Функциональные особенности антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов у больных апластической анемией тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Арчуадзе, Шорена Зурабовна

• Арчуадзе, Шорена Зурабовна
• кандидат медицинских наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Арчуадзе, Шорена Зурабовна

Список используемых сокращений и эффективность

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Иммунологические аспекты патогенеза апластической анемии

1.2. Лечение апластической анемии (АА) - механизмы действия препаратов, составляющих программу терапии больных АА

1.3. Дендритные клетки

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика больных, включенных в исследование

2.2. Методы.

2.3. Статистический анализ

2.4. Основные понятия

Глава 3. Функциональные особенности дендритных клеток, культивированных из моноцитов периферической крови больных апластической анемией до лечения и на фоне неэффективной иммуносупрессивной терапии

3.1. Иммунофенотипическая характеристика дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА

3.2. Секреция интерлейкина-12 дендритными клетками, полученными в результате культивирования моноцитов периферической крови больных АА в дебюте заболевания и у больных рефрактерной формой АА

3.3. Секреция интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными в результате культивирования и активации липополисахаридом моноцитов периферической крови больных АА в дебюте заболевания и больных АА рефрактерной формой заболевания

3.4. Секреция интерлейкина-10 неактивированными лимфоцитами и лимфоцитами после стимуляции фитогемаглютинином у больных АА до программной иммуносупрессивной терапии и у больных рефрактерной АА

Глава 4. Функциональные особенности дендритных клеток, культивированных из моноцитов периферической крови больных апластической анемией на фоне программной иммуносупрессивной терапии

4.1. Секреция интерлейкина-12 дендритными клетками, полученными в результате культивирования моноцитов периферической крови больных АА на фоне программной иммуносупрессивной терапии.

4.2. Секреция интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными в результате культивирования моноцитов периферической крови больных АА на фоне программной иммуносупрессивной терапии.

4.3. Сопоставление показателей секреции ИЛ-10 и ИЛ-12 дендритными клетками, полученными in vitro х из моноцитов периферической крови больных апластической анемией на фоне программной иммуносупрессивной терапии

4.4. Секреция интерлейкина-10 лимфоцитами без стимуляции и после стимуляции фитогемаглютинином у больных апластической анемией на фоне программной иммуносупрессивной терапии.

Глава 5. Секреция интерлейкина-12 и интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными в результате культивирования мононуклеаров периферической крови больных апластической анемией на поздних этапах программной иммуносупрессивной терапии

Глава 6. Секреция интерлейкина-12 и интерлейкина-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов периферической крови больных АА после достижения полной ремиссии и отмены иммуносупрессивной терапии

Глава 7. Зависимость достижения клиническиого ответа на иммуносупрессивное лечение от уровня продукции иммунорегуляторных цитокинов дендритными клетками, полученными из моноцитов больных апластической анемией . 130 Заключение

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональные особенности антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов у больных апластической анемией»

Актуальность проблемы

Результаты программной иммуносупрессивной терапии (ИСТ) при апластической анемии (АА), особенно, при рефрактерной форме заболевания требуют улучшения. Общепринятая, устаревшая, классификация апластической анемии, характеризует состояние гемопоэтической системы в момент установки диагноза, но не отражает глубину нарушений механизмов иммунорегуляции, приводящих к аплазии кроветворения. Следовательно, существующая классификация не позволяет выявить благоприятные или неблагоприятные факторы риска у больных апластической анемией при манифестации заболевания и разработать дифференцированный подход к иммуносупрессивному лечению конкретных больных с целью достижения оптимального ответа на терапию. Остаются неизученными вопросы, касающиеся необходимого объема и длительности иммуносупрессии в зависимости от выраженности иммунологических нарушений.

Mathe и соавт. 30 лет тому назад высказали предположение иммунологического механизма развития апластической анемии. Одним из подтверждений этой гипотезы является доказанная эффективность иммуносупрессивной терапии при АА. Кроме того, результаты изучения гипервариабельных регионов Т-клеточных рецепторов показали олигоклональность Т-клеточного ответа. В настоящее время считается доказанным, что у больных апластической анемией имеет место повышение соотношения активированных CD4+Т-хелперов I и II типа (Thl/Th2), гиперпродукция миелосупрессивных цитокинов (интерферона-у, фактора некроза опухоли-а) периферическими мононуклеарными клетками, а также дефицит иммунорегуляторных цитокинов, подавляющих продукцию миелосупрессивных цитокинов активированными Т хелперами и Т-цитотоксическими клетками I типа.

Однако, механизмы, определяющие развитие иммунной агрессии, приводящей к развитию апластической анемии, а именно, роль антигенпрезентирующих клеток остаются неизученными.

Антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки способны путем продукции иммуномодуляторных цитокинов - интерлейкина-10 и интерлейкина-12, определить направленность иммунного ответа. Показано, что именно дендритные клетки способствуют активации HLA-DR2 специфической Т клеточной популяции при апластической анемии. Однако, работы по функциональной характеристике АПК при АА не проводились.

В связи с вышесказанным, изучение функциональных способностей (иммунофенотипических и секреторных особенностей) Антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов больных апластической анемией при манифестации заболевания, на разных этапах ИСТ и в период ремиссии, а также выявление факторов риска с целью разработки дифференцированного подхода к лечению и оптимизации программной иммуносупрессивной терапии представляет большой интерес.

Данные нерешенные вопросы послужили поводом для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Изучить иммунофенотипические особенности, а также интерлейкин-10 и интерлейкин-12 продуцирующие способности дендритных клеток больных апластической анемией и определить прогностическую значимость функциональных свойств антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов при апластической анемии.

Задачи исследования:

1. Изучить иммунофенотипические особенности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА до начала иммуносупрессивной терапии.

2. Оценить способность культивированных дендритных клеток к продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12.

3. Оценить способность активированных лимфоцитов больных апластической анемией к секреции интерлейкина-10.

4. Определить прогностическую значимость уровня продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12 в культурах дендритных клеток больных апластической анемией.

5. Разработать практические рекомендации по анализу функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro (частота проведения исследования, особенности культивирования дендритных клеток).

Научная новизна

В процессе исследования антигенпрезентирующих клеток, полученных из периферической крови больных АА впервые:

• Получены дендритные клетки в in vitro условиях из моноцитов периферической крови больных апластической анемией.

• Изучена экспрессия костимуляторных молекул (CD40, CD80, CD86) и специфического маркера (CD 83) зрелых ДК на поверхности культивированных дендритных клеток больных АА.

• Изучена способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией к продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12 до начала иммуносупрессивной терапии и на разных этапах лечения.

• Определена прогностическая значимость интерлейкин-10 и интерлейкин-12 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro у больных апластической анемией.

Практическая ценность:

- Отработана методика культивирования дендритных клеток из моноцитов периферической крови больных апластической анемией, позволяющая изучить функциональные особенности культивированных дендритных клеток.

- Определены неблагоприятные факторы риска для больных апластической анемией, позволяющие разработать дифферецированный подход к терапии больных апластической анемией.

- Разработаны практические рекомендации по анализу функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro (время и частота проведения исследования), в зависимости от предшествующего неадекватного лечения или от этапа программной иммуносупрессивной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. До начала программной иммуносупессивной терапии значительно повышенный уровень продукции ИЛ-12 культивируемыми дендритными клетками выявляется у 70,8% больных апластической анемией, а низкая способность культивированных дендритных клеток к продукции ИЛ-10 отмечается у 61,6% больных апластической анемией.

2. Программная иммуносупрессивная терапия у 66,7% больных апластической анемией способствует снижению уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками, а также повышению продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками у 64,8% больных АА. Изменения функциональных особенностей дендритных клеток на фоне ИСТ коррелируют с клиническими результатами терапии.

3. Выявление высокой ИЛ-12 и низкой ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных апластической анемией до начала адекватного лечения или на ранних этапах терапии является показанием для более интенсивной и длительной (не менее двух лет) иммуносупрессивной терапии.

4. Отсутствие продукции интерлейкина-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных апластической анемией на фоне адекватной иммуносупрессивной терапии ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Арчуадзе, Шорена Зурабовна

Выводы:

1. Функциональные особенности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных апластической анемией, отличаются от аналогичных свойств культивируемых дендритных клеток здоровых доноров по способности отвечать на стимуляцию СБ40-лигандом продукцией ИЛ-12 и на стимуляцию липополисахаридом выработкой ИЛ-10. Иммунофенотипичеческие характеристики культивированных дендритных клеток больных апластической анемией и здоровых доноров существенно не отличаются по экспрессии маркера зрелых дендритных клеток - CD83 и костимуляторных молекул - CD40, CD80 и CD86.

2. Обнаружено, что у больных апластической анемией до начала программной иммуносупессивной терапии способность культивированных дендритных клеток к секреции ИЛ-12 в 70,8% случаев достоверно повышена, а продукция ИЛ-10 в 61,6% случаев достоверно снижена по сравнению с культивированными дендритными клетками здоровых доноров.

3. Программное иммуносупрессивное лечение у 66,7% больных апластической анемией способствует снижению уровня секреции ИЛ-12, а в 64,8% случаев -повышению продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками больных апластической анемией.

4. Культивированные дендритные клетки больных в состоянии полной ремиссии апластической анемии после отмены иммуносупрессивной терапии, характеризуются низким уровнем продукции ИЛ-12, а ИЛ-10 продуцирующая способность достоверно превышает аналогичный показатель культивированных дендритных клеток здоровых доноров.

5. Обнаружено, что высокая ИЛ-12 и низкая ИЛ-10 продуцирующая способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией до начала адекватного лечения или на ранних этапах иммуносупрессивной терапии является неблагоприятным прогностическим фактором и диктует необходимость проведения более интенсивной и длительной иммуносупрессивной терапии.

6. Выявлено, что у больных рефрактерной апластической анемией снижение ИЛ-12 продуцирующей и повышение ИЛ-10 секретирующей способности культивированных дендритных клеток отмечается через 18-26 месяцев от начала программной иммуносупрессивной терапии, что совпадает с медианой достижения полной ремиссии. Данное наблюдение подтверждает необходимость проведения длительной иммуносупрессивной терапии не менее двух лет.

7. В дебюте заболевания лимфоциты больных апластической анемией в отличие от лимфоцитов здоровых доноров при культивировании без стимуляции не продуцируют интерлейкин-10, а стимуляция фитогемаглютинином индуцирует секрецию данного цитокина в незначительном количестве. Отсутствие продукции ИЛ-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных АА на фоне адекватной ИСТ ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение.

Заключение

Современная программная иммуносупрессивная терапия позволяет достичь частичную или полную ремиссию заболевания у большинства больных апластической анемией. Однако, длительность и объем иммуносупрессивной терапии, необходимые для достижения благоприятных клинических результатов, варируются с 2 до 37 месяцев и с 1 до 4 и более этапов ИСТ, соответственно. Это объясняется сложностью и разнообразием иммунорегуляторных механизмов, участвующих в патогенезе заболевания. Дисбаланс между Thl и Th2, а также Tel и Тс2 субпопуляциями Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток, с преобладанием ИФН-у продуцирующих Т-эффекторов (Не Н. 2002) и гиперпродукция провоспалительных и миелосупрессивных цитокинов - ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-8 (Zhang Т. 2000; Tripathy NK. 2005; Young 2002) считаются непосредственной причиной, приводящей к аплазии кроветворения. Известно, что дендритные клетки путем продукции иммуностимуляторного цитокина -ИЛ-12 и иммуносупрессивного цитокина - ИЛ-10 способны регулировать поляризацию Т-хелперов и тем самым, определяют Thl или Th2 направленность антиген-специфического иммунного ответа (Xia C.Q. 2003). Однако, роль антиген-презентирующих клеток, а в частности, дендритных клеток в возникновении антиген-специфических цитотоксических Т-клеток, способных к подавлению кроветворения, остается неизученным. Лучшее понимание патогенеза апластической анемии и определение факторов риска, позволит разработать дифференциальный подход к лечению больных апластической анемией.

Изучение функциональных особенностей антиген-презентирующих клеток, а именно способности культивированных дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА на разных этапах лечения, экспрессировать костимуляторные молекулы и продуцировать ИЛ-10 и ИЛ-12 под воздействием ростовых факторов и индукторов созревания, а таюке определение прогностической значимости полученных показателей стали целью данной работы.

В исследовании были использованы методы клеточных культур и проточной цитометрии, а таюке иммуноферментный анализ.

Следует подчеркнуть, что в мире не проводилось культивирование и изучение функциональных особенностей дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА. Отсутствие таких исследований частично объясняется сложностью получения адекватного количества предшественников дендритных клеток у больных апластической анемией, особенно, в дебюте заболевания и на начальных этапах лечения. Данная проблема в настоящем исследовании была решена путем выполнения сеансов лейкафереза в режиме лечебного или диагностического лимфоцитафереза, которые позволяли получить 10,1-114,85х 108

8 8 8 (медиана - 18,75x10 ) и 0,75-12,5x10° (2,2x10°), соответственно, периферических мононуклеарных клеток с достаточным для исследовательских целей содержанием моноцитарных предшественников ДК.

В состоянии частичной или полной ремиссии у больных забирали 40-50мл периферической крови и выделяли 4,07х107 (1,56-18,75х107) ПМНК.

Дендритные клетки получали культивированием из моноцитов периферической крови больных АА в присутствии ростовых факторов в течение пяти суток. Моноциты получали путем адгезии на пластике фракции периферических мононуклеаров, выделенной на градиенте плотности фикола. Повторные контрольные исследования показали, что 90-95% адгезивных клеток были представлены CD 14+ моноцитами, а 93% неприкрепленных клеток представляли собой лимфоциты, экспрессирующие CD3.

Полученные таким образом клетки обладали характеристиками незрелых дендритных клеток. Их подвергали созреванию в присутствии наиболее хорошо изученных факторов - липополисахарида и С040-лиганда. Липополисахарид, рецепторы которого экспрессируются на поверхности активированных дендритных клеток, макрофагов и активированных В-лимфоцитов, индуцирует экспрессию костимуляторных молекул на поверхности дендритных клеток и продукцию иммунорегуляторных цитокинов, в том числе, интерлейкина-10.

СБ40-лиганд является наиболее эффективным стимулятором экспрессии CD80 и CD86 костимуляторных молекул на дендритных клетках и длительная активация СБ40-лигандом (не менее, чем в течение 12 часов) способствует секреции ИЛ-12р70. Для индукции созревания культивированных ДК С040-лигандом использовали клетки линии мышиных фибробластов CD40L-3T3, которые представляют собой мышиные фибробласты ЗТЗ, трансфецированные геном С040-лиганда человека и геном резистентности к G418. Повторная контрольная оценка экспрессии С040-лиганда на поверхности культивированных клеток линии мышиных фибробластов CD40L-3T3, подтвердило, что более 90-92% CD40L-3T3 фибробластов экспрессировали CD40-лиганд.

Количество живых клеток, полученных из моноцитов больных АА, составило 1,25 хЮ6 (колебания - 0,225-4,7 хЮ6) клеток. В результате культивации большинство клеток приобретали характерную для дендритных клеток морфологию с длинными отростками. Иммунофенотипическое исследование культивированных клеток проводилось у 10 больных и выявлено, что 49% (11,89 - 75%) клеток, полученных in vitro из моноцитов больных апластической анемией, экспрессировали специфический маркер зрелых ДК - CD83. Число CD40, CD80 или CD86 экспрессирующих клеток достигало 81,8% (63,7-95%), 88,9% (12,1-97%) и 82,5% (47-94,4%), соответственно, в культурах ДК больных и существенно не отличались от показателей здоровых доноров. Более того, по данным параметрам не было найдено отличий между больными тяжелой и нетяжелой формами апластической анемии или зависимости от предшествующего исследованию лечения.

На основании морфологических признаков и результатов исследования иммунофенотипических особенностей культивированных клеток можно утверждать, что используемые in vitro условия и метод культивации являются эффективными для получения дендритных клеток из моноцитов больных апластической анемией.

Примесь CD3+ лимфоцитов в оцениваемой популяции культивированных клеток составила 9,36% (3-38,1%). У двух больных в культуре клеток примесь CD14+ макрофагов достигала 11,6% и 20%. Следует отметить, что продукция интерлейкина-12 является исключительно функциональной особенностью антиген-презентирующих клеток, лимфоциты его не выделяют. Кроме того, нами было показано, что лимфоциты больных АА даже при стимуляции фитогемаглютинином не продуцируют интерлейкин-10. Таким образом, содержание в культурах лимфоцитов не могло значительно повлиять на показатели ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro.

Способность культивированных ДК отвечать на стимуляцию СЭ40-лигандом продукцией ИЛ-12 и на стимуляцию липополисахаридом выработкой ИЛ-10 оценивали у 30 больных апластической анемией. 10 больных до включения в исследование не получали лечения. Шести больным ранее проводилась программная иммуносупрессивная терапия и остальным 14 больным - неадекватное иммуносупрессивное лечение.

Иммуносупрессивные препараты оказывают влияние на функциональные свойства антигенпрезентирующих клеток, подавляя их созревание и продукцию провоспалительных цитокинов, включая интерлейкин-12, а также повышают секрецию иммуносупрессивного цитокина - интерлейкина-10. Следовательно, вопрос предшествующей терапии представлялся крайне важным, так как она могла повлиять на результаты изучения ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных апластической анемией. По данным in vivo исследований, уже через 4 часа после приема глюкокортикостероидов в плазме отмечается повышение уровня ИЛ-10 (Mozo L. 2003). In vitro изучение влияния глюкокортикоидов на экспрессию костимуляторных молекул и на продукцию интерлейкина-10 дендритными клетками, культивированными в присутствии дексаметазона из моноцитов здоровых доноров, показал, что дендритные клетки в течение 5 дней после удаления дексаметазона из культуральной среды сохраняли низкий уровень продукции ИЛ-12 и высокую ИЛ-10 продуцирующую способность (Xia С. 2005). Поэтому, больных, которые по месту жительства получали гормональную терапию, включали в исследование через 7-10 дней после её отмены. Так как иммуносупрессивный эффект циклоспорина-А прослеживается длительно после прекращения терапии, ЦС-А не отменяли больным до проведения сеанса лейкафереза. Однако, результаты изучения функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro, анализировали в зависимости от предшествующей терапии (1-я подгруппа - нелеченные больные, 2-я подгруппа - адекватно леченные и 3-я подгруппа неадекватно леченные больные АА).

В исследование были включены 18 больных тяжелой формой апластической анемией и 12 больных нетяжелой формой заболевания. Хотелось бы отметить, что тяжесть заболевания, определяемая по существующей классификации, не всегда отражает особенности течения и прогноз заболевания. Поэтому, представлялось важным, анализировать способность культивированных дендритных клеток к продукции иммунорегуляторных цитокинов в зависимости от тяжести заболевания.

Таким образом, разделить больных по четким группам не представлялось возможным. Это потребовало дифференцированного подхода к оценке результатов на каждом этапе исследования, и особую обработку данных.

Выявлено, что до начала программной иммуносупессивной терапии у преобладающего большинства (70,8%) больных апластической анемией способность дендритных клеток, полученных in vitro, к секреции ИЛ-12 значительно превышает аналогичный показатель ДК здоровых доноров.

Медиана показателей продукции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками выше у неадекватно леченных больных (3-я подгруппа), по сравнению с нелеченными и адекватно леченными больными АА. Кроме того, сопоставление результатов изучения функциональных особенностей ДК с давностью заболевания показало, что уровень секреции ИЛ-12 дендритными клетками, культивированными из моноцитов нелеченных больных ТАА, выше при давности заболевания более 3-4 месяцев, чем у тех больных ТАА, длительность анамнеза которых не превышала 1-3 месяца. Вероятнее всего длительный анамнез заболевания и отсроченное начало адекватной иммуносупрессивной терапии могут способствовать повышенной способности антигенпрезентирующих клеток продуцировать ИЛ-12, что может влиять на поляризацию Т-хелперного иммунного ответа и активацию других механизмов, приводящих к аплазии кроветворения.

Данное соображение подтверждается клиническими результатами программной иммуносупрессивной терапии. Через 26 (9-39) месяцев ИСТ клинические результаты были несколько хуже у больных, которым до начала адекватной программной ИСТ проводилось неадекватное леченние (3-я подгруппа), несмотря на то, что показатели ИЛ-12 продуцирующей способности ДК в культурах не отличались у больных разных подгрупп (1-я подгруппа - 53,19пг/мл, 2-я подгруппа - 61,55пг/мл, 3-я подгруппа -56,6пг/мл). Таким образом, своевременное (в течение 1-2 месяцев с момента манифестации заболевания) начало адекватной иммуносупрессивной терапии, способствует получению более благоприятного клинического ответа на лечение.

Повторное исследование (второй этап исследования) функциональных особенностей дендритных клеток проводили через 2 (0,75-12) месяца адекватной ИСТ. Выявлено, что проводимое лечение у 40% (6/15) больных способствовало значительному, а в 26,7% (4/15) случаев - несущественному снижению уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками. У 33,3% (5/15) больных данный показатель оставался на прежнем низком (17пг/мл до лечения, 26пг/мл на фоне лечения) уровне. Показана прямая зависимость частоты достижения клинико-гематологического улучшения у больных АА от уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками на фоне ИСТ: 100% больных, ДК которых была свойственна низкая продукция ИЛ-12 как до лечения, так и на фоне проводимой иммуносупрессивной терапии, достигли клинико-гематологического улучшения; в 66,7% (4/6) случаев значительного снижения продукции ИЛ-12 дендритными клетками на фоне ИСТ было получено клинико-гематологическое улучшение. Состояние больных с незначительным снижением уровня продукции ИЛ-12 оставалось без улучшения.

Более того, длительное наблюдение (36 (6-50) месяцев) за больными выявило, что полная ремиссия достигнута у 46,1% (6/13) тех больных, у которых до начала адекватной ИСТ отмечался высокий уровень продукции ИЛ-12 дендритными клетками в культурах; у двух больных клинико-гематологическое улучшение не было получено, а смертность составила 38,5% (5/13). С другой стороны, все больные, дендритные клетки которых до лечения характеризовались низкой ИЛ-12 секретирующей способностью, достигли полной ремиссии.

Длительность иммуносупрессивной терапии, необходимой для достижения КГУ и полной ремиссии была значительно выше у тех больных, дендритные клетки которых до ИСТ характеризовались высоким уровнем продукции ИЛ-12 (18 и 24 месяцев, соответственно) в культурах, по сравнению с больными, ДК которых ИЛ-12 продуцировали в небольшом количестве (2 и 8 месяцев, соответственно).

Способность культивированных дендритных клеток к продукции ИЛ-10 у 61,6% больных апластической анемией существенно ниже (включая 27% больных, у которых продукция ИЛ-10 отсутствовала в культурах ДК) по сравнению с дендритными клетками здоровых доноров. В ряде случаев наблюдалась высокая продукция ИЛ-10 дендритными клетками. Вероятнее всего, это связано с предшествующей неадекватной иммуносупрессивной терапией.

Выявлено, что адекватная иммуносупрессивная терапия в 64,8% случаев сопровождается повышением продукции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов больных АА. На фоне иммуносупрессивной терапии дендритные клетки, полученные in vitro, в 14,3% (3/22) случаев не продуцировали интерлейкин-10. У 23,8% (5/22) больных уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК был ниже, а у 28,6% (6/22) больных — сопоставим с аналогичным показателем культивированных ДК доноров. У 33,3% (7/22) больных апластической анемией на фоне лечения отмечается высокий уровень продукции ИЛ-10 дендритными клетками.

Более того, выявлена корреляция частоты достижения клинических результатов с уровнем ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных АА на фоне лечения. У всех больных АА, ДК которых в культурах продуцировали ИЛ-10 в большом количестве (медиана 274,2пг/х106ДК), отмечалось клинико-гематологическое улучшение. В тех случаях, когда культивированные ДК больных АА секретировали ИЛ-10 на уровне, сопоставимом с аналогичным показателем ДК контрольной группы, частота достижения КГУ на фоне программной иммуносупрессивной терапии составила 66,7%. Клиническая эффективность не превышала 40% у тех больных, ДК которых сохраняли низкую ИЛ-10 продуцирующую способность в культурах.

Изучение прогностической значимости ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток выявило, что низкий уровень продукции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными in vitro, как до адекватного лечения, так на фоне программной ИСТ, ассоциируется с неблагоприятными клиническими результатами. Частота достижения полной ремиссии, отсутствия клинического эффекта и смертность составила 68,75%, 12,5% и 18,75%, соответственно, у тех больных, дендритные клетки которых до начала программной ИСТ продуцировали ИЛ-10 в небольшом количестве или на уровне сопоставимом с показателями ДК доноров.

Высокий уровень продукции ИЛ-10 ДК до начала адекватной иммуносупрессивной терапии у большинства больных вероятно, может быть обусловлен предшествующим неадекватным лечением, включающим преднизолон и/или циклоспорин-А. Следовательно, высокая ИЛ-10 продуцирующая способность дендритных клеток, полученных из моноцитов больных апластической анемией до начала адекватной ИСТ, лишена прогностической значимости и поэтому, больным АА, которые получали неадекватную иммуносупрессивную терапшо, оценку ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных ДК следует проводить после первого этапа программной иммуносупрессивной терапии.

Высокий уровень секреции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов периферической крови больных АА на фоне ИСТ, был выявлен у 47% (8/17) больных. У всех из них была достигнута полная ремиссия. При этом 6 больных ответили на 1 этап ИСТ, а в двух случаях были проведены два этапа ИСТ.

Выявлено, что длительность иммуносупрессивной терапии до достижения клинико-гематологического улучшения и полной ремиссии было значительно меньше в подгруппе больных, дендритным клеткам которых был свойственен высокий уровень продукции ИЛ-10 на фоне ИСТ (3 и 8 месяцев, соответственно), по сравнению с больными, ДК которых продуцировали ИЛ-10 в небольшом количестве (12,5 и 21 месяцев, соответственно).

На основании этих результатов можно утверждать, что уровень продукции ИЛ-12 и ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов больных апластической анемией, имеет прогностическую значимость - позволяет при манифестации заболевания определить вероятность достижения клинических результатов и объем необходимой иммуносупрессивной терапии, а также разработать оптимальную схему терапии.

Показатели ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro, существенно не отличались у больных тяжелой и нетяжелой формой заболевания. Следует отметить, что на всех этапах ИСТ отмечалась определенная тенденция - число больных, дендритные клетки которых на фоне ИСТ продуцировали ИЛ-12 на уровне, превышающем показатели культивированных ДК здоровых доноров, было несколько выше при тяжелой апластической анемии (73,3% -до ИСТ; 45,45% - на фоне программной ИСТ), чем при НАА (66,7% - до ИСТ; 33,33% -на фоне программной ИСТ). Кроме того, число больных ТАА, достигших клинико-гематологическое улучшение через 2 месяца ИСТ было несколько меньше (54,5%), по сравнению с аналогичным показателем больных НАА (66,7%). Однако, выявленные несущественные отличия между больными ТАА и НАА не позволяют рассматривать тяжесть заболевания в качестве фактора риска и разработать дифференцированный подход к лечению.

Изучение клинических результатов, а также ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующих способностей культивированных дендритных клеток больных рефрактерной АА в зависимости от длительности программного иммуносупрессивного лечения выявило, что в течение 18 месяцев у больных рефрактерной апластической анемией сохраняется низкий уровень продукции ИЛ-10 ДК, полученными in vitro, тогда когда способность ДК к продукции ИЛ-12 колеблется от низких до высоких значений. За данный период в большинстве случаев состояние больных остается без улучшения. С 18 до 25 месяцев иммуносупрессивной терапии отмечается повышение ИЛ-10 продуцирующей способности ДК в культурах, а продукция ИЛ-12 дендритными клетками, стимулированными С040-лигандом, стабильно снижается до уровня, соответствующего верхней границе колебаний уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК здоровых доноров. На данном этапе лечения у больных рефрактерной АА достигается клинико-гематологическое улучшение. После 25-26 месяцев ИСТ уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК больных рефрактерной АА значительно (в 3-4 раза) преобладает над аналогичным показателем ДК доноров. У данных больных наблюдается нормализация показателей гемограммы. Представляется важным подчеркнуть, что подобный комплексный анализ клинико-лабораторных данных больных рефрактерной апластической анемией позволил, выявить, что время достижения благоприятных клинических результатов совпадает с моментом снижения иммуностимуляторной способности дендритных клеток и повышения иммуносупрессивной способности ДК в культурах.

У 66,7% больных в состоянии полной ремиссии апластической анемии после отмены иммуносупрессивной терапии ДК характеризовались низким уровнем продукции ИЛ-12 и высокой ИЛ-10 продуцирующей способностью. Показатели остальных больных АА в состоянии полной ремиссии несколько отличались, а именно, уровень продукции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками одного больного превышал уровень продукции ИЛ-12 ДК контрольной группы, тогда как ДК данного больного не продуцировали ИЛ-10 в in vitro условиях. Через 4 месяца у больного развился рецидив заболевания. Способность к продукции ИЛ-10 культивированными ДК двух больных соответствовал или был ниже контрольного уровня. При обследовании у данных больных была выявлена реактивация вирусной инфекции.

На примере этих клинических случаев показано, что повышение уровня продукции ИЛ-12 ДК в сочетании со значительным снижением секреции ИЛ-10 дендритными клетками у больных апластической анемией в полной ремиссии может предшествовать развитию рецидива заболевания и требует более тщательного наблюдения за больным. Данное наблюдение требует дальнейшего изучения и подтверждения в более многочисленной группе больных.

Изучение ИЛ-10 продуцирующей способности неактивированных лимфоцитов и лимфоцитов после стимуляции ФГА до начала программной ИСТ и на фоне адекватного лечения выявило, что в отличие от доноров, лимфоциты больных апластической анемией без стимуляции не продуцировали ИЛ-10, а стимуляция фитогемаглютинином способствовала секреции данного цитокина в незначительном количестве. Более того, в результате проведения начальных этапов программной иммуносупрессивной терапии у части больных АА отмечалось незначительное повышение уровня продукции ИЛ-10 лимфоцитами, как без стимуляции, так и после стимуляции. Разницу между полученными результатами для клеток доноров и больных АА можно объяснить тем, что при апластической анемии как относительное, так и абсолютное число лимфоцитов, способных к продукции интерлейкина-10, резко снижено. Отсутствие продукции ИЛ-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных АА, независимо от тяжести заболевания, на фоне адекватной ИСТ, ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение.

В заключении важно, подчеркнуть, что проведенное исследование функциональных особенностей культивированных дендритных клеток позволило, выявить несколько закономерностей по ИЛ-10 и ИЛ-12 продуцирующим способностям ДК, полученных из периферических мононуклеаров больных АА и стимулированных липополисахаридом или С040-лигандом, соответственно, и по динамике данных показателей на фоне программной иммуносупрессивной терапии, а также способствовало определению прогностической значимости полученных результатов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Арчуадзе, Шорена Зурабовна, 2007 год

1. Капустин С.Н., Попова Т.И., Лыщев А.А. и соавт. Особенности аллельного полиморфизма локуса HLA-DR у больных АА. Гематол. Трансфуз., 1999, 44 (3):16-21

2. Михайлова Е.А. Эритро- и гранулоцитопоэз при пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. 1980. 26стр. (М-во здравоохранения СССР ЦНИИГПК)

3. Михайлова Е.А., Савченко В.Г., Маслова Е.Р. и соавт. Лечение апластической анемии антилимфоцитарным глобулином. Терапевтический архив. 1997, № 7, 33-39

4. Михайлова Е.А., Савченко В.Г., Пашинин А.Н. и соавт. Альтернативные подходы к лечению больных апластической анемией. Терапевтический архив. 1992; №7, 68-74

5. Михайлова Е.А., Савченко В.Г., Устинова Е.Н. и соавт. Эффективность циклоспорина-А в лечении взрослых больных апластической анемией. Терапевтический архив. 2001; № 7, 56-61

6. Михайлова Е.А., Савченко В.Г., Устинова Е.Н. и соавт. Результаты программной терапии взрослых больных апластической анемией. Проблемы гематологии и переливания крови. 2003, № 3, 14-22

7. Михайлова Е.А., Саркисян Г.П., Арчуадзе Ш.З. и соавт. Иммунофенотип периферических лимфоцитов у больных апластической анемией на фоне иммуносупрессивной терапии. Проблемы гематологии и переливания крови. 2002; 1, стр. 60

8. Михайлова Е.А., Ядрихинская В.Н., Савченко В.Г. Апластические анемии и вирусные гепатиты (постгепатитные апластические анемии). Терапевтический архив. 1999, № 7, 64-69

9. Савченко В.Г., Садовникова Е.Ю., Паровичникова Е.Н. и соавт. Индукция противоопухолевой активности Т-лимфоцитов антигенпрезентирующими клетками, полученными из бластных клеток больных острыми лейкозами. Тер. арх. 2000; 72, 7, 14-21

10. Садовникова Е.Ю., Стрельникова Т.Б., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. Индукция костимуляторных молекул на поверхности бластных клток у больных острыми миелоидными лейкозами. Тер. арх. 2001; 73, 7, 34-40

11. Ahuja S.S., Shrivastav S., Danielpour D. et al. Regulation of transforming growth factor-pi by cyclosporine in human T lymphocytes. Transplantation. 1995. Vol 60, # 7:718-723

12. Alegre M.L., Frauwirth K.A., Thompson C.B. T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nature Reviews/Immunology. 2001; Vol. 1, N 3, 220-228

13. Asano Y., Shibata S., Kobayashi S. et al. Effect of interleukin-10 on the hematopoietic progenitor cells from patients with aplastic anemia. Stem Cells 1999; 17(3):147-151

14. Attia M., Welsh J.P., Laing K.L. et al. TNF-alpha causes an autocrine IFN-gamma response in CD34+ cells. The Haematology Journal. 2004, Vol. 5, Suppl. 2, 193

15. Ball S. E., Gibson F. M., Rizzo S. et al. Progressive telomere shortening in aplastic anemia. Blood. 1998; Vol. 91, No 10, 3582-3592

16. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998; 392:245-251

17. Beebe A.M., Cua D.J., Malefyt R.W. The role of interleukin-10 in autoimmune disease: systemic lupus erythematosus (SLE) and multiple sclerosis (MS). Cytokine&Growth Factor Reviews 2002, 13:403-412

18. Besinger S.J., Bandeira A., Jordan M.S. et al. Major histocompatibility complex class II-positive cortical epithelium mediates the selection of CD4+25+ immunoregulatory T cells. J. Exp. Med. 2001. Vol. 194, 4:427-438

19. Bourguin-Plonquet A., Rouard H., Roudot-Thoraval F. et al. Severe decrease in peripheral blood dendritic cells in hairy cell leukaemia. Brit. J. Haematol. 2002; V01 116, N 3, 595602

20. Brown K.E., Tisdale J., Dunbar C.E. at al. Hepatitis associated aplastic anemia. N. Engl. J.Med. 1997; 336, 1059-1064

21. Brummendorf Т.Н., Maciejewski J.P., Mark J. et al. Telomere length in leukocyte subpopulations of aplastic anemia. Blood; 2001, 97, 4: 895-900

22. Butler J.J., Cochran J., Ward N. et al. Activation-induced expression of cell surface CD28 on mouse T-lymphocytes is inhibited by cyclosporine-A. American Journal of Transplantation. 2002; 2:215-222

23. Caderbom L., Hall H., Ivars F. CD4+CD25+ regulatory T cells down-regulate co-stimulatory molecules on antigen-presenting cells. Eur. J. Immunol. 2000; 30:1538-1543

24. Callard R.E. and Kotowicz K.T. Protocol list. Protocol 2: Preparation of mononuclear cells from tonsils and venous blood. Academic press, London; p. 22-23

25. Caux C. Activation of human dendritic cells through CD-40 cross-linking. J. Exp. Med. 1994. 180:1263-1272

26. Cavani A., Nasorri F., Prezzi C. et al. Human CD4+ N lymphocytes with remarkable regulatory function on dendritic cells and nickel-specific Thl immune responses. J. Invest. Dermatol. 2000, 114:295-301

27. Chen G., Kook H., Zeng W. et al. Is there a direct effect of antithimocyte globulin on hematopoiesis? The Haematology Journal. 2004, 5, 255-261

28. Chklovskaia E., Nissen C., Landmann L. et al. Cell-surface trafficking and release of flt3 ligand from T lymphocytes is induced by common cytokine receptor y-chain signaling and inhibited by cyclosporin A. Blood; 2001, 97, 4: 1027-1034

29. Chung I.J., Lee J.J., Nam C.E. et al. Increased inducible nitric oxide synthase expression and nitric oxide concentration in patients with aplastic anemia. Ann. Hematol. 2003. 82, 2:104-108

30. Colledge L., Bennett C.L., Reay P.A. et al. Rapid constitutive genration of a specific pepetide-MHC class II complex from intact exogeneous protein in immature murine dendritic cell. Eur. J. Immunol. 2002. Vol. 32; 11:3246-3255

31. Corinti S., Cristina A., Sala A. et al. Regulatory activity of autocrine IL-10 on dendritic cell functions. The Journal of Immunology, 2001. 166:4312-4318

32. Cuningham A.E., Serre K., Toellner K.M. et 1. IL-4 induction is a consequence of, but does not drive, the initial Th2 priming and antibody responses. Immunology. 2003; Vol 110. Suppl.l, p. 41

33. D'Amico G., Frascaroli G. Bianchi G. et al. Uncoupling of inflammatory chemokine receptors by IL-10: generation of functional decoys. 2000; Vol 1, N 5, 387-391

34. Deters M., Kirchner G., Koal T. et al. Everolimus/cyclosporine interactions on bile flow and biliari excretion of bile salts and cholesterol in rats. Dig. Dis. Sci. 2004. Vol. 49; 1:30-37

35. Dhodapkar M.V., Steinman R.M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide specific CD8+ regulatory T-cells in vivo in humans. Blood. 2002; Vol 100, N 1, 174-178

36. Dong Ch., Flavell R.A. et al. Thl and Th2 cells. Current Opinion in Hematology. 2001; 8:47-51

37. Dubey S., Nityanand S. Involvement of Fas and TNF pathways in the induction of apoptosis of T cells by antithymocyte globulin. Annals of Hematology. 2003, Vol. 82, 8:496-501

38. Dybedal I., Guan F., Borge O. J. et al. Transforming growth factor-(31 abrogates Fas-induced suppression and apoptosis of murine bone marrow progenitor cells. Blood. 1997; 90, 9:3395-3403

39. Eisendle K., Lang A., Eibl B. et al. Phenotypic and functional deficiencies of leukemic dendritic cells from patients with chronic myeloid leukemia. Brit. J. Haematology. 2003; Vol. 120, N 1,63-67

40. Facon Т., Walter M.P., Fenaux P. et al. Treatment of severe aplastic anemia with antilymphocyte globulin and androgens: A report on 33 patients. Ann. Haematol. 1991, 63:89-93

41. Faries M.B., Bedrosian I., Xu S. et al. Calcium signaling inhibits interleukin-12 production and activates CD83+ dendritic cells that induce Th2 cell development. Blood. 2001; 98:2489-2497

42. Ferlazzo G., Semino C., Meta M. et al. T lymphocytes express B7 family molecules following interaction with dendritic cells and acquire bystander costimulatory properties. Eur. J. Immunol. 2002. Vol. 32; 11:3092-3101

43. Frickhofen N., Heimpel H., Kaltwassen J.P. et al. Antithymocyte globulin with or without cyclosporin A: 11-year follow-up of a randomized trial comparing treatments of aplastic anemia. Blood. 2003; 101, 4:1236-1242

44. Genestier L., Fournel S., Flacher M. et al. Induction of Fas (Apo-1, CD95)-mediated apoptosis of activated lymphocytes by polyclonal antithimocyte globulins. Blood. 1998. Vol. 91, 7:2360-2368

45. Giannakoulas N.C., Karakantza M., Theodorou G.L. et al. Clinical relevance of balance between type 1 and type 2 immune response of lymphocyte subpopulation in aplastic anemia patients. British J. Haematol. 2004; 124, 97-105

46. Goodman G.R., Dissanayake I.R., Boqman A.R. et al. Transforming growth factor-pi administration modifies cyclosporine A induced bone loss. Bone. 2001; Vol 28, N 6, 583-588

47. Gordon M.Y. Stem cells and the microenvironment in aplastic anemia. Brit. J. Haemat. 1994; 86, 190-192

48. Grabbe S., Kampgen E., Schuler G. Dendritic cells: multi-lineal and multi-functional. Immunology today. 2000; Vol. 21, N 9, 431-433

49. Gray C., Arosio P., Hersey P. Heavy chain ferritin activates regulatory T cells by induction of changes in dendritic cells. Blood. 2002. Vol. 99; 9:3326-3334

50. Greenwald R.J., Latchman Y.E., Sharpe A.H. Nagative co-receptors on lymphocytes. Current Opin. Immunol. 2002; 14, 391-396

51. Harizi H., Juzan ., Pitard V. et al. Cyclooxigenase-2-issued prostaglandin E2 enhances the production of endogenous IL-10 which down-regulates dendritic cell functions. J. Immunol. 2002. Vol. 168; No. 5: 2255-2263

52. Hart D. Dendritic cells: unique leukocyte populations, which control the primary immune response. Blood. 1997. Vol. 90, 9:3245-3287

53. Hayes MP., Wang J., Norcross M. et al Regulation of interleukin-12 expression in human monocytes: selective priming by interferon-y of lypopolysaccharide inducible p35 and p40 genes. Blood. 1995. 86:646-672

54. He H., Shao Z., He G. et al. Role of Thl cells in the pathogenesis of aplastic anemia. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2002. Vol. 23, N 11, 574-577

55. International Agency for Research on Cancer. IARK monographs on the carcinogenic risk of chemicals to humans. Pharmaceutical drugs. IARK. Lyon, France, 1990, Vol 50, 415

56. Issaragrisil S., Kaufman D.W., Anderson T. er al. Low drug attributability of aplasic anemia in Thailand. Blood. 1997; Vol 89, No 11, 4034-4039

57. Janeway C.A., Travers P., Walport M. et al. Immunobiology / 5th edition. Garland Publishing. 2001, 553-566

58. Kaito K., Kobayashi M., Katayama T. et al. Long-term administration of G-CSF for aplastic anemia patients is closely related to the early evolution of monosomy 7 MDS in adults. Brittish J Haematol. 1998; 103, 297-303

59. Kaito K., Otsubo H., Ogasawara Y. et al. Adhesion molecule expression by bone marrow CD34-positive cells in aplastic anemia before and after immunosuppressive therapy. Cli. Lab. Haematol. 2003; 25, 6:393-396

60. Kaito K., Otsubo H., Ogasawara Y. et al. Severe aplastic anemia associated with chronic natural killer cell lymphocytosis. Int. J. Haematol. 2000; 72, 4:463-465

61. Kapustin S. I., Popova T.I., Lyshchov A.A. et al. HLA-DR4-Ala74(3 is associated with risk and poor outcome of severe aplastic anemia. Annals of Haematology. 2001; 80, 2:6671

62. Karadimitris A., Manavalan J.S., Thaler H.T. et al. Abnormal T-cell repertoire is consistent with immune process underlying the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 2000; Vol 96, N 7, 2613-2619

63. Koh J.T., Kim O.J., Park Y.S. et al. Decreased expressions of thrombospondin 2 in cyclosporin A -induced gingival overgrowth. J. Periodontal Res. 2004. Vol. 39, 2:93-100

64. Kojima S., Ohara A., Tsuchida M. et al. Risk factors for evolution of acquired aplastic anemia into myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia after immunosuppressive therapy in children. Blood. 2002; 100, 3:786-790

65. Kook IT., Risitano A.M., Zeng W. et al. Changes in T-cell receptor VB repertoire in aplastic anemia: effect of different immunosuppressive regimens. Blood. 2002; 99, 10:3668-3675

66. Kook H., Zeng W., Guibin Ch. et al. Increased cytotoxic T-cells with effector phenotype in aplastic anemia and myelodysplasia. Exp. Hematology. 2001. Vol. 29, 11:1270-1277

67. Koski G., Lyakh L., Rice N. Rapid LPS-induced differentiation of CD14+ monocytes into CD83+ dendritic cells is modulated under serum-free conditions by exogenously added IFN-y and endogenously produced IL-10. Eur. J. Immunol. 2001; 31:3773-3781

68. Langenkamp A., Casorati G., Garavaglia C. et al. T cell priming by dendritic cells: thresholds for proliferation, differentiation and death and intraclonal function diversification. Eur. J. Immunol. 2002. Vol. 32; 7:2046-2054

69. Lechmann M., Zinser E., Golka A. et al. Role of CD83 in the immunomodulation of dendritic cells. International Archives of Allergy and immunology. 2002; 129:113-118

70. Levings M.K., Sangregorio R. and Roncarolo M.G. Human CD25+CD4+ T regulatory cells suppress naive and memory T cell proliferation and can be expanded in vitro without loss of function. The Journal of Experimental Medicine. 2001 Vol.193, No 11:1295-1302

71. LI C., LIM SW., Sun B. et al. Expression of apoptosis-related factors in chronic cyclosporine nephrotoxicity after cyclosporine withdrawal. Acta Pharmacol. 2004, 25(4): 401-411

72. Luft Т., Basu A., Melenhorst JJ. et al. Analysis of T-cell repertoire in hepatitis-associated aplastic anemia. Blood. 2004; 103, 4588-4593

73. Lyman S.D., Seaberg M., Hanna R. et al. Plasma/serum levels of flt3 ligand are low in normal individuals and highly elevated in patients with fanconi anemia and acquired aplastic anemia. Blood. 1995; 86, 11:4091-4096

74. Maciejewski J.P., Hibbs J.R., Anderson S. et al. Bone marrow and peripheral blood lymphocyte phenotype in patients with bone marrow failure. Experimental Hematology, 1994, 22:1102-1110

75. Mami N.B., Mothy M., Chambost H. et al. Blood dendritic cells in patients with acute lymphoblastic leukemia. Brit. J. Haematol. 2004; V01 126, N 1, 77-86

76. Martinez-Jaramillo G., Flores-Figueroa E., Sanchez-Valle E. et al. Comparative analysis of the in vitro proliferation and expansion of hematopoietic progenitors from patients with aplastic anemia and myelodysplasia. Leukemia Research. 2002; 26, 955-963

77. Mathe G, Amiel JL, Schwarzenberg L, Choay J, Trolard P, Schneider M, et al. Bone marrow graft in man after conditioning by antilymphocytic serum. Br Med J. 1970; 2:1316

78. Melenhorst J., Fibbe W.E., Struyk L. et al. Analysis of T-cell clonality in bone marrow of patients with acquired aplastic anemia. British Journal of Haematology, 1997, 96: 85-91

79. Michallet M.C., Saltel F., Preville X. et al. Cathepsin-D-dependent apoptosis triggered by antithymocyte globulins: a novel mechanism of T-cell depletion. Blood. 2003; Vol 102, 10:3719-3726

80. Moebius U., Herrmann F., Hercend T. et al. Clonal analysis of CD4+/CD8+ T cells in a patient with aplastic anemia. J. Clin. Invest. 1991; Vol. 87, 1567-1574

81. Morales-Polanco M.R., Sanchez-Valle E., Guerrero-Rivera S. et al. Treatment results of 23 cases of severe aplastic anemia with lymphocytopheresis. Arch. Med. Res. 1997. Vol. 28, 1:85-90

82. Moretta A. Natural killer cells and dendritic cells: rendezvous in abused tissues. Nature Reviews/Immunology. 2002; 2, 957-963

83. Mortazavi Y., Merk В., Mcintosh J. et al. The spectrum of PIG-A gene mutations in aplastic anemia/paroxismal nocturnal hemoglobinuria (AA/PNH): a high incidence of multiple mutations and evidence of a mutational hot spot. Blood. 2003; 101, 7:2833-2841

84. Mozo L., Suarez A. and Gutierrez C. Glucocorticoids up-regulate constitutive interleukin-10 production by human monocytes. Clin. Exp. Allergy. 2003; 34: 406-412

85. Mullen A.C. Hlx is induced by and genetically interacts with T-bet to promote heritable Thl gene induction. Nature Immunol. 2002; Vol. 3, 652-658

86. Murphy K.M., Reiner S.L. The lineage decisions of herlper T cells. Nature Reviews/Immunology. 2002; Vol.2, 933-943

87. Nakao S, Takamatsu H., Chuhjo T. et al. Identification of a specific HLA class II haplotype strongly associated with susceptibility to cyclosporine-dependent aplastic anemia. Blood. 1994; Vol 84, N 12:4257-4261

88. Nakao S, Takami A., Takamatsu H. et al. Isolation of a T-cell clone showing HLA-DRBl*0405-restricted cytotoxicity for hematopoietic cells in a patient with aplastic anemia. Blood. 1997; Vol 89, N 10:3691-3699

89. Neighbors M. A critical role for interleukin-18 in primaryand memory effector responses to Listeria monocytogenes that extends beyond its effects on interferon-y production. J. Exp. Med. 2001; 194, 383-390

90. Nimer SD, Ireland P, Meshkinpour A, Frane M. An increased HLA-DR2 frequency is seen in aplastic anemia patients. Blood 1994, Vol 84, No 3: 923-927

91. O'Sullivan B. Thomas R. Recent advances on the role of CD40 and dendritic cells in immunity and tolerance. Current Opinion in Hematology. 2002. Vol. 10; 4:272-278

92. Paik J.W., Kim C.S., Cho K.S. et al. Inhibition of cyclosporin A-induced gingival overgrowth by azithromycin through phagocytosis: an in vivo and in vitro study. J. Periodontol. 2004. Vol. 75, 3:380-387

93. Paquette RL. Diagnosis and treatment of aplastic anemia and myelodisplastic syndrome. Oncology 2002 Sep; 16(9 Suppl 10): 153-61

94. Paquette RL., Tebyani N., Frane M. et al. Long-term outcome of aplastic anemia in adults treated with antithymocyte globulin: comparison with bone marrow transplantation. Blood. 1995; Vol 85, 1:283-290

95. Piccirillo C. A., Shevach E.M. Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by CD4+CD25+ immunoregulatory cells. J. Immunol. 2001; 167: 1137-1140

96. Ratta M., Fagnoni F., Curti A. et al. Dendritic cells are functionally defective in multiple myeloma: the role of interleukin-6. Blood; 2002? Vol 100, N 1, 230-238

97. Rezvany M.R., Jeddi-Tehrani M., Biberfeld P. et al. Dendritic cells in patients with non-progressive B-chronic lymphocytic leukaemia have a normal functional capability but abnormal cytokine pattern. Brit. J. Haematol. 2001; V01 115, N 2, 263-270

98. Rigolin G.M., Howard J., Buggins A. et al. Phenotypic and functional characteristics of monocyte-derived dendritic cells from patients with myelodysplastic syndromes. British Journal of Haematology, 1999, 107: 844-850

99. Risitano A.M., Kook H., ZengW. Et al. Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxizmal nocturnal hemoglobinuria measured be Vbeta СОЮ spectratyping and flow cytometry. Blood. 2002; 100, 1: 78-183

100. Risitano A.M., Maciejevski J.P., Green S. et al. In-vivo dominant immune responses in aplastic anemia: molecular tracking of putatively pathogenetic T-cell clones by TCR P-CDR3 sequencing. The Lancet. 2004; 364, 355-364

101. Rissoan M.C., Soumelis V., Kadowaki N. et al. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation. Science. 1999. 283:1183-1190

102. Rizo S., Killick S.B., Patel S. et al. Reduced TGF-pi in patients with aplastic anemia in vivo and in vitro. Brit. J. Haematol. 1999, 107, 797-803

103. Roncarolo M.G., Gregori S., Battaglia M et al. Interleukin 10 secreting type 1 regulatory T cells in rodents and humans. Immunological reviews. 2006. Vol. 212, p.28-50

104. Rosenfeld SJ., Kimball J., Vining D. et al. Intensive immunosuppression with antithymocyte globulin and cyclosporine as treatment for severe acquired aplastic anemia. Blood. 1995; Vol 85, 11:3058-3065

105. Rothoeft Т., Gonschorek A., Barts H. et al. Antigen dose, type of antigen-presenting cell and time of differentiation contribute to the T helper 1/ T helper 2 polarization of naive T cells. Immunology. 2003; 110: 430-439

106. Sato Т., Selleri C., Young N.S. et al. Inhibition of interferon regulatory factor-1 expression results in predominance of cell growth stimulatory effects of interferon-y due to phosphorylation of Statl and Stat3. Blood. 1997; 90, 12:4749-4758

107. Saunthararajah Y., Nakamura R., Nam J.M. et al. HLA-DR15 (DR2) is overexpressed in myelodysplastic syndrome ans aplastic anemia and predicts a response to immunosuppressive in myelodysplastic syndrome. Blood. 2002; Vol 100, N 5, 1570-1574

108. Selleri C., Maciejewski J.P., Sato T. et al. Interferon-gamma constitutively expressed in the stromal microenvironment of human marrow cultures mediates potent hematopoietic inhibition. Blood. 1996; 87, 10:4149-4157

109. SchoIIer N., Hayden-Ledbetter M., Dahlin M. et al. Cutting edge: CD83 regulates the developmment of cellular immunity. J. Immunol. 2002; 168 (6), 2599-2602

110. Shortman K, Caux C. Dendritic cells development: Multiple pathways to Nature's adjuvants. Stem cells. 1997; 15, 409-419

111. Shu U., Kiniwa M., Wu CY et al. Activated T cells induce interleukin-12 production by monocytes via CD40-CD40-ligand interaction. Eur. J. Immunol. 1995.25:1125-1133

112. Sloand E., Kim S., Maciejewski P. et al. Pharmacologic doses of granulocyte colony-stimulating factor affect cytokine production by lymphocytes in vitro and in vivo. Blood. 2000; Vol 95, 7:2269-2274

113. Sloand E., Kim S., Maciejewski JP et al. Intracellular interferon-gamma in circulating and marrow T-cells detected by flow cytometry and the response to immunosuppressive therapy in patients with aplastic anemia. Blood. 2002 Aug; 100(4): 1185-91

114. Socie G., Henry-Amar M., Bacigalupo A. et al. Malignant tumors occurring after treatment of aplastic anemia. New Engl. J. Med. 1993; 29:1152-1157

115. Speck В., Tichelly A., Widmer E. et. al. Spleenectomy an adjuvant measure in the treatment of severe aplastic anemia. Br. J. Haemtal. 1996; 92:818-823

116. Steinbrink K., Graulich E., Kubsch S. et al. CD4+ and CD8+ anergic T cells induced by interleukin-10-treated human dendritic cells display antige-specific suppressor activity. Blood. 2002, Vol 99, No 7:2468-2476

117. Taga K., Kasahara Y., Yachie A. et al. Preferential expression of IL-2 receptor subunits on memory population within CD4+ and CD8+ T cells. Immunol. 1990; 72: 1519

118. Taga K., Tosato G. IL-10 inhibits human T cell proliferation and IL-2 production. The Journal of Immunology. 1992, Vol. 148, No 4:1143-1148

119. Taketazu F., Miyagawa K., Ichijo H. et al. Decreased level of transforming growth factor-beta in blood lymphocytes of patients with aplastic anemia. Growth factors. 992; Vol. 6, 1:85-90

120. Teramura M., Kobayashi S., Iwabe K. et al. Mechanism of action of antithymocyte globulin in the treatment of aplastic anemia: in vitro evidence for the presence of immunosuppressive mechanism. British Journal of Haematology, 1997, 96: 80-84

121. Thomas R., Lipsky P. Human peripheral blood dendritic cell subsets: isolation and characterization of precursor and mature antigen presenting cells. J. immunol. 1994; 153: 4016-28

122. Tichelli A., Passweg J., Nissen C. et al. Repeated treatment with horse antilymphocyte globulin for severe aplastic anemia. Brit. J. Haematol. 1988, 100, 393-400

123. Tisdale JF., Maciejewski JP., Nunez O., Rosenfeld SJ., Young NS. Late complications following treatment for severe aplastic anemia with high-dose cyclophosphamide: Follow-up of a randomized trial. Blood 2002 Jun 28

124. Tripathy N.K., Nityanand S., Vibhuti/ Bone marrow and blood plasma levels of IL-8 in aplastic anemia and their relationship with disease severity. Am. J. Hematol. 2005; Vol. 79, N 3, p. 240-242

125. Trullemans F., Grignard F., Camp B. et al. Clinical findings and magnetic resonance imaging in severe cyclosporine-related neurotoxicity after allogeneic bone marrow transplantation. European Journal of Haematology. 2001. Vol. 67, 2:94-100

126. Tsuda H., Yamasaki H. Type I and type II profiles in aplastic anemia and refractory anemia. Am J Haematol 2000 Aug; 64(4):271-274

127. Tursley SJ Dendritic cells: inciting and inhibiting autoimmunity. Current Opin. Immunol. 2002. 14; 6: 765-770

128. Uckovic V., Earnley F., Unningham G. et al. Dendritic cells in chronic myelomonocytic leukemia. Brit. J. Haematol. 1999; V01 105, N 4, 974-979

129. Vendetti S., Chai JG., Dyson J. et al. Anergic-T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. immunol. 2000; 165:1175-1181

130. Verma A., Deb D. K., Sassano A. et al. Cutting edge: Activation of the p38 Mitogen-activated protein kinase signaling pathway madiates cytokine-induced hematopoietic suppression in aplastic anemia. The J. Immunol. 2002; 168:5984-5988

131. Vieira P.L., Jong E.C., Wierenga E. et al. Development of Thl-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J. Immunol. 2000; 164:45074512

132. Vieira P.L., Kalinski P., Wierenga E. et al. Glucocorticoids inhibit bioactive IL-12p70 production by in vitro- generated human dendritic cells without affecting their T cell stimulatory potential. J. Immunol. 1998; 161:5245-5251

133. Vuillier F., Maloum K., Thomas E.K. et al. Functional monocyte-derived dendritic cells can be generated in chronic lymphocytic leukemia. Br. J. Haematol. 2001. Vol. 115; 4:831-844

134. Vulliamy Т., Marrone A., Dokal I. et al. Association between aplastic anemia and mutations in telomerase RNA. The Lancet, 2002; Vol 359, 9324:2168-2170

135. Wang X.N., Lange С., Schulz U. et al. Interleukin-10 modulation of alloreactivity and graft-versus-host reactions. Transplantation. 2002. Vol. 74; 6: 772-778

136. Watanabe K.H., Bois F.Y., Daisy J.M. et al. Benzene toxicokinetics in humans: exposure of bone marrow to metabolites. Occup. Environ. Med. 1994; 51, 414-420

137. Weisser J., Dell K., Bohler T. et al. Cyclosporine A up-regulates the expression of TGF-pi and its receptors type I and type II in rat mesangial cells. Nephrol. Dial. Transsplant. 2002, 17:1568-1577

138. Witsch E.J., Peiser M., Hutloff A. et al. ICOS and CD28 reversely regulate IL-10 on re-activation of human effector T cells with mature dendritic cells. Eur. J. Immunol. 2002. Vol. 32; 9 : 2680-2686

139. Wodnar Filipowicz A., Lyman S.D., Gratwohl A. et al. Flt3 ligand level reflects hematopoietic progenitor cell function in aplastic anemia and chemotherapy-induced bone marrow aplasia. Blood. 1996; 88, 12:4493-4499

140. Woltman A.M., de Fijter J.W., Kamerling S.W. et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur. J. Immunol. 2000; 30:1807-1812

141. Wright H.J., Chappie I.L., Blair F. et al. Crevicular fluid levels of TGF-betal in drug-induced gingival overgrowth. Arch. Oral Biology. 2004. Vol. 49, 5:421-425

142. Xia C.Q., Peng R., Beato F. et al. Dexamethazone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity. Scandinavian Journal of Immunology. 2005, 62, 45-54

143. Young N.S., Acquired aplastic anemia. Annals of internal medicine 2002, Vol. 136, No 7, p534-546

144. Young N.S., Abkowitz J.L., Luzzatto L. New insights into the pathophisiology of acquired cytopenias. Hematology. The International Society of Haematology 2000. 18-38

145. Young N.S., Maciejewski J. The pathophysiology of acquired aplastic anemia. New Engl. J. Med. 1997; Vol 336, No 19, 1365-1371

146. Yu H., Fehniger Т.A., Fuchshuber P. et al. Flt3 ligand promotes the generation of a distinct CD34+ human natural killer cell progenitor that responds to interleukin-15. Blood. 1998; 92, 10:3647-3657

147. Zeng W., Chen G., Kajigaya S. et al. Gene expression profiling in CD34 cells to identify differences between aplastic anemia patients and healthy volunteers. Blood. 2004; Vol 103, N 1,325-332

148. Zeng W., Kajigaya S., Chen G. et al. Transcript profile of CD4+ and CD8+ T cells from the bone marrow of acquired aplastic anemia patients. Experimental Haematology. 2001. Vol. 32, 9:806-814

149. Zhang Т., Sun В., Feng Q. et al. A comparative study on the expressions of IL-4, IFN-gamma and TNF-alpha in BMMNC of acute and chronic aplastic anemia patients. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2000. Vol. 21, N 10, 530-532

150. Zoumbus N.C., Gascon P., Djei J.Y. et al. Circulated activated suppressor T lymphocytes in aplastic anemia. N Eng J Medicine, 1985, 312:257-265