset, G.W. Knott, B. Lemaitre. Cell Division by Longitudinal Scission in the Insect Endosymbiont Spiroplasma poulsonii. // MBio, 2016. 7(4).

C.A. Hutchison, S.N. Peterson, S.R. Gill, R.T. Cline, O. White, C.M. Fraser, H.O. Smith, J.C. Venter. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. // Science, 1999. 286(5447): p. 2165-9.

M. Lluch-Senar, E. Querol, J. Pinol. Cell division in a minimal bacterium in the absence of ftsZ. // Molecular Microbiology, 2010. 78(2): p. 278-289. M.F. Balish. Mycoplasma pneumoniae, an underutilized model for bacterial cell biology. // J Bacteriol, 2014. 196(21): p. 3675-82.

P. de Boer, J.P. Hoogenboom, B.N.G. Giepmans. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! // Nat Methods, 2015. 12: p. 503. J. Bewersdorf, A. Egner, S.W. Hell, 4Pi Microscopy, in Handbook Of Biological Confocal Microscopy, J.B. Pawley, Editor. 2006, Springer US: Boston, MA. p. 561-570.

E. Betzig, A. Lewis, A. Harootunian, M. Isaacson, E. Kratschmer. Near Field Scanning Optical Microscopy (NSOM): Development and Biophysical Applications. // Biophys J, 1986. 49(1): p. 269-79.

S.M. Salapaka, M.V. Salapaka. Scanning probe microscopy. // Ieee Control Systems Magazine, 2008. 28(2): p. 65-83.

S.T. Hess, T.P. Girirajan, M.D. Mason. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. // Biophys J, 2006. 91(11): p. 4258-72.

I. Schoen, J. Ries, E. Klotzsch, H. Ewers, V. Vogel. Binding-activated localization microscopy of DNA structures. // Nano Lett, 2011. 11(9): p. 4008-11. M.J. Rust, M. Bates, X. Zhuang. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). // Nat Methods, 2006. 3(10): p. 793-5.

M. Heilemann, S. van de Linde, M. Schuttpelz, R. Kasper, B. Seefeldt, A. Mukherjee, P. Tinnefeld, M. Sauer. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. // Angew Chem Int Ed Engl, 2008. 47(33): p. 6172-6.

91. T. Dertinger, R. Colyer, R. Vogel, M. Heilemann, M. Sauer, J. Enderlein, S. Weiss. Superresolution optical fluctuation imaging (SOFI). // Adv Exp Med Biol, 2012. 733: p. 17-21.

92. J. Schnitzbauer, M.T. Strauss, T. Schlichthaerle, F. Schueder, R. Jungmann. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. // Nat Protoc, 2017. 12(6): p. 1198-1228.

93. S. Bretschneider, C. Eggeling, S.W. Hell. Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving. // Physical Review Letters, 2007. 98(21): p. 218103.

94. J. Kwon, J. Hwang, J. Park, G.R. Han, K.Y. Han, S.K. Kim. RESOLFT nanoscopy with photoswitchable organic fluorophores. // Sci Rep, 2015. 5: p. 17804.

95. U.J. Birk, D. Baddeley, C. Cremer. Nanosizing by spatially modulated illumination (SMI) microscopy and applications to the nucleus. // Methods Mol Biol, 2009. 464: p. 389-401.

96. M.G.L. Gustafsson. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005. 102(37): p. 13081-13086.

97. S.J. Sahl, S.W. Hell, S. Jakobs. Fluorescence nanoscopy in cell biology. // Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2017. 18: p. 685.

98. M.G.L. Gustafsson. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. // Journal of Microscopy-Oxford, 2000. 198: p. 82-87.

99. R. Heintzmann, T. Huser. Super-Resolution Structured Illumination Microscopy. // Chem Rev, 2017. 117(23): p. 13890-13908.

100. L. Schermelleh, P.M. Carlton, S. Haase, L. Shao, L. Winoto, P. Kner, B. Burke, M.C. Cardoso, D.A. Agard, M.G.L. Gustafsson, H. Leonhardt, J.W. Sedat. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. // Science, 2008. 320(5881): p. 1332-1336.

101. M.P. Strauss, A.T. Liew, L. Turnbull, C.B. Whitchurch, L.G. Monahan, E.J. Harry. 3D-SIM super resolution microscopy reveals a bead-like arrangement for FtsZ and the division machinery: implications for triggering cytokinesis. // PLoS Biol, 2012. 10(9): p. e1001389.

102. J. Horsington, L. Turnbull, C.B. Whitchurch, T.P. Newsome. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. // J Virol Methods, 2012. 186(1-2): p. 132-6.

103. S.W. Hell, J. Wichmann. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. // Opt Lett, 1994. 19(11): p. 780-782.

104. T.A. Klar, S.W. Hell. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. // Opt Lett, 1999. 24(14): p. 954-956.

105. В.А. Охонин. Способ исследования микроструктуры образца. // 1986.

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

P. Hoopmann, A. Punge, S.V. Barysch, V. Westphal, J. Bückers, F. Opazo, I. Bethani, M.A. Lauterbach, S.W. Hell, S.O. Rizzoli. Endosomal sorting of readily releasable synaptic vesicles. // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010. 107(44): p. 19055-19060.

F. Chen, P.W. Tillberg, E.S. Boyden. Expansion microscopy. // Science, 2015. 347(6221): p. 543-548.

H. Shen, L.J. Tauzin, R. Baiyasi, W. Wang, N. Moringo, B. Shuang, C.F. Landes. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. // Chem Rev, 2017. 117(11): p. 7331-7376.

E. Betzig, R.J. Chichester. Single molecules observed by near-field scanning optical microscopy. // Science, 1993. 262(5138): p. 1422-5. T. Funatsu, Y. Harada, M. Tokunaga, K. Saito, T. Yanagida. Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution. // Nature, 1995. 374: p. 555.

H. Geerts, M. De Brabander, R. Nuydens, S. Geuens, M. Moeremans, J. De Mey, P. Hollenbeck. Nanovid tracking: a new automatic method for the study of mobility in living cells based on colloidal gold and video microscopy. // Biophys J, 1987. 52(5): p. 775-82.

R.J. Ober, S. Ram, E.S. Ward. Localization accuracy in single-molecule microscopy. // Biophys J, 2004. 86(2): p. 1185-200.

J.C. Vaughan, S. Jia, X. Zhuang. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. // Nat Methods, 2012. 9(12): p. 1181-4. D.M. Shcherbakova, P. Sengupta, J. Lippincott-Schwartz, V.V. Verkhusha. Photocontrollable Fluorescent Proteins for Superresolution Imaging. // Annual review of biophysics, 2014. 43: p. 303-329.

A. Szczurek, L. Klewes, J. Xing, A. Gourram, U. Birk, H. Knecht, J.W. Dobrucki, S. Mai, C. Cremer. Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations. // Nucleic Acids Research, 2017. 45(8): p. e56-e56.

W.R. Legant, L. Shao, J.B. Grimm, T.A. Brown, D.E. Milkie, B.B. Avants, L.D. Lavis, E. Betzig. High density three-dimensional localization microscopy across large volumes. // Nat Methods, 2016. 13(4): p. 359-365.

M. Sauer, M. Heilemann. Single-Molecule Localization Microscopy in Eukaryotes. // Chem Rev, 2017. 117(11): p. 7478-7509.

N.G. Bozhanova, M.S. Baranov, N.V. Klementieva, K.S. Sarkisyan, A.S. Gavrikov, I.V. Yampolsky, E.V. Zagaynova, S.A. Lukyanov, K.A. Lukyanov, A.S. Mishin. Protein labeling for live cell fluorescence microscopy with a highly photostable renewable signal. // Chem Sci, 2017. 8(10): p. 7138-7142. N. Gustafsson, S. Culley, G. Ashdown, D.M. Owen, P.M. Pereira, R. Henriques. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through superresolution radial fluctuations. // Nat Commun, 2016. 7: p. 12471. D.A. Moore, Z.N. Whatley, C.P. Joshi, M. Osawa, H.P. Erickson. Probing for Binding Regions of the FtsZ Protein Surface through Site-Directed Insertions:

Discovery of Fully Functional FtsZ-Fluorescent Proteins. // J Bacteriol, 2017. 199(1).

121. N. Olivier, D. Keller, P. Gonczy, S. Manley. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. // PLoS One, 2013. 8(7): p. e69004.

122. A.D. Vedyaykin, A.V. Sabantsev, I.E. Vishnyakov, S.N. Borchsenius, Y.V. Fedorova, A.S. Melnikov, P.Y. Serdobintsev, M.A. Khodorkovskii. Localization microscopy study of FtsZ structures in E. coli cells during SOS-response. // 1st International School and Conference Saint-Petersburg Open 2014 on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures, 2014. 541.

123. M. Ovesny, P. Krizek, J. Borkovec, Z. Svindrych, G.M. Hagen. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and superresolution imaging. // Bioinformatics, 2014. 30(16): p. 2389-90.

124. C.A. Schneider, W.S. Rasband, K.W. Eliceiri. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. // Nat Methods, 2012. 9(7): p. 671-5.

125. I.E. Vishnyakov, S.A. Levitskii, V.A. Manuvera, V.N. Lazarev, J.A. Ayala, V.A. Ivanov, E.S. Snigirevskaya, Y.Y. Komissarchik, S.N. Borchsenius. The identification and characterization of IbpA, a novel alpha-crystallin-type heat shock protein from mycoplasma. // Cell Stress Chaperones, 2012. 17(2): p. 17180.

126. A. Kayumov, A. Heinrich, K. Fedorova, O. Ilinskaya, K. Forchhammer. Interaction of the general transcription factor TnrA with the PII-like protein GlnK and glutamine synthetase in Bacillus subtilis. // FEBS J, 2011. 278(10): p. 177989.

127. D. Lavysh, M. Sokolova, L. Minakhin, M. Yakunina, T. Artamonova, S. Kozyavkin, K.S. Makarova, E.V. Koonin, K. Severinov. The genome of AR9, a giant transducing Bacillus phage encoding two multisubunit RNA polymerases. // Virology, 2016. 495: p. 185-96.

128. V.A. Ivanov, V.J. Fel. On Some Similarity between Membrane-Antigens of the Cell of Zajdela Hepatoma and Liver of Rats Subjected to a Single 4-Dimethylaminoazobenzene Injection. // Neoplasma, 1980. 27(6): p. 745-750.

129. J.C. Vaughan, S. Jia, X. Zhuang. Ultra-bright Photoactivatable Fluorophores Created by Reductive Caging. // Nat Methods, 2012. 9(12): p. 1181-1184.

130. E.V. Ponomareva, I.E. Vishnyakov, N.E. Morozova, V.S. Polinovskaya, M.A. Khodorkovskii, A.D. Vedyaykin. Super-resolution microscopy of living bacterial cells. // 4th International School and Conference "Saint-Petersburg OPEN 2017", Санкт-Петербург, 3-6 апреля 2017 г., 2017.

131. A.D. Vedyaykin, I.E. Vishnyakov, V.S. Polinovskaya, M.A. Khodorkovskii, A.V. Sabantsev. New insights into FtsZ rearrangements during the cell division of Escherichia coli from single-molecule localization microscopy of fixed cells. // Microbiologyopen, 2016.

132. B. Soderstrom, A. Badrutdinov, H. Chan, U. Skoglund. Cell shape-independent FtsZ dynamics in synthetically remodeled bacterial cells. // Nat Commun, 2018. 9(1): p. 4323.

133. В. А.Д., С. А.В., В. И.Е., М. Н.Е., Х. М.А. Восстановление процесса деления в бактериальных клетках после индукции белка SulA, отвечающего за прекращение цитокинеза при SOS-ответе. // Цитология, 2016. 58(12): p. 930935.

134. Y. Chen, S.L. Milam, H.P. Erickson. SulA inhibits assembly of FtsZ by a simple sequestration mechanism. // Biochemistry, 2012. 51(14): p. 3100-3109.

135. H.J. Defeu Soufo, C. Reimold, U. Linne, T. Knust, J. Gescher, P.L. Graumann. Bacterial translation elongation factor EF-Tu interacts and colocalizes with actin-like MreB protein. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010. 107(7): p. 3163-3168.

136. G. Butland, J.M. Peregrin-Alvarez, J. Li, W. Yang, X. Yang, V. Canadien, A. Starostine, D. Richards, B. Beattie, N. Krogan, M. Davey, J. Parkinson, J. Greenblatt, A. Emili. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. // Nature, 2005. 433(7025): p. 531-7.

137. F. Mayer. Cytoskeletons in prokaryotes. // Cell Biol Int, 2003. 27(5): p. 429-38.

138. String database, FtsZ from M. gallisepticum. 2018 [cited 2018 2018-05-10]; Available from: https://string-db.org/cgi/network.pl?taskId=GYCWxV8oQ87E.

139. String database, FtsZ protein from A. laidlawii. 2018 [cited 2018 2018-05-10]; Available from: https: //string-db. org/cgi/network.pl?taskId=ATBTEuTfIOQZ.

140. A.D. Vedyaykin, V.S. Polinovskaya, A.V. Sabantsev, M.A. Khodorkovskii, S.N. Borchsenius, I.E. Vishnyakov. Influence of FtsZ proteins from some mycoplasma species on the division process in Escherichia coli cells. // Cell and Tissue Biology, 2017. 11(5): p. 389-398.